黑褐色鹿茸菇昌里1号菌株的分子标记及其应用的制作方法

1.本发明涉及食用菌技术领域，具体地，涉及黑褐色鹿茸菇昌里1号菌株的分子标记及其应用。


背景技术：

2.鹿茸菇，学名鹿茸菇(lyophyllumdecastes，属担子菌亚门(basidiomycotina)伞菌目(agaricales)白蘑科(tricholomataceae)离褶伞属(lyophyllum)。在欧洲被称为friedchickenmushroom，又名“路基蘑”“铁道蘑”“荷叶蘑”等；在中国因其切片与名贵中药鹿茸相似而得名鹿茸菇，为食药兼用的大型真菌。
3.目前市面上的鹿茸菇均为浅灰色品系，主要存在以下问题：1、子实体色泽单一，同质化明显，产品辨识度不高；2、培养及栽培周期较长；3、纤维较粗，口感不够细腻。这些问题无疑都最终导致了生产成本的增加，降低了产品的市场竞争力。
4.黑褐色鹿茸菇昌里1号菌株具有色泽独特，生长周期短，子实体纤维相对紧实细腻，口感脆嫩等特点，产品辨识度高，且周期较短，耐二氧化碳，保藏时间更长等特点，适宜工厂化推广种植。
5.随着分子生物学的发展，分子标记法越来越广泛地用于菌种的鉴别。scar(sequence-characterized amplified region)标记是一种十分稳定的分子标记，能够简便、快速、稳定的进行菌种鉴定，但目前尚未有对黑褐色鹿茸菇昌里1号菌株的scar分子标记，以快速鉴定和检测黑褐色鹿茸菇昌里1号。


