近红外二区荧光聚合物及其制备方法和应用、近红外二区荧光成像造影剂及其制备方法与流程

1.本发明涉及一种近红外二区荧光聚合物及其制备方法和应用、近红外二区荧光成像造影剂及其制备方法，属于纳米生物医学成像技术领域。


背景技术：

2.近年来，基于程序性死亡受体(pd-1)及其配体(pd-l1)的免疫检查点疗法已经成功应用于癌症的治疗。通过使用pd-1抗体或pd-l1抗体对程序性死亡受体通路进行阻断，减少癌症的免疫逃逸效应，以此增强病人潜在的抗肿瘤免疫反应，最终可以持续对抗肿瘤的复发与转移。然而，免疫点检查疗法目前仍然存在许多的挑战，比如难以预测患者对治疗的反应和详细了解抗体结合的过程。在当前的临床研究中，通常是利用免疫组织化学检测、断层扫描或荧光成像等手段来预测基于pd的免疫检查点疗法的治疗效果。
3.在有关的成像方式中，光学分子成像可以实现较高的空间分辨率，但基于可见光的传统荧光分子成像在光散射和自发荧光的影响下，效果往往难以令人满意。近红外光因其高穿透性和高灵敏度，已经成为了分子成像领域一种热门的成像技术。当前，已经有许多近红外二区荧光探针被开发出来，用于活体成像，如碳纳米管(cnts)、聚合物包覆有机染料、量子点和稀土掺杂纳米颗粒等。尽管这些材料大大提高了穿透深度并消弱了生物体的自发荧光，但也存在不少缺点，如制备后的再修饰环节效率比较低(例如在针对基于pd的免疫检查点靶向中，pd-l1的修饰产率比较低)，并且还存在生物相容性差、毒性大的问题，这些都限制了其在临床上的应用。
4.现有技术中，申请公布号为cn110760024a的中国发明专利申请公开了一种近红外二区荧光成像聚合物，该近红外二区荧光成像聚合物在制备时，首先使4,9-双(5-溴噻吩-2-基)-6,7-双(4-(己氧基)苯基)-[1,2,5]噻二唑并[3,4-g]喹喔啉与自2-(9,9-双(6-溴己基)-9-芴-2-硼酸酯、2-(9,9-双(6-溴己基)-9h-芴-2-基)噻吩和9-(6-溴己基)-3-(噻吩-2-基)-9,9二氢-4咔唑中任意一种作为电子给体进行反应，得到在近红外二区发光的有机小分子；然后将得到的近红外二区发光的有机小分子与4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸反应得到raft链转移剂修饰的近红外二区荧光成像分子；再将raft链转移剂修饰的近红外二区发光的有机分子与水溶性单体通过raft聚合形成所述近红外二区荧光成像聚合物。该近红外二区荧光成像聚合物具有良好的水溶性和生物相容性，以及较低的毒性。但其共轭主链骨架的共轭键长度较短，用于荧光成像时，存在荧光强度较低，成像分辨率难以满足应用需求。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是提供一种具有较高的荧光强度的近红外二区荧光聚合物。
[0006]
本发明还提供了一种上述近红外二区荧光聚合物的制备方法及在荧光成像中的应用。
[0007]
本发明同时还提供了一种免疫检查点靶向的近红外二区荧光成像造影剂及其制备方法。
[0008]
为了实现以上目的，本发明的近红外二区荧光聚合物所采用的技术方案是：
[0009]
一种近红外二区荧光聚合物，具有如式i所示的结构：
[0010][0011]
式i中，r1为碳原子数为2-8的直链亚烷基，r2为碳原子数为6-12的直链烷氧基，r3为碳原子数为2-6的直链亚烷基，x为10-20，n为20-80，m为1-10。
[0012]
本发明的近红外二区荧光聚合物具有瓶刷型的分子结构，含有聚合物主链以及侧链，其中聚合物主链具有供体和受体结构，能够有效延长共轭骨架中共轭键长度，显著提高聚合物的荧光强度，进而提升活体造影分辨率和对比例度，侧链含有按照特定的次序排列的聚赖氨酸和聚谷氨酸，不仅可以提供大量的氨基、亚氨基和羧基，使近红外二区荧光聚合物具有良好的水溶性，还可以形成有序的多肽结构，实现肿瘤靶向性，进而降低细胞毒性，增强细胞对材料的摄取度，提高材料的富集速率；近红外二区荧光聚合物的上述特性，使得其用于荧光成像时具有病灶快速富集、低毒性、生物代谢性好、高信噪比和高成像清晰度等优点。
[0013]
r1和r3为直链亚烷基可以增强共轭主链的有机溶解性，帮助其在后续反应溶剂中充分溶解，保证后续反应的有效进行。进一步地，式i中，r1为-(ch2)
6-，r2为c6h
13
o-，r3为-ch2ch2ch
2-。
[0014]
