lncRNAPRDM7-1:2作为标志物在开发结核病患者筛查试剂中的应用的制作方法

lncrna prdm7-1:2作为标志物在开发结核病患者筛查试剂中的应用
技术领域
1.本发明属于医学诊断领域，具体涉及lncrna prdm7-1:2作为标志物在开发结核病患者筛查试剂中的应用。


背景技术：

2.结核病是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,m.tb)引发的慢性传染性疾病，具有流行性广、病死率高等特点，大约四分之一的世界人口感染m.tb，是亟待解决的公共卫生问题。实现结核病的快速准确诊断对于缓解公共卫生压力具有重要的意义。现有的结核病诊断的金标准是病原学；其中涂片法是最基本的检测方法，虽然操作简单结果可靠，但是在实际应用中阳性率低的问题不容忽视；培养法虽然灵敏度略有提高，但存在培养时间长，阳性率低等问题。随着技术的发展，靶向结核杆菌的分子生物学检测技术常规应用于临床，使得结核病检出率提高至60％左右。但是，临床仍然存在接近一半的患者因缺乏病原学依据或无痰标本而无法得到准确诊断，因此临床上对结核病的诊断依然存在困难。为了尽早切断传染源与传播途径从而避免m.tb传播，实现结核病的快速诊断，who也提倡开发基于宿主“非痰”标本的血液/体液分子检测技术，因此需要从宿主角度大力开展新型生物标识物的鉴别和验证，以提高结核病的诊断效率。
3.既往研究发现m.tb感染宿主后，非编码rna(non-coding rna,ncrna)也参与抗感染过程，其中lncrna占非编码rna的80％。lncrna是一种由超过200个核苷酸组成的不具备蛋白质编码能力的rna，其可通过结合不同生物大分子，在转录水平、转录后以及翻译阶段发挥生物学作用，既往的研究结果显示其参与了包括传染性疾病在内的多种疾病的病理生理过程。虽然其具体的作用机制还需要进一步研究阐明或完善，但毋庸置疑的是，lncrna在细胞行使功能和疾病发生发展的过程中有着十分重要的调控作用，提示其作为诊断标识的潜在可能性。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供lncrna prdm7-1:2作为标志物在开发结核病患者筛查试剂中的应用。
5.本发明提供了用于筛查结核病患者的系统，包括检测系统和判读系统；
6.所述检测系统用于检测受试者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,pbmcs)中的lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的相对表达量；
7.所述判读系统用于将受试者pbmcs中的lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的相对表达量转换为判读结果，所述判读结果指的是结核病患者或健康者(非结核病患者)。
8.将受试者pbmcs中的lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的相对
表达量转换为判读结果的方法为：相对表达量大于等于阈值判断为结核病患者，相对表达量小于阈值判断为健康者(非结核病患者)。
9.具体的，所述阈值为0.001008514。
10.本发明还提供了用于诊断或辅助诊断结核病的系统，包括检测系统和判读系统；
11.所述检测系统用于检测受试者pbmcs中的lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的相对表达量；
12.所述判读系统用于将受试者pbmcs中的lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的相对表达量转换为判读结果，所述判读结果指的是发生结核病或未发生结核病。
13.将受试者pbmcs中的lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的相对表达量转换为判读结果的方法为：相对表达量大于等于阈值判断为发生结核病，相对表达量小于阈值判断为未发生结核病。
14.具体的，所述阈值为0.001008514。
15.本发明还提供了一种试剂盒，包括用于检测lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的物质；
16.所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)：
17.(a)筛查结核病患者；
18.(b)诊断或辅助诊断结核病。
19.所述试剂盒还包括记载有如下内容的载体：
20.(1)检测受试者pbmcs中的lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的相对表达量；
21.(2)相对表达量大于等于阈值判断为结核病患者，相对表达量小于阈值判断为健康者(非结核病患者)。
22.具体的，所述阈值为0.001008514。
23.所述试剂盒还包括记载有如下内容的载体：
24.(1)检测受试者pbmcs中的lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的相对表达量；
25.(2)相对表达量大于等于阈值判断为发生结核病，相对表达量小于阈值判断为未发生结核病。
26.具体的，所述阈值为0.001008514。
