一种弱碱性的复合骨水泥材料及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于医用材料技术领域，涉及一种弱碱性的复合骨水泥材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.随着老龄化社会的加剧，基于老龄化导致的组织修复再生需求已成为社会面临的主要问题之一，比如骨质疏松性骨折直接导致了骨修复生物材料需求量的极大提高。
3.聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)骨水泥因其具力学强度高，有良好的可塑性及室温下快速固化等优点，被广泛用于骨科修复材料技术领域，也逐渐应用于糖尿病导致的皮肤溃疡的覆盖和快速血管化领域。但是由于pmma的生物惰性，植入体内后只能形成纤维包裹，无法与骨形成牢固的骨性结合界面。因此植入缺损的骨质疏松椎体一段时间后，易发生滑脱、移位等问题，重新并发性引起患者背部疼痛和邻近椎体骨折，从而限制了pmma骨水泥在骨修复材料领域中的应用。
4.针对以上缺点，已有研究团队将生物活性玻璃掺入pmma骨水泥基体中从而赋予pmma骨水泥一定的生物活性和骨整合性，如cn104922731a(发明名称为复合骨水泥前体、锶硼酸盐生物玻璃/聚甲基丙烯酸甲酯复合骨水泥的制备方法和应用)，该专利公开了生物活性玻璃降引入惰性材料基体后，能有效地赋予其生物活性以及骨整合性能。但是该专利公开的复合骨水泥降解后会形成较高碱性微环境，对人体会带来一定的安全隐患。比如生物活性玻璃基材料植入局部骨组织后，过高的碱性微环境会抑制组织再生相关细胞的活性和功能表达，甚至导致溶血；又如生物活性玻璃用于皮肤修复，其降解后形成的较高碱性微环境会引起皮肤灼烧感，从而一定程度上可能增加皮肤局部炎症。因此，基于植入体内降解后形成的较高碱性微环境，组织修复复合材料基体中引入生物活性玻璃的含量往往不够高，从而也一定程度上限制对于复合材料生物学性能的提升。
5.因此，需要优化生物活性玻璃降解后形成的过高碱性微环境，以实现复合基体的高含量生物活性玻璃掺杂，从而制备兼具高生物活性和低碱性的复合材料，以实现更优的体内生物安全性和组织再生修复性能。


技术实现要素：

6.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种弱碱性的复合骨水泥材料及其制备方法和应用。本发明所述复合骨水泥材料中包括弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)，弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃降解后呈弱碱性，因此，在复合骨水泥材料中，弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃添加量高，使得所述复合骨水泥材料具有高的生物活性特点，优化了复合骨水泥的体内外生物安全性和组织修复性能。
7.本发明的第一方面提供一种弱碱性的复合骨水泥材料。
8.具体的，一种弱碱性的复合骨水泥材料，包括固体组分和液体组分；
9.所述固体组分包括弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、显影剂；
10.所述液体组分包括甲基丙烯酸甲酯(mma)和聚合活化剂；
11.所述弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃的化学组成为axo
·
bb2o3·
cp2o5·
dsio2·
ey2o，其中a、b、c、d和e为摩尔份数，a为4-39，b为5-15、17-35、37-53或55-65，c为1-10，d为0-60，e为2-12，x为ca、mg、sr中的一种或多种，y为na和/或k。
12.优选的，所述显影剂包括氧化锆和/或硫酸钡。
13.优选的，所述固体组分还包括过氧化苯甲酰(bpo)。
14.优选的，所述聚合活化剂包括n,n-二甲基对甲苯胺和/或对苯二酚。
15.优选的，所述弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃中，e的取值范围为5-10。当y同时为na和k时，e表示na2o和k2o的摩尔份数之和。
16.优选的，所述弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃中，a的取值范围为34-39。当x同时为ca、mg、sr时，a表示mgo、cao和sro的摩尔份数之和。
17.优选的，所述弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃的化学组成为3na2o
·
2k2o
·
8mgo
·
25cao
·
27b2o3·
2p2o5·
27sio2·
6sro、3na2o
·
4k2o
·
8mgo
·
23cao
·
27b2o3·
2p2o5·
27sio2·
6sro、4na2o
·
6k2o
·
8mgo
·
20cao
·
27b2o3·
2p2o5·
27sio2·
6sro或3na2o
·
4k2o
·
8mgo
