一种功能性深度共晶溶剂的制备及其对异甘草苷的提取方法

1.本发明涉及深度共晶溶剂合成与中药提取领域，具体涉及一种深度共晶溶剂的制备的及其对异甘草苷的提取方法。


背景技术：

2.深度共晶溶剂是一种新型的绿色溶剂，具有饱和蒸气压低和对化合物的出色溶解性能、被认为是常规溶剂的绿色替代品。作为萃取剂，深度共晶溶剂可以通过多种组合来调节物理化学性质，以有效地提取不同目标化合物。近年来，深度共晶溶剂作为传统易挥发、有毒有机溶剂的替代品在有机合成、电化学、化学反应、分析化学和分离过程等领域得到了广泛的应用。深度共晶溶剂不仅对环境友好、成本低，而且可增加提取化合物的范围，提高提取总收率，是潜在的优良提取剂之一。与传统有机溶剂相比，深度共晶溶剂具有灵敏度高、不易挥发、用量少、重现性好等优点。因此，近年来关于深度共晶溶剂作为提取溶剂应用于从天然产物中提取高附加值化合物的研究不断增多。其中在深度共晶溶剂的协同作用下从天然产物中提取黄酮类化合物的文献鲜有报道。
3.甘草是具有千年历史的传统中药。例如，在汉代(公元220年)，《伤寒杂病论》中记载了283种含甘草的方剂，常用次数达140次。异甘草苷是从甘草中提取的一种天然活性成分，具有多种生物活性，如抗氧化、肝毒性、抗炎、抗溃疡、抗过敏、抗病毒、抗肿瘤等。因此，异甘草苷越来越受到食品、医疗和保健等领域的重视，具有良好的开发前景。现有的分离方法通常是采用有机溶剂或树脂吸附洗脱从甘草中提取异甘草苷，但甘草中其它化学成分也会被提取出来，之后还需要多次萃取或多种树脂联合应用，并需要大量洗脱吸附质的溶剂。这种多级提取和纯化过程费时较长、成本较高，同时由于有机溶剂具有毒性和挥发性，有机溶剂的使用还可能对环境和人类健康产生危害。因此，开发高效和绿色的提取和纯化方法至关重要。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种深度共晶溶剂的制备的及其对异甘草苷的提取方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.一种功能性深度共晶溶剂的制备及其对异甘草苷的提取方法，包括以下步骤：
7.步骤1：称一定量的生物碱和有机酸按照摩尔比1:1的比例混合后通过减压旋蒸和真空干燥即得深度共晶溶剂；
8.步骤2：将甘草清洗、干燥、粉粹、筛分后，得到所需药粉；
9.步骤3：将步骤1的深度共晶溶剂溶液与步骤2得到的药粉充分混合超声；
10.步骤4：将步骤3得到的提取物离心分离、过滤，即的得到所需异甘草苷提取液。
11.进一步的，所述步骤1中的生物碱和有机酸分别为氯化胆碱和柠檬酸。
12.进一步的，所述步骤1中的减压旋蒸温度是50-70℃。
13.进一步的，所述步骤1中的真空干燥温度是60-80℃，干燥时间为12-48h。
14.进一步的，所述步骤1中的深度共晶溶剂的用kbr压片测定得到的红外吸收光谱在3386.63cm-1
、1731.24cm-1
、1484.1cm-1
、1392.26cm-1
、1192.33cm-1
、1080.55cm-1
、954.89cm-1
。
15.进一步的，所述步骤1中的深度共晶溶剂在dmso中的1hnmr峰分别为2.50、3.42、4.45、5.18和12.39ppm。
16.进一步的，所述步骤1中的深度共晶溶剂在tg-dsc中显示深共晶溶剂的纯度较高，且几乎不含水。
17.进一步的，所述步骤1中的深度共晶溶剂在流变学中显示其可以被描述为一种兼具黏性和塑性的特殊流体，表现出bingham流体的特征。
18.进一步的，所述步骤1中的深度共晶溶剂对铜绿甲单胞菌(p.aeruginosa)，表皮葡萄球菌(s.epidermidis)，大肠杆菌(e.coli)和金黄色葡萄球菌(s.aureus)均有明显的抑制作用。对大肠杆菌(e.coli)的抑制作用最强。
19.进一步的，所述步骤2中的所述的筛分方式是过五号筛。
20.进一步的，所述步骤3中的所述的深度共晶溶剂溶液为50％的氯化胆碱和柠檬酸深度共晶溶剂。
21.进一步的，所述步骤3中的所述的超声时间为30min，超声功率为200w。
22.进一步的，所述步骤4中的所述的异甘草苷提取液的分离方法为hplc分离。
23.进一步的，所述步骤4中的所述的异甘草苷提取液的离心分离，转速为10000～
24.15000r/min，离心时间为15～30min，离心处理温度条件为4～10℃。
25.本发明的有益效果是：
26.(1)本发明采用一种天然的有机酸为配体开发出一种功能性的深度共晶溶剂。
27.(2)本发明利用这种新型的深度共晶溶剂是一种兼具黏性和塑性的特殊流体，表现出bingham流体的特征，能够指导黄酮类化合物的提取工艺，具有很高的应用前景。
28.(3)本发明利用这种新型的深度共晶溶剂从植物、环境样品和中药材等样品中提取生物活性化合物具有很大前景；
29.本发明方法对目标化合物具有选择性和提取收率，萃取率高；环境友好，萃取方法简单易行、产品安全无毒、绿色环保；