上述式i所示的结构与苯环连接的封端基团为该封端基团通过b原子与式i所示的结构连接；与噻吩环连接的封端基团为卤代基，例如为溴基。
[0015]
进一步地，上述式i所示的结构中，x为15，n为20～50，m为5。
[0016]
本发明的近红外二区荧光聚合物的制备方法所采用的技术方案为：
[0017]
一种近红外二区荧光聚合物的制备方法，包括以下步骤：
[0018]
1)将具有式ii所示结构的聚合物与单氨基保护的二氨基烷进行主链聚合物中卤代基的亲核取代反应，然后将反应产物的氨基脱保护，生成化合物a；
[0019][0020]
式ii中，r1为碳原子数为2-8的直链亚烷基，x1为卤代基，r2为碳原子数为6-12的直链烷氧基，x为10-20；
[0021]
2)然后将化合物a与端氨基保护的赖氨酸-nca进行开环酰胺化反应，再将反应产物的氨基脱保护，生成化合物b；
[0022]
3)然后将化合物b与羧基保护的谷氨酸-nca进行开环酰胺化反应，再将反应产物的羧基脱保护，生成所述近红外二区荧光聚合物。
[0023]
本发明的近红外二区荧光聚合物的制备方法，以具有供体-受体结构的具有式ii所示结构的聚合物作为主链，通过两次开环聚合的方式实现用“graft from(引发剂法)”合成出侧链末端含有大量羧基的瓶刷型分子。通过调整具有式ii所示结构的聚合物的聚合度以及调整端氨基保护的赖氨酸-nca和羧基保护的谷氨酸-nca的用量控制接枝的聚合度，实现对分子结构和尺寸等性质的调控，进而可以通过调控肽链长度，实现对靶向性的调节。
[0024]
例如，式ii所示的结构中，与苯环连接的封端基团为与噻吩环连接的封端基团为卤代基，例如为溴基。进一步地，步骤1)中，所述具有式ii所示结构的聚合物是将式iii所示化合物与式iv所示化合物进行铃木偶联反应生成；
[0025][0026]
式iii中，r1为碳原子数为2-8的直链亚烷基，x1为卤代基；
[0027]
式iv中，r2为碳原子数为6-12的直链烷氧基，x2为卤代基。
[0028]
进一步地，r1为直链烷基。
[0029]
进一步地，所述具有式ii所示结构的聚合物的制备方法，包括以下步骤：将式iii所示化合物和式iv所示化合物在相转移催化剂、钯催化剂和碱的作用下于有机溶剂和水的混合溶剂中进行铃木偶联反应。具体地，所述主链聚合物在制备时，可以将式iii所示化合物、式iv所示化合物和相转移催化剂溶解在有机溶剂中，然后加入碱的水溶液、钯催化剂在惰性气氛中进行铃木偶联反应。加入碱的水溶液前后对体系进行除氧处理，除氧处理后再加入钯催化剂。所述除氧处理是在体系中通入氮气进行鼓泡。所述铃木偶联反应的温度为75～85℃，例如为80℃，铃木偶联反应的时间为16～20h，例如为18h。所述铃木偶联反应采用的相转移催化剂优选为四丁基溴化铵，钯催化剂优选为四(三苯基膦)钯，碱优选为碳酸钾，有机溶剂优选为甲苯。所述铃木偶联反应在保护气氛中进行，例如在氮气保护中进行。
[0030]
进一步地，所述具有式ii所示结构的聚合物的制备方法，还包括以下步骤：将铃木偶联反应后的体系在石油醚中进行沉降处理。通过将铃木偶联反应后的体系在石油醚中进行沉降处理，可以实现对主链聚合物的提纯。
[0031]
更进一步地，式iii中，r1为亚己基，x1为-br。式iv中，r2为碳原子数为6的直链烷氧基，x2为-br，此时式iv化合物为4,9-双(5-溴噻吩-2-基)-6,7-双(4-(己氧基)苯基)-[1,2,5]噻二唑并[3,4-g]喹喔啉。进一步地，式iii所示化合物与式iv化合物的摩尔比为1:1。
[0032]
进一步地，式iii所示化合物是将式v所示化合物与双联频哪醇基二硼进行交叉偶联反应生成；
[0033][0034]
式v中，r1为碳原子数为2-8的直链亚烷基，x1为卤代基，x3为卤代基。进一步地，x1为-br，x3为-br。
[0035]
进一步地，所述交叉偶联反应的温度为85～95℃，例如为90℃，交叉偶联反应的时间为22～26h，例如为24h。进一步地，式iii化合物的制备方法，包括以下步骤：将式v所示化合物与双联频哪醇基二硼在相转移催化剂和钯催化剂的作用下于有机溶剂中进行交叉偶联反应生成。所述相转移催化剂优选为乙酸钾。所述交叉偶联反应采用的钯催化剂优选为双(四三苯基膦)二氯化钯。所述交叉偶联反应采用的有机溶剂优选为1,4-二氧六环。所述交叉偶联反应优选在搅拌条件下进行。所述交叉偶联反应在保护气氛中进行，例如在氮气保护下进行。上述式iii所示化合物的制备方法，还包括以下步骤：交叉偶联反应结束后，将反应后的体系除去溶剂后，得到粗品；再将粗品溶解在食盐水中用二氯甲烷进行萃取，再通过硅胶柱色谱层析法进行提纯。
