一种抗单核巨噬细胞吞噬的纳米载药颗粒及其制备方法和应用

1.本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种抗单核巨噬细胞吞噬的纳米载药颗粒及其制备方法和应用。


背景技术：

2.药物治疗是目前慢性疾病治疗最主要的方法，其中静脉注射给药途径已经成为了当前最为广泛应用的给药方式。静脉注射通常是指通过静脉，将血液、药液、营养液等液体物质，直接注射到静脉中的一种医疗方法。在临床上，静脉注射的优点主要体现在药效起效快、伤害性较小等方面。但静脉注射药物的递送效率低下，有相关研究表明只有不足2％的药物能富集到作用部位，大大降低了药物的治疗效率，并带来了潜在的毒副作用。
3.纳米级药物载体是一种属于纳米级微观范畴的亚微粒药物载体输送系统。将药物包封于亚微粒中，可以调节释药的速度，增加生物膜的透过性、改变在体内的分布，是一种提高药物生物利用度的有效方法。纳米载药体是大小在10—1000nm之间的固态胶体颗粒，一般由天然高分子物质或合成高分子物质构成，可作为传导或输送药物的载体。固体脂质纳米粒是近年来正在发展的一种新型纳米粒给药系统，其中聚乳酸乙醇酸(poly lactic-co-glycolic acid，plga)因其在生物安全性、缓释性和可修饰性的突出优势而受到广泛关注，并已经成功应用在其他学科的临床治疗，如关节内注射plga为载体的曲安奈德制剂可凭借缓释特性显著提高疗效，并减少药物入血带来的副作用。然而，单核巨噬细胞系统作为天然免疫的重要屏障，在肝脏内吞噬消耗了大量的纳米药物载药体，致使其利用率大打折扣。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种抗单核巨噬细胞吞噬的纳米载药颗粒及其制备方法和应用，该纳米载药颗粒减少药物被单核巨噬细胞的吞噬、增加药物疗效，降低毒副作用，克服了现有技术中存在肝脏内单核巨噬细胞系统吞噬消耗了大量的纳米药物的技术瓶颈。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种抗单核巨噬细胞吞噬的纳米载药颗粒，所述纳米载药颗粒包括plga纳米颗粒，以及通过特异性酶切多肽片段连接于所述plga纳米颗粒表面的cd47免疫识别多肽片段；
7.其中，所述plga纳米颗粒用于包载目标药物，所述特异性酶切多肽片段具备在肝脏中被特异性剪切的功能，所述cd47免疫识别多肽片段具有靶向结合单核巨噬细胞sirp-α的功能。
8.优选的是，所述plga纳米颗粒的结构式如式i所示：
[0009][0010]
购买厂家是ponsure生物技术有限公司cas货号26780-50-7。
[0011]
优选的是，所述特异性酶切多肽片段的氨基酸序列为grvglpc。
[0012]
优选的是，所述cd47免疫识别多肽片段的氨基酸序列为cgnytcevteltregetiielk。
[0013]
优选的是，所述目标药物包括用于治疗心血管疾病、糖尿病或性肿瘤的药物。
[0014]
优选的是，所述目标药物包括磷酸肌酸钠，尼可地尔，单硝酸异山梨酯，沙库巴曲缬沙坦，阿霉素，多西他赛，吉西他滨或顺铂。
[0015]
优选的是，所述恶性肿瘤包括乳腺癌、膀胱癌、肺癌。
[0016]
本发明还提供一种所述的纳米载药颗粒的制备方法，包括以下步骤：用plga纳米颗粒包裹目的药物，然后与特异性酶切多肽片段以及cd47免疫识别多肽片段混合，组装成抗单核巨噬细胞吞噬的纳米载药颗粒。
[0017]
优选的是，所述plga纳米颗粒、特异性酶切多肽片段以及cd47免疫识别多肽片段的配比为：1:1:1
[0018]
所述plga纳米颗粒与目标药物的质量比为20:1。
[0019]
本发明还提供所述的纳米载药颗粒在制备治疗心血管疾病、糖尿病或恶性肿瘤的药物中的应用。
[0020]
本发明抗单核巨噬细胞吞噬的纳米载药颗粒抗单核巨噬细胞吞噬原理为：首先，抗单核巨噬细胞吞噬的药物递送纳米颗粒由plga纳米颗粒、特异性酶切多肽片段和cd47免疫识别多肽片段组成，其中cd47片段具靶向结合单核巨噬细胞sirp-α功能，特异性酶切多肽片段能够在肝脏中被特异性剪切，最后将plga纳米颗粒包载的药物成功释放到血液循环中，减少药物被单核巨噬细胞的吞噬、增加药物疗效，降低毒副作用。具体地，药物递送纳米颗粒使用后，迅速富集到肝脏并被单核巨噬细胞识别；随后该药物递送纳米颗粒表面的cd47免疫识别多肽能够与单核巨噬细胞表面sirp-α相结合，并发出“不吃我”指令，与此同时肝脏内高表达的mmps可将cd47免疫识别片段与plga纳米药物载体的链接片段切割，释放plga纳米药物载体到血液循环中发挥生物学功能。