技术实现要素：

6.针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种黑褐色鹿茸菇昌里1号菌株的分子标记，能够用于黑褐色鹿茸菇昌里1号的鉴别和检测，与常规的食用菌菌种检测方法相比，具有检测时间短、准确性高的特点。
7.本发明第一方面提供了一种黑褐色鹿茸菇昌里1号菌株的分子标记，特异性pcr扩增引物对序列如下：
8.正向引物-f：5'-ctctctctctctctcccactctctcacacgctccct-3'和，
9.反向引物-r：5'-ggttccgattcctcctctcg-3'；
10.分子标记的片段大小为1582bp，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示。
11.本发明第二方面提供了上述黑褐色鹿茸菇昌里1号菌株的分子标记在黑褐色鹿茸菇昌里1号菌株的鉴定和检测中的应用。
12.与现有技术相比，本发明的实施例具有如下的有益效果：本发明实施例提供的黑褐色鹿茸菇昌里1号菌株的分子标记，能够用于黑褐色鹿茸菇昌里1号的鉴别和检测，与常规的食用菌菌种检测方法(形态学检测、拮抗试验和出菇试验等方法)相比，具有检测时间短、准确性高的特点。
附图说明
13.通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
14.图1为分子标记的验证的凝胶电泳图；
15.图2为scar得到的条带序列在genbank(基因库)中比对结果图；
16.图3为设计的分子标记扩增条带在genbank(基因库)中比对结果图；
17.图4为分子标记的验证的凝胶电泳图(重复性验证)；
18.图5为分子标记的验证的凝胶电泳图(重复性验证)；
19.图6为issr-pcr体系变异菌株所对应亲本菌株的多态性条带凝胶电泳图。
具体实施方式
20.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
21.本发明提供了一种分子标记，通过该分子标记能够能够简便、快速、稳定的鉴定和检测黑褐色鹿茸菇昌里1号菌株，该黑褐色鹿茸菇昌里1号菌株，属于荷叶离褶伞(lyophyllum decastes)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号为cctcc no：m2023595，保藏日期为2023年04月23日。
22.以下通过具体实施方式对黑褐色鹿茸菇昌里1号菌株的分子标记进行进一步描述。
23.实施例1
24.1试验材料
25.1.1供试菌株
26.实验品种：黑褐色鹿茸菇昌里1号菌株(
‘
ly-ppx-by’)，试验编号：b，菌株由江苏品品鲜生物科技股份有限公司提供。
27.对照品种：(1)
‘
ly-ppx-qb’、试验编号：q；(2)
‘
ly-sd’、试验编号：s；上述两个对照品种的菌株均购自江苏品品鲜生物科技股份有限公司。
28.1.2试剂
[0029]2×
hippoq3fasttaqpremix易禾生物；引物由福州擎科生物科技有限公司合成；dnamarket上海百赛生物技术股份有限公司；真菌dna提取mini试剂盒美国omegabio-tek公司；
[0030]
1.3仪器：
[0031]
主要仪器与设备
[0032][0033]
1.4引物：
[0034]
从加拿大哥伦比亚大学所公布的100条随机引物中随机随机选取67条引物，分别命名为p1-29、issr1-38。
[0035]
表1issr的引物序列(p1-29)
[0036]
[0037][0038]
表2 issr的引物序列(issr1-38)
[0039]
编号序列编号序列issr1gagagagagagagagaaissr20agagagagagagagaggissr2ggatgcaacacacacacacissr21gsgtgtgtgtgtgtgtgtissr3acacacacacacacaccissr22agagagagagagagagtissr4acacacacacacacactissr23tctctctctctctctcissr5tctctctctctctctccissr24agagagagagagagagyaissr6gagagagagagagagaycissr25agagagagagagagagycissr7kkrbrbracacacacacacissr26gagagagagagagagaycissr8dbdacacacacacacacissr27gagagagagagagagaytissr9cacgagagagagagagaissr28gagagagagagagagaygissr10tctctctctctctctccgissr29gagagagagagagagaaissr11agagagagagagagaggissr30gtgacacacacacacissr12cacacacacacacacaissr31agtgtgtgtgtgtgtissr13tgtgtgtgtgtgtgtgissr32ccagtggtggtggtgissr14cacacacacacacacatissr33ggagtggtggtggtgissr15tgtgtgtgtgtgtgtgaissr34agagagagagagagaggissr16gagagagagagagagatissr35agagagagagagagaggcissr17gagaagagagagagagtissr36acacacacacacacaccg
issr18gagaagagagagagagcissr37acacacacacacacacissr19agagagagagagagagcissr38acacacacacacacacc
[0040]
2试验方法
[0041]
2.1dna提取(试剂盒法)
[0042]
收集菌丝：将菌株接种于pda平板上黑暗培养活化后，切取边缘菌块接种于铺有玻璃纸的pda平板上，黑暗培养至满板。菌丝用灭过菌的药匙刮下，放至1.5ml离心管中，速冻保存。采用试剂盒法提取dna。
[0043]
液氮研磨：1、将研钵洗净灼烧备用，用专用容器盛一些液氮备用。2、将液氮小心加入并浸满研钵，浸泡预冷研杵与研钵(加入液氮时，缓慢加入，防止液氮飞溅)；3、当第一次加入的液氮挥发后，立即向研钵中缓慢加入约1/2研钵体积的液氮(若组织块较大或较多的情况下可浸满研钵)，将组织迅速转移至液氮内，确保组织全部浸没在液氮中；4、使用研杵在液氮中轻轻敲打组织，将组织打碎成小块，要注意切勿用力过度，要防止组织块飞溅出研钵；在液氮即将挥发完时，使用研杵对组织样本进行碾压研磨；5、待液氮挥发完后，立即加入1/3研钵体积的液氮(注意，加入液氮速度要缓慢，切勿使得液氮冲击力过大，将组织样本冲出研钵)，迅速用研杵研磨组织，根据组织状态的变化程度，在确保组织始终处于冰冻状态下，及时补充液氮进行研磨，(一般30s～1min补充一次，至少需要补充3次以上)，直至组织被研磨成粉末状。6、当组织研磨成粉末状后立即移至离心管中备用；
[0044]
dna提取：在2.0ml微量离心管中收集磨碎的真菌组织(30-100mg)，并立即加入500μlbuffercpl和10μl2-巯基乙醇，大力涡旋并确保分散所有团块；65℃孵育15分钟，在孵化过程中通过翻转管将样品混合两次，加入500μl氯仿/异戊醇(24:1)并涡旋混合。13.000xg,4℃离心5分钟，小心吸取300ul上清液至新的1.5ml微量离心管中；加入150ulbuffercxd，然后加入300ul无水乙醇并涡旋以获得均匀的混合物，将整个样品(包括可能已形成的任何沉淀物)加到hibinddna柱上，该柱放置在2.0ml收集管(提供)中。以10,000xg离心柱1分钟以结合dna，丢弃2.0ml收集管和流通液；将柱子转移到第二个收集管中，加入用无水(96％-100％)乙醇稀释的650μlspw,洗涤缓冲液进行洗涤。将10,000xg离心1分钟并丢弃流过的液体，在下面的下一步中重复使用收集管，使用额外的650ulspw洗涤缓冲液以10,000xg离心机重复洗涤步骤1分钟；将柱子放入收集管中，以最大速度将空柱子离心2分钟以干燥，把色谱柱转移到干净的1.5ml管中；加入预热至65℃，室温孵育2分钟的洗脱缓冲液35μl。以10.000xg离心1分钟以洗脱，-20℃保存备用。
[0045]
2.2issr-pcr体系
[0046]
反应体系为25ul体系，94℃预变性4min，然后94℃变性30s，38℃退火1min，72℃延伸1min，扩增38个循环，最后72℃延伸10min。
[0047]
从加拿大哥伦比亚大学所公布的100条随机引物中选定了67条引物进行issr分析。
[0048]
变异菌株与所对应亲本菌株的多态性条带凝胶电泳图如图6所示:经筛选后得到18条能以鹿茸菇dna为模板扩增出多态条带的引物，其中有2条引物能以鹿茸菇dna为模板扩增出特异性条带。其中，引物issr 5(tctctctctctctctcc)能扩增出特征条带，且该条带只在黑褐色鹿茸菇昌里1号菌株中出现。
[0049]
2.2scar标记的特征条带分析
[0050]
将issr 5(tctctctctctctctcc)引物扩增出的在鹿茸菇变异菌株中具有特征性的dna片段切胶纯化进行克隆、测序，得到一段2007bp的序列(seq id no.4)：
[0051]
[0052][0053]
将scar得到的条带序列在genbank(基因库)中比对结果如图2所示，说明胶回收得到的条带为鹿茸菇的条带，测序结果可靠。
[0054]
2.3scar标记引物的设计、合成及scar标记的验证
[0055]
scar标记引物的设计及合成
[0056]
根据特征条带ta克隆后测序所得到的序列结果，再根据引物设计原则，设计该特征条带的扩增引物对，编号5，正向引物5-f：tctctctctctctctcccactctctcacacgctccct，反向引物5-r：ggttccgattcctcctctcg。委托测序擎科生物公司进行合成。
[0057]
将该分子标记序列在genbank(基因库)中比对结果如图3所示，说明所设计的分子标记序列结果可靠。
[0058]
scar标记的验证
[0059]
使用scar标记引物5对各种鹿茸菇的dna进行pcr扩增验证，反应体系为25ul体系，94℃预变性4min，然后94℃变性30s，69℃退火1min，72℃延伸1min，扩增33个循环，最后72℃延伸10min。pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
[0060]
经过三次重复的pcr实验结果如图1、4、5所示：使用本发明scar标记对包含变异菌株昌里1号在内的鹿茸菇菌株与亲本菌株及国内市场上的主栽菌株进行扩增对比，结果只有本发明黑褐色鹿茸菇昌里1号菌株有专一扩增条带，其他鹿茸菇菌株中不能扩增出该特征条带。说明正向引物5-f：tctctctctctctctcccactctctcacacgctccct(seq id no.2)和反向引物5-r：ggttccgattcctcctctcg(seq id no.3)是黑褐色鹿茸菇昌里1号的scar分子标记引物，能够将黑褐色鹿茸菇昌里1号菌株与其他鹿茸菇菌株区分开。用该引物对所扩增出的dna片段分子量为1582bp，所述1582bp的特异dna片段为本发明黑褐色鹿茸菇昌里1号菌株的scar分子标记，该分子标记的核苷酸序列如下所示(seq id no.1)：
[0061][0062][0063]
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本技术的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

