基于平顶照明的高时空分辨多路复用宽场拉曼成像系统及方法

1.本发明涉及光学显微成像技术和光谱成像技术领域，尤其涉及基于平顶照明的高时空分辨多路复用宽场拉曼成像系统及方法。


背景技术：

2.拉曼光谱作为一种无标记的分子指纹光谱，主要用于实现物质分子结构和成分的定性或定量分析。通常，传统拉曼光谱数据是一维的，很难分辨样品空间中不同区域化学信息的差异性和动态变化过程。拉曼光谱成像技术将拉曼光谱技术与光学成像技术结合，可以同时获得包含样品空间信息和光谱信息的高光谱图像，从而实现物质分子的定性、定量和定位分析。然而，经典的逐步扫描成像方法，例如点扫描或线扫描成像方法，对于较大区域的样品扫描时间最快为秒级甚至更慢，同时由于步进扫描方式存在时间延迟和成像误差，成像过程具有严重的时空不同步性，无法对大多数毫秒级时间分辨率的动态变化过程进行研究。
3.幸运地是，宽场成像方法可以解决上述问题，该方法在单次相机曝光时间(毫秒级)内就可直接获得大视场单波长成像信息而具有时空同步性，因此具有高时空分辨率，这对于大多数仅需研究特征拉曼峰的动态体系来说十分适用。对于静态或相对稳定的样品，不仅可以实现特征峰的快速检测，还能通过波长扫描装置在很短时间内获取高光谱图像，成像速度依然比大多数扫描成像技术快。
4.然而，常规的宽场拉曼成像系统中，单个成像探测器无法实现多特征峰的时空同步动态成像比较与分析，这限制了多物种同时分析的可能性。其次，宽场拉曼成像系统的激发光源通常为具有高斯强度分布的激光，其不均匀的激发强度会造成宽场拉曼强度图像中的强度信息来源具有不确定性，不利于存在空间分布异质性、强度波动或动态变化过程的体系研究。同时，不均匀激发强度会产生场依赖的图像质量和光谱信噪比，降低有效成像视场，阻碍了高通量、高质量宽场拉曼成像。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于解决现有技术中的上述问题，提供基于平顶照明的高时空分辨多路复用宽场拉曼成像系统及方法。利用共聚焦激发模式获得高信噪比的拉曼光谱，从而确定样品的拉曼光谱特征峰；利用基于平顶照明的宽场激发模式能够以大视场、均匀强度激发样品，同时以高时空分辨率实现单个拉曼特征峰的快速检测或动态变化过程的监测，还能采集全光谱范围的宽场高光谱图像。此外，通过多路复用宽场成像方式可以实现完全时空同步的多特征峰动态变化监测与比较。本发明解决了扫描成像技术存在的成像速度慢、时空不同步等问题，还解决了激光不均匀强度激发导致的场依赖图像质量与光谱信噪比、受限的有效视场等问题，有利于实现对存在样品空间分布异质性、强度波动或动态变化等体系的准确定量或定性分析，在生物医学、物理化学等领域具有广泛的应用前景。
6.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明涉及一种基于平顶照明的高时空分辨双通道宽场拉曼成像系统，包括光源模块、激光调制模块、共聚焦激发模块、基于平顶照明的宽场激发模块、光谱模块、宽场成像模块和光谱与图像控制模块；
8.所述光源模块，用于选择不同波长的激光；
9.所述激光调制模块，用于实现激光线宽、功率、光束质量和光束大小的调制；
10.所述共聚焦激发模块，用于通过共聚焦方式激发样品产生拉曼散射；
11.所述基于平顶照明的宽场激发模块，用于通过宽场方式以均匀强度激发样品产生拉曼散射；
12.所述光谱模块，用于获得高信噪比的一维拉曼光谱；
13.所述宽场成像模块，用于实现单波长或高光谱宽场拉曼成像以及多路复用的时空同步宽场拉曼成像；
14.所述光谱与图像控制模块，用于控制所述光谱模块的光栅转换和探测器图像采集参数设置，以及用于控制所述宽场成像模块的波长选择与扫描、多通道探测器图像采集和同步触发。