[0021]
本发明公开了以下技术效果：
[0022]
本发明制备的抗单核巨噬细胞吞噬的药物递送纳米颗粒由plga纳米颗粒、特异性酶切多肽片段和cd47免疫识别多肽片段组成。其中，cd47片段具靶向结合单核巨噬细胞sirp-α功能，特异性酶切多肽片段能够在肝脏中被基质金属蛋白酶(mmps)特异性剪切，最后将plga纳米颗粒及包载的药物成功释放到血液循环中，减少药物被单核巨噬细胞的吞噬、增加药物疗效，降低毒副作用。更具体的是通过如下方式实现：
[0023]
(1)本发明制备的药物递送纳米颗粒同时具有与sirp-α特异性结合和被mmps特异性酶切的功能，能够在肝脏内逃逸单核巨噬细胞系统的吞噬作用。通过该药物递送纳米颗
粒递送药物，首先将cd47免疫结合肽与单核巨噬细胞的sirp-α特异性结合，实现“不吃我”信号的传递；其次，特异性酶切多肽在肝脏内通过与mmps响应进行切割，释放纳米载药体。
[0024]
(2)本发明制备的药物递送纳米颗粒递送药物，能够通过逃逸肝脏内单核巨噬细胞系统的吞噬作用，从而提高血液循环内的有效药物浓度，实现疗效提升，并减少在体内产生的副作用。
附图说明
[0025]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0026]
图1是抗单核巨噬细胞吞噬的纳米载药颗粒的设计原理图；
[0027]
图2是实施例1中抗单核巨噬细胞吞噬的纳米载药颗粒随时间变化的尺寸变化；
[0028]
图3是实施例1中抗单核巨噬细胞吞噬的纳米载药颗粒的电镜形态图；
[0029]
图4是实施例1中抗单核巨噬细胞吞噬的纳米载药颗粒的zeta电位图(g1：pp；g2：pp@dox；g3：pp-cd47p；g4：pp@dox-cd47p)；
[0030]
图5是实施例2中抗单核巨噬细胞吞噬的纳米载药颗粒抗巨噬细胞吞噬图；
[0031]
图6是实施例3中抗单核巨噬细胞吞噬的纳米载药颗粒在动物肝脏中的吞噬逃逸能力图；
[0032]
图7是实施例4中各实验组的小动物肿瘤体积变化图；
[0033]
图8是实施例4中各实验组的小动物体重变化图(g1：pbs；g2：pp@dox；g3：pp-cd47p；g4：pp@dox-cd47p)；
[0034]
图9是实施例4中各实验组的小动物生存期变化图(g1：pbs；g2：pp@dox；g3：pp-cd47p；g4：pp@dox-cd47p)。
具体实施方式
[0035]
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0036]
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0037]
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0038]
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多
种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
[0039]
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
[0040]
实施例1抗单核巨噬细胞吞噬的纳米载药颗粒的设计
[0041]
1、纳米药物载体合成
[0042]
①
常温下制备3ml含适量阿霉素(dox)的氯仿溶液(1:1)。
[0043]
②
将购买的带有马来酰亚胺修饰的plga(6kd)-peg(2kd)与上述溶液混合(控制plga-peg与dox质量比为20:1)，通过超声、震荡使溶解均匀。
[0044]
③
常温下制备12ml 1％聚乙烯醇(pva)与d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸(tpgs)质量比为3:1的混合溶液。
[0045]
④