·
16cao
·
27b2o3
·
2p2o5·
27sio2·
13sro。
18.优选的，所述弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃中还包括zno和/或cuo。
19.优选的，所述聚甲基丙烯酸甲酯的数均分子量为30万-150万；进一步优选的，所述聚甲基丙烯酸甲酯的数均分子量为40万-100万。
20.优选的，所述弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃在所述固体组分中的质量百分含量为大于20％，小于等于70％；进一步优选的，所述弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃在所述固体组分中的质量百分含量为大于20％，小于等于60％；更优选的，所述弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃在所述固体组分中的质量百分含量为30-50％。
21.优选的，所述显影剂在所述固体组分中的质量百分含量为18-32％；进一步优选的，所述显影剂在所述固体组分中的质量百分含量为20-30％。
22.优选的，所述过氧化苯甲酰在所述固体组分中的质量百分含量为0.1-1.6％；进一步优选的，所述过氧化苯甲酰在所述固体组分中的质量百分含量为0.2-1.5％。
23.优选的，所述固体组分，按照质量百分含量计，包括弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃20.1-60％、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)30-61.9％、显影剂10-39.9％。
24.优选的，所述固体组分，按照质量百分含量计，包括弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃20.1-60％、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)8.5-59.7％、显影剂20-30％、过氧化苯甲酰0.2-1.5％。
25.优选的，所述液体组分中，甲基丙烯酸甲酯(mma)的质量百分含量为90-99.5％，优选95-99.5％。
26.优选的，所述液体组分中，聚合活化剂的质量百分含量为0.5-10％，优选0.5-5％。
27.优选的，所述液体组分中，所述对苯二酚的含量不超过50ppm，优选30-50ppm。
28.优选的，所述液体组分中，按照质量百分含量计，包括甲基丙烯酸甲酯95-99.5％、n,n-二甲基对甲苯胺0.5-5％。
29.优选的，所述弱碱性的复合骨水泥材料中，固体组分与液体组分的质量体积比为(2.1-3.0)g：1ml；进一步优选的，所述弱碱性的复合骨水泥材料中，固体组分与液体组分的质量体积比为(2.1-2.7)g：1ml；更优选的，所述弱碱性的复合骨水泥材料中，固体组分与液体组分的质量体积比为(2.3-2.5)g：1ml。
30.优选的，所述固体组分为粉末状态。
31.优选的，所述固体组分中，所述弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃的粒径为30-55μm，优选40-50μm。
32.优选的，所述固体组分中，所述聚甲基丙烯酸甲酯的粒径为10-90μm，优选20-80μm。
33.本发明的第二方面提供一种弱碱性的复合骨水泥材料的制备方法。
34.具体的，一种弱碱性的复合骨水泥材料的制备方法，包括以下步骤：
35.固体组分的制备：称取制备所述弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃的原料组分，混合，熔融，冷却，粉碎，制得所述弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃，然后将所述弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、显影剂混合，制得所述固体组分；
36.液体组分的制备：将所述甲基丙烯酸甲酯(mma)和聚合活化剂混合，制得所述液体组分；
37.将所述固体组分和液体组分混合。
38.优选的，所述制备所述弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃的原料组分包括钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、锶盐、二氧化硅、硼酸、磷酸盐。
39.进一步优选的，所述钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、锶盐指钠、钾、镁、钙、锶对应的碳酸盐或碳酸氢盐。
40.优选的，所述固体组分制备过程中，冷却后，还包括粉碎、球磨的操作过程。
41.所述复合骨水泥材料在使用时，将所述固体组分和所述液体组分按照比例混合即可。
42.本发明的第三方面提供一种弱碱性的复合骨水泥材料的应用。
43.一种组织修复材料，包括上述复合骨水泥材料。
44.优选的，所述组织修复材料包括皮肤修复材料或骨修复材料。
