一种规模化培养人二倍体细胞制备F基因型腮腺炎减毒活疫苗的方法

一种规模化培养人二倍体细胞制备f基因型腮腺炎减毒活疫苗的方法
技术领域
1.本发明涉及疫苗制备技术领域，尤其涉及一种规模化培养人二倍体细胞制备f基因型腮腺炎减毒活疫苗的方法。


背景技术：

2.流行性腮腺炎是由腮腺炎病毒感染导致的急性呼吸道传染病，通过空气传播，主要发生在儿童和青少年人群。流行性腮腺炎发病率高，传染性强，其并发症可感染中枢神经系统导致死亡。自20世纪60年代以来，随着腮腺炎减毒活疫苗的广泛应用，腮腺炎感染已得到有效控制。腮腺炎病毒分为12个基因型，腮腺炎病毒基因型分布具有明显的地域性，在欧洲流行株主要是a、c、d、g、h，美洲的主要流行株是c、d、d、g、h、j、k，亚洲地区的主要流行株为b、f、i、l，当前主要流行毒株是f基因型。目前，全球范围内正在使用的减毒活疫苗主要是a基因。本发明是利用我所自主筛选分离的f基因型腮腺炎毒种sp-a株接种于人二倍体细胞制备腮腺炎减毒活疫苗，相较于目前已上市的腮腺炎疫苗更加安全有效。
3.近年来，随着市场对疫苗和治疗性蛋白类生物制品的需求量增加及产品质量的严格要求，大规模细胞培养技术的应用凸显其安全性、经济性、有效性。f基因型腮腺炎减毒毒种sp-a株对kmb-17细胞株具有一定的敏感性，故kmb-17细胞株可以作为腮腺炎减毒活疫苗生产的细胞基质。因kmb-17是贴壁依赖型细胞而且生长缓慢，故利用固定床生物反应器，片状载体作为贴壁介质提供了细胞最佳的培养条件，可建立合适的大规模培养体系，实现细胞高密度培养和产物高效表达。
4.因此，利用固定床生物反应器培养人二倍体细胞生产腮腺炎减毒活疫苗，是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种大规模培养人二倍体细胞生产腮腺炎减毒活疫苗的方法，利用固定床生物反应器代替传统的细胞工厂，可大规模培养人二倍体细胞生产腮腺炎减毒活疫苗。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一种大规模培养人二倍体细胞生产腮腺炎减毒活疫苗的方法，包括如下步骤：
8.(1)将人二倍体细胞接种至生物反应器中进行细胞培养；设置生物反应器的培养参数为ph 7.2、do 50％、转速40rpm、温度37.0℃，待生物反应器参数稳定后，将细胞接种至反应器中。接种密度为2～3
×
105个/ml，培养体积为5l。细胞培养的时间为4～6d。
9.(2)向所述生物反应器接种腺炎病毒株后进行病毒培养；设置生物反应器的培养参数为ph 7.8、do 50％、转速40rpm、温度37.0℃，待生物反应器参数稳定后，按moi 0.03接种f基因型腮腺炎病毒毒种，病毒培养的时间为10d。每天取样检测病毒滴度。
10.(3)待病毒培养结束，收集上清液即为病毒收获液。
11.(4)病毒收获液经过滤得到疫苗原液。
12.(5)在疫苗原液中加入等体积的冻干稳定剂得到半成品。
13.(6)将所得疫苗半成品按0.6ml/瓶分装于西林瓶中，冻干得到成品。
14.与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
15.(1)本发明在固定床生物反应器中，利用片状载体作为贴壁介质提供了最佳的培养条件，能实现腮腺炎病毒的大规模生产。
16.(2)本发明有产量大、成本低、质量稳定等优点，可在短时间内生产制备得到大量的腮腺炎病毒活疫苗，可替代传统细胞工厂的培养模式。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
18.图1为f基因型腮腺炎病毒培养过程的病毒滴度(202201批为实施例，202202和202203为对比例)。
具体实施方式
19.本发明提供了一种大规模培养人二倍体细胞生产腮腺炎减毒活疫苗的方法，包括如下步骤：
