一组用于鉴别茶枝柑品种的SSR引物组合及其应用

一组用于鉴别茶枝柑品种的ssr引物组合及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学和植物品种鉴别技术领域，具体涉及一组用于鉴别茶枝柑品种的ssr引物组合及其应用。


背景技术：

2.茶枝柑的果皮制干即为中药陈皮，是陈皮正品。王好古《汤液本草》(公元1248年)载：“或云与陈皮一种，“日久者佳，故称陈皮”。历来所称陈皮，原出广州，故又称广陈皮，就是茶枝柑的果皮。茶枝柑作为国家地理标志产品有700多年的种植栽培历史，是十大广药之首。依靠传统经验的品种鉴定多从形态性状为判别点，易受植物形态及环境的影响，并且需要从事中药材种植经验丰富的专业人员才能准确区别。随着分子生物学鉴定的发展，分子生物学鉴定技术为物种鉴定特别是中药混淆品、代用品鉴定提供了一种新技术思路。
3.现有技术中基于k2p距离构建的nj发育树不能较好地区分鉴定各陈皮栽培品种，原因在于陈皮来源植物宽皮柑橘的栽培品种之间普遍存在自然杂交和芽变现象,特别是经杂交育种的杂柑(天草、不知火等),其dna片段上仅存在少数位点的单核苷酸变异，its2序列存在高度相似性，因此，仅从具有特征片段的dna条形码序列难以进行区分。通过判断trnh-psba序列dna条形码可用于初步鉴别广陈皮，但是不能区分新会茶枝柑。通过比较五种dna条形码候选片段its2、its、psba-trnh、rbcl、matk用于不同产地和栽培品种的的鉴定，发现its2序列鉴别效果最佳，但是its序列测序成功率低，且基于its序列构建的nj进化树无法区分广陈皮与陈皮。
4.ssr位点分析是对ssr序列进行基因型分析的过程。ssr(简单重复序列，又称微卫星)是长度为1至6个碱基的串联重复序列，并广泛分布在动植物基因组中，通过pcr扩增，电泳分离和测序等技术，可以将样品中的ssr位点扩增出来，并进行分型分析。ssr位点分析可以用于遗传多样性研究、种质资源评估、品种鉴定、遗传图谱构建、基因功能研究等领域。
5.ssr在种间的通用性和特异性表现良好，利用少数的ssr标记组合便可以提供较高的检测效率。此外，ssr标记可从物种的基因组和转录组测序中开发获得，具有共显性、稳定性和可重复性，已成为一种用于动植物种质资源识别、鉴定的理想分子标记。其鉴定结果可靠性高且可重复,不受实验条件和设备的影响，便于不同实验室相互交流合作开发引物，这对茶枝柑种质资源的收集、保存、评价和利用具有十分重要的意义。
6.在中药材品种改良和育种中，ssr位点分析可以帮助选择优良基因型，实现快速育种和良种选育。有鉴于此，本发明致力于提供一种通过分析茶枝柑基因组序列获得了基因组ssr分子标记，并根据序列合成核心基因组ssr引物，构建了茶枝柑鉴定的ssr指纹图谱，可高效、准确、低成本对茶枝柑品系或其近缘种进行鉴定。目前，在国内还未见基于ssr分子标记对茶枝柑品种进行鉴定的相关报道。


技术实现要素：

7.为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案。
8.本发明的目的在于提供一组用于鉴别茶枝柑品种的ssr分子标记组合，所述分子标记具有如下编号为:cluster-1013.0、cluster-10239.0、cluster-10345.0、cluster-10191.0、cluster-10077.0、cluster-10228.0、cluster-10273.0、cluster-10192.0、cluster-10023.0、cluster-10024.0、cluster-10025.0、cluster-1038.0、cluster-10343.0、cluster-10337.0、cluster-10019.0、cluster-10157.0、cluster-10233.0、cluster-10313.0、cluster-10022.0、cluster-10357.0、cluster-10014.0、cluster-10247.0、cluster-10351.0、cluster-10272.1、cluster-10204.0、cluster-10211.0、cluster-10141.0、cluster-10044.0、cluster-10260.0、cluster-10027.0所示的序列；所述分子标记物组合包括所述分子标记中的至少3个；用于扩增所述ssr分子标记的引物对核苷酸序列依次为:seq id no：1和seq id no：2、seq id no：3和seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6、seq id no：7和seq id