45.以往的硼硅酸盐生物活性玻璃虽然具有好的生物活性，但是并不能往pmma骨水泥基体中掺入很多，其中一个重要原因是硼硅酸盐生物活性玻璃的降解会造成较强的碱性，易引起生物安全性问题，诸如溶血和细胞毒性方面的问题；而较低含量的硼硅酸盐生物活性玻璃的掺入对于pmma骨水泥的生物学效应的提高效果并不显著；因此本发明通过调整硼硅酸盐生物活性玻璃的组分，制备出弱碱性的硼硅酸盐生物活性玻璃，显著降低了其在特定溶液中浸泡并降解所引起的高碱性ph效应。
46.相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
47.(1)本发明所述复合骨水泥材料中包括弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃，本发明通过调整弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃的组成，降低了其降解产物的ph值，达到降解后弱碱性的效果，而弱碱性能够极高的提高细胞的存活率，并显著降低高碱性导致的溶血反应，从而显著地提高了其体外细胞相容性。
48.(2)虽然成骨需要一定的碱性环境，但是只有在相对合适的弱碱性条件下才能有
效介导干细胞定向成骨分化、增强成骨细胞活性、并抑制破骨细胞活性；而当碱性过高时，反而会抑制干细胞的增殖分化、抑制破骨细胞的活性，并损伤宿主组织；因此鉴于碱性调控成骨理论，其碱性环境不是越高越好，而需要特定的弱碱性微环境。本发明提供的弱碱性复合骨水泥材料，恰好能提供发挥最佳成骨促进作用所需的弱碱性微环境。
49.(3)本发明所述复合骨水泥材料中的弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃含量在固体组分中的占比超过20％，例如30-60％，含量明显高于cn104922731a中骨水泥材料中的硼硅酸盐生物活性玻璃含量。故本发明可显著提高pmma基复合骨水泥的生物活性、骨整合性和成骨再生能力等体内外生物学性能。
50.(4)本发明提供的复合骨水泥材料的制备方法原料易得，工艺简单，操作方便，便于应用。
附图说明
51.图1为实施例1-3复合骨水泥材料的力学性能；
52.图2为实施例1-3复合骨水泥材料、对比例1-3复合骨水泥材料对应的溶血率；
53.图3为实施例4-6复合骨水泥材料对应的溶血率；
54.图4为hbmscs细胞在不同ph值的含有10％(质量浓度)cck-8试剂的培养基中第1、3和7天的存活情况；
55.图5为hbmscs细胞在不同ph值条件下1、3、5和7天的活细胞染色图；
56.图6为hbmscs细胞在不同ph值条件下成骨诱导3、5、7与10天后的alp染色以及alpl基因的mrna表达水平；
57.图7为hmscs细胞在不同ph值条件下成骨诱导10天后的(a)col1a1的免疫细胞化学；(b)相对荧光强度；(c)col1a1基因的mrna表达水平；(d)天狼星红染色情况；
58.图8为hbmscs细胞在不同ph值条件下成骨诱导7、10和14天后的(a)茜素红染色；(b)茜素红半定量；
59.图9为hbmscs细胞在不同ph值条件下成骨诱导3、7、10与14天后的成骨相关基因sp7的mrna表达水平。
具体实施方式
60.为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
61.以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
62.实施例1
63.一种复合骨水泥材料，包括固体组分和液体组分；
64.固体组分，按照质量百分含量计，包括弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃30％、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)粉末60％、显影剂(zro2)10％。
65.液体组分，按照质量百分含量计，包括甲基丙烯酸甲酯(mma)99.2％和n,n-二甲基对甲苯胺(dmpt)0.8％；
66.弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃的化学组成为3na2o
·
2k2o
·
8mgo
·
25cao
·
27b2o3·
2p2o5·
27sio2·
6sro。
67.一种弱碱性的复合骨水泥材料的制备方法，包括以下步骤：
68.(1)固体组分的制备：
69.弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃的制备：
70.称取5.23g na2co3、13.64gk2co3、38.34g(mgco3)4·
mg(oh)2·
5h2o、123.48g caco3、169.7g h3bo3、80.05g sio
2:
、43.71g srco3、30.79g nah2po4·
2h2o到容器中，搅拌混合后，倒入铂金坩埚中并放入高温炉，在1200℃下加热1小时，然后取出来直接倒在冰水里，取出玻璃物，用酒精洗一遍，放入干燥箱里烘干，烘干后放置在球磨机上球磨1小时，最后用振动筛筛选出粒径为40-45μm的弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃；
