一种蓝莓汁的发酵方法

culture collection center,cgmcc)获得。
10.本发明所述方法所述乳酸乳球菌(lactococcuslactis)jyll-60 cgmcc no.2335可由中国普通微生物菌种保藏管理中心(china general microbiological culture collection center,cgmcc)获得。
11.优选地，乳双歧杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌的质量比为1:1:1。
12.优选地，乳双歧杆菌的接入量为蓝莓汁的1％，植物乳杆菌的接入量为蓝莓汁的1％，乳酸乳球菌的接入量为蓝莓汁的1％。
13.本发明所述蓝莓汁的发酵方法，具体为：37℃恒温下，首先，使用乳双歧杆菌jybr-190发酵蓝莓汁3小时，后添加植物乳杆菌jylp-326发酵3小时，再添加乳酸乳球菌jyll-60协同发酵48小时后结束发酵。
14.优选地，所述各个菌种进行活化，挑选至固体培养基上培养后在接入液体培养基中进行接种备用。
15.进一步地，将三种菌种分别涂布于固体培养基表面，于37℃恒温培养两天，挑取平板上单菌落，分别转移至固体培养基上划线分离两次以上得到纯菌落，挑取至液体培养基中进行培养。
16.优选地，所述蓝莓汁原料按下述方法制得：将蓝莓果肉加水榨汁，过滤，蓝莓果肉与水的比例为1g：2～3ml；向蓝莓汁中添加碳酸钠，将其ph值调节至5.0，加入0.4％果胶酶，45℃水浴90分钟；4500r/min离心20min进行均质；60℃水浴10min灭酶；75℃条件下杀菌15min。
17.本发明有益效果为：本发明首次采用不同商业菌添加顺序发酵蓝莓汁，将乳酸菌的益生功能与蓝莓营养功能有效的结合起来，经乳酸菌发酵后蓝莓汁的caa细胞抗氧化能力显著增强，优于传统模式复合菌同时发酵。按本发明菌种添加顺序发酵蓝莓汁后其营养功能成分含量如总酚，总黄酮含量显著增加，优于传统模式复合菌同时发酵。按本发明菌种添加顺序发酵蓝莓汁色差值差异不显著，a
*
值较未发酵蓝莓原汁显著增大，呈鲜丽红色，有良好观感。按本发明菌种添加顺序发酵蓝莓汁其酸度值高，有良好产酸能力。
附图说明
18.图1(a)(b)为乳酸菌在mrs培养基中生物量。表示植物乳杆菌jylp-326在第3小时成为优势菌种。表明接种至第3小时，让其充分利用营养生长为优势菌，再接入下一个菌种，协同发酵直至结束。
19.图1(c)(d)为乳酸菌在mrs培养基中生物量。表示乳酸乳球菌jyll-60在第3小时成为优势菌种。表明接种至第3小时，让其充分利用营养生长为优势菌，再接入下一个菌种，协同发酵直至结束。
20.图1(e)(f)为乳酸菌在mrs培养基中生物量。表示乳双歧杆菌jybr-190在第几小时成为优势菌种。表明接种至第3小时，让其充分利用营养生长为优势菌，再接入下一个菌种，协同发酵直至结束。
21.图2为实施例1中不同菌种添加顺序发酵蓝莓汁工艺优化caa细胞抗氧化活性。其中小写字母表示同一行不同字母表示差异性显著(p》0.05)。
22.图3为实施例1中不同菌种添加顺序发酵蓝莓汁工艺优化总酚含量。其中小写字母
表示同一行不同字母表示差异性显著(p》0.05)。
23.图4为实施例1中不同菌种添加顺序发酵蓝莓汁工艺优化总黄酮含量。其中小写字母表示同一行不同字母表示差异性显著(p》0.05)。
24.图5为实施例1中不同菌种添加顺序发酵蓝莓汁工艺优化总花色苷含量。其中小写字母表示同一行不同字母表示差异性显著(p》0.05)。
25.图6为实施例1中不同菌种添加顺序发酵蓝莓汁工艺优化活菌数。其中小写字母表示同一行不同字母表示差异性显著(p》0.05)。