15.优选地，所述光源模块包含两个平行、等高放置的第一和第二高质量单模激光器，激光波长包括但不限于532nm、660nm。
16.优选地，所述激光调制模块中，在第一高质量单模激光器后放置第一激光线滤光片和第一反射镜；在第二高质量单模激光器后放置第二激光线滤光片、二向色镜。
17.优选地，所述激光调制模块中，所述第一或第二高质量单模激光器出射的激光通过二向色镜，然后依次经过可调偏振衰减器、空间滤波器、变倍变焦扩束器和第二反射镜。
18.优选地，所述可调偏振衰减器包括可旋转安装座、消色差或零级半波片、激光或宽带偏振分束立方体、光挡或光阱。
19.优选地，所述空间滤波器包括非球面透镜或物镜、高损伤阈值精密针孔和第一透镜、第一可调光阑。
20.优选地，所述变倍变焦扩束器为消色差变倍变焦扩束器，具有滑动对焦或旋转对焦机制。
21.优选地，所述共聚焦激发模块将不同波长的激光经第一翻转反射镜、第二透镜、第三透镜、第三反射镜、第二翻转反射镜、拉曼滤光片和物镜后到达样品平面激发样品产生拉曼散射。
22.优选地，所述拉曼滤光片包括532nm或660nm边缘滤光片。
23.优选地，所述物镜为空气、水浸或油浸物镜。
24.优选地，所述基于平顶照明的宽场激发模块包括第四反射镜、光束整形器、第四透镜、第五透镜、第六透镜、拉曼滤光片和物镜。
25.优选地，所述光束整形器为可调节激光发散的消色差光束整形器。
26.优选地，所述光谱模块包括显微镜塔轮的反射镜档、第七透镜、第八透镜、可调狭缝、多光栅光谱仪和探测器。
27.优选地，所述多光栅光谱仪包括但不限于300gr/mm、1200gr/mm和1800gr/mm的光栅。
28.优选地，所述探测器为ccd。
29.优选地，所述宽场成像模块包括显微镜塔轮的空档、分束镜、第一宽场成像通道、第五反射镜、第二宽场成像通道。
30.优选地，所述分束镜为50:50或其他分光比例的分束镜。
31.优选地，所述第一宽场成像通道包括依次放置的第一成像透镜、第一波长扫描装置、第一探测器。
32.优选地，所述第一波长扫描装置为液晶可调谐滤光片。
33.优选地，所述第一探测器为emccd或scmos。
34.优选地，所述第二宽场成像通道包括依次放置的第二成像透镜、第二波长扫描装置、第二探测器。
35.优选地，所述第二波长扫描装置为角度可调谐滤光片。
36.优选地，所述第二探测器为emccd或scmos。
37.一种基于平顶照明的高时空分辨多路复用宽场拉曼成像方法，包括以下步骤：
38.(1)通过所述光源模块选择不同波长的激光器，激光波长包括但不限于532nm和660nm；
39.(2)利用所述可调偏振衰减器调节不同波长激光的功率；
40.(3)利用所述变焦变倍扩束器调节不同波长的激光直径；
41.(4)当使用所述共聚焦激发模块时，将所述第一翻转反射镜和所述第二翻转反射镜切入光路，通过适当调节所述变倍变焦扩束器使得激光光束直径能够完全填充所述物镜的通光孔径，用于产生最小聚焦光斑激发样品产生拉曼散射；
42.(5)当使用所述共聚焦激发模块获得拉曼散射信号后，需要将所述显微镜塔轮的反射镜档切入光路，拉曼信号进入所述光谱模块获得高信噪比的一维拉曼光谱，用于确定拉曼光谱特征峰；
43.(6)当使用所述基于平顶照明的宽场激发模块时，将所述第一翻转反射镜和所述第二翻转反射镜切出光路，利用所述变倍变焦扩束器针对不同波长激光设置各自特定的激光光束直径，用于匹配所述光束整形器的光束整形要求并获得平顶光束，平顶光束聚焦到物镜后焦平面或后焦平面附近，通过物镜在样品平面上实现样品的大视场、均匀强度激发；
44.优选地，所述532nm和660nm特定的激光光束直径在6mm～7mm之间；
