一种厚朴七物汤的质量控制方法与流程

1.本技术涉及中药材质量控制技术领域，特别涉及一种厚朴七物汤的质量控制方法。


背景技术：

2.古代经典名方，是古代以来中医典籍中记载的、至今仍应用广泛、疗效确切、具有明显特色优势的方剂。2018年4月，国家中医药管理局发布《古代经典名方目录(第一批)》，确定了首批的100首经典名方，厚朴七物汤位列第27首。
3.厚朴七物汤始载于东汉张仲景所著《金匮要略》一书，书中记载：“病腹满，发热十日，脉浮而数，饮食如故，厚朴七物汤主之”。该方由厚朴、甘草、大黄、大枣、枳壳、肉桂、生姜七味药材组成，方中厚朴行气消满，导滞而和畅腑气；大黄泻热通便，通降浊气；桂枝解肌散风寒，调和营卫；枳实泻热消痞，补益脾胃；甘草、大枣益气生津，生姜解表散寒，起调和诸药、相辅相成的作用。厚朴七物汤属温通之剂，偏重解里，治针对寒气入脉、微脉引发的虚寒证，其病机主要为冷气搏于肠胃，致饮食不消，肠胃挟实而成腹满，主要功效为行气除满、温中下气，攻逐积冷、推陈致新。目前，厚朴七物汤在现代临床上多用于治疗消化不良、腹痛腹胀、呕吐的病症，也有用于治疗肠胃炎症和控制急性支气管哮喘导致的老年性窿闭等方面疾病。
4.迄今为止，对经典名方厚朴七物汤的现代研究多为药理机制及临床应用方面，孙娜等uplc-q-tof-ms建立了厚朴七物汤特征图谱，并指认出甘草苷等7个特征峰；张文娓等通过正交实验法，优化了厚朴七物汤的水提工艺；但总体而言，在厚朴七物汤的基准样品质量控制及制剂工艺方面的研究较少。


技术实现要素：

5.本技术的主要目的是提供一种厚朴七物汤的质量控制方法，旨在解决现有技术中关于厚朴七物汤的质量控制及制剂工艺方面的研究较少，无法全面反映产品质量特征的技术问题。
6.为实现上述目的，本技术提出一种厚朴七物汤的质量控制方法，包括以下步骤：s1.供试品溶液的制备；s2.对照品溶液的制备；
7.s3.测定：分别吸取对照品溶液与供试品溶液注入超高效液相色谱仪进行高效液相色谱分析，记录色谱峰，获得厚朴七物汤的指纹图谱；
8.步骤s3中的高效液相色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相a，以体积分数0.1％的磷酸溶液为流动相b进行梯度洗脱，其中，指纹图谱采用双波长进行测定：0～32min时的检测波长为320nm，32～70min时的检测波长为254nm。
9.可选地，步骤s3中，高效液相色谱条件还包括：色谱柱为waters acquity uplc csh c18，2.1mm
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100mm，1.7μm，柱温为30-40℃，进样量为2μl，流速为0.25～0.35ml/min。在上述色谱柱、柱温、流速条件下，色谱峰的分离度更好。
10.可选地，步骤s3中的梯度洗脱条件为：0～5min，流动相a10～12％，流动相b 90-88％；5～15min，流动相a12～13％，流动相b88-87％；15～20min，流动相a13～15％，流动相b 87-85％；20～32min，流动相a15％，流动相b 85％；32～35min，流动相a15～28％，流动相b 85-72％；35～45min，流动相a 28～30％，流动相b 72-70％；45～50min，流动相a 30～35％，流动相b 70-65％；50～55min，流动相a35～37％，流动相b 65-63％；55～60min，流动相a 37～50％，流动相b63-50％；60～70min，流动相a 50～70％，流动相b 50-30％。
11.可选地，步骤s1包括如下步骤：精密称定厚朴七物汤冻干粉0.25-0.5g，于容器中精密加入甲醇25-50ml，称定质量后超声处理20-30min，冷却后再次称定质量，加入甲醇补足减少的质量并摇匀，离心处理5-10min，于0.2-0.45um的微孔滤膜下过滤后，即得到所述供试品溶液。制剂可制成对应的冻干粉或喷雾粉等。
12.可选地，步骤s2包括如下步骤：精密称定甘草苷、柚皮苷、桂皮醛、新橙皮苷、大黄酸、6-姜辣素、甘草酸铵、大黄素、大黄酚、和厚朴酚、芦荟大黄素、厚朴酚对照品，向上述对照品中分别加入甲醇摇匀，制成含量分别为200-400mg
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的单一对照品储备液；精密量取大黄酸、6-姜辣素、甘草酸铵、大黄素、大黄酚、和厚朴酚、芦荟大黄素、厚朴酚单一对照品储备液，于容器中全部混合(吸取不同量的单一对照品储备液，混合后再加入甲醇定容)，再加入不同量的甲醇摇匀，制成质量浓度分别为2-10mg
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的混合对照品溶液1；精密量取甘草苷、柚皮苷、桂皮醛、新橙皮苷单一对照品储备液，于容器中全部混合，再加入不同量的甲醇摇匀，制成质量浓度分别为20-50mg
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的混合对照品溶液2。
13.可选地，厚朴七物汤的指纹图谱包括23个特征峰，其中，4号、20号、22号峰为厚朴，12号、18号、19号、21号、23号峰为大黄，1号、2号、11号峰、13号、14号、16号、17号峰为甘草，3号、5号、6号、9号、10号峰为枳壳，7号峰为肉桂，15号峰为生姜，8号峰为共有峰。
14.可选地，还包括采用薄层色谱法鉴别厚朴七物汤的厚朴、大黄、甘草、枳壳、肉桂、生姜中的至少一种。
15.可选地，厚朴的薄层鉴别过程包括：取厚朴七物汤制剂1-2g，加入20-30ml甲醇超声20-30min，振摇后滤过，滤液蒸干获得残渣，再加15-20ml水溶解，以乙醚振摇提取2-3次，每次获得15-20ml溶液，再合并乙醚溶液，蒸干，获得的残渣再加入2-3ml甲醇溶解，制成供试品溶液；取厚朴对照药材及缺厚朴阴性制剂各1-2g，分别加入20-30ml甲醇超声20-30mi，分别振摇后滤过，滤液蒸干获得残渣，再分别加15-20ml水溶解，分别以乙醚振摇提取2-3次，每次获得15-20ml溶液，再合并乙醚溶液，蒸干，获得的残渣再加入2-3ml甲醇溶解，制成对照药材溶液及阴性供试品溶液；另取厚朴酚、和厚朴酚对照品，加入甲醇分别制成每ml各含1-2mg的溶液，制成对照品溶液；
16.大黄的薄层鉴别过程包括：取厚朴七物汤制剂1-2g，加20-30ml甲醇超声45-60min滤过，取滤液5-10ml蒸干，残渣加水10-20ml溶解，再加盐酸1-2ml，加热回流30-45min，立即冷却，以乙醚振摇提取2-3次，每次获得15-20ml溶液，合并乙醚溶液，蒸干，获得的残渣加2-3ml甲醇溶解，制成供试品溶液；取大黄对照药材及缺大黄阴性制剂各1-2g，分别加20-30ml
甲醇超声45-60min滤过，分别取滤液5-10ml蒸干，残渣分别加水10-20ml溶解，再分别加盐酸1-2ml，分别加热回流30-45min，立即冷却，分别以乙醚振摇提取2-3次，每次获得15-20ml溶液，合并乙醚溶液，蒸干，获得的残渣加2-3ml甲醇溶解，制成对照药材溶液剂阴性样品溶液；另取大黄酸对照品，加甲醇制成每ml各含1-2mg的混合溶液，制成对照品溶液；