27.本发明提供了用于检测lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的物质在制备用于筛查结核病患者的试剂盒中的应用。
28.本发明还提供了lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段作为标志物在开发用于筛查结核病患者的试剂盒中的应用。
29.本发明还提供了用于检测lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的物质在制备用于诊断或辅助诊断结核病的试剂盒中的应用。
30.本发明还提供了lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段在开发用于诊断或辅助诊断结核病的试剂盒中的应用。
31.以上任一所述用于检测lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的
物质包括：用于检测lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的引物对。
32.以上任一所述用于检测lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的物质还包括：用于检测内参基因的引物对。
33.具体来说，检测lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段指的是：检测人pbmcs中的lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的相对表达量。
34.具体来说，检测lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段指的是：通过荧光定量pcr检测人pbmcs中的lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的相对表达量。
35.具体的，lncrna prdm7-1:2如序列表的序列1所示。
36.具体的，lncrna prdm7-1:2的特征性片段如序列表的序列1中第2797-2858位所示。
37.具体的，用于检测lncrna prdm7-1:2的特征性片段的引物对由序列表的序列3所示的引物和序列表的序列4所示的引物组成。
38.具体的，以上任一所述筛查为从健康者(非结核病患者)中筛查。
39.具体的，以上任一所述内参基因为gapdh基因。
40.具体的，用于检测内参基因的引物对由序列表的序列7所示的引物和序列表的序列8所示的引物组成。
41.相对表达量的计算方法如下：
42.△
ct＝ct
lncrna prdm7-1:2-ct
内参基因
；
43.相对表达量(relative expression level)＝2
‑△
ct
。
44.具体的，以上任一所述结核病为肺结核病。
45.为了鉴定用于结核病诊断的潜在差异表达的lncrna，并揭示其参与的结核病发生发展中的病理生理过程，本发明的发明人开展了一项全基因组rna芯片筛查，完成了来自结核病患者和健康人两类人群pbmcs内的lncrna表达谱对比分析，初步获得了大量差异表达的lncrna。
46.进一步，发明人将初步获得的lncrna在另外的独立样本中进行qpcr验证，筛选到2个lncrna(lncrna chi3l1-2:3、lncrna prdm7-1:2)的组间表达趋势与芯片结果一致，并且2个lncrna在结核病患者组中的表达显著高于健康人组，差异具有统计学意义。
47.进一步，发明人在新的人群中对2个lncrna作为单独标志物的诊断性能进行了分析。受试者工作特征曲线分析显示，2个lncrna独立用于结核病诊断的roc曲线下面积均大于0.70，lncrna prdm7-1:2作为诊断标志物的性能显著优于lncrna chi3l1-2:3。本发明对于结核病的快速诊断以及尽早治疗十分重要。
附图说明
48.图1为实施例4中所有受试者pbmcs中的2种lncrna的相对表达量。
49.图2为实施例4中独立采用2种lncrna作为诊断标志物的roc曲线。
具体实施方式
50.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐
expression wash buffer kit(cat.#5188-5327,agilent technologies,santa clara,ca,us)。
66.5、芯片扫描
67.完成杂交的芯片采用agilent microarray scanner(cat.#g2565ca,agilent technologies,santa clara,ca,us)进行扫描，软件设置dye channel:green,scan resolution＝3μm,pmt 100％,20bit。用feature extraction software 10.7(agilent technologies,santa clara,ca,us)读取数据，最后采用r软件中limma包进行归一化处理，所用的算法为quantile。
68.6、对tb组样本pbmcs内的lncrna谱和hc组样本pbmcs内的lncrna谱进行筛选和对比分析，筛选获得多个差异表达的lncrna(p《0.05,fold change》2)。
69.示例性的2个lncrna(该2个lncrna进行后续验证被确认为有效标志物)的芯片分析结果见表1。
70.表1
[0071][0072]