45.优选地，所述基于平顶照明的宽场激发模块可在样品平面上产生最大约110
×
110μm2有效视场，有效视场范围包括但不限于110
×
110μm2；
46.(7)当使用所述基于平顶照明的宽场激发模块获得拉曼散射信号后，需要将所述显微镜塔轮的空档切入光路，拉曼信号进入第一或第二宽场成像通道快速获取特征峰图像或高光谱图像；
47.(8)当使用所述基于平顶照明的宽场激发模块获得拉曼散射信号后，需要将所述显微镜塔轮的空档切入光路，拉曼信号同时进入第一和第二宽场成像通道实现多通道宽场拉曼成像。
48.相对于现有技术，本发明技术方案取得的有益效果是：
49.(1)本发明采用共聚焦拉曼光谱技术可获得高信噪比的一维拉曼光谱，可以确定更为准确的拉曼光谱特征峰；
50.(2)本发明的高时空分辨宽场拉曼成像技术具有毫秒级成像时间分辨率，可实现单个拉曼特征峰的高通量、高时空分辨动态成像或全光谱范围的快速高光谱成像；
51.(3)本发明的多路复用宽场拉曼成像技术可实现多特征峰的时空同步动态成像比较与分析，以及对多物种分析的复杂体系进行背景扣除；
52.(4)本发明的基于平顶照明的宽场拉曼成像技术可以获得与场无关的图像质量和光谱信噪比，提高有效成像视场，提高了宽场拉曼成像系统的成像通量和质量。
附图说明
53.图1为本发明实施例中的基于平顶照明的高时空分辨多路复用宽场拉曼成像系统的模块图；
54.图2为本发明实施例中的基于平顶照明的高时空分辨多路复用宽场拉曼成像系统的光路结构示意图；
55.图3为图2中拆解的共聚焦激发模式的结构示意图；
56.图4为图2中拆解的基于平顶照明的宽场激发模式的结构示意图；
57.图5为基于平顶照明的高时空分辨多路复用宽场拉曼成像方法的实施步骤图。
具体实施方式
58.为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚、明白，以下结合附图和实施例，对本发明做进一步详细说明。
59.如图1所示，一种基于平顶照明的高时空分辨多路复用宽场拉曼成像系统，包括光源模块、激光调制模块、共聚焦激发模块、光谱模块、基于平顶照明的宽场激发模块、宽场成像模块和光谱与图像控制模块；
60.所述光源模块，用于提供不同波长的激光；
61.所述激光调制模块连接激光调制模块，用于实现激光线宽、功率、光束质量和光束大小的调制；
62.所述共聚焦激发模块连接激光调制模块，用于通过共聚焦方式激发样品产生拉曼散射；
63.所述基于平顶照明的宽场激发模块连接激光调制模块，用于以均匀强度分布的光束通过宽场方式激发样品产生拉曼散射；
64.所述光谱模块连接共聚焦激发模块，用于获得高信噪比的一维拉曼光谱；
65.所述宽场成像模块连接基于平顶照明的宽场激发模块，用于实现单波长或高光谱宽场拉曼成像以及多路复用的时空同步宽场拉曼成像；
66.所述光谱与图像控制模块连接光谱模块和宽场成像模块，用于控制所述光谱模块的光栅转换和探测器图像采集，以及用于控制所述宽场成像模块的波长选择与扫描、多通道探测器图像采集和同步触发。
67.所述光源模块包含不同波长的第一激光器和第二激光器，激光波长包括532nm、660nm。
68.所述激光调制模块包括依次设置在所述第一激光器后的第一激光线滤光片、第一反射镜和所述第二激光器后的第二激光线滤光片、二向色镜、可调偏振衰减器、空间滤波
器、变倍变焦扩束器组件和第二反射镜。
69.所述可调偏振衰减器包括依次设置的旋转半波片、偏振分束立方体和光挡；所述旋转半波片包括可调旋转安装座、半波片；所述可调偏振衰减器用于连续改变入射线偏振激光的s偏振光和p偏振光的比例，s偏振光反射后通过所述光挡吸收，从而实现p偏振光的连续可调衰减。