26.图7为实施例1中不同菌种添加顺序发酵蓝莓汁工艺优化总酸度。其中小写字母表示同一行不同字母表示差异性显著(p》0.05)。
27.图8为实施例1中不同菌种添加顺序发酵蓝莓汁工艺优化ph值。其中小写字母表示同一行不同字母表示差异性显著(p》0.05)。
28.图9为实施例1中不同菌种添加顺序发酵蓝莓汁工艺优化色差值。其中小写字母表示同一行不同字母表示差异性显著(p》0.05)。
具体实施方式
29.下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
30.下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
31.一种发酵蓝莓汁的工艺方法，包括下述步骤：
32.(1)蓝莓汁制备：挑选，清洗300g蓝莓果肉，倒入榨汁机中加水，蓝莓与水比例1g:2～3ml，用300目纱布进行抽滤，抽滤3次。向蓝莓汁中添加碳酸钠，将其ph值调节至5.0，加入0.4％果胶酶，45℃水浴90分钟；4500r/min离心20min进行均质；60℃水浴10min灭酶；75℃条件下杀菌15min，杀菌可对于蓝莓果汁里面的酶/有害杂菌进行灭活，并避免过高温度导致营养成分的改变。
33.(2)活化菌种：用无菌吸管吸取1.0ml无菌水将植物乳杆菌jylp-326、乳酸乳球菌jyll-60、乳双歧杆菌jybr-190菌粉完全溶解，取100μl菌液10倍梯度稀释，分别涂布于固体培养基(solarbio cat#m8330 mrs琼脂)表面，于37℃恒温培养两天，挑取平板上单菌落，分别转移至固体培养基上划线分离两次以上得到纯菌落，挑取至液体培养基(solarbio cat#m8540 mrs肉汤)中进行培养。
34.(3)菌种生物量测定：测定步骤(2)处理所得的菌种植物乳杆菌jylp-326、乳酸乳球菌jyll-60、乳双歧杆菌jybr-190样品在600nm波长处的od值和发酵液的ph值，得出各菌种对应的生长曲线及其产酸性能，通过两者确定单菌种添加发酵时间。
35.(4)发酵时间：37℃恒温下，将步骤(1)所得蓝莓汁置于锥形瓶中，按照菌种顺序加入后放入恒温培养箱37℃密闭培养48小时至发酵结束，乳双歧杆菌的接入量为蓝莓汁的1％，植物乳杆菌的接入量为蓝莓汁的1％，乳酸乳球菌的接入量为蓝莓汁的1％。
36.菌种添加顺序：乳双歧杆菌jybr-190(c)添加到蓝莓汁中发酵3小时，再添加植物乳杆菌jylp-326(a)发酵3小时，再添加乳酸乳球菌jyll-60(b)培养至48小时发酵结束。添加菌种顺序为(c、a、b)
37.本发明建立一种更优营养物质指标制备益生菌发酵蓝莓汁的工艺方法，按最优菌种顺序添加益生菌发酵后的蓝莓汁caa细胞抗氧化能力显著增强，分析了顺序添加菌种发酵的主要物质功能和色差值。利用紫外分光光度计比色法比较发酵前后蓝莓果汁中酚类物质含量，最佳发酵方式酚类物质含量增加55.269(mg/100ml)总黄酮含量也显著增加97.76(mg/100ml)，酚类物质和花色苷降解度显著提高，证明了顺序添加菌种对蓝莓汁中功能物质的生物转换功能。在发酵结束后蓝莓汁ph降低，总酸度不断积累升高，cab组总酸度最高，最高可达到4.36g/l，显著高于其他组别。对其发酵48小时后活菌数量进行检测，cab组活菌数高于益生菌发酵饮料国家标准，达到6.93lg(cfu)/ml。
38.本发明所建立的方法，可以应用于益生菌发酵蓝莓汁工艺商品化的生产，为今后益生菌蓝莓汁的最佳发酵工艺方式提供重要的参考。
39.实施例1：不同菌种添加顺序发酵蓝莓汁的制备
40.s1:制备蓝莓汁方法：