附图说明
30.图1是合成氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂的原料药结构图；
31.图2氯化胆碱-柠檬酸深共晶溶剂的合成反应图谱；
32.图3是柠檬酸(a)、氯化胆碱(b)、氯化胆碱-柠檬酸物理混合物(c)、氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂(d)的ft-ir光谱图；
33.图4是氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂(a)、柠檬酸(b)和氯化胆碱(c)的核磁共振谱图；
34.图5是氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂的tg-dsc图谱；
35.图6是氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂的剪切速率/剪切应力(a)和剪切速率与剪切应力(b)的流动曲线图谱；
36.图7水、乙醇、氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂对异甘草苷的提取图；
37.图8是氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂的抑菌活性24h(a)和48h(b)图谱；
38.图9是铜绿假单胞菌(a)、表皮葡萄球菌(b)、埃希氏菌(c)和金黄色葡萄球菌(d)24小时的氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂的抗菌环试验图谱；
39.图10是铜绿假单胞菌(a)、表皮葡萄球菌(b)、埃希氏菌(c)和金黄色葡萄球菌(d)48小时的氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂的抗菌环试验图谱；
40.图11是氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂对hacat细胞的毒性图谱；
41.图12是水、乙醇和深度共晶溶剂对异甘草苷的相对提取率。
具体实施方式
42.以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
43.一种功能性的深度共晶溶剂的制备及其对异甘草苷的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
44.步骤1：称取一定量的氯化胆碱与柠檬酸置于250ml的烧杯中(摩尔比，1:1)，在加入100-200ml注射用水，反应温度控制为50-60℃，在剧烈搅拌条件下反应20h，得到澄清透明的溶液。将澄清溶液于50-70℃下减压旋蒸，并在70-80℃下真空干燥48-72h，即得到氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂，将其放置于干燥器内备用；
45.步骤2：将甘草清洗、干燥、粉碎、在200目筛分后，得到所需药粉；
46.步骤3：采用水，乙醇和深度共晶溶剂提取异甘草苷，比较不同溶剂对异甘草苷的提取率的影响。首先，将甘草样品制成粉末，并在50％氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂中加入一定量的粉末(固液比5-15:1)。在超声波提取30min后，得提取液混合物。
47.步骤4：将提取液混合物离心分离，收集上清液，过spe柱(c18)除去深度共晶溶剂。水洗后再用乙醇洗脱，将收集到的洗脱液氮气吹干，再加乙醇水溶液复溶，再次离心后取上清液得到其药物成分。深度共晶溶剂可以通过减压加热蒸馏回收，从而实现循环使用。离心过程中转速为10000～15000r/min，离心时间为15～45min，离心处理温度条件为4～10℃。
48.实施例1：
49.按照以下步骤合成深度共晶溶剂和提取异甘草苷：
50.步骤1：称取氯化胆碱1396.3mg与柠檬酸1921.4mg置于250ml的烧杯中(摩尔比，1:1)，在加入100ml注射用水，反应温度控制为55℃，在剧烈搅拌条件下反应12h，得到澄清透明的溶液。将澄清溶液于60℃下减压旋蒸，并在75℃下真空干燥24h，即得到氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂；
51.步骤2：将甘草清洗、干燥、粉碎、在200目筛分后，得到所需药粉；
52.步骤3：采用深度共晶溶剂提取异甘草苷，比较不同溶剂对异甘草苷的提取率的影响。首先，将甘草样品制成粉末，并在50％氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂中加入一定量的粉末(固液比5:1)。在超声波提取30min后，得提取液混合物。
