大青叶水提取物在抑制青枯病菌中的应用

1.本发明属于病害防治技术领域，具体涉及一种大青叶水提取物在抑制青枯病菌中的应用。


背景技术：

2.青枯病是一种由青枯病菌引起的一类毁灭性土传病害，此病菌可危害44个科300多种植物，广泛分布于热带、亚热带和温带地区，该病害危害较重分布较广的寄主主要有马铃薯、番茄、烟草、茄子、辣椒、花生、姜、香蕉、甘茹、麻等。细菌性青枯病是危害最大，分布最广，损失最重的植物病害之一，近年来，随着全球性气候变化，气温上升，细菌性青枯病的危害逐年加重，成为一些地区农业生产主要障碍。
3.早期针对作物青枯病的防治，国内外专家在抗病品种选育、化学防治、农业措施等方面进行了大量的研究，但仍存在一些问题，如品种抗病性能低，抗性易丧失，化学防治药剂后期防效差，病菌易产生抗药性，且容易造成环境污染与作物药剂残留。随着人们生活质量的提高和环保意识的增强.开发对人畜安全、无污染、低毒、低残留的生物农药已成为农药领域研究的新热点。植物源农药作为生物合理性农药的一部分，其开发研究一直是新农药研究的热点课题之一。植物源农药来源于自然，能在自然界降解，一般不会污染环境及农产品，在环境和人体中积累毒性的可能性不大，对人和牲畜相对安全，对害虫天敌伤害小，具有低毒、低残留的特点，能够保持农产品的高品质，因此植物源农药具有广阔的市场。
4.cn101828578a公开了一种水茄提取物及其提取方法和应用。该发明提取方法包括如下步骤：取水茄的植株，干燥后粉碎，加入乙酸乙酯进行提取，通过过滤、分离，得到水茄提取液。用药后，茄子青枯病的发病率低于10％，发病植株表现为1级（即整个植株有1～2片枯萎）。
5.cn111387183a公开了一种赖百当类化合物在防治作物青枯病中的应用，该发明防治的青枯病为番茄青枯病。14天进行第一次病情调查发病率为3.33%～20.0%之间，21天进行第二次病情调查，发病率为6.67%～26.7%之间。
6.cn104247719a公开了一种公丁香提取物在防治烟草青枯病方面的应用，公丁香提取物对烟草青枯病有较好的防治效果，稀释200倍（5g/l）对烟草青枯病防效与农用硫酸链霉素相当，稀释400倍（2.5g/l）防效仍达67.02。
7.大青叶，为十字花科植物菘蓝的干燥叶片，主产于内蒙古、陕西、甘肃、河北、山东、江苏、浙江、安徽、贵州等地。其主要化学成分包括菘蓝叶含色氨酸、靛玉红b、葡萄糖芸苔素、新葡萄糖芸苔素、葡萄糖芸苔素-1-磺酸盐及靛蓝。药理学研究表明，菘蓝叶对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌均有一定抑制作用；大青叶对乙肝表面抗原以及流感病毒亚甲型均有抑制作用。但是，目前尚未见到大青叶水提取物在抑制青枯病菌相关的报道。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种大青叶水提取物在抑
制青枯病菌中的应用。
9.本发明所采取的技术方案是：本发明提供大青叶水提取物在制备青枯病菌抑制剂中的应用。
10.在一些实例中，所述大青叶水提取物的制备方法为：将大青叶烘干粉碎过筛，加入纯水混合进行多次抽滤，最后合并滤液浓缩即得到所述大青叶水提取物。
11.在一些实例中，所述每次抽滤中，纯水加入量为大青叶或前一步抽滤所得到的滤渣的体积的4.9～5.1倍。
12.在一些实例中，所述抽滤次数为4～6次。
13.在一些实例中，所述抽滤温度为45～55℃。
14.在一些实例中，所述抽滤时间为1.4～1.6h。
15.在一些实例中，所述浓缩温度为45～55℃。
16.在一些实例中，所述大青叶水提取物的制备方法为：将大青叶烘干粉碎过筛，加入大青叶4.9～5.1倍的纯水混合在45～55℃抽滤1.4～1.6h，重复4～6次，每次抽滤补充的纯水量为滤渣体积的4.9～5.1倍，最后合并滤液，45～55℃浓缩即得到所述大青叶水提取物。
17.在一些实例中，所述抑制剂为水乳制剂或微乳制剂。
18.本发明提供一种植物青枯病的防治方法，包括使用大青叶水提取物沾根或灌根；在植物发病初期，用大青叶水提取物对植株进行灌根。
19.本发明的有益效果是：本发明发现大青叶水提取物对青枯病菌具有抑制作用和减轻青枯病的发生，为防治青枯病提供简便、有效、无公害的新方法，而且大青叶价格合适、处理方便，在农业生产中具有良好的应用前景。
附图说明
20.图1为浓度为14.8g/ml的大青叶纯水提取物抑菌实验结果图。
21.图2为浓度为11.87g/ml的大青叶纯水提取物抑菌实验结果图。
22.图3为浓度为7.4g/ml的大青叶纯水提取物抑菌实验结果图。