[0036]
进一步地，式v所示化合物与双联频哪醇基二硼的摩尔比为1:1。
[0037]
将具有式ii所示结构的聚合物与端氨基保护的赖氨酸-nca进行开环酰胺化反应前，先将具有式ii所示结构的聚合物与单氨基保护的二氨基丙烷进行反应延长支链可以减少后续聚合单体反应时的位阻。进一步地，所述二氨基烷中碳原子的个数为2-6，两个氨基分别位于二氨基烷碳链的两端。例如所述二氨基烷为二氨基丙烷，所述单氨基保护的二氨基烷为n-叔丁基氧羰基-1,3-二氨基丙烷。
[0038]
进一步地，步骤1)中，所述亲核取代反应在有机溶剂中进行；所采用的有机溶剂为乙腈和四氢呋喃；所述乙腈和四氢呋喃的体积比为0.8～1.2:1，例如为1:1。所述亲和取代反应在室温下进行，亲核取代反应的时间为10～14h，例如为12h。所述亲核取代反应在搅拌条件下进行。亲核取代反应结束后将反应体系除去溶剂后在乙醚中进行沉降，得到反应产物的固体。
[0039]
进一步地，步骤1)中，将亲核取代反应的反应产物的氨基脱保护是将反应产物溶解在有机溶剂中，加入三氟乙酸在室温下进行反应；氨基脱保护后除去反应体系中的溶剂得到化合物a的固体；所采用的有机溶剂优选为二氯甲烷；优选采用旋蒸的方式除去反应体系中的溶剂；氨基脱除保护在搅拌条件下进行。加入三氟乙酸在室温下进行反应的时间为16～20h，例如为18h。
[0040]
进一步地，步骤2)中，所述开环酰胺化反应在催化剂的作用下于有机溶剂中进行，也就是说将化合物a、端氨基保护的赖氨酸-nca在催化剂的作用下于有机溶剂中进行所述开环酰胺化反应。步骤2)开环酰胺化反应结束后，将反应体系在乙醚中进行沉降，得到反应产物的固体。
[0041]
步骤2)中，开环酰胺化反应采用催化剂为硫脲，有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺。化合物a和硫脲的质量之比为1:10～25。每1g化合物a对应采用的有机溶剂的体积为75～150ml步骤2)中，所述开环酰胺化反应在保护气氛中进行，例如在氮气保护中进行。步骤2)
中，开环酰胺化反应的时间为70～75h，例如为72h。
[0042]
进一步地，步骤2)中，将开环酰胺化反应的反应产物的氨基脱保护是将反应产物溶解于甲醇和氢氧化钠溶液的混合物进行反应；反应结束后将反应体系置于透析袋中并置于稀盐酸中进行透析，透析结束后将透析袋内物水溶液进行干燥去除水分，得到化合物b的固体，例如可以采用冷冻干燥的方式去除水分。
[0043]
进一步地，所述甲醇与氢氧化钠溶液体积比为3:8～12，例如为3:10。所述氢氧化钠溶液的浓度为0.3～0.5mmol/ml，例如为0.4mmol/ml。所述稀盐酸是将浓度为0.15～0.25mol/l的盐酸与水按照质量比为2～4:500的比例混合得到，例如是将浓度为0.2mol/l的盐酸与水按照质量比为3:500的比例混合得到。
[0044]
进一步地，化合物a和端氨基保护的赖氨酸-nca的质量之比为0.2:4～10，例如为0.2:6。所述端氨基保护的赖氨酸-nca优选为赖氨酸(三氟乙酰基)-nca。
[0045]
进一步地，步骤3)中，所述开环酰胺化反应在催化剂的作用下于有机溶剂中进行，也就是说将化合物b与羧基保护的谷氨酸-nca在催化剂的作用下于有机溶剂中进行所述开环酰胺化反应。步骤3)开环酰胺化反应结束后，将反应体系在乙醚中进行沉降，得到反应产物的固体。
[0046]
步骤3)中，所述开环酰胺化反应采用的催化剂为硫脲，有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺。硫脲的质量与化合物b的质量之比为0.15～0.2:3～8。每1g化合物b对应采用的有机溶剂的体积为100～400ml。步骤3)中，所述开环酰胺化反应在保护气氛中进行，例如在氮气保护中进行。步骤3)中，开环酰胺化反应的时间为70～75h，例如为72h。
[0047]
进一步地，步骤3)中，将反应产物的羧基脱保护是将反应产物溶解于二氯乙酸中，再加入含有33wt％氢溴酸(hbr)的醋酸溶液进行反应；反应结束后将反应体系进行浓缩后在乙醚中进行沉降，即可得到所述近红外二区荧光聚合物的固体。
[0048]
进一步地，化合物b与羧基保护的谷氨酸-nca的质量之比为1:5.5～20。所述羧基保护的谷氨酸-nca优选为5-苄基酯谷氨酸-nca，即谷氨酸(苄基)-nca。
[0049]