53.步骤4：将提取液混合物离心分离，收集上清液，过spe柱(c18)除去深度共晶溶剂。水洗后再用乙醇洗脱，将收集到的洗脱液氮气吹干，再加乙醇水溶液复溶，再次离心后取上清液得到其药物成分。深度共晶溶剂可以通过减压加热蒸馏回收，从而实现循环使用。离心过程中转速为10000r/min，离心时间为45min，离心处理温度条件为4℃。
54.对比例1
55.按照以下步骤提取异甘草苷：
56.步骤1：将甘草清洗、干燥、粉粹、在200目筛分后，得到所需药粉；
57.步骤2：采用水提取异甘草苷首先，将甘草样品制成粉末，并在水中加入一定量的粉末(固液比5:1)。在超声波提取30min后，得提取液混合物。
58.步骤3：将提取液混合物离心分离，收集上清液，过spe柱(c18)除去残留溶剂。水洗后再用乙醇洗脱，将收集到的洗脱液氮气吹干，再加乙醇水溶液复溶，再次离心后取上清液得到其药物成分。离心过程中转速为10000r/min，离心时间为45min，离心处理温度条件为4℃。
59.对比例2
60.按照以下步骤提取异甘草苷：
61.步骤1：将甘草清洗、干燥、粉粹、在200目筛分后，得到所需药粉；
62.步骤2：采用乙醇提取异甘草苷。首先，将甘草样品制成粉末，并乙醇溶剂中加入一定量的粉末(固液比5:1)。在超声波提取30min后，得提取液混合物。
63.步骤3：将提取液混合物离心分离，收集上清液，过spe柱(c18)除去残留溶剂。水洗后再用乙醇洗脱，将收集到的洗脱液氮气吹干，再加乙醇水溶液复溶，再次离心后取上清液得到其药物成分。离心过程中转速为10000r/min，离心时间为45min，离心处理温度条件为4℃。
64.测试例1
65.采用ft-ir研究深度共晶溶剂中各组分之间的分子相互作用。分别将柠檬酸、氯化胆碱、氯化胆碱-柠檬酸物理混合物、氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂与kbr压成薄片，采用傅立叶变换红外光谱仪测定，在4000～400cm-1范围内扫描，扫描的光谱64次，分辨率为4cm-1，使用opus软件记录红外光谱。
66.测试结果：柠檬酸的测试结果如图3a所示，氯化胆碱的测试结果如图3b所示，氯化胆碱-柠檬酸物理混合物的结果如图3c所示，柠檬酸-氯化胆碱深度共晶溶剂的结果如图3d所示。
67.由图可知，氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂的红外光谱波数为：3386.63cm-1
、1731.24cm-1
、1484.1cm-1
、1392.26cm-1
、1192.33cm-1
、1080.55cm-1
、954.89cm-1
。
68.测试例2
69.采用德国公司avanceiiitm hd 600mhz核磁共振波谱仪，氘代试剂作为外标试剂，对所制备的深度共晶溶剂进行分析。具体来说，分别将柠檬酸、氯化胆碱、氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂(2mg)溶解在在dmso中，在将转移到核磁共振管中，在25℃进行分析。
70.测试结果：柠檬酸的测试结果如图4a所示，氯化胆碱的测试结果如图4b所示氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂的结果如图4c所示。
71.由图可知，氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂在dmso中的1h nmr峰分别为2.50、3.42、4.45、5.18和12.39ppm。
72.测试例3
73.采用tg-dsc(tga/dsc,switzerland mettler toledo)同步热分析仪对氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂进行测定。升温速率为10℃/min，深度共晶溶剂测定范围为30-500℃。数据用origin8.0软件分析。
74.测试结果：氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂的结果如图5所示。
75.由图可知，氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂的tg曲线在30-100℃范围内几乎没有失重，并在dsc曲线上几乎没有溶剂残留的蒸发峰。随着温度继续升高，dsc曲线在170-180℃左右处均出现了明显的吸热峰，并且此时的tg曲线处分别出现22.73％和24.41％的失重。随着温度继续升高，dsc曲线在300℃-310℃出现明显的吸热峰，tg曲线失重31.77％。
76.测试例4