17.甘草的薄层鉴别过程包括：取厚朴七物汤制剂1-2g，加20-30ml乙醇冷浸20-30min，滤过后获得滤液，浓缩至2-3ml，制成供试品溶液；取甘草对照药材及缺甘草阴性制剂各1-2g，分别加20-30ml乙醇冷浸20-30min，分别滤过后获得滤液，分别浓缩至2-3ml，制成对照药材溶液及阴性样品溶液；另取甘草苷、甘草酸铵对照品，加甲醇分别制成每ml各含1-2ml的混合溶液，制成对照品溶液；
18.枳壳的薄层鉴别过程包括：取厚朴七物汤制剂1-2g，加20-30ml乙醇冷浸20-30min，滤过后获得滤液，浓缩至2-3ml，制成供试品溶液；取枳壳对照药材及缺枳壳阴性制剂各1-2g，加20-30ml乙醇冷浸20-30min，滤过后获得滤液，浓缩至2-3ml，制成对照药材溶液及阴性样品溶液；另取柚皮苷、新橙皮苷对照品，加甲醇分别制成每ml各含1-2mg的混合溶液，制成对照品溶液；
19.肉桂的薄层鉴别过程包括：取厚朴七物汤制剂1-2g，加20-30ml乙醇冷浸20-30min后，滤液浓缩至2-3ml，制成供试品溶液；取肉桂对照药材及缺大枣阴性制剂各1-2g，加20-30ml乙醇冷浸20-30min后，滤液浓缩至2-3ml，制成对照药材溶液及阴性样品溶液；另取桂皮醛对照品，加乙醇分别制成每ml各含1-2mg的混合溶液，制成对照品溶液；
20.生姜的薄层鉴别过程包括：取厚朴七物汤制剂1-2g，加20-30ml水溶解，用水饱和正丁醇提取3-4次，每次15-20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2-3次，每次15-20ml，弃去水液，蒸干正丁醇液，残渣加2-3ml甲醇溶解，制成供试品溶液；取生姜对照药材及缺生姜阴性制剂各1-2g，加20-30ml水溶解，用水饱和正丁醇提取3-4次，每次15-20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2-3次，每次15-20ml，弃去水液，蒸干正丁醇液，残渣加2-3ml甲醇溶解，制成对照药材溶液及阴性样品溶液；另取6-姜辣素对照品，加甲醇制成每ml各含1-2mg的混合溶液，制成对照品溶液。
21.可选地，厚朴、甘草、枳壳、肉桂和生姜所用薄层板为硅胶g薄层板，大黄所用薄层板为硅胶h薄层板；厚朴、大黄的展开剂为环己烷-乙酸乙酯-甲酸，甘草的展开剂为乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸-水，枳壳的展开剂为三氯甲烷-甲醇-水，肉桂的展开剂为石油醚-乙酸乙酯，生姜的展开剂为石油醚-三氯甲烷-乙酸乙酯；大黄薄层板在波长为365nm的紫外光下观察；厚朴、生姜的显色剂为香草醛硫酸溶液，甘草的显色剂为硫酸乙醇溶液，枳壳的显色剂为三氯化铝乙醇溶液，肉桂的显色剂为二硝基苯肼乙醇溶液，均为显色后在日光下观察。
22.可选地，还包括采用厚朴七物汤的含量测定方法，包括如下步骤：供试品溶液的制备：精密称定厚朴七物汤冻干粉0.25-0.5g，于容器中精密加入甲醇25-50ml，称定质量后超声处理15-20min，冷却后再次称定质量，加入甲醇补足减少的质量并摇匀，离心处理5-10min，于0.2-0.45um的有机微孔滤膜下过滤后，即得到所述供试品溶液；
23.对照品溶液的制备：分别精密量取甘草苷、柚皮苷、桂皮醛、新橙皮苷、大黄酸，6-姜辣素，甘草酸铵，大黄素，大黄酚，和厚朴酚，芦荟大黄素，厚朴酚对照品，分别加入甲醇溶液制成各单一对照品储备液；精密量取大黄酸，6-姜辣素，甘草酸铵，大黄素，大黄酚，和厚朴酚，芦荟大黄素，厚朴酚对照品储备液，于容器中全部混合，再加入不同量的甲醇摇匀，制
成质量浓度分别为2-10mg
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的混合对照品溶液1；精密量取甘草苷、柚皮苷、桂皮醛、新橙皮苷对照品储备液，于容器中全部混合，再加入不同量的甲醇摇匀，制成质量浓度分别为20-50mg
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的混合对照品溶液2；
24.测定：取供试品溶液和对照品溶液分别采用与上述指纹图谱一致的超高效液相色谱法检测，以acquity uplc csh c18色谱柱为色谱柱，以乙腈为流动相a，以体积分数0.1％的磷酸溶液为流动相b进行梯度洗脱，流速为0.25～0.35ml/min。
25.本技术的厚朴七物汤的质量控制方法具有如下有益效果：本发明在现有技术的基础上，运用超高效液相色谱法(uplc)建立了厚朴七物汤基准样品的指纹图谱，采用相似度评价法及相关化学模式识别方法进行分析，同时测定了甘草苷等12种指标成分的含量，以此反映厚朴七物汤基准样品的质量特征，为厚朴七物汤的后续研究提供参考依据，以更好地反映其药理药效基础的相关性，专属性良好，各特征峰间分离度良好，不同化学成分间无明显干扰，精密度、稳定性、重复性均符合要求。得到的厚朴七物汤指纹图谱能够全面反映厚朴七物汤配方中多种成分的整体面貌，能定性、定量的分析厚朴七物汤的质量，为厚朴七物汤的质量控制提供了新方法。
附图说明
26.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
27.图1为本技术提供的厚朴七物汤uplc-pad指纹图谱对照指认图；图2为本技术提供的厚朴薄层鉴别色谱图；图3为本技术提供的大黄薄层鉴别色谱图；图4为本技术提供的甘草薄层鉴别色谱图；图5为本技术提供的枳壳薄层鉴别色谱图；图6为本技术提供的肉桂薄层鉴别色谱图；图7为本技术提供的生姜薄层鉴别色谱图；图8为本技术提供的厚朴七物汤在不同波长条件下的uplc-pad指纹图谱对比图；图9为本技术提供的厚朴七物汤在不同流动相条件下的uplc-pad指纹图谱对比图；图10为本技术提供的厚朴七物汤在不同色谱柱条件下的uplc-pad指纹图谱对比图；图11为本技术提供的厚朴七物汤在不同柱温条件下的uplc-pad指纹图谱对比图；图12为本技术提供的厚朴七物汤在不同流速条件下的uplc-pad指纹图谱对比图；图13为本技术提供的厚朴七物汤在不同提取溶剂下的uplc-pad指纹图谱对比图；图14为本技术提供的厚朴七物汤在不同提取方式下的uplc-pad指纹图谱对比图；图15为本技术提供的厚朴七物汤在不同提取时间下的uplc-pad指纹图谱对比图；图16为本技术提供的厚朴七物汤在不同料液比下的uplc-pad指纹图谱对比图；图17为厚朴七物汤全方与各阴性基准样品uplc-pad对比图；图18为15个批次的厚朴七物汤基准样品uplc-dad指纹图谱；图19为对比例色谱条件进样本方案供试品及对比例供试品的指纹图谱；图20为按对比例色谱条件进样对比例供试品的指纹图谱；图21为本方案的色谱条件进样对比例供试品的指纹图谱；图22为按本方案色谱条件，本方案供试品与对比例供试品双波长检测图谱的对比图；图23为按本方案色谱条件及对比例色谱条件，分别进样实验例供试品的色谱图。
28.本技术目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
29.为使本技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
30.1.厚朴七物汤物质基准制备