no：8、seq id no：9和seq id no：10、seq id no：11和seq id no：12、seq id no：13和seq id no：14、seq id no：15和seq id no：16、seq id no：17和seq id no：18、seq id no：19和seq id no：20、seq id no：21和seq id no：22、seq id no：23和seq id no：24、seq id no：25和seq id no：26、seq id no：27和seq id no：28、seq id no：29和seq id no：30、seq id no：31和seq id no：32、seq id no：33和seq id no：34、seq id no：35和seq id no：36、seq id no：37和seq id no：38、seq id no：39和seq id no：40、seq id no：41和seq id no：42、seq id no：43和seq id no：44、seq id no：45和seq id no：46、seq id no：47和seq id no：48、seq id no：49和seq id no：50、seq id no：51和seq id no：52、seq id no：53和seq id no：54、seq id no：55和seq id no：56、seq id no：57和seq id no：58或seq id no：59-seq id no：60。
9.本发明提供的茶枝柑的引物组合物，包括seq id no：1-seq id no：60所示的引物组合对。
10.优选地，本发明鉴别茶枝柑品种的ssr分子标记组合由所述的30个ssr分子标记组成，如品种差异大，ssr分子标记数组合可较少，例如10个；如茶枝柑样品品种的差异较少，ssr分子标记数组合可增加至20个，或进一步的到30个，检测人员可在减少流程与检测准确性间权衡。
11.优选地，一种鉴定茶枝柑的鉴定方法，通过鉴定茶枝柑的基因组中是否含有所述的ssr分子标记组合至少10个来进行鉴定。
12.需要说明的是，对特异性扩增ssr分子标记的引物不作具体限定，本领域技术人员熟知针对一段特定的核苷酸序列，扩增其的引物不会仅仅是一对特定核苷酸序列的上下游引物，根据引物碱基不同或长度不同，可以有多对引物特异性扩增一个ssr分子标记，此处列举的seq id no：1-seq id no：60的引物仅是本发明的一种优选实施例，其余的能够特异性扩增ssr分子标记的引物也在本发明的保护范围之内。
13.本发明以不同区域(例如古井，东甲，梅江，天马，茶坑)的随机茶枝柑样品为试验对象，通过mrna测序技术对样品转录组测序并进行基因分型，分析茶枝柑基因序列，获得了包含30个茶枝柑ssr分子标记组合，该分子标记组合不包括内含子，可从茶枝柑基因组直接扩增。
14.本发明涉及一种试剂，包括所述的引物对中至少一对。
15.本发明涉及一种试剂盒，包括所述的引物对中至少一对。
16.一种茶枝柑品种或其近缘种的鉴定试剂盒，所述试剂盒用于鉴定茶枝柑品种或其近缘种，所述试剂盒包括所述30个引物对。
17.一种茶枝柑品种ssr指纹图谱，其包括：
[0018][0019]
或者
[0020]
[0021][0022]
本发明提供了一种茶枝柑品种ssr指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
[0023]
(1)从不同区域(例如古井，东甲，梅江，天马，茶坑)随机采摘茶枝柑的果皮样品为试验对象，提取rna后，进行一代测序；
[0024]
(2)采用misa对测序的结果进行ssr检测，鉴定出多种类型的ssr；
[0025]
(3)虽然ssr在基因组上的位置不尽相同，但是其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此根据ssr两端互补序列来设计引物，通过pcr反应扩增其单片段(由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用pcr的方法扩增出不同长度的pcr产物)，将得到的产物进行凝胶电泳，并测序验证，即可获得ssr指纹图谱，步骤(3)中，pcr扩增可包括：
[0026]
优选的，所述pcr扩增的反应体系包括：25μl反应体系体积，含每种dntp0.25mmol/l，正向引物和反向引物各0.4μmol/l，taqdna聚合酶1.0u，1xpcr缓冲液，样品dna 0.05μl；
[0027]