进一步地，步骤2)和步骤3)中，开环酰胺化反应均在搅拌条件下进行，脱保护的反应也均在搅拌条件下进行。
[0050]
本发明的近红外二区荧光聚合物的应用所采用的技术方案为：
[0051]
上述的近红外二区荧光聚合物的制备方法制得的近红外二区荧光聚合物在荧光成像中的应用。
[0052]
本发明的近红外二区荧光聚合物在荧光成像中的应用，具有良好的水溶性和较高的近红外二区荧光成像强度，能够显著提高近红外二区荧光成像效果。
[0053]
本发明的免疫检查点靶向的近红外二区荧光成像造影剂所采用的技术方案为：
[0054]
本发明的免疫检查点靶向的近红外二区荧光成像造影剂，是将上述的近红外二区荧光聚合物上的羧基与带有氨基的免疫检查点抗体上的氨基进行偶联反应形成。
[0055]
本发明的免疫检查点靶向的近红外二区荧光成像造影剂，在近红外二区荧光聚合物的支链末修饰免疫检查点抗体，能够实现造影剂对免疫检查点的靶向功能。
[0056]
进一步地，所述带有氨基的免疫检查点抗体为带有氨基的pd-l1抗体。
[0057]
本发明的免疫检查点靶向的近红外二区荧光成像造影剂的制备方法所采用的技术方案为：
[0058]
本发明的免疫检查点靶向的近红外二区荧光成像造影剂的制备方法，包括以下步骤：将上述所述的近红外二区荧光聚合物溶解在酸缓冲溶液中，然后加入活化剂活化近红外二区荧光聚合物的羧基，再将带有氨基的免疫检查点抗体加入体系中进行带有氨基的免疫检查点的氨基与近红外二区荧光聚合物活化后的羧基进行偶联反应，生成免疫检查点靶向的近红外二区荧光成像瓶刷型分子造影剂。
[0059]
本发明制备的近红外二区荧光成像造影剂不仅具有良好的水溶性和优异的近红外二区荧光成像效果，修饰在近红外二区荧光聚合物支链末端的免疫检查点抗体还可使造影剂对相应的肿瘤进行有效地靶向，并能有可能同时起到免疫检查点治疗的效果，有着很好的应用前景。
[0060]
进一步地，所述缓冲溶液为2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液(mes)。所述2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲液的浓度优选为0.3～22mg/ml，例如为21.3mg/ml，即100mmol/l。
[0061]
进一步地，所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/n-羟基丁二酰亚胺体系。
[0062]
进一步地，所述带有氨基的免疫检查点抗体为带有氨基的pd-l1抗体。以在近红外二区荧光聚合物的支链末端偶联pd-l1抗体可以使本发明制得的造影剂对ct26肿瘤进行有效地靶向。
[0063]
进一步地，所述偶联反应的温度为37℃，时间为≥16h。
[0064]
进一步地，上述近红外二区荧光成像造影剂的制备方法，还包括以下步骤：将偶联反应所得体系进行透析，超滤后离心，收集上清液。透析时采用的透析膜或透析袋的分子量≥3000。
附图说明
[0065]
图1为实施例4～6中所采用的主链聚合物的吸收与发射光谱图；
[0066]
图2为实施例4～6中制得的分子刷的核磁共振氢谱图；
[0067]
图3为实施例4～6中制得的分子刷的透射电镜照片；
[0068]
图4为实施例4～6中制得的分子刷的的动态光散射测得的流体力学直径示意图；
[0069]
图5为实施例4～6中制得的分子刷的的吸收光谱图；
[0070]
图6为实施例4～6中制得的分子刷的的发射光谱图；
[0071]
图7为实施例4～6中制得的分子刷和近红外二区荧光聚合物的凝胶渗透色谱图；
[0072]
图8为实施例4～6中制得的近红外二区荧光聚合物的核磁共振氢谱图；
[0073]
图9为实施例4～6中制得的近红外二区荧光聚合物的透射电镜照片；
[0074]
图10为实施例4～6中制得的近红外二区荧光聚合物的动态光散射测得的流体力学直径示意图；
[0075]
图11为实施例4～6中制得的近红外二区荧光聚合物的吸收光谱图；
[0076]
图12为实施例4～6中制得的近红外二区荧光聚合物的发射光谱图；
[0077]
图13为实施例4～6中制得的近红外二区荧光聚合物；
[0078]
图14为实施例8中免疫检查点靶向的近红外二区荧光成像造影剂的合成示意图。
具体实施方式
[0079]
以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明。
[0080]
实施例1
[0081]