41.蓝莓清洗挑选过，300g蓝莓果肉，倒入榨汁机中加水。用300目纱布进行过滤。调配，过滤液加入去离子水定容至600ml，蓝莓与水比例1:2抽滤3次；加入0.4％果胶酶，45℃水浴90min，4500r/min离心20min进行均质，60℃水浴10min灭酶。其它方式接种前水浴杀菌(75℃，15min)对于存在蓝莓果汁里面的酶/有害杂菌进行灭活，并避免过高温度导致营养成分的改变。
42.s2:菌种的分离纯化、保藏及活化方法：
43.用无菌吸管吸取1.0ml无菌水将植物乳杆菌jylp-326、乳酸乳球菌jyll-60、乳双歧杆菌jybr-190菌粉完全溶解，取100μl菌液10倍梯度稀释，分别涂布于固体培养基表面，于37℃恒温培养两天，挑取平板上单菌落，分别转移至固体培养基上划线分离了次以上得到纯菌落。菌种保藏：挑取单菌落接到100ml液体培养基中，于37℃恒温密闭培养20h，取1ml菌液与60％甘油按1：1的比例混合制成甘油管，-20℃冻存。菌种活化：将从甘油管拿出来的菌株接种到mrs肉汤培养基，37℃恒温密闭培20h。
44.s3:乳酸菌发酵性能测定
45.将s2中处理后的菌种植物乳杆菌jylp-326、乳酸乳球菌jyll-60、乳双歧杆菌jybr-190测定样品在600nm波长处的od值，得出对应的生长曲线，根据生长曲线数值确定单菌种添加发酵时间。
46.s4:不同菌种添加顺序发酵蓝莓汁的制备
47.将s1样品装入锥形瓶中，依次按照s3菌种顺序加入后放入恒温培养箱37℃密闭培养48小时至发酵结束。
48.菌种添加顺序：乳双歧杆菌jybr-190(c)添加到蓝莓汁中发酵3小时，再添加植物乳杆菌jylp-326(a)发酵3小时，再添加乳酸乳球菌jyll-60(b)培养至48小时发酵结束。添加菌种顺序为(c、a、b)
49.针对实施例1的不同菌种添加顺序发酵蓝莓汁工艺优化的caa细胞抗氧化活性分析
50.将hepg2细胞置于含10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素的deme培养基中培养，37℃和5％co2。将处于对数生长期的细胞添加到96孔黑板中(6万个/孔)，孵化48h后，去除培养基，以pbs缓冲溶液洗涤细胞。用50ul发酵蓝莓汁分别处理6个复孔，空白组加以50微升的
培养液。随后加入50微升的荧光探针dcfh-da，孵育1h。孵育结束后，将样品液吸出弃之，其中三个复孔用磷酸缓冲液洗涤(pbs wash)，三个不清洗(no pbs wash)用排枪吸取100微升的abap工作液加入到样品孔中。随后，将96孔板置于荧光酶标仪中，在37℃下以535nm(发射)和485nm(激发)每5min记录荧光1h。根据以下公式进行计算。
51.caa value＝100-(∫sa/∫ca)x100
52.其中，∫sa为样品荧光-时间曲线下面积，∫ca为对照曲线下面积。
53.caa测定是基于细胞的评估生物活性物质抗氧化能力的方法，考虑到生物利用度和细胞摄取，是一种相对有代表性的检测手段。本试验中，非pbs清洗处理时，七种蓝莓汁的caa值均比经pbs清洗处理的caa值大，这表明发酵蓝莓汁在细胞膜表面的抗氧化活性优于在细胞内部的抗氧化活性。清洗处理过组中有三组细胞抗氧化活性显著高于传统复合yabc发酵方式。无pbs清洗处理组中有四组抗氧化活性高于yabc组。清洗组cab组抗氧化活性高于其他组别。
54.针对实施例1的不同菌种添加顺序发酵蓝莓汁工艺优化总酚含量的分析
55.向试管中加入0.1ml发酵蓝莓汁。然后在试管中加入0.1ml福林酚试剂和0.4ml蒸馏水，漩涡震荡混匀。6分钟后，在试管中加入1ml 7％na2co3溶液和0.8ml蒸馏水。漩涡震荡后，混合物于室温下避光显色90分钟。将200μl反应溶液转移至96孔板。使用酶标仪在760nm波长下测定吸光度。将吸光度带入标准曲线计算样品浓度。样品中总酚含量以没食子酸当量表示。标准曲线：y＝0.0022x+0.0698r2＝0.999不同菌种添加顺序发酵对蓝莓汁中酚类物质变化产生不同影响，会使酚类物质的含量增加。可能是植物乳杆菌代谢过程中能产生酚酸酯酶、β-半乳糖苷酶等酶类，这些酶可释放果汁中的酚类物质，另外乳酸菌发酵创造的酸性环境有利于多酚的稳定性。不同顺序菌种添加顺序组总酚含量均显著高于未发酵的蓝莓原汁，其中cab组总酚含量最高。