优选的，所述pcr扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，63℃退火40s，72℃延伸45s，每个循环降1℃，共15个循环；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保温。
[0028]
本发明提供了一种茶枝柑品种或其近缘种的鉴定方法，包括以下步骤:
[0029]
(1)提取待检茶枝柑样品或其干燥果皮的基因组dna，以所述引物对待检样品的基因组dna进行pcr扩增；
[0030]
(3)pcr产物的分离与检测，包括琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳及测序等；
[0031]
(4)依据pcr产物大小或dna序列测序结果比较待检茶枝柑样品与茶枝柑ssr指纹
图谱的差异，从而判断茶枝柑真伪，鉴定茶枝柑品种亲缘关系；
[0032]
(5)序列数据的分析和注释：不同茶枝柑品种间，对每一个ssr分子标记pcr扩增子，长度一致时计算为2分，半数长度一致时计为1分，完全不一致时计为0分；得分值越高，与ssr指纹图谱中的品种越相近。
[0033]
本发明还提供了所述ssr分子标记组合、所述的引物对、所述试剂、所述试剂盒、所述指纹图谱或所述的构建方法在茶枝柑品种鉴定中的应用。
[0034]
本发明采用上述技术方案的某一实施例具有以下至少一种有益效果：
[0035]
本发明使用ssr分子标记对茶枝柑进行基因型分析，对其进行遗传多样性分析，操作简单，能有效区分茶枝柑种质，ssr在种间的通用性和特异性表现良好，具有共显性、稳定性和可重复性，克服需要经验丰富的专业人员仅通过形态性状来鉴定品种这一缺点，通过ssr分子标记的识别，茶枝柑品系或其近缘种可以高效、准确、低成本地进行鉴定。
[0036]
本发明提供了一种茶枝柑的指纹图谱，可用于品种鉴定以及遗传多样性分析，有利于不同实验室相互交流合作开发引物。
[0037]
本发明提供的试剂盒，能够准确且快速，区分茶枝柑品种。
[0038]
术语说明
[0039]
术语“任选”、“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情形可以但不一定出现。
[0040]
术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或多项的组合。
[0041]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
具体实施方式
[0042]
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0043]
实施例1
[0044]
筛选茶枝柑ssr分子标记和合成ssr引物
[0045]
(1)使用rnaprep纯植物试剂盒从茶枝柑冷冻果皮的样品中提取总rna；illumina rna-seq由迈维代谢生物技术有限公司实施，具体地：mrna的数量和质量由nanophotometer分光光度计测定；rna的完整性通过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；然后，cdna文库在illumina novaseq6000系统中进行了测序；为了获得高质量的数据，使用fastp消除了适配体和具有≥5个不确定碱基或50％以上qphred≤20个碱基的低质量序列；分析中采用misa对unigene进行ssr分析，去除含内含子的序列后，依据ssr两端序列两端互补序列来设计引物。
[0046]
(2)合成ssr引物，ssr引物名称编号和具体核苷酸序列见下表：
[0047]
[0048]
[0049][0050]
实施例2
[0051]
构建茶枝柑ssr指纹图谱，包括以下步骤：
[0052]
(1)取0.5g植物茶枝柑材料，双蒸水洗净，并用滤纸吸干；剪成1cm左右碎片，放入预冷的瓷研钵中；加入液氮速冷，研磨成细粉；在5ml离心管中加入抽提缓冲液2.5ml(2％ctab，1％β-巯基乙醇1.4mol/l nacl，20mmol/l edta，100mmol/l tris-hcl ph8.0，3m naac，50mm tris-hcl ph8.0，20mm edta)，60℃保温1小时；15000rpm，离心10分钟；上清转入另一个新的离心管中；加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)抽提；15000rpm，离心10分钟；上清转入另一个新的离心管中，加入2/3倍体积预冷异丙醇，-20℃保温30min-1h；最后dna沉淀用70％乙醇洗2次，加入400ul te buffer溶解dna，备用；
[0053]