77.使用旋转流变仪(malvem instruments ltd,uk)在25℃下进行了测试。简而言之，des以0.3ml的体积放置在底板中，并允许温度稳定5分钟，剪切速率从0.1到100s-1，持续120s，记录50个数据点。
78.测试结果：氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂的结果如图6所示。
79.由图可知，氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂在最初会抵抗流动，直到剪切应力超过一定值。流体开始流动后，剪切应力/剪切速率之间呈线性关系。其截距和斜率分别表示des的屈服应力为1.590pa，剪切黏度为2.774pa.s，表明其为bingham流体的行为。
80.测试例5
81.采用水，乙醇和深度共晶溶剂提取异甘草苷，比较不同溶剂对异甘草苷的提取率的影响。首先，将甘草样品制成粉末，并在50％氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂中加入一定量的粉末(固液比5:1)。在超声波提取30min后，经过滤得到提取液进行含量测定。hplc分析前，两相均用等量水稀释后，用0.22μm膜过滤。采用外标法对样品溶液中的异甘草苷进行分析。
82.测试结果：采用水，乙醇和深度共晶溶剂对异甘草苷的相对提取率分别是69.14％，75.56％和100％(图7，图12)。
83.测试结论：深度共晶溶剂对异甘草苷的相对提取率最好。
84.试验例1
85.氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂的体外抗菌活性研究
86.将氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂溶解于去离子水中，配制成浓度为200，100，50mg/ml的深度共晶溶剂溶液，备用。并将铜绿甲单胞菌(p.aeruginosa)，表皮葡萄球菌(s.epidermidis)，大肠杆菌(escherichia coli)和和金黄色葡萄球菌(s.aureus)四种菌分别置于na平板上培养。将小圆纸片(直径为6.0mm)种植于平板上。在纸片上分别滴加10μl去离子水，10μl不同浓度的深度共晶溶剂。分别于37℃的培养箱孵育24h和48h后测量其抑菌圈的直径，每种菌每个浓度平行操作3次(直径》7mm且p《0.05，表明差异具有统计学意义。
87.结果分析：从图8-10可以发现，去离子水无抑菌圈的产生。与去离子水组相比，在24h和48h的氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂对铜绿甲单胞菌(p.aeruginosa)，表皮葡萄球菌(s.epidermidis)，大肠杆菌(escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(s.aureus)均有明显的抑制作用，p《0.05。在中浓度(100mg/ml)和高浓度(200mg/ml)时，氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂对大肠杆菌(escherichia coli)的抑制作用强度均大于其它3种菌；在低浓度(50mg/ml)时，氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂对铜绿甲单胞菌(p.aeruginosa)，大肠杆菌(escherichia coli)，表皮葡萄球菌(s.epidermidis)和金黄色葡萄球菌(s.aureus)的抑制作用强度相当；在中浓度(100mg/ml)时，氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂对铜绿甲单胞菌(p.aeruginosa)和金黄色葡萄球菌(s.aureus)的抑制作用强度相当；在高浓度(200mg/ml)
时，氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂对金黄色葡萄球菌(s.aureus)的抑制作用强度强于表皮葡萄球菌(s.epidermidis)和铜绿甲单胞菌(p.aeruginosa)的抑制作用强度。综上所述，氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂对铜绿甲单胞菌(p.aeruginosa)，表皮葡萄球菌(s.epidermidis)，大肠杆菌(escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(s.aureus)均有明显的抑制作用。对大肠杆菌(escherichia coli)的抑制作用最强。
88.试验例2
89.氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂生物安全性研究