31.厚朴七物汤基准样品制备工艺为：称取厚朴七物汤药材，厚朴110.4g，大黄41.4g，甘草41.4g，枳壳60g，肉桂27.8g，大枣30g，生姜69g，倒入陶瓷煎药壶中，浸泡30min后，以500w火力煮沸，转300w火力保持微沸状态煎煮，煎煮过程中不开盖不搅拌，煎煮至约800ml煎液，趁热以400目药筛过滤，倾出药液，放冷分装后，经预冷、抽真空、一次升华、解析干燥的步骤真空冷冻干燥72h，即得厚朴七物汤基准样品冻干粉。
32.2.厚朴七物汤的薄层鉴别
33.(1)仪器
[0034][0035]
(2)材料
[0036][0037]
[0038]
(3)实验内容
[0039]
厚朴的薄层鉴别：分别取s1-s15批次厚朴七物汤冻干粉1.0g，加甲醇20ml，密塞，超声30min，时时振摇，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，以乙醚振摇提取2次，每次20ml,合并乙醚溶液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；取厚朴对照药材及缺厚朴阴性冻干粉各1g，同法制成对照药材溶液及阴性供试品溶液；另取厚朴酚、和厚朴酚对照品，加甲醇分别制成每1ml各含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，取各样品5ul，对照品及对照药材2ul，分别点于同一硅胶g薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(15：5：0.2)为展开剂展开，取出晾干，喷以1％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，后于日光检视，供试品色谱中，在于对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
[0040]
图2为厚朴的薄层板薄层色谱图，其中：1～7为厚朴七物汤，s1-s7，5ul；8为厚朴对照药材，2ul；9为厚朴酚，2ul；10为厚朴阴，s1，5ul；11为和厚朴酚，2ul；12～19为厚朴七物汤，s8-s15，5ul。
[0041]
大黄的薄层鉴别：分别取s1-s15批次厚朴七物汤冻干粉1.0g，加甲醇20ml，超声1小时，滤过，取滤液5ml蒸干，残渣加水10ml使溶解，再加盐酸1ml，加热回流30min，立即冷却，以乙醚振摇提取2次，每次20ml,合并乙醚溶液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；取大黄对照药材及缺大黄阴性冻干粉各1g，同法制成对照药材溶液剂阴性样品溶液；另取大黄酸对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，取各样品及对照品2ul，对照药材10ul，分别点于同一硅胶h薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(15：5：1)的上层溶液为展开剂展开，取出晾干，于紫外灯365nm下检视，供试品色谱中，在于对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
[0042]
图3为大黄的薄层板薄层色谱图，其中：1～7为厚朴七物汤，s1-s7，2ul；8为大黄对照药材，10ul；9为厚朴阴，s1，2ul；10为大黄酸，2ul；11～18为厚朴七物汤，s8-s15，2ul。
[0043]
甘草的薄层鉴别：分别取s1-s15批次厚朴七物汤冻干粉1.0g，加乙醇20ml，冷浸20min，滤过，滤液浓缩至2ml，作为供试品溶液；取甘草对照药材及缺甘草阴性冻干粉各1g，同法制成对照药材溶液及阴性样品溶液；另取甘草苷、甘草酸铵对照品，加甲醇分别制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，取各溶液1-2ul，分别点于同一硅胶g薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15：1：1：2)为展开剂展开，取出晾干后，喷以10％硫酸乙醇溶液，晾干后，在105℃加热至斑点显色清晰，后于紫外365nm下检视，供试品色谱中，在于对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
[0044]
图4为甘草的薄层板薄层色谱图，其中：1～7为厚朴七物汤，s1-s7，10ul；8为甘草对照药材，10ul；9为甘草阴，s1，10ul；10为甘草苷，5ul；11～18为厚朴七物汤，s8-s15，2ul。
[0045]
枳壳的薄层鉴别：分别取s1-s15批次厚朴七物汤冻干粉1.0g，加甲醇20ml，超声30min，滤过，滤液蒸干，残渣用2ml甲醇溶解作为供试品溶液；取枳壳对照药材及缺枳壳阴性冻干粉各1g，同法制成对照药材溶液及阴性样品溶液；另取柚皮苷、新橙皮苷对照品，加甲醇分别制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，取各溶液2ul，分别点于同一硅胶g紫光薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13：6：2)的下层溶液为展开剂展开，取出晾干后，喷以3％三氯化铝乙醇溶液，晾干后，于紫外365nm下检视，供试品色谱中，在于对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
[0046]
图5为枳壳的薄层板薄层色谱图，其中：1～7为厚朴七物汤，s1-s7，2ul；8为枳壳对照药材，2ul；9为甘草苷，2ul；10为枳壳阴，s1，2ul；11为新橙皮苷，2ul；12～19为厚朴七物汤，s8-s15，2ul。
[0047]
肉桂的薄层鉴别：分别取s1-s15批次厚朴七物汤冻干粉1.0g，浸泡20min后，滤液浓缩至2ml，作为供试品溶液；取肉桂对照药材及缺大枣阴性冻干粉各1g，同法制成对照药材溶液及阴性样品溶液；另取桂皮醛对照品，加乙醇分别制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，取各溶液2-4ul，分别点于同一硅胶g薄层板上，以石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(17：3)为展开剂展开，取出晾干，喷二硝基苯肼乙醇溶液，晾干后，于日光下检视，供试品色谱中，在于对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
[0048]
图6为肉桂的薄层板薄层色谱图，其中：1～7为厚朴七物汤，s1-s7，2ul；8为桂皮醛，4ul；9为肉桂阴，s1，2ul；10为肉桂对照药材，2ul；11～18为厚朴七物汤，s8-s15，2ul。
[0049]
生姜的薄层鉴别：分别取s1-s15批次厚朴七物汤冻干粉1.0g，加水20nl使溶解，用水饱和正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次20ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；取生姜对照药材及缺生姜阴性冻干粉各1g，同法制成对照药材溶液及阴性样品溶液；另取6-姜辣素对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，取供试品溶液10ul，对照药材2-4ul，对照品1-2ul，分别点于同一硅胶g薄层板上，以石油醚(60-90℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯(2：1：1)为展开剂展开，取出晾干，喷以1％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，后于日光下检视，供试品色谱中，在于对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