56.针对实施例1的不同菌种添加顺序发酵蓝莓汁工艺优化总黄酮含量的分析
57.取1ml样液与10ml容量瓶中，加入0.3ml5％亚硝酸钠溶液混匀并静置6min，然后加入10％硝酸铝溶液0.3ml，混匀后静置6min，加入1ml 4％氢氧化钠溶液混匀，用浓度为70％的乙醇定容到10ml，25℃水浴15min，酶标仪测定370nm处吸光度值，以槲皮素为标准品做标准曲线。标准曲线：y＝0.4136x+0.0256r2＝0.993以每克干重的槲皮素当量表示总黄酮含量。乳酸菌的不同添加顺序组合在发酵过程中进行代谢或生物转化从而产生黄酮类物质，将复杂的黄酮分解成其他化合物。在此过程中乳酸菌分泌糖苷酶。一方面黄酮苷被水解成水不溶的黄酮苷元,另一方面膳食纤维结合的黄酮易水解为水溶性黄酮，可能会对发酵果汁中黄酮类物质的生物利用率有积极作用。七组发酵组总黄酮含量也均高于未发酵蓝莓原汁。
58.针对实施例1的不同菌种添加顺序发酵蓝莓汁工艺优化总花色苷含量的分析
59.在37℃冰水浴下解冻样品，将样品加入离心管，于800rpm离心15min,分别移取2份处理好的样品0.2ml置于试管中，分別加入ph1.0和ph4.5。ph1.0值为緩冲液的制备过程是：用蒸馏水将溶液3gkci进行定容到体积为200ml，然后以1：3的比例和浓度为0.2mol/l的盐酸溶液进行混合，即可得到所需溶液：ph值为4.5的缓冲液的制备过程是：用蒸馏水将溶液8.2g kci进行定容到体积为100ml，然后继续加入蒸馏水和浓度为1mol的，二者的体积分別为90ml和60ml，即可得到所需溶液)的缓冲液4.8ml，暗处放置1h，与520nm和700nm波长下测
吸光度，做3次平行，取平均值。所有组序蓝莓汁发酵结束后，七组发酵顺序的总花色苷含量均呈下降趋势。总花色苷含量的下降可能是由于处于发酵阶段乳酸菌旺盛的代谢作用。其中yabc组在发酵蓝莓汁过程中保留花色苷能力最强。不同菌种添加顺序发酵对蓝莓汁中酚类物质变化产生不同影响，会使酚类物质的含量增加。可能是植物乳杆菌代谢过程中能产生酚酸酯酶、β-半乳糖苷酶等酶类，这些酶可释放果汁中的酚类物质，另外乳酸菌发酵创造的酸性环境有利于多酚的稳定性。
60.针对实施例1的不同菌种添加顺序发酵蓝莓汁工艺优化活菌数含量的分析
61.梯度稀释。将菌悬液移取1ml加入装有9ml无菌水的试管中，振荡混匀后取出1ml加入下一支装有9ml无菌水的试管中，依次类推，对菌悬液作10倍梯度稀释。根据实际情況，稀释倍数一般以显微镜视野中菌体数为30-300个为宜。吸取合适稀释度的菌悬液沿盖玻片边缘自动进入计数室，选择计数室4个角和中央的一个中格进行显微镜计数。
62.针对实施例1的不同菌种添加顺序发酵蓝莓汁工艺优化总酸含量的分析
63.总酸的测定参考gb/t 12456—2008《食品中总酸的测定》对样品进行总酸含量测定，结果以乳酸(g/l)计。酸度值也是衡量菌种产酸能力的重要指标，七组发酵结束后酸度值有明显差异，cab组酸度最高。
64.针对实施例1的不同菌种添加顺序发酵蓝莓汁工艺优化ph值的分析
65.ph计直接测定，重复三次。发酵果汁中ph值的变化幅度反映菌种发酵性能的优劣，七组发酵组发酵48h后ph值下降大致相似。bac顺序组ph值达到3.53
±
0.04，生长情况较好。
66.针对实施例1的不同菌种添加顺序发酵蓝莓汁工艺优化色差测定的分析