20.(1)将人二倍体细胞接种至生物反应器中进行细胞培养；设置生物反应器的培养参数为ph 7.2、do 50％、转速40rpm、温度37.0℃，待生物反应器参数稳定后，将细胞接种至反应器中。接种密度为2～3
×
105个/ml，优选为2.5
×
105个/ml。培养体积为5l。细胞培养的时间为4～6d，优选为5d。
21.(2)向所述生物反应器接种腺炎病毒株后进行病毒培养；细胞培养结束，达到的细胞量为35～50
×
108个，优选为细胞量不少于40
×
108个进行病毒培养。腺炎病毒株的moi为0.005～0.03；优选为moi 0.01计算病毒量进行接种培养。培养的时间为10d，优选为5～6d。
22.(3)待病毒培养结束，收集上清液即为病毒收获液。
23.(4)病毒收获液经过滤得到疫苗原液，病毒收获液按下述顺序进行过滤：收获液
→
10μm滤器
→
原液收集罐。
24.(5)在疫苗原液中加入等体积的冻干稳定剂得到半成品。
25.(6)将所得疫苗半成品按0.6ml/瓶分装于西林瓶中，冻干后得到成品。
26.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
27.实施例1
28.利用5l篮式生物反应器进行细胞培养和腮腺炎病毒培养(记为202201批次)
29.1.步骤
30.1.1预处理80g片状载体(培养体积5l，因此片状载体浓度为16g/l)
31.1.1准备5l篮式生物反应器，121℃灭菌15min，加入5l含有10％新生牛血清的mem培养基，进行预培养。
32.1.2设置生物反应器的培养参数为ph 7.2、do 50％、转速40rpm、温度37.0℃，待生物反应器参数稳定后，接种kmb-17细胞，接种密度为25
×
104/ml。
33.1.3细胞培养
34.1.3细胞进生物反应器30min后取样观察计数。培养至24h改转速为50rpm。培养至48h用10％nbs mem以5l/d进行灌流培养至96h。96h后用0％nbs mem以10l/d进行灌流培养至120h。每天监测细胞代谢情况。
35.1.4病毒培养
36.1.4培养至120h后将生物反应器中的培养基更换为4l病毒维持液，每1l病毒维持液含有6.6％nahco340ml，3％谷氨酰胺20ml和mem培养基940ml，待参数稳定后(ph 7.8、do50％、转速50rpm、温度37.0℃)补加含毒种的1l病毒维持液继续培养10天(腮腺炎病毒f基因型sp-a株毒种，毒种滴度6.25，moi为0.03)。每天取样检测滴度，第10天病毒培养结束。
37.结果：202201批细胞接种至反应器中取样观察细胞状态良好，进罐30min后取样观察计数，上清游离细胞2
×
104/ml，即细胞的贴壁率为92％。培养至24h取样上清无游离细胞。结果见表1，细胞生长至96h细胞最大量为41.2
×
108。
38.表1：202201批细胞的生长情况
[0039][0040]
对比例1记为202202批次
[0041]
其他方法与实施例1完全相同，区别仅在于，腮腺炎病毒f基因型sp-a株毒种的moi为0.02。
[0042]
结果：202202批细胞接种至反应器中取样观察细胞状态良好，进罐30min后取样观察计数，上清无游离细胞，即细胞的贴壁率为100％。根据细胞的代谢数据计算每天的葡萄量消耗量及细胞总量，结果见表2；细胞生长至120h其细胞量为41.17
×
108。
[0043]
表2：202202批细胞的生长情况
[0044][0045]
对比例2记为202203批次
[0046]
其他方法与实施例1完全相同，区别仅在于，腮腺炎病毒f基因型sp-a株毒种的moi为0.01。
[0047]
结果：202203批细胞接种至发酵罐中取样观察细胞状态良好，进罐30min后取样观察计数，上清游离细胞3
×
104/ml，即细胞的贴壁率为88％。培养至24h取样上清无游离细