71.弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃占固体组分末质量百分含量为30％，将弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃、pmma粉末和zro2置于三维混合仪中使之均匀混合(50hz，2小时)，得到固体组分；
72.(2)液体组分的制备：
73.将甲基丙烯酸甲酯(mma)与n,n-二甲基对甲苯胺(dmpt)混合，得到液体组分；
74.(3)复合骨水泥材料的制备：
75.在室温下，将上述固体组分与液体组分按2.4g：1ml的质量体积比混合后搅拌均匀，即可制得复合骨水泥材。
76.实施例2
77.一种弱碱性的复合骨水泥材料的制备方法，弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃占固体组分质量百分含量的40％，聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)粉末40％、显影剂(zro2)20％，其余过程均与实施例1相同。
78.实施例3
79.一种弱碱性的复合骨水泥材料的制备方法，弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃占固体组分质量百分含量的50％，聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)粉末40％、显影剂(zro2)10％，其余过程均与实施例1相同。
80.实施例4
81.制备一种弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃，记为：弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃-1，其化学组成为3na2o
·
4k2o
·
8mgo
·
23cao
·
27b2o3·
2p2o5·
27sio2·
6sro。其制备过程为：称取5.23g na2co3、27.08gk2co3、38.34g(mgco3)4·
mg(oh)2·
5h2o、112.75g caco3、169.7gh3bo3、80.05g sio
2:
、43.71g srco3、30.79g nah2po4·
2h2o到容器中，其余步骤与实施例1所描述的制备弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃的方法完全一致。
82.将本实施例制备的弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃替代实施例1中的弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃来制备复合骨水泥材料，其余步骤与实施例1完全一致。
83.实施例5
84.制备一种弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃，记为：弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃-2，其化学组成为4na2o
·
6k2o
·
8mgo
·
20cao
·
27b2o3·
2p2o5·
27sio2·
6sro。其制备过程为：称取10.3g na2co3、40.29gk2co3、38.34g(mgco3)4·
mg(oh)2·
5h2o、97.26g caco3、169.7gh3bo3、80.05g sio
2:
、43.71g srco3、30.79g nah2po4·
2h2o到容器中，其余步骤与实施例1所描述的制备弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃的方法完全一致。
85.将本实施例制备的弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃替代实施例1中的弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃来制备复合骨水泥材料，其余步骤与实施例1完全一致。
86.实施例6
87.制备一种弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃，记为：弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃-3，其化学组成为3na2o
·
4k2o
·
8mgo
·
16cao
·
27b2o3·
2p2o5·
27sio2·
13sro。其制备过程为：称取5.23g na2co3、27.08gk2co3、38.34g(mgco3)4·
mg(oh)2·
5h2o、75.96g caco3、169.7gh3bo3、80.05g sio
2:
、91.03g srco3、30.79g nah2po4·