本实施例的近红外二区荧光聚合物具有如下所示的结构：
[0082][0083]
其中，x约为15，n约为20，m约为5。本实施例的近红外二区荧光聚合物采用实施例4的制备方法制得。
[0084]
实施例2
[0085]
本实施例的近红外二区荧光聚合物具有如下所示的结构：
[0086][0087]
其中，x约为15，n约为30，m约为5。本实施例的近红外二区荧光聚合物采用实施例5的制备方法制得。
[0088]
实施例3
[0089]
本实施例的近红外二区荧光聚合物具有如下所示的结构：
[0090][0091]
其中，x约为15，n约为50，m约为5。本实施例的近红外二区荧光聚合物采用实施例6的制备方法制得。
[0092]
以下实施例4～6中采用的主链聚合物采用包括以下步骤的方法制得：
[0093]
在氮气保护下向250ml的烧瓶中加入2,7-双溴-9,9-双(6-溴己基)芴(4g)、双联频哪醇基二硼(11g)、乙酸钾(2.75g)和双(四三苯基膦)二氯化钯(0.4g)。用注射器加入1,4-二氧六环(60ml)后在90℃下搅拌24小时。反应结束后待体系冷却至室温，通过旋蒸的方法除去溶剂，之后将所剩固体溶解在食盐水中用二氯甲烷多次萃取。最后通过硅胶柱色谱层析法提纯得到供体分子(2.8g)。
[0094]
在避光环境下，在烧瓶中加入供体分子(350mg)、受体分子4,9-双(5-溴噻吩-2-基)-6,7-双(4-(己氧基)苯基)-[1,2,5]噻二唑并[3,4-g]喹喔啉(400mg)和四丁基溴化铵(30mg)。用甲苯(10ml)溶解上述固体后，通入氮气鼓泡20分钟以上，接着加入碳酸钾溶液(0.3mg/ml，5ml)继续鼓泡10分钟以上。快速向烧瓶中加入四(三苯基膦)钯(50mg)，在氮气保护下将烧瓶置于80℃的条件中反应18小时。之后再石油醚中反复沉降得到棕色的近红外二区荧光主链聚合物(620mg)。
[0095]
合成路线为：
[0096][0097]
其中，x约为15。
[0098]
以四氢呋喃作为有机溶剂，配置浓度为1mg/ml的主链聚合物的有机溶液，测试其吸收与发射光谱图，如图1所示，可以看出其吸收峰位于772纳米波段，在808纳米激光激发下其在900-1200纳米波段表现出荧光信号。
[0099]
实施例4
[0100]
本实施例的近红外二区荧光聚合物的制备方法，包括以下步骤：
[0101]
1)分子刷一的合成
[0102]
将主链聚合物(200mg)和n-碳酸叔丁基-1,3-二氨基丙烷(150mg)溶于乙腈(10ml)和四氢呋喃(10ml)的混合溶液中。接着在室温下搅拌12小时，旋蒸除去溶剂后多次在乙醚中进行沉降，将得到的固体溶于二氯甲烷(6ml)中。向上述溶液中加入三氟乙酸(6ml)后，在室温下搅拌18小时，旋蒸除去溶剂和脱除的保护基，得共轭聚合物固体产物，纯度大于95％。
[0103]
将所得共轭聚合物固体(0.2g)、赖氨酸(三氟乙酰基)-nca(4g)和硫脲(2g)溶于n,n-二甲基甲酰胺(15ml)中。在氮气保护下将以上混合溶液搅拌72小时。反应结束后在乙醚中沉降，将沉降所得固体溶解在甲醇(3ml)和氢氧化钠溶液(0.4mmol/ml，10ml)组成的混合溶液中搅拌8小时。接着将溶液置于分子量大于3000的透析袋中，并置于稀盐酸(将浓度为0.2mol/l的盐酸与水按照质量比为3:500的比例混合得到)中进行透析，透析结束后将透析袋内物水溶液进行冻干去除水分，得到分子刷一(680mg)的固体。
[0104]
合成路线为：
[0105][0106]
其中，x约为15，n约为20。
[0107]
2)瓶刷型分子一的合成
[0108]
将分子刷一(200mg)、硫脲(3g)和谷氨酸(苄基)-nca(1.1g)溶于n,n-二甲基甲酰
胺(20ml)中，在氮气保护下搅拌72小时。之后再乙醚中沉降得到固体。将上述固体产物(100mg)在50℃下溶于二氯乙酸(10ml)中，再加入含有33％氢溴酸的醋酸溶液(5ml)继续搅拌4小时，然后再室温下静置过夜。将上述反应液蒸发浓缩，在乙醚中沉降得到瓶刷型分子一(57mg)。
[0109]
合成路线为：
[0110][0111]
其中，x约为15，n约为20，m约为5。
[0112]
实施例5
[0113]
本实施例的近红外二区荧光聚合物的制备方法，包括以下步骤：
[0114]
1)分子刷二的合成
[0115]