胞。结果见表3；细胞生长至96h细胞最大量为42
×
108。
[0048]
表3：202203批细胞的生长情况
[0049][0050]
对实施例1，对比例1及对比例2得到的腮腺炎病毒液的滴度进行测定，结果如图1所示。
[0051]
三种不同moi接种病毒所得到的腮腺炎病毒收获液的滴度均较高，moi为0.03，收获液最高的滴度为7.5igccid
50
/ml；moi为0.02，收获液最高的滴度为7.625igccid
50
/ml；moi为0.01，收获液最高的滴度为7.5igccid
50
/ml。细胞工厂所得到的收获液最高的滴度为7.125igccid
50
/ml。相比较利用反应器规模化培养人二倍体细胞制备f基因型腮腺炎减毒活疫苗在收获液制备阶段具有明显的优势。后续步骤无改变。
[0052]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种规模化培养人二倍体细胞制备f基因型腮腺炎减毒活疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将人二倍体细胞接种至生物反应器中进行细胞培养；(2)向所述生物反应器接种腮腺炎病毒进行病毒培养；(3)收获液制备；(4)疫苗原液制备；(5)疫苗半成品制备；(6)疫苗成品制备。2.根据权利要求1所述的一种大规模培养人二倍体细胞生产腮腺炎减毒活疫苗的方法，其特征在于，步骤(1)所述人二倍体细胞的接种密度为2～3
×
105个/ml；步骤(1)所述细胞培养的时间为4～6d；所述细胞培养的ph7.2
±
0.2。3.根据权利要求1所述的一种大规模培养人二倍体细胞生产腮腺炎减毒活疫苗的方法，其特征在于，步骤(1)所述细胞培养结束其细胞量为35～45
×
108个。4.根据权利要求1所述的一种大规模培养人二倍体细胞生产腮腺炎减毒活疫苗的方法，其特征在于，步骤(2)所述腮腺炎病毒株的接种moi为0.01～0.03。5.根据权利要求1所述的一种大规模培养人二倍体细胞生产腮腺炎减毒活疫苗的方法，其特征在于，步骤(2)所述病毒培养的时间为4～7d；病毒培养的ph7.8
±
0.2。6.根据权利要求1所述的一种大规模培养人二倍体细胞生产腮腺炎减毒活疫苗的方法，其特征在于，步骤(3)所述病毒培养结束，收集上清液即为病毒收获液。7.根据权利要求1所述的一种大规模培养人二倍体细胞生产腮腺炎减毒活疫苗的方法，其特征在于，步骤(4)所述病毒收获液经过滤去除细胞碎片即为疫苗原液。8.根据权利要求1所述的一种大规模培养人二倍体细胞生产腮腺炎减毒活疫苗的方法，其特征在于，步骤(5)所述在疫苗原液中加入等量冻干保护剂，混匀即为疫苗半成品。9.根据权利要求1所述的一种大规模培养人二倍体细胞生产腮腺炎减毒活疫苗的方法，其特征在于，步骤(6)所述疫苗半成品经分装、冻干得到的即为腮腺炎减毒活疫苗成品。10.根据权利要求1所述的一种大规模培养人二倍体细胞生产腮腺炎减毒活疫苗的方法，其特征在于，步骤(2)所述腮腺炎病毒株的滴度为5.5～6.5；所述腮腺炎病毒株为腮腺炎病毒f基因型sp-a株。

技术总结
本发明涉及疫苗制备技术领域，尤其涉及一种大规模培养人二倍体细胞生产腮腺炎减毒活疫苗的方法。本发明提供了一种大规模培养人二倍体细胞生产腮腺炎减毒活疫苗的方法，包括如下步骤：(1)将人二倍体细胞接种至生物反应器中进行培养；(2)向所述生物反应器接种腮腺炎病毒后继续培养；(3)收获液制备；(4)疫苗原液制备；(5)疫苗半成品制备；(6)疫苗成品制备。本发明利用固定床生物反应器代替传统的细胞工厂，可实现利用生物反应器规模化培养人二倍体细胞生产腮腺炎减毒活疫苗。细胞生产腮腺炎减毒活疫苗。细胞生产腮腺炎减毒活疫苗。


技术研发人员：杨净思 王微 王晶晶 平玲 杨振清 邱恒
受保护的技术使用者：中国医学科学院医学生物学研究所
技术研发日：2023.05.11
技术公布日：2023/8/14