(2)pcr反应体系：25μl反应体系体积，含每种dntp0.25mmol/l，正向引物和反向引物各0.4μmol/l，taqdna聚合酶1.0u，1xpcr缓冲液，样品dna 0.05μl；pcr反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，63℃退火40s，72℃延伸45s，每个循环降1℃，共15个循环；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保温；
[0054]
(3)pcr产物进行毛细管电泳检测和一代测序；
[0055]
(4)根据电泳检测中扩增产物的相对位置，验证pcr产物长度与引物设计时预计长度的一致性，并使用一代测序确定测序信息；
[0056]
(5)通过对不同位点的数据整合，获得了来源不同地区的茶枝柑品种的ssr指纹图谱：
[0057]
[0058][0059]
或者
[0060][0061][0062]
实施例3
[0063]
茶枝柑品种的鉴定方法，包括以下步骤：
[0064]
(1)取待测品种的茶枝柑，依据实施例2的1-4步骤，对pcr扩增产物进行电泳检测或一代测序；
[0065]
(2)根据电泳检测中扩增产物的相对位置，记录以下结果：不同茶枝柑品种间，对每一个ssr分子标记pcr扩增子，长度一致时计算为2分，半数长度一致时计为1分，完全不一致时计为0分，得分值越高，与ssr指纹图谱中的品种越相近；
[0066]
(3)阈值判断：由于在所选的30个含ssr序列中，品种间的有差异的含ssr序列为4-7个，如所测品种与ssr指纹图谱中的类似基因比较得分大于49分，应考虑为高亲缘性品种。
[0067]
实施例4
[0068]
验证茶枝柑品种鉴定方法准确度
[0069]
(1)取东甲5#，天马3#，四会柑，沙田桔作为待检样品；
[0070]
(2)依据实施例2的1-4步骤，对pcr扩增产物进行电泳检测；
[0071]
(3)根据电泳检测中扩增产物的相对位置，记录以下结果：不同茶枝柑品种间，对每一个ssr分子标记pcr扩增子，长度一致时计算为2分，半数长度一致时计为1分，完全不一致时计为0分。得分值越高，与ssr指纹图谱中的品种越相近；
[0072]
(4)阈值判断结果：与实施例2建立的ssr指纹图谱对比计分发现，东甲5#，天马3#得分大于49分，而四会柑，沙田桔低于10分。
[0073]
上述结果表明本发明实施例1筛选得到的30对引物组合可以较好的区分不同茶枝柑品种。
[0074]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一组用于鉴别茶枝柑品种的ssr分子标记组合，其特征在于，所述分子标记具有如下编号为:cluster-1013.0、cluster-10239.0、cluster-10345.0、cluster-10191.0、cluster-10077.0、cluster-10228.0、cluster-10273.0、cluster-10192.0、cluster-10023.0、cluster-10024.0、cluster-10025.0、cluster-1038.0、cluster-10343.0、cluster-10337.0、cluster-10019.0、cluster-10157.0、cluster-10233.0、cluster-10313.0、cluster-10022.0、cluster-10357.0、cluster-10014.0、cluster-10247.0、cluster-10351.0、cluster-10272.1、cluster-10204.0、cluster-10211.0、cluster-10141.0、cluster-10044.0、cluster-10260.0、cluster-10027.0所示的序列；所述分子标记物组合包括所述分子标记中的至少3个；用于扩增所述ssr分子标记的引物对核苷酸序列依次为:seq id no：1和seq id no：2、seq id no：3和seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6、seq id no：7和seq id no：8、seq id no：9和seq id no：10、seq id no：11和seq id no：12、seq id no：13和seq id no：14、seq id no：15和seq id no：16、seq id no：17和seq id no：18、seq id no：19和seq id no：20、seq id no：21和seq id no：22、seq id no：23和seq id no：24、seq