将主链聚合物(200mg)和n-碳酸叔丁基-1,3-二氨基丙烷(150mg)溶于乙腈(10ml)和四氢呋喃(10ml)的混合溶液中。接着在室温下搅拌12小时，旋蒸除去溶剂多次沉降后，将得到的固体溶于二氯甲烷(6ml)中。向上述溶液中加入三氟乙酸(6ml)后，在室温下搅拌18小时，旋蒸除去溶剂。
[0116]
将所得固体(0.2g)、赖氨酸(三氟乙酰基)-nca(6g)和硫脲(3g)溶于n,n-二甲基甲酰胺(20ml)中。在氮气保护下将以上混合溶液搅拌72小时。反应结束后在乙醚中沉降，将沉降所得固体溶解在甲醇(3ml)和氢氧化钠溶液(0.4mmol/ml，10ml)组成的混合溶液中搅拌8小时。接着将溶液置于透析袋中，并置于hcl：water＝3:500的溶液中透析。最后冻干得到分子刷二(930mg)的固体。
[0117]
合成路线为：
[0118][0119]
其中，x约为15，n约为30。
[0120]
2)瓶刷型分子二的合成
[0121]
将分子刷二(200mg)、硫脲(4.5g)和谷氨酸(苄基)-nca(1.8g)溶于n,n-二甲基甲酰胺(30ml)中，在氮气保护下搅拌72小时。之后再乙醚中沉降得到固体。将上述固体产物(100mg)在50℃下溶于二氯乙酸(10ml)中，再加入含有33％氢溴酸的醋酸溶液(5ml)继续搅拌4小时，然后再室温下静置过夜。将上述反应液蒸发浓缩，在乙醚中沉降得到瓶刷型分子二(70mg)。
[0122]
合成路线为：
[0123][0124]
其中，x约为15，n约为30，m约为5。
[0125]
实施例6
[0126]
本实施例的近红外二区荧光聚合物的制备方法，包括以下步骤：
[0127]
1)分子刷三的合成
[0128]
将主链聚合物(200mg)和n-碳酸叔丁基-1,3-二氨基丙烷(150mg)溶于乙腈(10ml)和四氢呋喃(10ml)的混合溶液中。接着在室温下搅拌12小时，旋蒸除去溶剂多次沉降后，将得到的固体溶于二氯甲烷(6ml)中。向上述溶液中加入三氟乙酸(6ml)后，在室温下搅拌18
小时，旋蒸除去溶剂。
[0129]
将所得固体(0.2g)、赖氨酸(三氟乙酰基)-nca(10g)和硫脲(5g)溶于n,n-二甲基甲酰胺(30ml)中。在氮气保护下将以上混合溶液搅拌72小时。反应结束后在乙醚中沉降，将沉降所得固体溶解在甲醇(5ml)和氢氧化钠溶液(0.4mmol/ml，20ml)组成的混合溶液中搅拌8小时。接着将溶液置于透析袋中，并置于hcl：water＝3:500的溶液中透析。最后冻干得到分子刷三(1.15g)的固体。
[0130]
合成路线为：
[0131][0132]
其中，x约为15，n约为50。
[0133]
2)瓶刷型分子三的合成
[0134]
将分子刷三(150mg)、硫脲(8g)和谷氨酸(苄基)-nca(3g)溶于n,n-二甲基甲酰胺(60ml)中，在氮气保护下搅拌72小时。之后再乙醚中沉降得到固体。将上述固体产物(80mg)在50℃下溶于二氯乙酸(10ml)中，再加入含有33％氢溴酸的醋酸溶液(5ml)继续搅拌4小时，然后再室温下静置过夜。将上述反应液蒸发浓缩，在乙醚中沉降得到瓶刷型分子三(50mg)。
[0135]
合成路线为：
[0136][0137]
其中，x约为15，n约为50，m约为5。
[0138]
实施例7
[0139]
本实施例的免疫检查点靶向的近红外二区荧光成像造影剂，是将上述实施例4～6任意一个实施例中制备的近红外二区荧光聚合物上的羧基与带有氨基的pd-l1抗体上的氨基进行偶联反应形成。
[0140]
实施例8
[0141]
本实施例的免疫检查点靶向的近红外二区荧光成像造影剂的制备方法，包括以下步骤：
[0142]
将实施例2中制备的近红外二区荧光聚合物(20mg)溶于的2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(100mmol/l，10ml)，接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(80mg)和n-羟基丁二酰亚胺(120mg)。将上述溶液在37℃下搅拌15分钟。接着加入带有氨基的pd-l1抗体在37℃下搅拌16小时，最后将体系置于透析袋(透析袋的分子量为大于10000)中并放置在纯水中于4℃的环境中透析去除小分子化合物，通过超滤离心，收集上清液得到免疫检查点靶向的近红外二区荧光成像造影剂。免疫检查点靶向的近红外二区荧光成像造影剂的合成示意图见图14。
[0143]
实验例1
[0144]