注：p值为tb组与hc组标准化信号值比较结果，p《0.05为有统计学意义。
[0073]
实施例2、进一步筛选有效标志物
[0074]
利用细胞模型以及新的临床分组样本(即tb组样本和hc组样本)，在实施例1初筛获得的差异表达的lncrna中进行进一步筛选，获得2个有效标志物。
[0075]
2个有效标志物为lncrna prdm7-1:2和lncrna chi3l1-2:3。
[0076]
lncrna prdm7-1:2如序列表的序列1所示。
[0077]
lncrna chi3l1-2:3如序列表的序列2所示。
[0078]
实施例3、应用标志物筛查结核病患者的方法的建立
[0079]
新的临床分组样本(即tb组样本和hc组样本)。
[0080]
一、检测每个标志物的相对表达量
[0081]
1、利用edta抗凝采血管采集受试者的外周血(4ml)，分离获得pbmcs。
[0082]
2、取步骤1获得的pbmcs，用pbs缓冲液洗涤，利用qiazol lysis reagent(qiagen公司，货号79306)进行细胞裂解，然后利用mirneasy mini kit(qiagen公司，货号217004)进行rna提取。
[0083]
3、取步骤2获得的rna，在0.2ml pcr管中按照表2制备20μl反应体系，然后进行反转录。
[0084]
表2
[0085]
[0086][0087]5×
rt buffer、enzyme mix、primer mix，均为revertra ace qpcr rt kit(toyobo公司，货号fsq-101)中的组件。
[0088]
反转录的反应程序：37℃15min，95℃5min，4℃保存。
[0089]
4、完成步骤3后，在96孔板中按照表3制备20μl反应体系，然后进行pcr扩增。
[0090]
表3
[0091]
组分体积powerup
tm
sybrgreen预混液10μl引物工作液2μl步骤3的产物2μlddh2o6μl
[0092]
powerup
tm
sybr green预混液：美国abi公司，货号a25742。
[0093]
引物工作液提供的有效成分为用于检测靶标的上游引物和下游引物。引物工作液中，上游引物和下游引物的浓度均为10μm。
[0094]
pcr扩增采用abiquantstudio 7flex荧光定量pcr仪。pcr扩增的反应程序：50℃2min、95℃10min；95℃15s、60℃1min，40个循环。
[0095]
用于检测lncrna prdm7-1:2基因表达时，pcr扩增采用的引物如下：
[0096]
lncrna prdm7-1:2上游引物(序列表的序列3)：ccatgggttctacgtgtttcttg；
[0097]
lncrna prdm7-1:2下游引物(序列表的序列4)：cattcctggtgcccattctg。
[0098]
用于检测lncrna chi3l1-2:3基因表达时，pcr扩增采用的引物如下：
[0099]
lncrna chi3l1-2:3上游引物(序列表的序列5)：cactactctcccaagcccttctat；
[0100]
lncrna chi3l1-2:3下游引物(序列表的序列6)：gaaggactaatggctggacactaatat。
[0101]
用于检测内参基因(gapdh基因)表达时，pcr扩增采用的引物如下：
[0102]
gapdh上游引物(序列表的序列7)：tgacttcaacagcgacaccca；
[0103]
gapdh下游引物(序列表的序列8)：caccctgttgctgtagccaaa。
[0104]
引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0105]
△
ct＝ct
lncrna-ct
gapdh
；
[0106]
相对表达量(relative expression level)＝2
‑△
ct
。
[0107]
二、设定利用有效标志物筛查结核病患者的阈值
[0108]
根据临床分组情况和标志物的相对表达量数据设立阈值。
[0109]
lncrna prdm7-1:2作为标志物时，将阈值设置为0.001008514，大于等于阈值判断为结核病患者，小于阈值判断为健康者。
[0110]
lncrna chi3l1-2:3作为标志物时，将阈值设置为0.000120130，大于等于阈值判断为结核病患者，小于阈值判断为健康者。
[0111]
实施例4、在新的样本群体中验证lncrna作为结核病患者筛查标志物的用途
[0112]
受试者：共计102例受试者；70例结核病患者组成结核病患者人群(tb组)，32例健康者组成健康者人群(hc组)。
[0113]
一、检测每个标志物的相对表达量
[0114]
分别对每个受试者进行检测，方法同实施例3的步骤一。
[0115]
32例健康者和70例结核病患者进行上述步骤获得的两种lncrna的相对表达量见图1。由于相对表达量数据较小，为了便于展示，将相对表达量数值乘以100000，得到相对表达量展示值。32例健康者的pbmcs中各个靶标的相对表达量展示值见表4。70例结核病患者的pbmcs中各个靶标的相对表达量展示值见表5。
[0116]
表4
[0117][0118][0119]
表5
[0120]
[0121][0122]
tb组受试者的pbmcs中两个靶标的相对表达量(该组受试者的平均值)和hc组受试者的pbmcs中两个靶标的相对表达量(该组受试者的平均值)及其表达差异分析见表6。
[0123]
表6
[0124]