id no：25和seq id no：26、seq id no：27和seq id no：28、seq id no：29和seq id no：30、seq id no：31和seq id no：32、seq id no：33和seq id no：34、seq id no：35和seq id no：36、seq id no：37和seq id no：38、seq id no：39和seq id no：40、seq id no：41和seq id no：42、seq id no：43和seq id no：44、seq id no：45和seq id no：46、seq id no：47和seq id no：48、seq id no：49和seq id no：50、seq id no：51和seq id no：52、seq id no：53和seq id no：54、seq id no：55和seq id no：56、seq id no：57和seq id no：58或seq id no：59-seq id no：60。2.根据权利要求1所述的ssr分子标记组合，其特征在于，所述分子标记组合包含所述30个ssr分子标记中的至少10个。3.一种茶枝柑的鉴定方法，其特征在于，通过鉴定茶枝柑的基因组中是否含有权利要求1所述的ssr分子标记组合至少10个来进行鉴定。4.一种试剂，其特征在于，包含权利要求1所述的引物对中的至少一对。5.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物对中至少一对。6.一种茶枝柑品种或其近缘种的鉴定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于鉴定茶枝柑品种或其近缘种，所述试剂盒包括权利要求1所述的30个引物对。7.一种茶枝柑品种ssr指纹图谱，其特征在于，包括如下指纹图谱：
或者
8.一种茶枝柑品种ssr指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：(1)从不同区域随机采摘茶枝柑的果皮样品为试验对象，提取rna后，进行一代测序；(2)采用misa对测序的结果进行ssr检测，鉴定出多种类型的ssr；(3)利用引物对对上述茶枝柑各品种dna进行pcr扩增，将得到的产物进行凝胶电泳，并测序验证，任选地，步骤(3)中pcr扩增包括：pcr扩增的反应体系包括：25μl反应体系体积，含每种dntp0.25mmol/l，正向引物和反向引物各0.4μmol/l，taqdna聚合酶1.0u，1xpcr缓冲液，样品dna 0.05μl；pcr扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，63℃退火40s，72℃延伸45s，每个循环降1℃，共15个循环；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保温。9.一种茶枝柑品种的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)提取待检茶枝柑样品或其干燥果皮的基因组dna，以权利要求1所述的引物对对待检样品的基因组dna进行pcr扩增；(2)pcr扩增产物进行电泳检测以及测序；(3)依据pcr产物大小或dna序列测序结果比较待检茶枝柑样品与茶枝柑ssr指纹图谱的差异，从而判断茶枝柑真伪，鉴定茶枝柑品种亲缘关系；(4)序列数据的分析和注释：不同茶枝柑品种间，对每一个ssr分子标记pcr扩增子，长度一致时计算为2分，半数长度一致时计为1分，完全不一致时计为0分；得分值越高，与ssr指纹图谱中的品种越相近。10.权利要求1所述的分子标记物组合，权利要求1所述的引物对、权利要求4所述试剂、权利要求5所述试剂盒、权利要求7所述的指纹图谱或权利要求8所述构建方法在茶枝柑品种鉴定中的应用。

技术总结
本发明提供了一组用于鉴别茶枝柑品种的SSR引物组合及其应用，涉及分子生物学和植物品种鉴别技术领域。本发明提供了一组用于鉴别茶枝柑品种的SSR分子标记组合，利用筛选获得的30组SSR分子标记，并依据保守序列设计并验证SSR序列扩增引物，利用PCR和电泳检测技术可对茶枝柑品种快速鉴定，可高效、准确对茶枝柑品系进行鉴定，还提供了一种茶枝柑品种指纹图谱的构建方法，本发明的鉴定方法可以为茶枝柑真伪进行有效监控，减少育种的盲目性，提高了育种的效率，有利于新品种培育，为茶枝柑品种的保护和鉴定提供了依据。的保护和鉴定提供了依据。


技术研发人员：李卫岗 张文生 吴洁珊 陈超 翁福良
受保护的技术使用者：北京师范大学珠海校区
技术研发日：2023.05.24
技术公布日：2023/8/14