将上述两种溶液混合，在冰浴的条件下选用80w的超声探头持续5min乳化溶液，形成油水(o/w)乳液。
[0046]
⑤
最后，将混合溶液添加到30ml含有0.3％pva的磷酸盐缓冲溶液(ph＝9.0)中，搅拌过夜以挥发氯仿。
[0047]
⑥
用100kd超滤管浓缩得到装载dox的plga-peg纳米球(简称为：pp@dox)，将pp@dox保存在4℃冰箱。
[0048]
上述plga-peg的结构式如下式i所示：
[0049][0050]
2、多肽的合成及共价偶联
[0051]
(1)多肽
[0052]
cd47免疫结合多肽：合成能够靶向识别sirp-α的多肽，氨基酸序列为cgnytc(acm)evteltregetiielk；
[0053]
特异性mmps酶切响应多肽：氨基酸序列为grvglpc。
[0054]
(2)溶液配制
[0055]
脱保护溶剂——六氢吡啶：二甲基甲酰胺(dmf)＝1：4，(v/v)；
[0056]
反应液——n-甲基吗啉(nmm)：dmf＝1：24，(v/v)；
[0057]
裂解液——三氟乙酸(tfa，95％)、三异丙基硅烷(tis，2.5％)、乙二硫醇(edt，2.5％),(v/v/v)；
[0058]
茚三酮测试液——茚三酮、vc、苯酚各一滴；
[0059]
荧光偶联溶剂——吡啶：dmf：二氯甲烷(dcm)＝12：7：5，(v/v)。
[0060]
(3)具体操作方法
[0061]
称量树脂并投入到多肽固相合成管(以下简称反应器)中，加入适量的d
“”
mf溶胀30分钟以上。抽掉dmf，用脱保护液进行fmoc去保护反应，于摇床振荡10min。抽掉脱保护液，
cd47p)具有很高粒径稳定性和良好的多分散性能(见图2)。
[0069]
将1ml终材料溶液转移到亲水性处理的网格上，并在室温下完全干燥。然后，在120kv加速电压下，用透射电子显微镜对样品进行观测成像并测量大小，结果发现其为类圆形纳米颗粒，并具有均匀的形态和分布(见图3)。
[0070]
取适量终材料均匀分散于纯水中，室温下进行操作。通过zeta电位的变化观察了合成过程中的电位变化，这些电位的改变证明多肽被成功连接(见图4)。
[0071]
实施例2抗单核巨噬细胞吞噬的纳米载药颗粒在细胞水平的抗吞噬能力
[0072]
通过体外实验来验证抗单核巨噬细胞吞噬的纳米载药颗粒“不吃我”的特性。通过迈克尔加成反应，将荧光素-5-马来酰亚胺基(f5m)分别与抗单核巨噬细胞吞噬的纳米载药颗粒、另一个非功能序列的肽(cp)连接，分别设置为抗吞噬纳米载药颗粒组和cp组。在激光共聚焦扫描显微镜下，观察了两组不同肽在0.5小时、1小时和4小时与小鼠巨噬细胞raw264.7细胞的共孵育情况，同时用did染料对raw264.7细胞膜进行染色。
[0073]
结果发现，随着时间延长到4小时，可以看到大量的cp被内吞到细胞质，但抗吞噬纳米载药颗粒组表现出持续的对巨噬细胞吞噬作用的抵抗。为了更直观的分析，我们在多次实验后对两组数据进行了统计：相比于cp组，在共孵育4小时后，巨噬细胞对纳米载药颗粒的吞噬与cp相比仍然有72％减少(见图5)。这些结果证实了，抗吞噬纳米载药颗粒可以显著抑制巨噬细胞的内吞作用。
[0074]
实施例3抗单核巨噬细胞吞噬的纳米载药颗粒在动物肝脏内的抗吞噬能力
[0075]
在体外实验结果的基础上，进一步在动物水平评估了抗单核巨噬细胞吞噬的纳米载药颗粒在动物肝脏中的抗吞噬能力。对小鼠进行随机分组，每隔一天注射一次(15mg/kg)，共注射3次。为了最先观察抗单核巨噬细胞吞噬的纳米载药颗粒“不吃我”的特性，在第三次给药后的4小时、12小时和24小时，处死了部分小鼠并切除主要器官(心、肝、脾、肺、肾)，通过活体动物成像仪进行成像观察器官内dox的积聚量。以两种普通纳米颗粒1和普通纳米颗粒2(分别为pp和pp@dox)作为对照
[0076]
结果表明，与2种普通纳米颗粒(pp和pp@dox)相比，抗单核巨噬细胞吞噬的纳米载药颗粒处理组明显减少了dox在肝脏中的积累(见图6)。
[0077]
实施例4抗吞噬纳米载药颗粒的高效低毒验证
[0078]
采用皮下注射法建立ht1197肿瘤裸鼠模型：首先将ht1197细胞进行扩增，根据所需细胞量传代，方法如前所述，然后对细胞进行消化、离心、重悬，用血球计数板进行计数。在雌性balb/c裸鼠进行注射区域的局部消毒，一只手将小鼠固定并充分暴露操作区域。将100μl的pbs溶液(含细胞数为2