fc(tb/hc)p-value
lncrnaprdm7-1:23.816《0.000lncrnachi3l1-2:31.563《0.001
[0125]
二、利用有效标志物筛查结核病患者
[0126]
利用步骤一获得的两个目标物的相对表达量，按照实施例3的步骤二进行判断。
[0127]
根据判断结果和实际分组进行性能评价。
[0128]
两种lncrna作为诊断标志物的roc曲线见图2。两种lncrna作为诊断标志物的性能评价数据见表7。
[0129]
表7
[0130]
auc(95％ci)敏感性(95％ci)特异性(95％ci)lncrnaprdm7-1:20.928(0.876-0.980)0.829(0.756-0.902)0.969(0.935-1.000)lncrnachi3l1-2:30.715(0.608-0.822)0.714(0.626-0.802)0.781(0.701-0.861)
[0131]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：
1.用于筛查结核病患者的系统，包括检测系统和判读系统；所述检测系统用于检测受试者pbmcs中的lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的相对表达量；所述判读系统用于将受试者pbmcs中的lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的相对表达量转换为判读结果，所述判读结果指的是结核病患者或健康者。2.用于诊断或辅助诊断结核病的系统，包括检测系统和判读系统；所述检测系统用于检测受试者pbmcs中的lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的相对表达量；所述判读系统用于将受试者pbmcs中的lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的相对表达量转换为判读结果，所述判读结果指的是发生结核病或未发生结核病。3.一种试剂盒，包括用于检测lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的物质；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)：(a)筛查结核病患者；(b)诊断或辅助诊断结核病。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述用于检测lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的物质包括：用于检测lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的引物对。5.用于检测lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的物质在制备用于筛查结核病患者的试剂盒中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述用于检测lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的物质包括：用于检测lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的引物对。7.lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段作为标志物在开发用于筛查结核病患者的试剂盒中的应用。8.用于检测lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的物质在制备用于诊断或辅助诊断结核病的试剂盒中的应用。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述用于检测lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的物质包括：用于检测lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段的引物对。10.lncrna prdm7-1:2或lncrna prdm7-1:2的特征性片段在开发用于诊断或辅助诊断结核病的试剂盒中的应用。

技术总结
本发明公开了lncRNA PRDM7-1:2作为标志物在开发结核病患者筛查试剂中的应用。本发明提供了用于检测lncRNA PRDM7-1:2或lncRNA PRDM7-1:2的特征性片段的物质在制备用于筛查结核病患者的试剂盒中的应用或者在制备用于诊断或辅助诊断结核病的试剂盒中的应用。发明人开展了全基因组RNA芯片筛查，完成了来自结核病患者和健康人两类人群PBMCs内的lncRNA谱筛选和对比分析，初步获得了大量差异表达lncRNA。发明人将初步获得的lncRNA在另外独立样本中进行qPCR验证，筛选到2个lncRNA。发明人在新人群中对2个lncRNA作为单独标志物的性能进行了分析。本发明对于结核病的快速诊断以及尽早治疗十分重要。尽早治疗十分重要。


技术研发人员：权利要求书1页说明书10页序列表（电子公布）附图1页
受保护的技术使用者：北京市结核病胸部肿瘤研究所
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/8/14