67.采用全自动色差仪(透视模式)测定发酵蓝莓汁样品的色泽，以未发酵蓝莓汁作为参比液，结果以总色差δe*计。色泽变化是发酵果汁的重要评价指标之一，七组48h发酵结束后样品之间色差值差异不大，但均较未发酵蓝莓汁颜色改变较大。呈诱人红色。蓝莓汁中主要的呈色物质为花色苷，而花色苷主要呈红色和蓝色，同之前检测花色苷含量相对应与七组中色差值变化相符合。
68.实施例2
69.不同菌种添加顺序发酵蓝莓汁的制备：
70.s1～s3步骤同实施例1完全相同。
71.s4:其中菌种添加顺序为，植物乳杆菌jylp-326(a)、乳酸乳球菌jyll-60(b)、乳双歧杆菌jybr-190(c)按照s2处理后，a菌发酵至3小时添加b菌种发酵至3小时后添加c协同发酵至48小时。(a、b、c)
72.表1(a、b、c)菌种添加顺序发酵48小时后对蓝莓汁营养品质及色差值的影响
[0073][0074]
注:值表示为平均值
±
sd(n＝3)
[0075]
实施例3
[0076]
不同菌种添加顺序发酵蓝莓汁的制备：
[0077]
s1～s3步骤同实施例1完全相同。
[0078]
s4:其中菌种添加顺序为，植物乳杆菌jylp-326(a)、乳酸乳球菌jyll-60(b)、乳双
歧杆菌jybr-190(c)按照s2处理后，a菌发酵至3小时添加c菌种发酵至3小时后添加b协同发酵至48小时。(a、c、b)
[0079]
表2(a、c、b)菌种添加顺序发酵48小时后对蓝莓汁营养品质及色差值的影响
[0080][0081]
注:值表示为平均值
±
sd(n＝3)
[0082]
实施例4
[0083]
不同菌种添加顺序发酵蓝莓汁的制备：
[0084]
s1～s3步骤同实施例1完全相同。
[0085]
s4:其中菌种添加顺序为，植物乳杆菌jylp-326(a)、乳酸乳球菌jyll-60(b)、乳双歧杆菌jybr-190(c)按照s2处理后，b菌发酵至3小时添加a菌种发酵至3小时后添加c协同发酵至48小时。(b、a、c)
[0086]
表3(b、a、c)菌种添加顺序发酵48小时后对蓝莓汁营养品质及色差值的影响
[0087][0088]
注:值表示为平均值
±
sd(n＝3)
[0089]
实施例5
[0090]
不同菌种添加顺序发酵蓝莓汁的制备：
[0091]
s1～s3步骤同实施例1完全相同。
[0092]
s4:其中菌种添加顺序为，植物乳杆菌jylp-326(a)、乳酸乳球菌jyll-60(b)、乳双歧杆菌jybr-190(c)按照s2处理后，b菌发酵至3小时添加c菌种发酵至3小时后添加a协同发酵至48小时。(b、c、a)
[0093]
表4(b、c、a)菌种添加顺序发酵48小时后对蓝莓汁营养品质及色差值的影响
[0094][0095]
注:值表示为平均值
±
sd(n＝3)
[0096]
实施例6
[0097]
不同菌种添加顺序发酵蓝莓汁的制备：
[0098]
s1～s3步骤同实施例1完全相同。
[0099]
s4:其中菌种添加顺序为，植物乳杆菌jylp-326(a)、乳酸乳球菌jyll-60(b)、乳双歧杆菌jybr-190(c)按照s2处理后，c菌发酵至3小时添加a菌种发酵至3小时后添加b协同发酵至48小时。(c、a、b)
[0100]
表5(c、a、b)菌种添加顺序发酵48小时后对蓝莓汁营养品质及色差值的影响
[0101][0102]
注:值表示为平均值
±
sd(n＝3)
[0103]
实施例7
[0104]
不同菌种添加顺序发酵蓝莓汁的制备：
[0105]
s1～s3步骤同实施例1完全相同。
[0106]
s4:其中菌种添加顺序为，植物乳杆菌jylp-326(a)、乳酸乳球菌jyll-60(b)、乳双歧杆菌jybr-190(c)按照s2处理后，c菌发酵至3小时添加b菌种发酵至3小时后添加a协同发酵至48小时。(c、b、a)