[0050]
图7为生姜的薄层板薄层色谱图，其中：1～7为厚朴七物汤，s1-s7，10ul；8为生姜对照药材，4ul；9为生姜阴，s1，10ul；10为6-姜辣素，2ul；11～18为厚朴七物汤，s8-s15，10ul。
[0051]
3.厚朴七物汤的指纹图谱建立
[0052]
(1)仪器
[0053][0054]
(2)材料
[0055]
名称批号/级别厂家厚朴酚110729-202015中国食品药品检定研究院和厚朴酚110730-201915中国食品药品检定研究院大黄酚110796-201922中国食品药品检定研究院大黄酸110757-201607中国食品药品检定研究院
大黄素110756-201913中国食品药品检定研究院芦荟大黄素110795-202011中国食品药品检定研究院甘草苷111610-202209中国食品药品检定研究院甘草酸铵110731-202122中国食品药品检定研究院柚皮苷110722-202116中国食品药品检定研究院新橙皮苷111857-201804中国食品药品检定研究院桂皮醛110710-202022中国食品药品检定研究院6-姜辣素111833-202007中国食品药品检定研究院乙腈色谱纯赛默飞世尔科技(中国)有限公司甲醇色谱纯赛默飞世尔科技(中国)有限公司水纯净水广州屈臣氏食品饮料有限公司
[0056]
注：本方案所用其它试剂均为分析纯。
[0057]
(3)指纹图谱的建立
[0058]
供试品溶液的制备：精密称定厚朴七物汤冻干粉0.5g，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定质量，超声处理(400w，40khz)30min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减少的质量，摇匀，离心(12000r
·
min-1
)5min，0.22μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
[0059]
阴性样品溶液的制备：按上述供试品溶液的制备方法分别制备缺厚朴、缺大黄、缺甘草、缺枳壳、缺肉桂、缺大枣、缺生姜的阴性样品溶液。
[0060]
对照品溶液的制备：分别取甘草苷、柚皮苷、桂皮醛、新橙皮苷、大黄酸、6-姜辣素、甘草酸铵、大黄素、大黄酚、和厚朴酚、芦荟大黄素、厚朴酚对照品适量，精密称定，置于不同量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，制成含量分别为420、1032、1066、998.4、104.3、894.5、615.2、104.2、52.7、205.2、50.1、233.6μg
□
ml-1
的单一对照品储备液。
[0061]
精密量取大黄酸，6-姜辣素，甘草酸铵，大黄素，大黄酚，和厚朴酚，芦荟大黄素，厚朴酚对照品储备液适量，置于同一量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为2.09，35.78，24.61，4.17，1.05，4.10，1.00，4.67mg
·
l-1的混合对照品溶液1；精密量取甘草苷、柚皮苷、桂皮醛、新橙皮苷对照品储备液适量，置于同一量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为16.80，123.84，2.13，119.81mg
·
l-1
混合对照品溶液2。
[0062]
(4)色谱条件的考察
[0063]
波长的选择：通过查阅文献及2020年版《中国药典》可知，目前，厚朴七物汤指纹图谱的检测波长主要有237nm、254nm、280nm、283nm、290nm、294nm等。采用pda进行全波长扫描(190～400nm)，将不同波长色谱图进行比较，以基线、峰形、峰数、分离度等因素为波长选定标准，以期获得最大化指纹图谱信息。本方案的厚朴七物汤指纹图谱采取双波长洗脱方法，在0～32min的波长为320nm，32～70min的波长为254nm，根据图8的多波长对比结果，本方案采用的双波长洗脱方法所得的色谱峰数量更多，峰高合适，峰型完整，基线平稳，更适于后续指纹图谱色谱峰定性定量研究。
[0064]
流动相的选择：本方案选取6种不同流动相(分别为流动相1：乙腈-0.05％磷酸；流动相2：乙腈-0.1％甲酸；流动相3：乙腈-0.1％乙酸；流动相4：乙腈-水；流动相5：甲醇-0.1％磷酸；流动相6：乙腈-0.1％磷酸)进行uplc进样比较研究，确定适宜的流动相。根据图9中的不同流动相对比结果发现，采用乙腈-磷酸体系作为流动相时，色谱峰分离度更好，而
乙腈-0.1％磷酸对比乙腈-0.05％的出峰时间适中，效果更好。
[0065]
色谱柱的选择：本方案选择不同色谱柱类型：waters acquity uplc hss t3(2.1mm*100mm，1.7μm)，waters acquity uplc beh c
18
(2.1mm*100mm，1.7μm)，waters acquity uplc csh
tm c
18
(2.1mm*100mm，1.7μm)，按上述确定条件进样供试品溶液，并对uplc指纹图谱进行比较，确定最适宜的色谱柱。根据图10中的不同色谱柱对比结果发现，采用csh
tm c
18
色谱柱作为色谱条件时，色谱峰出峰数量，色谱峰分离度，响应因子值均优于其他两种类型色谱峰，故选择cshtm c18色谱柱作为指纹图谱条件。
[0066]
柱温的选择：本方案选择不同柱温(30℃，35℃，40℃)，按上述确定条件进样供试品溶液，并对uplc指纹图谱进行比较，确定最适柱温。根据图11中不同色谱柱柱温对比结果发现，柱温为35℃时，色谱峰分离度明显优于其他柱温时的色谱峰分离度，故选择色谱柱柱温为35℃作为最优的指纹图谱条件。
[0067]
流速的选择：选择不同流速(0.25ml
·
min-1
，0.3ml
·
min-1
，0.35ml
·
min-1
)，按上述确定条件进样供试品溶液，并对uplc指纹图谱进行比较，确定最适流速。根据图12中的不同流动相流速对比结果发现，采用流动相流速为0.3ml
·
min-1
时，色谱峰分离度明显优于其他色流速时的色谱峰分离度，故选择流动相流速0.3ml
·
min-1
作为最优的指纹图谱条件。
[0068]
综上，本方案确定的最优色谱条件为：高效液相色谱仪类型waters uplc h-class；色谱柱类型waters acquity uplc cshtm c
18
(2.1mm
×
100mm，1.7μm)；流动相选择乙腈(a)、0.1％磷酸水溶液(b)；进样量2μl；柱温35℃；流速0.3ml
·
min-1