70.所述空间滤波器用于改善激光光束质量和提高激光椭圆度，其包括依次设置的非球面透镜或物镜、精密针孔、第一透镜和可调光阑；所述可调光阑用于消除高级衍射；所述变倍变焦扩束器组件包括变倍变焦扩束器和可调光阑；变倍变焦扩束器用于调节激光光束大小和激光准直度；可调光阑用于进一步消除高级衍射。
71.所述共聚焦激发模块包括依次设置的第一翻转反射镜、第二透镜、第三透镜、第三反射镜、第二翻转反射镜、拉曼滤光片和物镜。
72.所述基于平顶照明的宽场激发模块包括依次设置的第四反射镜、光束整形器、第四透镜、第五透镜、第六透镜、拉曼滤光片和物镜；所述光束整形器用于将激光转换为平顶光束。
73.所述光谱模块包括依次设置的显微镜塔轮的反射镜档、第七透镜、第八透镜、可调狭缝、多光栅光谱仪和探测器；所述探测器为ccd相机。
74.所述宽场成像模块包括显微镜塔轮的空档、分束镜、第一宽场成像通道、第五反射镜、第二宽场成像通道；所述第一宽场成像通道包括依次放置的第一成像透镜、第一波长扫描装置、第一探测器；所述第二宽场成像通道包括依次放置的第二成像透镜、第二波长扫描装置、第二探测器；所述第一或第二波长扫描装置包括液晶可调谐滤光片和角度可调谐滤光片；所述第一或第二探测器包括emccd相机或scmos相机。
75.具体地，如图2所示，一种基于平顶照明的高时空分辨多路复用宽场拉曼成像系统，当选用激光器1时，激光器1出射的激光经过激光线滤光片2、反射镜3和二向色镜6反射进入系统主光路；当选用激光器4时，激光器4出射的激光经过激光线滤光片5和二向色镜6透射进入系统主光路。不同波长的激光经过由旋转消色差半波片7、宽带偏振分束立方体8和光挡9组成的可调偏振衰减器实现激光功率的调节，然后通过由非球面透镜或物镜10、精密针孔11、透镜12、可调光阑13组成的空间滤波器改善激光的光束质量、提高激光椭圆度和消除高级衍射，然后激光利用变倍变焦扩束器14调节激光光束直径和激光准直度，再利用可调光阑15进一步消除高级衍射，然后激光通过反射镜16进入后续光路，此时利用翻转反射镜17可将激发光路分为两种路径。
76.若将翻转反射镜17切入光路，激光通过透镜18和透镜19调整激光光束直径并延长激光光束的传播距离，激光经过反射镜20反射到同时切入光路的翻转反射镜21上，然后准直的激光经拉曼滤光片22反射到物镜23的后焦平面，通过物镜23在样品平面上产生共聚焦的点光斑激发样品产生拉曼散射，在这个过程中，需要利用样品三维调节平台24调焦和选择样品的感兴趣区域。
77.若将翻转反射镜17、翻转反射镜21切出光路，此时激光将经反射镜25反射后进入光束整形器26，将激光转换为平顶光束，然后平顶光束经过透镜27、透镜28进一步扩大光束直径，提高平顶光束的均匀性并延长平顶光束的传播距离，然后利用透镜29将平顶光束聚焦到物镜23的后焦平面或后焦平面附近，通过物镜23在样品平面上产生准直或散焦的均匀
强度大光斑激发样品产生拉曼散射，在这个过程中，需要利用样品三维调节平台24调焦和选择样品的感兴趣区域。
78.上述不同路径下获得的拉曼散射信号，利用物镜23收集后，通过拉曼滤光片22滤除瑞利散射和杂散光。此时拉曼散射信号会经过显微镜塔轮，显微镜塔轮可将收集光路分为两种路径。
79.若将显微镜塔轮的反射镜档30切入光路，拉曼散射信号通过反射镜反射后，利用透镜31、透镜32对拉曼散射信号进行中继，延长拉曼散射信号的传播，然后利用透镜33将拉曼散射信号聚焦到可调狭缝34上，用于调控光谱分辨率和阻挡杂散光，然后滤波后的拉曼散射信号进入光谱仪35、ccd36实现一维拉曼光谱的采集。