[0107]
表7(c、b、a)菌种添加顺序发酵48小时后对蓝莓汁营养品质及色差值的影响
[0108][0109]
注:值表示为平均值
±
sd(n＝3)
[0110]
本发明涉及一种益生菌发酵蓝莓汁最优菌种添加顺序工艺制备方法，属于食品益生菌果汁加工领域。本发明发酵后样品以蓝莓果汁作为底物基质，选择三株适于此基质的乳酸菌对其进行发酵工艺的开发，确定最优的菌种添加顺序进行发酵。分析其发酵结束后的多项指标变化，包括功能物质含量、抗氧化能力、色差值等，以期为蓝莓深加工业提供新的思路和一定技术指导，并为乳酸菌发酵蓝莓制品的规律硏宄提供新的理论数据基础。

技术特征：
1.一种蓝莓汁的发酵方法，其特征在于：依次使用如下三种菌种进行蓝莓汁发酵，具体为：乳双歧杆菌jybr-190cgmcc no.18092，植物乳杆菌jylp-326cgmccno.18038，乳酸乳球菌jyll-60cgmcc no.2335。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：乳双歧杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌的质量比为1:1:1。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：乳双歧杆菌的接入量为蓝莓汁的1％，植物乳杆菌的接入量为蓝莓汁的1％，乳酸乳球菌的接入量为蓝莓汁的1％。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：37℃恒温下，首先，使用乳双歧杆菌jybr-190发酵蓝莓汁3～3.5小时，后添加植物乳杆菌jylp-326发酵3～3.5小时，再添加乳酸乳球菌jyll-60协同发酵48～48.5小时后结束发酵。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述各个菌种进行活化，挑选至固体培养基上培养后再接入液体培养基中进行接种备用。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：将三种菌种分别涂布于固体培养基表面，于37℃恒温培养两天，挑取平板上单菌落，分别转移至固体培养基上划线分离两次以上得到纯菌落，挑取至液体培养基中进行培养。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述蓝莓汁原料按下述方法制得：将蓝莓果肉加水榨汁，过滤，蓝莓果肉与水的比例为1g：2～3ml；向蓝莓汁中添加碳酸钠，将其ph值调节至5.0，加入0.4％果胶酶，45℃水浴90分钟；4500r/min离心20min进行均质；60℃水浴10min灭酶；75℃条件下杀菌15min。

技术总结
本发明涉及一种蓝莓汁的发酵方法，属于食品加工领域。一种蓝莓汁的发酵方法，其特征在于：依次使用如下三种菌种进行蓝莓汁发酵，具体为：乳双歧杆菌JYBR-190CGMCC No.18092，植物乳杆菌JYLP-326CGMCC No.18038，乳酸乳球菌JYLL-60CGMCC No.2335。本发明首次采用不同商业菌添加顺序发酵蓝莓汁，将乳酸菌的益生功能与蓝莓营养功能有效的结合起来，经乳酸菌发酵后蓝莓汁的CAA细胞抗氧化能力显著增强，优于传统模式复合菌同时发酵。按本发明菌种添加顺序发酵蓝莓汁后其营养功能成分含量如总酚，总黄酮含量显著增加，优于传统模式复合菌同时发酵。酵。


技术研发人员：王月华 王元园 李斌 孟宪军 孙希云 朱金艳 边媛媛
受保护的技术使用者：沈阳农业大学
技术研发日：2023.05.09
技术公布日：2023/8/14