；检测波长的程序为双波长检测：0～31min，320nm；31～70min，254nm。梯度洗脱条件如下：0～5min，a 10～12％，b 90-88％；5～15min，a12～13％，b 88-87％；15～20min，a 13～15％，b 87-85％；20～31min，a 15％，b 85％；31～35min，a 15～28％，b 85-72％；35～45min，a28～30％，b 72-70％；45～50min，a 30～35％，b 70-65％；50～55min，a 35～37％，b 65-63％；55～60min，a 37～50％，b 63-50％；60～70min，a 50～70％，b 50-30％。
[0069]
(5)供试品制备方法的考察
[0070]
提取溶剂的考察：精密称定厚朴七物汤冻干粉0.5g，置50ml具塞锥形瓶中，共称取5组，每组平行2次，各组分别精密加入甲醇、乙醇、50％甲醇、50％乙醇、水25ml，称定质量，超声处理30min，放冷，再次称定质量，分别用相应溶剂补足减少的质量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，即得相应溶剂的供试品溶液。按前一步确定的色谱条件进样，记录特征峰的峰面积。根据图13中不同提取溶剂对比结果发现采用甲醇作为提取溶剂时，所得的色谱峰出峰时间适中，峰型更好，分离度更高，响应因子数值更大，基线平稳，故提取溶剂使用甲醇作为供试品条件。
[0071]
提取方式的考察：精密称定厚朴七物汤冻干粉0.5g，置50ml具塞锥形瓶中，共称取3组，每组平行2次，各组分别精密加入甲醇25ml，称定质量，一组超声处理30min，二组回流提取30min，三组冷浸30min，分别放冷，再次称定质量，用甲醇补足减少的质量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，即得相应供试品溶液。按前一步确定的色谱条件进样，记录特征峰的峰面积。
[0072]
不同提取方式总峰面积结果
[0073][0074]
根据图14中的不同提取方式对比结果发现，三种提取方式对色谱峰出峰时间，分离度影响不大，对分离度值r＞1.5的色谱峰进行总峰面积结果计算发现，采用超声提取方式时，总峰面积大于其他两种提取方式，故采用超声作为供试品提取方式进行指纹图谱的考察。
[0075]
提取时间的考察：精密称定厚朴七物汤冻干粉0.5g，置50ml具塞锥形瓶中，共称取4组，每组平行2次，各组分别精密加入甲醇25ml，称定质量，一组超声处理15min，二组超声提取30min，三组超声提取45min，四组超声提取60min，分别放冷，再次称定质量，用甲醇补足减少的质量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，即得相应供试品溶液。按前一步确定的色谱条件进样，记录特征峰的峰面积。
[0076]
不同提取时间总峰面积结果
[0077][0078]
根据图15中的不同提取方式对比结果发现，提取时间对色谱峰出峰时间，分离度影响不大，对分离度r＞1.5的色谱峰进行总峰面积结果计算发现，超声时间的增加，对总峰面积的提升效果不佳，考虑到实验的便捷性，故采用超声15min作为供试品提取时间进行指纹图谱的考察。
[0079]
料液比的考察：精密称定厚朴七物汤冻干粉，共称取4组，每组平行2次，置50ml具塞锥形瓶中，一组精密称定0.5g，精密加入甲醇25ml，二组精密称定1g，精密加入甲醇25ml，三组精密称定0.5g，精密加入甲醇50ml，四组精密称定1g，精密加入甲醇50ml，分别称定质量，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减少的质量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，即得相应供试品溶液。按前一步确定的色谱条件进样，记录特征峰的峰面积。
[0080]
不同料液比总峰面积结果
[0081][0082]
根据图16中的不同料液比对比结果发现，四组料液比方式对色谱峰出峰时间，分离度影响不大，色谱峰高度及响应因子值随料液比值的减小而增加，通过对分离度r＞1.5的色谱峰进行总峰面积结果计算发现，换算为同等系数时，料液比0.5g-25ml时，总峰面积大于其他三种料液比方式，故采用0.5g-25ml的料液比值进行指纹图谱的考察。
[0083]
综上，本方案确定的最优供试品制备方法为：称取0.25g上述厚朴七物汤基准样品冻干粉，加入25ml甲醇溶液，称定质量，超声15min，放冷后再次称定，并以甲醇补足损失的质量，摇匀，12000r
·
min-1
离心10min，用0.22μm滤膜过滤，即得厚朴七物汤基准样品供试品溶液。
[0084]
对比例
[0085]
供试品的制备：取厚朴24g，甘草9g，大黄9g，大枣25g，枳实10g，桂枝6g，生姜15g，共98g；加水煎煮二次，第1次加12倍量水1176g，煎煮2小时，第2次加10倍量水980g，煎煮1小时，合并煎液，滤过，滤液真空冷冻干燥冻干72h，即得对比例1的冻干粉。取冻干粉0.5g,精密称定，加入甲醇25ml,超声30min，离心后滤过，即得对比例1供试品。
[0086]
色谱条件：色谱柱类型：agilent zorbax eclipse xdb-c18色谱柱(4.6
×
250mm，5μm)；流动相选择：乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)。梯度洗脱条件：0-15min，a：b为5％：95％
→
15％：85％；15min，a：b为15％：85％；15-45min，a：b为15％：85％
→
20％：80％；45min，a：b为20％：80％；45-70min，a：b为20％：80％
→
40％：60％；70min，a：b为40％：60％；70-90min，a：b为40％：60％
→
60％：40％；90min，a：b为60％：40％；90-110min，a：b为60％：40％
→
80％：20％。检测波长为254nm；流速为1.0ml/min，柱温为30℃；理论塔板数按柚皮苷峰计应不低于3000；进样量为10ul。
[0087]
按对比例的色谱条件进样本方案的供试品及对比例供试品，如图19所示，图中，a为对照品，b为厚朴七物汤本方案样品，c为对比例样品，通过结果发现，采用对比例的色谱条件进样，本方案对染能获取更多的色谱峰，但分离效果不佳。
[0088]
按对比例的原方法进样，按对比例色谱条件进样对比例供试品，观察图20的图谱结果发现，a为对比例样品，b为对照品，对比例样品出峰较完整，但目标峰分离度一般。
[0089]
按本方案的色谱条件进样对比例样品，并进行254nm波长与双波长图谱对比，如图21所示，a为对比例双波长检测，b为对比例254nm检测，根据图谱对比结果发现，双波长检测时，前段采用320nm波长检测，更少杂峰对目标峰产生干扰，30min的柚皮苷分离效果更佳。
[0090]
按本方案色谱条件，本方案供试品与对比例供试品双波长检测图谱对比，如图22
所示，a为对照品，b为对比例样品，c为厚朴七物汤样品，两个供试品出峰效果均良好，但对比例未见25min的桂皮醛色谱峰。
[0091]
按本方案的条件及对比例条件，进样本方案供试品，对比不同检测方法对色谱图的影响，如图23所示，a为对比例，254nm检测；b为对比例，双波长检测；c为对比例色谱条件检测，通过图谱结果可看出，两种色谱条件均能完整出峰，但本方案的条件出峰更快，色谱峰数目更多，可节省40min的实验时间；对比双波长检测方法及254nm单波长检测结果，发现双波长检测时，320nm检测波段的色谱峰杂峰对目标峰的影响更小，目标峰峰型更好看。