80.若将显微镜塔轮中的空档37切入光路，拉曼散射信号在透镜38和透镜39组成的无限远校正光路中传播，然后经过50:50分束镜后可分为等比例的拉曼散射信号，其中一半拉曼散射信号进入由成像透镜40、液晶可调谐滤光片42、emccd43组成的第一宽场成像通道，另外一半拉曼散射信号通过反射镜44进入由角度可调谐滤光片45、成像透镜46、emccd47组成的第二宽场成像通道，第一或第二宽场成像通道均可实现宽场拉曼成像。
81.最后，在实际操作过程中，可利用计算机48可对光谱仪35、ccd36、液晶可调谐滤光片42、emccd43、角度可调谐滤光片45、emccd47进行控制，从而实现对光谱与图像的采集和控制设置。
82.图3为图2一种基于平顶照明的高时空分辨多路复用宽场拉曼成像系统中拆解的共聚焦激发模式结构示意图。在共聚焦激发模式下，利用光源模块可选择不同波长的激光，然后利用激光调制模块实现激光强度、光束质量和光束直径的调制，再利用所述变倍变焦扩束器14适当调控激光光束直径，确保共聚焦激发模块中的激光能够完全填充物镜23的通光孔径，获得最小聚焦光斑激发样品产生拉曼散射，然后拉曼散射信号进入光谱模块获得高信噪比的一维拉曼光谱，用于确定拉曼光谱特征峰，在这个过程中利用光谱与图像控制模块用于控制所述光谱模块的光栅转换和ccd图像采集参数设置。
83.图4为图2一种基于平顶照明的高时空分辨多路复用宽场拉曼成像系统中拆解的基于平顶照明的宽场激发模式结构示意图。在宽场激发模式下，利用光源模块可选择不同波长的激光，然后利用激光调制模块实现激光强度、光束质量和光束直径的调制，此时需要利用所述变倍变焦扩束器14针对不同波长的激光调节特定的光束直径，以匹配光束整形器26的光束整形要求并获得平顶光束，然后通过所述基于平顶照明的宽场激发模块实现对样品的大视场、均匀强度激发并获得拉曼散射信号，然后拉曼散射信号进入所述宽场成像模块，若仅使用单个宽场成像通道可实现单个拉曼特征峰的高通量、高时空分辨动态成像或全光谱范围的快速高光谱成像，若同时使用两个宽场成像通道可实现多特征峰的时空同步动态成像比较与分析，以及对多物种分析的复杂体系进行背景扣除。在这个过程中利用光谱与图像控制模块用于控制波长的选择与扫描、多通道探测器图像采集和同步触发。
84.如图5所示，一种超快速大视场超分辨率荧光显微成像系统的成像方法，包括以下步骤：
85.(1)通过所述光源模块选择不同波长的激光器，激光波长包括但不限于532nm和660nm；
86.(2)利用所述可调偏振衰减器调节不同波长激光的功率；
87.(3)利用所述变焦变倍扩束器调节不同波长的激光直径；
88.(4)当使用共聚焦激发模式时，将翻转反射镜17和翻转反射镜21切入光路，通过适当调节所述变倍变焦扩束器14使得激光光束直径能够完全填充物镜23的通光孔径，用于产生最小聚焦光斑激发样品产生拉曼散射；
89.(5)当使用共聚焦激发模式获得拉曼散射信号后，将显微镜塔轮的反射镜档30切入光路，拉曼散射信号进入所述光谱模块实现高信噪比的一维拉曼光谱采集；
90.(6)当使用所述基于平顶照明的宽场激发模式时，将翻转反射镜17和翻转反射镜21切出光路，利用变倍变焦扩束器14针对不同波长激光设置各自特定的激光光束直径，用于匹配光束整形器26的光束整形要求并获得平顶光束，平顶光束聚焦到物镜23后焦平面后在样品平面上，然后通过所述基于平顶照明的宽场激发模块实现对样品的大视场、均匀强度激发并获得拉曼散射信号；
91.(7)当使用所述基于平顶照明的宽场激发模块获得拉曼散射信号后，所述显微镜塔轮的空档37切入光路，拉曼散射信号进入宽场成像模块快速获取特征峰图像或高光谱图像，或者实现多通道宽场拉曼成像；