2h2o到容器中，其余步骤与实施例1所描述的制备弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃的方法完全一致。
88.将本实施例制备的弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃替代实施例1中的弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃来制备复合骨水泥材料，其余步骤与实施例1完全一致。
89.对比例1
90.与实施例1相比，对比例1的区别仅在于使用的硼硅酸盐生物活性玻璃的组成为：6na2o
·
8k2o
·
8mgo
·
16cao
·
27b2o3·
2p2o5·
27sio2·
6sro(称为常规硼硅酸盐生物活性玻璃)，其余过程与实施例1相同。
91.对比例2
92.与实施例2相比，对比例2的区别仅在于使用的硼硅酸盐生物活性玻璃的组成为：6na2o
·
8k2o
·
8mgo
·
16cao
·
27b2o3·
2p2o5·
27sio2·
6sro(称为常规硼硅酸盐生物活性玻璃)，其余过程与实施例2相同。
93.对比例3
94.与实施例3相比，对比例3的区别仅在于使用的硼硅酸盐生物活性玻璃的组成为：6na2o
·
8k2o
·
8mgo
·
16cao
·
27b2o3·
2p2o5·
27sio2·
6sro(称为常规硼硅酸盐生物活性玻璃)，其余过程与实施例3相同。
95.产品效果测试
96.1.力学性能测试
97.将实施例1-3的复合骨水泥材料注入模具中，在室温下固化1小时候取出，即制得长为(75
±
0.1)mm、宽为(10
±
0.1)mm、厚为(3.3
±
0.1)mm的复合骨水泥试样，进行四点弯曲强度、抗弯模量测试。
98.将实施例1-3的复合骨水泥材料注入模具中，在室温下固化1小时候取出，即制得圆柱状试样，且打磨后的尺寸达到长度为(12
±
0.1)mm、直径为(6
±
0.1)mm的复合骨水泥材料试样，进行抗压强度测试。
99.图1为实施例1-3复合骨水泥材料的力学性能；图1(图1中的横坐标“弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃含量”表示弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃占复合骨水泥材料中固体组分质量百分含量依次为30％、40％、50％，即依次对应实施例1、实施例2、实施例3；图1中的虚线为yy 0459-2003中规定的标准值)中的(a)为四点弯曲强度测试结果，图1中的(b)为抗弯模量测试结果，图1中的(c)为抗压强度测试结果。
100.从图1可以看出，实施例1-3复合骨水泥材料试样测量的四点弯曲强度分别为54.81
±
1.73mpa(实施例1)、54.14
±
1.93mpa(实施例2)和53.29
±
2.01mpa(实施例3)；抗弯模量分别为强度为3766.02
±
83.93mpa(实施例1)、3861.51
±
74.19mpa(实施例2)与3866.86
±
62.79mpa(实施例3)；抗压强度为86.28
±
3.18mpa(实施例1)、90.64
±
2.96mpa
(实施例2)与88.71
±
3.63mpa(实施例3)。
101.以上结果表明，本发明实施例1-3制备的复合骨水泥材料的力学性能良好。
102.对实施例4-6的复合骨水泥材料也进行同样的力学性能测试，测试结果发现力学结果皆符合yy 0459-2003中规定的标准要求，且实施例4-6之间的力学性能无显著性差异。
103.2.浸泡ph值测试
104.由实施例1-3制备的复合骨水泥材料试样，将其浸泡在生理盐水中，于37℃恒温箱中孵育2小时后，测定浸泡液的ph值，对比例1、对比例2、对比例3进行相同的实验。
105.实施例1-3复合骨水泥材料的浸泡液ph值分别为8.89(实施例1)、8.93(实施例2)与9.12(实施例3)，而常规硼硅酸盐生物活性玻璃复合骨水泥材料ph值为10.46(对比例1)、10.73(对比例2)与10.81(对比例3)，表明实施例1-3复合骨水泥材料试样降解后的碱性ph明显降低，优化了其在体内的生物安全性。
106.对实施例4-6的复合骨水泥材料也进行同样的测试，测试结果表明其与常规硼硅酸盐生物活性玻璃复合骨水泥材料的ph值相比，也具有比较低的ph值，和实施例1-3所测试的结果相似。
107.3.溶血测试
108.对实施例1-3制备的复合骨水泥材料试样进行溶血实验。对比例1-3进行相同的实验。
109.图2为实施例1-3复合骨水泥材料、对比例1-3复合骨水泥材料对应的溶血率。
110.从图2(图2中的虚线为yy/t 1651.1-2019中规定的标准值，30％、40％、50％分别指弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃或常规硼硅酸盐生物活性玻璃在固体组分中的含量)可以看出，实施例1-3的复合骨水泥材料的溶血率分别为1.39
±
0.21％(实施例1)、2.34
±
0.35％(实施例2)与4.69
±
0.29％(实施例3)，对比例1-3对应的溶血率分别为23.47