[0092]
4.方法学验证
[0093]
(1)专属性验证
[0094]
取厚朴七物汤供试品溶液、空白溶剂甲醇溶液、阴性样品溶液进行uplc-pda分析，按上述色谱条件测定，记录色谱图，如图17所示。按分离度及响应因子值，厚朴七物汤基准样品色谱图共标定23个特征峰，根据与阴性色谱图对比结果发现，各特征峰间分离度良好，不同化学成分间无明显干扰，说明此指纹图谱方法专属性良好。
[0095]
峰归属及指认：按照供试品制备方法制备厚朴七物汤供试品溶液及按照混合对照品制备方法制备混合对照品溶液，根据上述色谱条件进行uplc-pad检测，记录色谱图，如图1所示，根据对照品指认了13个专属峰，根据对比结果，确认归属于厚朴的峰为峰4、20、22，归属于大黄的峰为峰12、18、19、21、23，归属于甘草的峰为峰1、2、11、13、14、16、17，归属于枳壳的峰为峰3、5、6、9、10，归属于肉桂的峰为峰7，归属于生姜的峰为峰15，峰8为共有峰。
[0096]
图1中，a为厚朴七物汤样品；b为混合对照溶液1；c为混合对照溶液2；d为甲醇空白。1为甘草苷；6为柚皮苷；7为桂皮醛；10为新橙皮苷；12为大黄酸；14为6-姜辣素；17为甘草酸铵(s)；18为大黄素；19为大黄酚；20为和厚朴酚；21为芦荟大黄素；22为厚朴酚；23为大黄素甲醚。
[0097]
(2)精密度验证
[0098]
取厚朴七物汤供试品溶液，按上述色谱条件连续测定6次，选择出峰时间适中、响应因子较高的17号峰为参照峰(s)，计算各共有峰相对保留时间，具体结果见以下表格，根据结果发现，各共有峰相对保留时间rsd≤0.26％，表明仪器精密度良好。
[0099]
指纹图谱精密度考察相对保留时间结果
[0100][0101]
(3)稳定性验证
[0102]
取厚朴七物汤供试品溶液适量，分别于制备后0，2，4，8，12，24h按上述色谱条件测定，选择出峰时间适中、响应因子较高的17号峰为参照峰(s)，计算各共有峰相对保留时间。根据结果发现，各共有峰相对保留时间rsd≤0.92％，表明该供试品在24h内相对稳定，具体结果见以下表格。
[0103]
指纹图谱稳定性考察相对保留时间结果
[0104][0105]
(4)重复性验证
[0106]
取厚朴七物汤冻干粉适量，按供试品制备方法平行制备供试品溶液6份，按前一步确定的色谱条件测定，选择出峰时间适中、响应因子较高的17号峰为参照峰(s)，计算各共有峰相对保留时间。根据结果发现，各共有峰相对保留时间rsd≤0.47％，表明该方法重复性良好，具体结果见以下表格。
[0107]
指纹图谱重复性考察相对保留时间结果
[0108][0109]
(5)15批次相似度评价
[0110]
将15批次指纹图谱与生成对照图谱进行相似度评价(见图18)，相似度分别为0.984、0.989、0.983、0.975、0.931、0.971、0.983、0.972、0.982、0.990、0.979、0.980、0.968、0.979、0.988，15批次相似度结果均＞0.9，表明15批次基准样品指纹图谱间相似度良好。
[0111]
15批次厚朴七物汤基准样品指纹图谱相似度评价结果
[0112][0113][0114]
5.厚朴七物汤指标性成分含量测定研究
[0115]
供试品制备：精密称定厚朴七物汤冻干粉0.25g，精密加入甲醇25ml，称定质量，超声处理(400w，40khz)15min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减少的质量，摇匀，离心(12000r
·
min-1)5min，离心液用0.22μm有机微孔滤膜过滤，即得厚朴七物汤供试品溶液。
[0116]
对照品制备：分别精密量取甘草苷、柚皮苷、桂皮醛、新橙皮苷、大黄酸，6-姜辣素，
甘草酸铵，大黄素，大黄酚，和厚朴酚，芦荟大黄素，厚朴酚对照品适量，分别加入甲醇溶液制成各单一对照品储备液。精密量取大黄酸，6-姜辣素，甘草酸铵，大黄素，大黄酚，和厚朴酚，芦荟大黄素，厚朴酚对照品储备液适量，置于同一量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为2.09，35.78，24.61，4.17，1.05，4.10，1.00，4.67mg
·
l-1
的混合对照品溶液1；精密量取甘草苷、柚皮苷、桂皮醛、新橙皮苷对照品储备液适量，置于同一量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为16.80，123.84，2.13，119.81mg
·
l-1
混合对照品溶液2。
[0117]
线性关系：取前项配置的对照品储备液，分别稀释为线性浓度的校准溶液，按照色谱条件进样，以峰面积为横坐标(x)，对照品浓度为纵坐标(y)，绘制标准曲线，结果见下表，表明各成分在线性范围内线性关系良好。
[0118]
指标成分含量测定线性关系考察结果(n＝6)
[0119]
指标成分线性回归方程r2线性范围(μg
·
ml-1
)甘草苷y＝2*10-4
x-0.8865r2＝0.99974.20～105.00柚皮苷y＝5*10-4
x-2.3936r2＝0.999341.28～516.00桂皮醛y＝5*10-5
x-0.0237r2＝0.99910.43～10.66新橙皮苷y＝5*10-4
x-2.0746r2＝0.999339.94～499.20大黄酸y＝6*10-5
x-0.0368r2＝0.99980.21～8.346-姜辣素y＝1.5*10-4
x-0.5603r2＝0.99918.95～143.12甘草酸铵y＝2*10-4
x+0.1515r2＝0.99966.15～123.04大黄素y＝9*10-5
x-0.695r2＝0.99940.52～20.84大黄酚y＝8*10-5
x+0.1767r2＝0.99940.26～4.22和厚朴酚y＝6*10-5
x-0.0055r2＝0.99951.03～24.62芦荟大黄素y＝3*10-5
x-0.0077r2＝0.99960.25～4.01厚朴酚y＝1*10-4
x-0.0122r2＝0.99961.17～28.03
[0120]
(1)检出限与定量限
[0121]
同时将各对照品储备液进行稀释，按照确定的色谱条件进样，测定各指标成分的检出限与定量限。当信噪比s/n值为10/1时，记为定量限，当信噪比s/n值为3/1时，记为检测限，检测结果见下表6。
[0122]
指标成分检测限与定量限考察结果
[0123]
指标成分检测限μg
·
ml-1
定量限μg
·ml-1
甘草苷0.1210.404柚皮苷0.0470.158桂皮醛0.1000.333新橙皮苷0.0760.254大黄酸0.0580.1956-姜辣素0.0880.295甘草酸铵0.1070.357大黄素0.0690.231大黄酚0.0740.246
和厚朴酚0.0560.187芦荟大黄素0.0710.238厚朴酚0.0660.221
[0124]
(2)精密度
[0125]