23.图4为浓度为3.7g/ml的大青叶纯水提取物抑菌实验结果图。
24.图5为浓度为1.85g/ml的大青叶纯水提取物抑菌实验结果图。
25.图6为浓度为7.40g/ml的大青叶乙醇提取物抑菌实验结果图。
26.图7为浓度为3.70g/ml的大青叶乙醇提取物抑菌实验结果图。
27.图8为浓度为1.85g/ml的大青叶乙醇提取物抑菌实验结果图。
28.图9为浓度为0.74g/ml的大青叶乙醇提取物抑菌实验结果图。
29.图10为浓度为0.37g/ml的大青叶乙醇提取物抑菌实验结果图。
30.其中，图6～图10中，1为提取液产生的抑菌圈，2为纯水产生的抑菌圈，3为溶剂产生的抑菌圈，4为链霉素产生的抑菌圈。
具体实施方式
31.下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方案。
32.实施例11）大青叶纯水提取物制备
大青叶纯水提取物采用冷浸法，将大青叶烘干，用粉碎机粉碎后过60目筛。称取大青叶37g。将称好的植物材料混合加入5倍体积的纯水，超声（温度50℃）振荡1.5h后，进行抽滤（滤纸），将滤渣再次加入5倍体积的纯水进行提取，3次后合并滤液。把滤液用旋转蒸发仪在50℃进行浓缩，完全旋干后，用2.5ml纯水进行溶解，将溶液保存在4℃冰箱中待用，溶液浓度为14.8g/ml。
33.2）药剂配制将大青叶水提取物配置成浓度为14.8g/ml、11.87g/ml、7.4g/ml、3.7g/ml、1.85g/ml。
34.3）抑菌实验供试病原菌青枯菌为毒性较强的茄科劳尔氏菌（r.solanacearum）。培养好的青枯菌与 50%的甘油 1:1 混合贮存于-80 ℃冰箱内。
35.培养基包括cpg琼脂培养基和cpg液体培养基，分别高压灭菌处理20min，具体组成如下：cpg琼脂培养基：细菌学蛋白胨 10 g/l，葡萄糖 10 g/l，酪蛋白水解物 1 g/l，琼脂粉 18 g/l；cpg液体培养基：细菌学蛋白胨 10 g/l，葡萄糖 10 g/l，酪蛋白水解物 1 g/l。
36.取10mlcpg液体培养基倒入离心管中，将保存在-80℃冰箱中的青枯菌解冻后取200μl加入倒好的液体培养基中，在28℃与220rmp条件下摇床过夜培养。取过夜培养的菌液200μl加入液体培养基中28℃ 220rmp摇床培养12小时摇好后，放入4℃冰箱待用。
37.在超净工作台上进行无菌操作，cpg培养基凉至约50℃时与青枯菌（浓度为od
600
=0.05）混合倒于培养皿中，待培养基全部凝固，用直径0.5cm的打孔器在cpg培养基上打孔，在孔中依次加入不同浓度的40μl大青叶水提取物、40μl纯水（每个处理3个重复）。4℃预扩散2h后置于28℃环境条件下培养至长满培养基。
38.观察抑菌圈大小并用十字交叉法对抑菌圈直径进行测量求直径平均，3个菌落再次取平均，抑菌圈大小即为抗菌活性大小，分为4个等级：无抑菌圈
“‑”
，抑菌圈直径小于1.0cm为“+”，抑菌圈直径1.1-1.5cm为“++”，抑菌圈直径大于1.5cm为“+++”。
39.抑菌圈大小=实际测量抑菌圈直径-0.5cm。
40.4）实验结果采用单层平板法测定提取液抑菌效果，实验结果见表1和图1～图5。
41.表1浓度（g/ml）抑菌圈直径（平均值
±
标准误）/cm多重比较抑菌圈大小14.801.72
±
0.08a+++11.841.41
±
0.01b++7.401.42
±
0.04b++3.701.07
±
0.01c+1.850d-从表1中可以看出当大青叶水提取物浓度为14.80g/ml时，抑菌圈最大为1.72cm；当浓度为11.84g/ml时，抑菌圈直径为1.41cm，仅次于14.80g/ml。整体呈现出随着浓度降低抑菌圈直径逐渐减小的趋势，ec50值为2.63 g/ml。纯水处理不产生抑菌圈，符合实验预期。
42.对比例1）大青叶乙醇提取物制备
大青叶乙醇粗提物采用冷浸法，将大青叶烘干，用粉碎机粉碎后过60目筛。称取大青叶37g。将称好的植物材料混合加入5倍体积的95%的乙醇，超声（温度40℃）振荡1.5h后，进行抽滤（滤纸），将滤渣再次加入5倍体积的乙醇进行提取，3次后合并滤液。把滤液用旋转蒸发仪在45℃进行浓缩，完全旋干后，用5ml95%乙醇进行溶解，将溶液保存在4℃冰箱中待用，溶液浓度为7.4g/ml。
43.2）药剂配制将大青叶乙醇提取物配置成浓度为7.4g/ml、3.7g/ml、1.85g/ml、0.74g/ml、0.37g/ml。
44.3）抑菌实验供试病原菌青枯菌为毒性较强的茄科劳尔氏菌（r.solanacearum）。培养好的青枯菌与 50%的甘油 1:1 混合贮存于-80 ℃冰箱内。