×
106个)通过胰岛素注射器注射到balb/c裸鼠的腋后方间隙中，随后可观察到注射部位隆起一个软性类圆形包块，快速拔出注射器并用棉签按压针孔以防治液体漏出，重复操作步骤同时直至所有小鼠全部接种。小鼠的初始体重约为17-18g。当肿瘤生长至单个体积约50mm3时，将肿瘤体积相同的裸鼠分组进行实验。，对小鼠进行随机分组给予治疗。每间隔一日对小鼠的肿瘤体积及体重进行了测量，连续监测28天，对小鼠总存活时间观测至35天。
[0079]
如图7所示，可以看到不同处理组(对照组：pbs；普通纳米颗粒组：pp@dox；抗吞噬组：pp@dox-cd47p)小鼠肿瘤体积的变化，本发明制备的抗吞噬纳米载药颗粒组治疗对肿瘤生长抑制作用明显高于普通纳米颗粒组1，抗吞噬纳米载药颗粒组最终减少了63％的肿瘤
体积。从体重曲线上可以看出，所有组别(g1：pbs；g2：pp@dox；g3：pp-cd47p；g4：pp@dox-cd47p)从体重曲线上看没有明显差异(见图8)。最后，利用记录的数据制作了小鼠存活时间的统计图(见图9)，可以看出：与其他组相比，抗单核巨噬细胞吞噬的纳米载药颗粒明显延长了小鼠的生存时间。
[0080]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种抗单核巨噬细胞吞噬的纳米载药颗粒，其特征在于，所述纳米载药颗粒包括plga纳米颗粒，以及通过特异性酶切多肽片段连接于所述plga纳米颗粒表面的cd47免疫识别多肽片段；其中，所述plga纳米颗粒用于包载目标药物，所述特异性酶切多肽片段具备在肝脏中被特异性剪切的功能，所述cd47免疫识别多肽片段具有靶向结合单核巨噬细胞sirp-α的功能。2.如权利要求1所述的药纳米载药颗粒，其特征在于，所述plga纳米颗粒的结构式如式i所示：3.如权利要求1所述的纳米载药颗粒，其特征在于，所述特异性酶切多肽片段的氨基酸序列为grvglpc。4.如权利要求1所述的纳米载药颗粒，其特征在于，所述cd47免疫识别多肽片段的氨基酸序列为cgnytcevteltregetiielk。5.如权利要求1所述的纳米载药颗粒，其特征在于，所述目标药物包括用于治疗心血管疾病、糖尿病或性肿瘤的药物。6.如权利要求1或5所述的纳米载药颗粒，其特征在于，所述目标药物包括磷酸肌酸钠，尼可地尔，单硝酸异山梨酯，沙库巴曲缬沙坦，阿霉素，多西他赛，吉西他滨或顺铂。7.如权利要求5所述的纳米载药颗粒，其特征在于，所述恶性肿瘤包括乳腺癌、膀胱癌、肺癌。8.一种如权利要求1-7任一项所述的纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：用plga纳米颗粒包裹目的药物，然后与特异性酶切多肽片段以及cd47免疫识别多肽片段混合，组装成抗单核巨噬细胞吞噬的纳米载药颗粒。9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述plga纳米颗粒、特异性酶切多肽片段以及cd47免疫识别多肽片段的配比为：1:1:1。所述plga纳米颗粒与目标药物的质量比为20:1。10.如权利要求1-7任一项所述的纳米载药颗粒在制备治疗心血管疾病、糖尿病或恶性肿瘤的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种抗单核巨噬细胞吞噬的纳米载药颗粒及其制备方法和应用，属于医药技术领域。该纳米载药颗粒包括PLGA纳米颗粒，特异性酶切多肽片段及CD47免疫识别多肽片段；PLGA纳米颗粒包载有目标药物，特异性酶切多肽片段在肝脏中被特异性剪切，CD47免疫识别多肽片段具有靶向结合单核巨噬细胞SIRP-α的功能。本发明通过特定的设计降低治疗药物在肝脏中被单核巨噬细胞系统的截流，通过在肝脏中的特异性响应酶切，将目标药物及其载体进行释放。本发明通过对纳米载药颗粒的设计和适应症的选取，为该纳米载药颗粒的转化和发展提供了新思路，减少药物被单核巨噬细胞的特异性吞噬、增加药物疗效，降低毒副作用。降低毒副作用。降低毒副作用。


技术研发人员：孙驰 赵美惠 白雪 姜婷婷 池彦彤
受保护的技术使用者：哈尔滨医科大学
技术研发日：2023.05.24
技术公布日：2023/8/14