±
1.24％(对比例1)、42.06
±
2.25％(对比例2)与49.18
±
1.99％(对比例3)，表明实施例1-3制备的复合骨水泥材料具有远低于对比例1-3复合骨水泥材料的溶血率，具有更优异的生物安全性。
111.对实施例4-6制备的复合骨水泥材料试样进行同样的溶血实验。实验结果表明(图3)，实施例4-6的复合骨水泥材料的溶血率分别为1.58
±
0.37％(实施例4)、4.60
±
0.47％(实施例5)与2.67
±
0.33％(实施例6)，表明实施例4-6制备的复合骨水泥材料具有与实施例1-3复合骨水泥材料相当的溶血率，都具有优异的生物安全性。
112.4.ph对人的骨髓间充质干细胞(hbmscs)的增殖的影响
113.将hbmscs细胞以5000个/孔种于96孔板中，在不同ph值的α-mem培养基中分别培养1、3和7天后将培养基吸出，更换含有10％(质量浓度)cck-8试剂的培养基(不含血清)在细胞培养箱中孵育1小时，使用酶标仪在450nm检测吸光度，结果如图4所示。
114.图4为hbmscs细胞在不同ph值的含有10％(质量浓度)cck-8试剂的培养基中第1、3和7天的存活情况(图4中的“control”表示对照组，“absorbance@450nm”表示450nm对应的吸光度，“time(day)”表示“时间(天)”；“*”表示p＜0.05，“**”表示p＜0.01，“***”表示p＜0.001，“****”表示p＜0.0001与control组比较)。
115.从图4可知，在第1天时，所有的组的细胞活性无显著性差异。在第3天时，与对照组ph为7.350相比，ph为7.650与7.800组的吸光度无显著性差异，而ph为7.050、6.750以及
7.950组的吸光度较低。在第7天时，对照组以及ph为7.650与7.800组的吸光度较第3天的明显增加，说明细胞增殖正常，未受影响。表明在ph为7.650-7.800范围内的弱碱性环境下hbmscs细胞的增殖未受到明显影响，而ph为7.050与7.950组的吸光度与第3天的对比，增加幅度小于ph为7.350、7.650与7.800三组，并且第7天的吸光度较对照组显著降低。说明ph值大于7.800与小于7.350的条件对细胞代谢产生明显影响，细胞的增殖受到了抑制，细胞的存活率降低。而ph为6.750组的吸光度甚至小于第3天，说明在此条件下，细胞可能开始凋亡。综上，hbmscs细胞可在ph为7.350-7.800范围内保持正常的生理代谢活动。因此表明弱碱性环境对于细胞的生理状况至关重要。
116.5.碱性微环境对hbmscs细胞存活状态的影响
117.将hbmscs细胞以4*10000个/孔种于24孔板中，在不同ph值的α-mem培养基中分别培养1、3、5和7天后将培养基吸出，加入calcein-am/pi试剂(活细胞死细胞双染试剂)在细胞培养箱中孵育30分钟，使用荧光显微镜观察细胞的活死状态，结果如图5所示。
118.图5为hbmscs细胞在不同ph值条件下1、3、5和7天的活细胞染色图(“control”表示对照组，“day1”、“day3”、“day5”、“day7”依次表示第1天、第3天、第5天、第7天)。
119.从图5可以看出，随着时间的增加，ph为7.050-7.950五组的细胞数量逐渐增多，且细胞间的排布更为致密。而ph为6.750组的细胞存活率明显下降，细胞数量明显减少，在7天时剩余活细胞数量较少。并且细胞的形态受到影响较大，细胞间的空隙增大，排布稀疏，单个细胞的形态皱缩。在1天时，ph为7.050、6.750以及7.950组对细胞的影响较大，细胞形态皱缩。ph为7.650与7.800组与对照组无明显差异。结果表明，在较生理环境偏酸性(ph＜7.050)的条件下，hbmscs细胞的增殖受到较大程度地抑制，而生理环境微偏碱性(ph为7.650-7.800)的环境对hbmscs细胞增殖与形态的影响较小，与生理条件相比几乎无发生明显变化。因此表明弱碱性环境有益于细胞的生长。
120.6.碱性微环境对hbmscs碱性磷酸酶(alp)表达的影响
121.将hbmscs细胞成骨诱导分化3、5、7和10天后，使用碧云天bcip/nbt碱性磷酸酶显色试剂盒检测细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，alp)的表达，结果如图6所示。
122.图6为hbmscs细胞在不同ph值条件下成骨诱导3、5、7与10天后的alp染色以及alpl基因的mrna表达水平(“control”表示对照组，“day3”、“day5”、“day7”、“day10”依次表示第3天、第5天、第7天、第10天；“fold change”表示差异倍数，“time(day)”表示时间(天))。
123.图6中(a)为hbmscs细胞进行alp染色的结果，蓝紫色的部分为alp，颜色越深表明酶的含量越高。由图6中(a)可见，随着成骨诱导的天数增加，各组的alp染色的颜色加深，说明alp的表达量都增加。在5天时，ph为7.650组的颜色较对照组更深，同样的在7天时也较对照组明显的颜色更深。而ph为7.850组的颜色与对照组相比无明显区别。使用qpcr检测alpl基因的mrna表达水平(如图6中(b))，研究发现随着成骨诱导的天数增加，各组的alpl的mrna表达水平呈现上升趋势，这与alp染色的结果一致。在5天时，ph为7.650的alpl的mrna表达水平较对照组也明显上调。结合alp染色的结果，说明在ph为7.650的偏碱性胞外环境促进了hbmscs细胞alp的表达。