45.培养基包括cpg琼脂培养基和cpg液体培养基，分别高压灭菌处理20min，具体组成如下：cpg琼脂培养基：细菌学蛋白胨 10 g/l，葡萄糖 10 g/l，酪蛋白水解物 1 g/l，琼脂粉 18 g/l；cpg液体培养基：细菌学蛋白胨 10 g/l，葡萄糖 10 g/l，酪蛋白水解物 1 g/l。
46.采用的是单层平板法，将灭菌好的cpg培养基取20ml加入到培养皿中，待其全部凝固后向其中加入100μl青枯菌液（od
600
=0.1）均匀涂布。晾干后用0.5cm的打孔器打孔，在cpg培养基上以正方形的形状打孔，在孔中依次加入不同等浓度的40μl大青叶乙醇提取物、40μl不同浓度的溶剂、40μl纯水、40μl链霉素（每个处理3个重复）。4℃预扩散2h后置于28℃环境条件下培养直至细菌长满。观察抑菌圈大小并用十字交叉法对抑菌圈直径进行测量2次求直径平均，3个菌落再次取平均，抑菌圈大小即为抗菌活性大小，分为4个等级：无抑菌圈
“‑”
，抑菌圈直径小于1.0cm为“+”，抑菌圈直径1.1-1.5cm为“++”，抑菌圈直径大于1.5cm为“+++”。
47.抑菌圈大小=实际测量抑菌圈直径-0.5cm。
48.4）实验结果采用单层平板法测定提取液抑菌效果，实验结果见表2和图6～图10。从中可以看出，除了7.40 g/ml和3.7 0g/ml浓度以外，其余浓度没有抑菌圈。纯水都没有抑菌圈，符合实验预期。对照组链霉素由于在培养皿中扩散效果不佳，没有接触到青枯菌，导致没有产生抑菌圈。大青叶乙醇提取物浓度为7.40g/ml时，抑菌圈直径为1.14
±
0.07cm效果最好，浓度为3.70g/ml时次之，抑菌圈直径为0.78
±
0.02cm。
49.表2浓度（g/ml）抑菌圈直径（平均值
±
标准误）/cm多重比较抑菌圈大小7.401.14
±
0.07a+3.700.78
±
0.02b+1.850c-0.740c-0.370c-以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.大青叶水提取物在制备青枯病菌抑制剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述大青叶水提取物的制备方法为：将大青叶烘干粉碎过筛，加入纯水混合进行多次抽滤，最后合并滤液浓缩即得到所述大青叶水提取物。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述每次抽滤中，纯水加入量为大青叶或前一步抽滤所得到的滤渣的体积的4.9～5.1倍。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抽滤次数为4～6次。5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抽滤温度为45～55℃。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抽滤时间为1.4～1.6h。7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述浓缩温度为45～55℃。8.根据权利要求2～7所述的应用，其特征在于，所述大青叶水提取物的制备方法为：将大青叶烘干粉碎过筛，加入大青叶4.9～5.1倍的纯水混合在45～55℃抽滤1.4～1.6h，重复4～6次，每次抽滤补充的纯水量为滤渣体积的4.9～5.1倍，最后合并滤液，45～55℃浓缩即得到所述大青叶水提取物。9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为水乳制剂或微乳制剂。10.一种植物青枯病的防治方法，其特征在于，包括使用大青叶水提取物沾根或灌根；在植物发病初期，用大青叶水提取物对植株进行灌根。

技术总结
本发明公开了大青叶水提取物在制备青枯病菌抑制剂中的应用，该大青叶水提取物的制备方法为：将大青叶烘干粉碎过筛，加入纯水混合进行多次抽滤，最后合并滤液浓缩即得到所述大青叶水提取物。该方法为防治青枯病提供简便、有效、无公害的手段，而且大青叶价格合适、处理方便，在农业生产中具有良好的应用前景。在农业生产中具有良好的应用前景。在农业生产中具有良好的应用前景。


技术研发人员：冯远娇 杜甜甜 诸卫平 张晨宁 舒迎花 王建武
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2023.05.09
技术公布日：2023/8/14