92.(8)在步骤(5)和步骤(7)中，利用计算机48实现对光谱与图像的采集与控制，主要用于控制所述光谱模块的光栅转换和ccd图像采集参数设置，或者用于控制波长的选择与扫描、多通道探测器图像采集和同步触发；
93.综上所述，本发明提供了一种基于平顶照明的高时空分辨多路复用宽场拉曼成像系统及方法，该方法利用共聚焦拉曼光谱光路可获得高信噪比的一维拉曼光谱，可以确定更为准确的拉曼光谱特征峰；该方法利用毫秒级成像时间分辨率的高时空分辨宽场拉曼成像技术可实现单个拉曼特征峰的高通量、高时空分辨动态成像或全光谱范围的快速高光谱成像；该方法利用多路复用宽场拉曼成像技术可实现多特征峰的时空同步动态成像比较与分析，以及对多物种分析的复杂体系进行背景扣除；该方法利用基于平顶照明的宽场拉曼成像技术可以获得与场无关的图像质量和光谱信噪比，提高有效成像视场，提高了宽场拉曼成像系统的成像通量和质量。
94.应当说明的是，上述具体实施例仅进一步说明本发明涉及的一种基于平顶照明的高时空分辨多路复用宽场拉曼成像系统及方法的较优实施例，但本发明并不局限于本实施例，凡是本领域普通技术人员依据本发明的技术实质对以上实施例光路、光学元件或光路切换方式所作的任何简单修改、等效修饰与变化，均属于本发明技术方案的保护范围。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

技术特征：
1.基于平顶照明的高时空分辨多路复用宽场拉曼成像系统及方法，其特征在于：包括光源模块、激光调制模块、共聚焦激发模块、基于平顶照明的宽场激发模块、光谱模块、宽场成像模块和光谱与图像控制模块；所述光源模块，用于提供不同波长的激光；所述激光调制模块连接激光调制模块，用于实现激光线宽、功率、光束质量和光束大小的调制；所述共聚焦激发模块连接激光调制模块，用于通过共聚焦方式激发样品产生拉曼散射；所述基于平顶照明的宽场激发模块连接激光调制模块，用于以均匀强度分布的光束通过宽场方式激发样品产生拉曼散射；所述光谱模块连接共聚焦激发模块，用于获得高信噪比的一维拉曼光谱；所述宽场成像模块连接基于平顶照明的宽场激发模块，用于实现单波长或高光谱宽场拉曼成像以及多路复用的时空同步宽场拉曼成像；所述光谱与图像控制模块连接光谱模块和宽场成像模块，用于控制所述光谱模块的光栅转换和探测器图像采集，以及用于控制所述宽场成像模块的波长选择与扫描、多通道探测器图像采集和同步触发。2.如权利要求1所述的基于平顶照明的高时空分辨多路复用宽场拉曼成像系统及方法，其特征在于：所述光源模块包含不同波长的第一激光器和第二激光器，激光波长包括532nm、660nm。3.如权利要求2所述的基于平顶照明的高时空分辨多路复用宽场拉曼成像系统及方法，其特征在于：所述激光调制模块包括依次设置在所述第一激光器后的第一激光线滤光片、第一反射镜和所述第二激光器后的第二激光线滤光片、二向色镜、可调偏振衰减器、空间滤波器、变倍变焦扩束器组件和第二反射镜。4.如权利要求3所述的基于平顶照明的高时空分辨多路复用宽场拉曼成像系统及方法，其特征在于：所述可调偏振衰减器包括依次设置的旋转半波片、偏振分束立方体和光挡；所述旋转半波片包括可调旋转安装座、半波片；所述可调偏振衰减器用于连续改变入射线偏振激光的s偏振光和p偏振光的比例，s偏振光反射后通过所述光挡吸收，从而实现p偏振光的连续可调衰减。5.如权利要求4所述的基于平顶照明的高时空分辨多路复用宽场拉曼成像系统及方法，其特征在于：所述空间滤波器用于改善激光光束质量和提高激光椭圆度，其包括依次设置的非球面透镜或物镜、精密针孔、第一透镜和可调光阑；所述可调光阑用于消除高级衍射；所述变倍变焦扩束器组件包括变倍变焦扩束器和可调光阑；变倍变焦扩束器用于调节激光光束大小和激光准直度；可调光阑用于进一步消除高级衍射。6.如权利要求1所述的基于平顶照明的高时空分辨多路复用宽场拉曼成像系统及方法，其特征在于：所述共聚焦激发模块包括依次设置的第一翻转反射镜、第二透镜、第三透镜、第三反射镜、第二翻转反射镜、拉曼滤光片和物镜。7.如权利要求1所述的基于平顶照明的高时空分辨多路复用宽场拉曼成像系统及方法，其特征在于：所述基于平顶照明的宽场激发模块包括依次设置的第四反射镜、光束整形器、第四透镜、第五透镜、第六透镜、拉曼滤光片和物镜；所述光束整形器用于将激光转换为