技术特征：
1.一种黑褐色鹿茸菇昌里1号菌株的分子标记，其特征在于，特异性pcr扩增引物对序列如下：正向引物-f：5'-ctctctctctctctcccactctctcacacgctccct-3'和，反向引物-r：5'-ggttccgattcctcctctcg-3'；分子标记的片段大小为1582bp，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示。2.权利要求1所述的黑褐色鹿茸菇昌里1号菌株的分子标记在黑褐色鹿茸菇昌里1号菌株的鉴定和检测中的应用。

技术总结
本发明提供了一种黑褐色鹿茸菇昌里1号菌株的分子标记，特异性PCR扩增引物对序列如下：正向引物-F：5'-CTCTCTCTCTCTCTCCCACTCTCTCACACGCTCCCT-3'和，反向引物-R：5'-GGTTCCGATTCCTCCTCTCG-3'；分子标记的片段大小为1582bp，分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的黑褐色鹿茸菇昌里1号菌株的分子标记，能够用于黑褐色鹿茸菇昌里1号的鉴别和检测，与常规的食用菌菌种检测方法相比，具有检测时间短、准确性高的特点。准确性高的特点。准确性高的特点。


技术研发人员：邱昌里 陈长茂 卓智茂 路选
受保护的技术使用者：江苏品品鲜生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.05.30
技术公布日：2023/8/14