90.采用mtt法分别评价不同深度共晶溶剂对hacat细胞的安全性。取对数生长期的hacat细胞以每孔1*104个细胞左右的密度接种于96孔板中，每孔加入100μl含10％fbs的dmem培养液，于37℃和5％的co2的培养箱中培养。24h后用移液枪吸去旧培养液，加入含不同浓度的深度共晶溶剂的dmem培养基100μl，于37℃继续培养24h。以不加药物处理的细胞为空白对照组。培养结束后，每孔加入10μl的mtt溶液和90μl的dmem培养基培养4h，加入formazan溶解液，继续培养2h，在570nm的波长下测定od值。以无细胞的培养基相同操作处理作为空白组，对照每个样品3个复孔，按照以下公式计算细胞存活率：cell viability(％)＝(ods-odo)/(odcontrol-odo)*100％。其中，ods为含有细胞和药物培养液的吸光度，odcontrol是含有细胞的空白培养液吸光度，odo是无细胞培养液的吸光度。
91.结果分析：图11显示了不同浓度的氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂对hacat细胞的毒性实验。可以发现，深度共晶溶剂的浓度在3.125-800μg/ml浓度范围内对hacat细胞存活率没有明显的影响，表明氯化胆碱-柠檬酸深度共晶溶剂对hacat细胞安全性良好。此外，与空白细胞组相比，各个浓度的给药组的细胞形态均未发生明显变化，进一步表明，深度共晶溶剂具有较好的生物安全性。
92.以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

技术特征：
1.一种功能性深度共晶溶剂的制备及其对异甘草苷的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：称一定量的生物碱和有机酸按照摩尔比1:1的比例混合后通过减压旋蒸和真空干燥即得深度共晶溶剂；步骤2：将甘草清洗、干燥、粉粹、筛分后，得到所需药粉；步骤3：将步骤1的深度共晶溶剂溶液与步骤2得到的药粉充分混合超声；步骤4：将步骤3得到的提取物离心分离、过滤，即的得到所需含有异甘草苷提取液。2.根据权利1要求的所述的一种功能性深度共晶溶剂的制备及其对异甘草苷的提取方法，其特征在于，所述步骤1中的生物碱和有机酸分别为氯化胆碱和柠檬酸。3.根据权利1要求的所述的一种功能性的深度共晶溶剂的制备及其对异甘草苷的提取方法，其特征在于，所述步骤1中的减压旋蒸温度是50℃-70℃。4.根据权利1要求的所述的一种功能性深度共晶溶剂的制备及其对异甘草苷的提取方法，其特征在于，所述步骤1中的真空干燥温度是60-80℃，干燥时间为12-48h。5.根据权利1要求的所述的一种功能性深度共晶溶剂的制备及其对异甘草苷的提取方法，其特征在于，所述步骤1中的深度共晶溶剂的用kbr压片测定得到的红外吸收光谱在3386.63cm-1
、1731.24cm-1
、1484.1cm-1
、1392.26cm-1
、1192.33cm-1
、1080.55cm-1
、954.89cm-1
。6.根据权利1要求的所述的一种功能性深度共晶溶剂的制备及其对异甘草苷的提取方法，其特征在于，所述步骤2中的所述的筛分方式是过五号筛。7.根据权利1要求的所述的一种功能性深度共晶溶剂的制备及其对异甘草苷的提取方法，其特征在于，所述步骤3中的所述的深度共晶溶剂溶液为50％的氯化胆碱和柠檬酸深度共晶溶剂。8.根据权利1要求的所述的一种功能性深度共晶溶剂的制备及其对异甘草苷的提取方法，其特征在于，所述步骤3中的所述的超声时间为30min，超声功率为200w。9.根据权利1要求的所述的一种功能性深度共晶溶剂的制备及其对异甘草苷的提取方法，其特征在于，所述步骤4中的所述的异甘草苷提取液的分离方法为hplc分离。10.根据权利1要求的所述的一种功能性深度共晶溶剂的制备及其对异甘草苷的提取方法，其特征在于，所述步骤4中的所述的异甘草苷提取液的离心分离，转速为10000～15000r/min，离心时间为15～30min，离心处理温度条件为4～10℃。

技术总结
本发明公开了一种功能性深度共晶溶剂的制备及其对异甘草苷的提取方法，该方法以氯化胆碱和柠檬酸进行深度共晶溶剂的合成，在采用红外光谱，TG-DSC，核磁，流变学对合成深度共晶溶剂进行了表征，并通过抑菌实验和细胞实验对深度共晶溶剂进行了药效学和安全性筛选，最后采用超声提取工艺对异甘草苷进行提取，并通过HPLC对提取物中的异甘草苷进行含量测定。本发明制备出了一种功能性深度共晶溶剂，并对目标化合物具有选择性和提取收率，萃取率高；环境友好，萃取方法简单易行、产品安全无毒、绿色环保。保。


技术研发人员：刘强 胡义 郑泽颖 王著显 梁佩仪 朱红霞 吴煜凡 曾泉富
受保护的技术使用者：南方医科大学
技术研发日：2023.05.22
技术公布日：2023/8/14