1)分别对实施例4～6中制备的分子刷一、分子刷二和分子刷三化合物进行核磁共振波谱检测，得到分子刷一、分子刷二和分子刷三的核磁共振氢谱图，如图2所示，可看到分子刷一、分子刷二和分子刷三的赖氨酸侧链的特征质子信号。
[0145]
2)分别将实施例1～3中制得的分子刷一、分子刷二和分子刷三配制浓度为1mg/ml的分子刷一的水溶液、浓度为1mg/ml的分子刷二的水溶液、浓度为1mg/ml的分子刷三的水溶液。
[0146]
i)采用透射电镜对各水溶液进行分析，所得的透射电镜图如图3所示，由图3可知，分子刷一、分子刷二和分子刷三的粒径大小均约为80纳米。
[0147]
ii)基于配制的分子刷一的水溶液、分子刷二的水溶液和分子刷三的水溶液，根据动态光散射测得：分子刷一在水中的平均流体力学直径约为102纳米，分子刷二在水中的平均流体力学直径约为90纳米，分子刷三在水中的平均流体力学直径约为90纳米，所得的各分子流体力学体积图如图4所示。
[0148]
iii)基于配制的分子刷一的水溶液、分子刷二的水溶液和分子刷三的水溶液，分别测试分子刷一、分子刷二和分子刷三的吸收与发射光谱图，结果如图5与图6所示，可以看出：分子刷一的吸收峰位于810纳米波段，在808纳米激光激发下其发射峰位于在1078纳米波段；分子刷二的吸收峰位于810纳米波段，在808纳米激光激发下其发射峰位于在1078纳米波段；分子刷三的吸收峰位于810纳米波段，在808纳米激光激发下其发射峰位于在1078纳米波段。
[0149]
实验例2
[0150]
1)分别对实施例4～6中制备的瓶刷型分子一、瓶刷型分子二、瓶刷型分子三进行核磁共振波谱检测，得到瓶刷型分子一、瓶刷型分子二和瓶刷型分子三的核磁共振氢谱图，如图8所示，可看到瓶刷型分子一、瓶刷型分子二、瓶刷型分子三的谷氨酸侧链的特征质子信号。
[0151]
2)分别将实施例4～6中制备的瓶刷型分子一、瓶刷型分子二和瓶刷型分子三溶解
在0.2mol/l的碳酸氢钠水溶液中，配制成浓度1mg/ml的瓶刷型分子一的碳酸氢钠水溶液、浓度为1mg/ml的瓶刷型分子二的碳酸氢钠水溶液和浓度为1mg/ml的瓶刷型分子三的碳酸氢钠水溶液。
[0152]
i)采用透射电镜对各水溶液进行分析，所得的透射电镜图如图9所示。由图9可知，瓶刷型分子一的粒径大小约为85纳米、瓶刷型分子二的粒径大小约为90纳米、瓶刷型分子三的粒径大小约为90纳米。
[0153]
ii)基于配制的瓶刷型分子一的碳酸氢钠水溶液、瓶刷型分子二的碳酸氢钠水溶液和瓶刷型分子三的碳酸氢钠水溶液，根据动态光散射测得：瓶刷型分子一在水中的平均流体力学直径约为100纳米，瓶刷型分子二在水中的平均流体力学直径约为100纳米，瓶刷型分子三在水中的平均流体力学直径约为100纳米，所得各分子流体力学体积图如图10所示。
[0154]
iii)基于配制的瓶刷型分子一的碳酸氢钠水溶液、瓶刷型分子二的碳酸氢钠水溶液和瓶刷型分子三的碳酸氢钠水溶液，测定瓶刷型分子一、瓶刷型分子二和瓶刷型分子三的吸收与发射光谱图，如图11与图12所示，可以看出：瓶刷型分子一的吸收峰位于738纳米波段，在808纳米激光激发下其发射峰位于在1075纳米波段，瓶刷型分子二的吸收峰位于738纳米波段，在808纳米激光激发下其发射峰位于在1090纳米波段；瓶刷型分子三的吸收峰位于738纳米波段，在808纳米激光激发下其发射峰位于在1085纳米波段。
[0155]
2)分别将实施例4～6中制备的分子刷一、瓶刷型分子一、分子刷二、瓶刷型分子二、分子刷三和瓶刷型分子三溶解在四氢呋喃中，分别得到浓度为1mg/ml的分子刷一的有机溶液、浓度为1mg/ml的瓶刷型分子一的有机溶液、浓度为1mg/ml的分子刷二的有机溶液、浓度为1mg/ml的瓶刷型分子二的有机溶液、浓度为1mg/ml的分子刷三的有机溶液、浓度为1mg/ml的瓶刷型分子三的有机溶液。
[0156]
基于配制的各有机溶液，按照聚合物在分离柱上按分子流体力学体积大小被分离开的方法，测试分子刷一、瓶刷型分子一、分子刷二、瓶刷型分子二、分子刷三、瓶刷型分子三的凝胶渗透色谱，结果如图7所示，可以看出：分子刷一位于分子量最小的位置，分子刷二位于分子量较小的位置，分子刷三位于分子量中等的位置、瓶刷型分子一位于分子量中等的位置、瓶刷型分子二位于分子量较大的位置、瓶刷型分子三位于分子量最大的位置。
[0157]
实验例3
[0158]