取s10批次厚朴七物汤基准样品样品，按上述条件制备供试品溶液，按最优色谱条件连续测定6次，计算甘草苷、柚皮苷、桂皮醛、新橙皮苷、大黄酸、6-姜辣素、甘草酸铵、大黄素、大黄酚、和厚朴酚、芦荟大黄素、厚朴酚的峰面积的rsd值分别为0.67％、1.56％、1.78％、1.04％、0.81％、1.48％、0.65％、1.69％、0.61％、0.41％、0.51％、0.85％，表明仪器精密度良好。
[0126]
指标成分含量测定精密度考察结果(n＝6)
[0127][0128]
(3)稳定性
[0129]
取s10批次厚朴七物汤基准样品样品，按上述条件制备的供试品溶液，分别于制备后0，2，4，8，12，24h按最优色谱条件测定，计算甘草苷、柚皮苷、桂皮醛、新橙皮苷、大黄酸、6-姜辣素、甘草酸铵、大黄素、大黄酚、和厚朴酚、芦荟大黄素、厚朴酚的峰面积的rsd值分别为0.46％、0.73％、1.93％、1.74％、0.68％、2.61％、1.62％、0.61％、0.89％、1.16％、1.02％、0.67％，表明该供试品在24h内相对稳定。
[0130]
指标成分含量测定稳定性考察结果(n＝6)
[0131][0132][0133]
(4)重复性
[0134]
取s10批次厚朴七物汤基准样品样品，按上述最优条件平行制备供试品溶液6份，按最优色谱条件测定，计算甘草苷、柚皮苷、桂皮醛、新橙皮苷、大黄酸、6-姜辣素、甘草酸铵、大黄素、大黄酚、和厚朴酚、芦荟大黄素、厚朴酚的峰面积的rsd值分别为2.16％、1.61％、2.56％、1.26％、0.96％、1.84％、2.63％、1.92％、1.86％、1.82％、0.77％、1.19％，表明该方法重复性良好。
[0135]
取同一批厚朴七物汤冻干粉，精密称定6份，制成供试品进样，计算各指标成分含量，计算rsd值，结果见下表。
[0136]
指标成分含量测定重复性考察结果(n＝6)
[0137]
[0138]
(5)加样回收
[0139]
称取已知各指标成分含量的s10批次厚朴七物汤基准样品样品，精密称定供试品重量的1/2(0.125g)，平行6份，分别按照样品中相对应成分含量1：1加入对照品溶液，按上述方法制备供试品溶液，按上述最优色谱条件测定，计算甘草苷、柚皮苷、桂皮醛、新橙皮苷、大黄酸、6-姜辣素、甘草酸铵、大黄素、大黄酚、和厚朴酚、芦荟大黄素、厚朴酚的平均加样回收率分别为100.64％、101.94％、99.25％、102.51％、102.28％、102.46％、97.70％、97.58％、101.83％、100.17％、99.56％、99.97％，rsd值分别为0.75％、1.03％、0.82％、1.88％、1.05％、0.69％、0.46％、0.56％、0.85％、0.60％、0.89％、0.66％，表明该检测方法准确可靠。
[0140]
指标成分含量测定加样回收率考察结果(n＝6)
[0141]
[0142][0143]
(6)含量测定
[0144]
取15批次厚朴七物汤基准样品样品，按上述方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件测定，计算各指标成分的含量。结果表明15批基准样品中甘草苷、柚皮苷、桂皮醛、新橙皮苷、大黄酸、6-姜辣素、甘草酸铵、大黄素、大黄酚、和厚朴酚、芦荟大黄素、厚朴酚的质量分数范围分别为2.41～4.87、24.11～54.36、0.15～1.23、19.60～30.49、0.09～0.58、0.39～0.82、3.30～7.87、0.13～3.73、0.03～0.05、0.14～0.63、0.03～0.11、0.46～1.01mg
·
g-1，结果见下表。
[0145]
厚朴七物汤指标成分质量分数表
[0146][0147]
以上所述仅为本技术的优选实施例，并非因此限制本技术的专利范围，凡是在本技术的发明构思下，利用本技术说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本技术的专利保护范围内。

技术特征：
1.一种厚朴七物汤的质量控制方法，其特征在于，包括以下步骤：s1.供试品溶液的制备；s2.对照品溶液的制备；s3.测定：分别吸取对照品溶液与供试品溶液注入超高效液相色谱仪进行高效液相色谱分析，记录色谱峰，获得厚朴七物汤的指纹图谱；步骤s3中，高效液相色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相a，以体积分数0.1％的磷酸溶液为流动相b进行梯度洗脱，其中，所述指纹图谱采用双波长进行测定：0～32min时的检测波长为320nm，32～70min时的检测波长为254nm。2.如权利要求1所述的一种厚朴七物汤的质量控制方法，其特征在于，步骤s3中，高效液相色谱条件还包括：色谱柱为acquity uplc csh c18，2.1mm
×
100mm，1.7μm，柱温为30-40℃，进样量为2μl，流速为0.25～0.35ml/min。3.如权利要求1所述的一种厚朴七物汤的质量控制方法，其特征在于，步骤s3中的梯度洗脱条件为：0～5min，流动相a10～12％，流动相b 90-88％；5～15min，流动相a12～13％，流动相b 88-87％；15～20min，流动相a13～15％，流动相b 87-85％；20～32min，流动相a15％，流动相b 85％；32～35min，流动相a15～28％，流动相b 85-72％；35～45min，流动相a 28～30％，流动相b 72-70％；45～50min，流动相a 30～35％，流动相b 70-65％；50～55min，流动相a 35～37％，流动相b 65-63％；55～60min，流动相a 37～50％，流动相b63-50％；60～70min，流动相a 50～70％，流动相b 50-30％。4.如权利要求1所述的一种厚朴七物汤的质量控制方法，其特征在于，步骤s1包括如下步骤：精密称定厚朴七物汤制剂0.25-0.5g，于容器中精密加入甲醇25-50ml，称定质量后超声处理20-30min，冷却后再次称定质量，加入甲醇补足减少的质量并摇匀，离心处理5-10min，于0.2-0.45um的微孔滤膜下过滤后，即得到所述供试品溶液。5.如权利要求1所述的一种厚朴七物汤的质量控制方法，其特征在于，步骤s2包括如下步骤：精密称定甘草苷、柚皮苷、桂皮醛、新橙皮苷、大黄酸、6-姜辣素、甘草酸铵、大黄素、大黄酚、和厚朴酚、芦荟大黄素、厚朴酚对照品，向上述对照品中分别加入甲醇摇匀，制成含量分别为200-400mg
·
l-1
,800-1000mg
·
l-1
,800-1000mg
·
l-1
,80-100mg
·
l-1
,80-100mg
·
l-1
,80-100mg
·
l-1
,200-400mg
·
l-1
,200-400mg
·
l-1
,20-50mg
·
l-1
,80-100mg
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l-1
,20-50mg
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l-1
,80-100mg
·
l-1
的单一对照品储备液；精密量取大黄酸、6-姜辣素、甘草酸铵、大黄素、大黄酚、和厚朴酚、芦荟大黄素、厚朴酚单一对照品储备液，于容器中全部混合，再加入不同量的甲醇摇匀，制成质量浓度分别为2-10mg
·
l-1
，2-10mg
·
l-1
，50-100mg
·
l-1
，10-50mg
·
l-1
，0.5-2mg