124.7.碱性微环境对hbmscs细胞col1a1表达的影响
125.将hbmscs细胞成骨诱导分化10天后，测试col1a1基因的mrna表达；使用abcam的天狼星红染液(picro sirius red)进行检测，而且也使用细胞免疫荧光法对col1a1进行检
测，结果如图7所示。
126.图7为hmscs细胞在不同ph值条件下成骨诱导10天后的(a)col1a1的免疫细胞化学；(b)相对荧光强度；(c)col1a1基因的mrna表达水平；(d)天狼星红染色情况(图7中的“control”表示对照组，“dapi”表示4',6-二脒基-2-苯基吲哚，“merged”表示合并，“relative fluorescence intensity for col1a1 staining”表示col1a1染色的相对荧光强度，“fold change”表示差异倍数，“picro-sirius red(10days)”表示10天时，天狼星红染液；“**”表示p＜0.01，“***”表示p＜0.001)。
127.图7中(a)、(b)为成骨诱导hbmscs细胞10天时，细胞免疫荧光图及其相对荧光强度的半定量分析，绿色的部分为ⅰ型胶原α1链(collagen type i alpha 1chain，col1a1)蛋白。由图可知，在较生理环境偏酸性(ph为7.050)的条件下，col1a1蛋白的表达量明显较对照组少，具有显著性差异。而在ph为7.650-7.800范围内的表达较多，并且ph为7.650组与对照组相比存在显著性差异。
128.从col1a1基因的mrna的表达水平(图7中(c))结果可得，在ph为7.650-7.800范围内，col1a1基因的mrna表达较对照组显著上调，而ph为6.750、7.050以及7.950组的表达与对照组相比无明显差异。
129.进一步地使用天狼星红染液对hbmscs细胞的胶原进行染色，红色的部分为胶原蛋白。结果如图7中(d)所示，在较生理环境偏酸性的条件下(6.750-7.050)胶原的表达减少，并且发现细胞的形态与增殖情况都发生明显变化，细胞的增殖受到抑制，细胞形态皱缩。而在较生理环境碱性(7.650-7.800)的条件下，胶原的表达增加。但ⅰ型胶原的表达并不随着碱性的增加而增加，ph为7.950组的胶原表达明显减少，同时发现细胞的形态也发生明显的变化。结果表明，hbmscs细胞只有在较生理微偏碱性(7.650-7.800)的条件下才促进胶原的表达，超出一定范围的ph值条件对细胞存活与细胞的形态都造成影响，从而导致在此条件下细胞的蛋白表达也受到影响。这与col1a1基因的mrna的表达水平的结果一致。结合col1a1的细胞免疫荧光、mrna的表达水平以及天狼星红染色的结果来看，表明一定范围内(ph为7.650-7.800)的碱性环境能促进hmscs细胞ⅰ型胶原的表达，而超出该范围的环境对细胞代谢将可能造成影响，从而降低了蛋白的表达。
130.8.碱性微环境对hbmscs细胞矿化钙结节形成的影响
131.将hmscs细胞成骨诱导分化3、7、10和14天后，使用索莱宝的茜素红染色液对细胞的矿化钙结节情况进行检测，结果如图8所示。
132.图8为hbmscs细胞在不同ph值条件下成骨诱导7、10和14天后的(a)茜素红染色；(b)茜素红半定量(图8中的“day”表示天，“alizarin red s”表示茜素红染色，“control”表示对照组；“alizarin red s absorbance@562nm”表示茜素红染色562nm对应的吸光度，“time(day)”表示时间(天)；“*”表示p＜0.05，“**”表示p＜0.01，“***”表示p＜0.001，“****”表示p＜0.0001与control组比较)。
133.从图8可以看出，在7天时，ph为7.650与7.800两组有矿化钙结节的产生，并在10天时表达量较对照组显著地提高。而在生理条件(ph为7.35-7.45)下，通常在成骨诱导分化14天时才形成矿化钙结节。在较生理微偏碱性(ph为7.650-7.800)的环境下，14天的矿化钙结节较对照组明显增加，而ph为7.950组，并无矿化钙结节的形成。其原因可能是在过碱的环境下，细胞的增殖受到影响，且不适于细胞的成骨相关蛋白如胞外基质的合成，因此无法形
成矿化钙结节。此外，发现在ph＜7.350的条件下也无矿化钙结节的形成。结果表明，随着碱性的增加，矿化的形成增加，但只有在较生理环境微偏碱性(ph为7.650-7.800)的条件下能促进hbmscs细胞矿化钙结节的形成，过碱的条件(ph大于7.950)可能对细胞的代谢产生影响。
134.9.碱性微环境对hbmscs细胞成骨相关基因表达的影响
135.对成骨相关基因sp7的表达在成骨诱导3、7、10和14天时进行检测，结果如图9所示。