分别利用实施例5中制备的近红外二区荧光成像造影剂和制备的瓶刷型分子二，配制含有3mg/ml具有免疫检查点靶向功能的瓶刷型分子的细胞培养液和3mg/ml瓶刷型分子二的细胞培养液，分别用以上两种培养液与有较高免疫检查点(pd-l1)表达的小鼠结肠癌细胞培养2小时，然后采用近红外二区荧光成像仪进行观察，如图13所示。近红外二区荧光聚合物组没有明显的荧光信号，而具有免疫检查点靶向功能的瓶刷型分子组的小鼠出现了较明显的荧光信号，证明了其经过修饰后的靶向性。

技术特征：
1.一种近红外二区荧光聚合物，其特征在于：具有如式i所示的结构：式i中，r1为碳原子数为2-8的直链亚烷基，r2为碳原子数为6-12的直链烷氧基，r3为碳原子数为2-6的直链亚烷基，x为10-20，n为20-80，m为1-10。2.根据权利要求1所述的近红外二区荧光聚合物，其特征在于：式i中，r1为-(ch2)
6-，r2为c6h
13
o-，r3为-ch2ch2ch
2-。3.一种如权利要求1所述的近红外二区荧光聚合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)将具有式ii所示结构的聚合物与单氨基保护的二氨基烷进行主链聚合物中卤代基的亲核取代反应，然后将反应产物的氨基脱保护，生成化合物a；
式ii中，r1为碳原子数为2-8的直链亚烷基，x1为卤代基，r2为碳原子数为6-12的直链烷氧基，x为10-20；2)然后将化合物a与端氨基保护的赖氨酸-nca进行开环酰胺化反应，再将反应产物的氨基脱保护，生成化合物b；3)然后将化合物b与羧基保护的谷氨酸-nca进行开环酰胺化反应，再将反应产物的羧基脱保护，生成所述近红外二区荧光聚合物。4.根据权利要求3所述的近红外二区荧光聚合物的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述具有式ii所示结构的聚合物是将式iii所示化合物与式iv所示化合物进行铃木偶联反应生成；式iii中，r1为碳原子数为2-8的直链亚烷基，x1为卤代基；
式iv中，r2为碳原子数为6-12的直链烷氧基，x2为卤代基。5.根据权利要求4所述的近红外二区荧光聚合物的制备方法，其特征在于：式iii所示化合物是将式v所示化合物与双联频哪醇基二硼进行交叉偶联反应生成；式v中，r1为碳原子数为2-8的直链亚烷基，x1为卤代基，x3为卤代基。6.一种如权利要求1或2所述的近红外二区荧光聚合物在荧光成像中的应用。7.一种免疫检查点靶向的近红外二区荧光成像造影剂，其特征在于：所述近红外二区荧光成像造影剂是将如权利要求1所述的近红外二区荧光聚合物上的羧基与带有氨基的免疫检查点抗体上的氨基进行偶联反应形成。8.根据权利要求7所述的免疫检查点靶向的近红外二区荧光成像造影剂，其特征在于：所述带有氨基的免疫检查点抗体为带有氨基的pd-l1抗体。9.一种如权利要求7或8所述的免疫检查点靶向的近红外二区荧光成像造影剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将上述所述的近红外二区荧光聚合物溶解在酸缓冲溶液中，然后加入活化剂活化近红外二区荧光聚合物的羧基，再将带有氨基的免疫检查点抗体加入体系中进行带有氨基的免疫检查点的氨基与近红外二区荧光聚合物活化后的羧基进行偶联反应，生成免疫检查点靶向的近红外二区荧光成像瓶刷型分子造影剂。10.根据权利要求9所述的免疫检查点靶向的近红外二区荧光成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述缓冲溶液为2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液；所述2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲液的浓度为0.3～20mg/ml。

技术总结
本发明涉及一种近红外二区荧光聚合物及其制备方法和应用、近红外二区荧光成像造影剂及其制备方法，属于纳米生物医学成像技术领域。本发明的聚合物具有如式I所示的结构。该近红外二区荧光聚合物，含有聚合物主链以及侧链，其中聚合物主链具有供体和受体结构，能够显著提高聚合物的荧光强度，提升活体造影分辨率和对比度，侧链含有按照特定顺序排列的聚赖氨酸和聚谷氨酸，不仅可以提供大量的氨基、亚氨基和羧基，使聚合物具有良好的水溶性，还可以形成有序的多肽结构；该聚合物的上述特性，使得其用于荧光成像时具有提高信噪比和和成像清晰度优点。像清晰度优点。像清晰度优点。


技术研发人员：卢晓梅 李力
受保护的技术使用者：郑州中科生物医学工程技术研究院
技术研发日：2023.05.16
技术公布日：2023/8/14