平顶光束。8.如权利要求1所述的基于平顶照明的高时空分辨多路复用宽场拉曼成像系统及方法，其特征在于：所述光谱模块包括依次设置的显微镜塔轮的反射镜档、第七透镜、第八透镜、可调狭缝、多光栅光谱仪和探测器；所述探测器为ccd相机。9.如权利要求1所述的基于平顶照明的高时空分辨多路复用宽场拉曼成像系统及方法，其特征在于：所述宽场成像模块包括显微镜塔轮的空档、分束镜、第一宽场成像通道、第五反射镜、第二宽场成像通道；所述第一宽场成像通道包括依次放置的第一成像透镜、第一波长扫描装置、第一探测器；所述第二宽场成像通道包括依次放置的第二成像透镜、第二波长扫描装置、第二探测器；所述第一或第二波长扫描装置包括液晶可调谐滤光片和角度可调谐滤光片；所述第一或第二探测器包括emccd相机或scmos相机。10.一种基于平顶照明的高时空分辨多路复用宽场拉曼成像方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用光源模块选择不同波长的激光器，激光波长包括532nm和660nm；(2)利用可调偏振衰减器调节不同波长激光的功率；(3)利用变倍变焦扩束器调节不同波长的激光直径；(4)当使用共聚焦激发模块时，切入光路，通过适当调节变倍变焦扩束器使得激光光束直径能够完全填充物镜的通光孔径，用于产生最小聚焦光斑激发样品产生拉曼散射；(5)当使用共聚焦激发模块获得拉曼散射信号后，切入光路，拉曼信号进入光谱模块获得高信噪比的一维拉曼光谱，用于确定拉曼光谱特征峰；(6)当使用基于平顶照明的宽场激发模块时，切出光路，利用变倍变焦扩束器针对不同波长激光设置各自特定的激光光束直径，用于匹配光束整形器的光束整形要求并获得平顶光束，平顶光束聚焦到物镜后焦平面或后焦平面附近，通过物镜在样品平面上实现样品的大视场、均匀强度激发；(7)当使用基于平顶照明的宽场激发模块获得拉曼散射信号后，切入光路，拉曼信号进入单个宽场成像通道快速获取特征峰图像或高光谱图像，用于实现单个特征峰的高通量、高时空分辨动态成像或全光谱范围的高光谱宽场成像；(8)当使用基于平顶照明的宽场激发模块获得拉曼散射信号后，切入光路，拉曼信号同时进入两个宽场成像通道，用于实现多特征峰的时空同步动态成像比较与分析。

技术总结
基于平顶照明的高时空分辨多路复用宽场拉曼成像系统及方法，包括光源模块、激光调制模块、共聚焦激发模块、基于平顶照明的宽场激发模块、光谱模块、宽场成像模块、光谱与图像控制模块。利用共聚焦激发模式获得高信噪比的拉曼光谱确定拉曼光谱特征峰；利用基于平顶照明的宽场激发模式能够以大视场、均匀强度激发样品，同时以高时空分辨率实现单个拉曼特征峰的快速检测或动态变化过程的监测，还能采集全光谱范围的宽场高光谱图像。通过多路复用宽场成像方式实现完全时空同步的多特征峰动态变化监测与比较。有利于实现对存在样品空间分布异质性、强度波动或动态变化等体系的准确定量或定性分析，在生物医学、物理化学等领域具有广泛的应用前景。泛的应用前景。泛的应用前景。


技术研发人员：任斌 周雨生 刘川
受保护的技术使用者：厦门大学
技术研发日：2023.05.22
技术公布日：2023/8/14