136.图9为hbmscs细胞在不同ph值条件下成骨诱导3、7、10与14天后的成骨相关基因sp7的mrna表达水平(“flod change”表示差异倍数，“time(day)”表示时间(天)；“*”表示p＜0.05，“**”表示p＜0.01)。
137.由图9可知随着天数的增加，sp7基因的表达增加。并且发现ph为7.650组的sp7基因的表达水平较对照组显著性上调。
138.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明而进行的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种复合骨水泥材料，其特征在于，包括固体组分和液体组分；所述固体组分包括弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、显影剂；所述液体组分包括甲基丙烯酸甲酯和聚合活化剂；所述弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃的化学组成为axo
·
bb2o3·
cp2o5·
dsio2·
ey2o，其中a、b、c、d和e为摩尔份数，a为4-39，b为5-15、17-35、37-53或55-65，c为1-10，d为0-60，e为2-12，x为ca、mg、sr中的一种或多种，y为na和/或k。2.根据权利要求1所述的复合骨水泥材料，其特征在于，所述显影剂包括氧化锆和/或硫酸钡。3.根据权利要求1所述的复合骨水泥材料，其特征在于，所述固体组分还包括过氧化苯甲酰。4.根据权利要求1所述的复合骨水泥材料，其特征在于，所述弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃中，e的取值范围为5-10。5.根据权利要求1所述的复合骨水泥材料，其特征在于，所述弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃中，a的取值范围为34-39。6.根据权利要求1所述的复合骨水泥材料，其特征在于，所述弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃的化学组成为3na2o
·
2k2o
·
8mgo
·
25cao
·
27b2o3·
2p2o5·
27sio2·
6sro、3na2o
·
4k2o
·
8mgo
·
23cao
·
27b2o3·
2p2o5·
27sio2·
6sro、4na2o
·
6k2o
·
8mgo
·
20cao
·
27b2o3·
2p2o5·
27sio2·
6sro或3na2o
·
4k2o
·
8mgo
·
16cao
·
27b2o3
·
2p2o5·
27sio2·
13sro。7.根据权利要求1所述的复合骨水泥材料，其特征在于，所述弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃中还包括zno和/或cuo。8.根据权利要求1-7任一项所述的复合骨水泥材料，其特征在于，所述弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃在所述固体组分中的质量百分含量为大于20％，小于等于60％。9.根据权利要求1-7任一项所述的复合骨水泥材料，其特征在于，所述固体组分，按照质量百分含量计，包括弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃20.1-60％、聚甲基丙烯酸甲酯30-61.9％、显影剂10-39.9％。10.根据权利要求8所述的复合骨水泥材料，其特征在于，所述弱碱性的复合骨水泥材料中，固体组分与液体组分的质量体积比为(2.1-3.0)g：1ml。11.权利要求1-10任一项所述的复合骨水泥材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：固体组分的制备：称取制备所述弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃的原料组分，混合，熔融，冷却，粉碎，制得所述弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃，然后将所述弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、显影剂混合，制得所述固体组分；液体组分的制备：将所述甲基丙烯酸甲酯和聚合活化剂混合，制得所述液体组分；将所述固体组分和液体组分混合。12.一种组织修复材料，其特征在于，包括权利要求1-10任一项所述的复合骨水泥材料。

技术总结
本发明属于医用材料技术领域，公开了一种弱碱性的复合骨水泥材料及其制备方法和应用。该复合骨水泥材料包括固体组分和液体组分；固体组分包括弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃，弱碱性硼硅酸盐生物活性玻璃的化学组成为aXO


技术研发人员：潘浩波 崔旭 张浩 李红龙 柳春玉
受保护的技术使用者：深圳先进技术研究院
技术研发日：2023.05.24
技术公布日：2023/8/14