·
l-1
，2-10mg
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l-1
，0.5-2mg
·
l-1
，2-10mg
·
l-1
的混合对照品溶液1；精密量取甘草苷、柚皮苷、桂皮醛、新橙皮苷单一对照品储备液，于容器中全部混合，再加入不同量的甲醇摇匀，制成质量浓度分别为20-50mg
·
l-1
，200-500mg
·
l-1
，2-10mg
·
l-1
，200-500mg
·
l-1
的混合对照品溶液2。6.如权利要求1所述的一种厚朴七物汤的质量控制方法，其特征在于，厚朴七物汤的所述指纹图谱包括23个特征峰，其中，4号、20号、22号峰为厚朴，12号、18号、19号、21号、23号峰为大黄，1号、2号、11号峰、13号、14号、16号、17号峰为甘草，3号、5号、6号、9号、10号峰为枳壳，7号峰为肉桂，15号峰为生姜，8号峰为共有峰。
7.如权利要求1所述的一种厚朴七物汤的质量控制方法，其特征在于，还包括采用薄层色谱法鉴别厚朴七物汤的厚朴、大黄、甘草、枳壳、肉桂、生姜中的至少一种。8.如权利要求7所述的一种厚朴七物汤的质量控制方法，其特征在于，厚朴的薄层鉴别过程包括：取厚朴七物汤制剂1-2g，加入20-30ml甲醇超声20-30min，振摇后滤过，滤液蒸干获得残渣，再加15-20ml水溶解，以乙醚振摇提取2-3次，每次获得15-20ml溶液，再合并乙醚溶液，蒸干，获得的残渣再加入2-3ml甲醇溶解，制成供试品溶液；取厚朴对照药材及缺厚朴阴性制剂各1-2g，分别加入20-30ml甲醇超声20-30mi，分别振摇后滤过，滤液蒸干获得残渣，再分别加15-20ml水溶解，分别以乙醚振摇提取2-3次，每次获得15-20ml溶液，再合并乙醚溶液，蒸干，获得的残渣再加入2-3ml甲醇溶解，制成对照药材溶液及阴性供试品溶液；另取厚朴酚、和厚朴酚对照品，加入甲醇分别制成每ml各含1-2mg的溶液，制成对照品溶液；大黄的薄层鉴别过程包括：取厚朴七物汤制剂1-2g，加20-30ml甲醇超声45-60min滤过，取滤液5-10ml蒸干，残渣加水10-20ml溶解，再加盐酸1-2ml，加热回流30-45min，立即冷却，以乙醚振摇提取2-3次，每次获得15-20ml溶液，合并乙醚溶液，蒸干，获得的残渣加2-3ml甲醇溶解，制成供试品溶液；取大黄对照药材及缺大黄阴性制剂各1-2g，分别加20-30ml甲醇超声45-60min滤过，分别取滤液5-10ml蒸干，残渣分别加水10-20ml溶解，再分别加盐酸1-2ml，分别加热回流30-45min，立即冷却，分别以乙醚振摇提取2-3次，每次获得15-20ml溶液，合并乙醚溶液，蒸干，获得的残渣加2-3ml甲醇溶解，制成对照药材溶液剂阴性样品溶液；另取大黄酸对照品，加甲醇制成每ml各含1-2mg的混合溶液，制成对照品溶液；甘草的薄层鉴别过程包括：取厚朴七物汤制剂1-2g，加20-30ml乙醇冷浸20-30min，滤过后获得滤液，浓缩至2-3ml，制成供试品溶液；取甘草对照药材及缺甘草阴性制剂各1-2g，分别加20-30ml乙醇冷浸20-30min，分别滤过后获得滤液，分别浓缩至2-3ml，制成对照药材溶液及阴性样品溶液；另取甘草苷、甘草酸铵对照品，加甲醇分别制成每ml各含1-2ml的混合溶液，制成对照品溶液；枳壳的薄层鉴别过程包括：取厚朴七物汤制剂1-2g，加20-30ml乙醇冷浸20-30min，滤过后获得滤液，浓缩至2-3ml，制成供试品溶液；取枳壳对照药材及缺枳壳阴性制剂各1-2g，加20-30ml乙醇冷浸20-30min，滤过后获得滤液，浓缩至2-3ml，制成对照药材溶液及阴性样品溶液；另取柚皮苷、新橙皮苷对照品，加甲醇分别制成每ml各含1-2mg的混合溶液，制成对照品溶液；肉桂的薄层鉴别过程包括：取厚朴七物汤制剂1-2g，加20-30ml乙醇冷浸20-30min后，滤液浓缩至2-3ml，制成供试品溶液；取肉桂对照药材及缺大枣阴性制剂各1-2g，加20-30ml乙醇冷浸20-30min后，滤液浓缩至2-3ml，制成对照药材溶液及阴性样品溶液；另取桂皮醛对照品，加乙醇分别制成每ml各含1-2mg的混合溶液，制成对照品溶液；生姜的薄层鉴别过程包括：取厚朴七物汤制剂1-2g，加20-30ml水溶解，用水饱和正丁
醇提取3-4次，每次15-20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2-3次，每次15-20ml，弃去水液，蒸干正丁醇液，残渣加2-3ml甲醇溶解，制成供试品溶液；取生姜对照药材及缺生姜阴性制剂各1-2g，加20-30ml水溶解，用水饱和正丁醇提取3-4次，每次15-20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2-3次，每次15-20ml，弃去水液，蒸干正丁醇液，残渣加2-3ml甲醇溶解，制成对照药材溶液及阴性样品溶液；另取6-姜辣素对照品，加甲醇制成每ml各含1-2mg的混合溶液，制成对照品溶液。9.如权利要求8所述的一种厚朴七物汤的质量控制方法，其特征在于，厚朴、甘草、枳壳、肉桂和生姜所用薄层板为硅胶g薄层板，大黄所用薄层板为硅胶h薄层板；厚朴、大黄的展开剂为环己烷-乙酸乙酯-甲酸，甘草的展开剂为乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水，枳壳的展开剂为三氯甲烷-甲醇-水，肉桂的展开剂为石油醚-乙酸乙酯，生姜的展开剂为石油醚-三氯甲烷-乙酸乙酯；大黄薄层板在波长为365nm的紫外光下观察；厚朴、生姜的显色剂为香草醛硫酸溶液，甘草的显色剂为硫酸乙醇溶液，枳壳的显色剂为三氯化铝乙醇溶液，肉桂的显色剂为二硝基苯肼乙醇溶液，均为显色后在日光下观察。10.如权利要求1所述的一种厚朴七物汤的质量控制方法，其特征在于，还包括采用厚朴七物汤的含量测定方法，包括如下步骤：供试品溶液的制备：精密称定厚朴七物汤制剂0.25-0.5g，于容器中精密加入甲醇25-50ml，称定质量后超声处理15-20min，冷却后再次称定质量，加入甲醇补足减少的质量并摇匀，离心处理5-10min，于0.2-0.45um的有机微孔滤膜下过滤后，即得到所述供试品溶液；对照品溶液的制备：分别精密量取甘草苷、柚皮苷、桂皮醛、新橙皮苷、大黄酸，6-姜辣素，甘草酸铵，大黄素，大黄酚，和厚朴酚，芦荟大黄素，厚朴酚对照品，分别加入甲醇溶液制成各单一对照品储备液；精密量取大黄酸，6-姜辣素，甘草酸铵，大黄素，大黄酚，和厚朴酚，芦荟大黄素，厚朴酚对照品储备液，于容器中全部混合，再加入不同量的甲醇摇匀，制成质量浓度分别为2-10mg
·
l-1
，2-10mg
·
l-1
，50-100mg
·
l-1
，10-50mg
·
l-1
，0.5-2mg
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l-1
，2-10mg
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l-1
，0.5-2mg
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l-1
，2-10mg
·
l-1
的混合对照品溶液1；精密量取甘草苷、柚皮苷、桂皮醛、新橙皮苷对照品储备液，于容器中全部混合，再加入不同量的甲醇摇匀，制成质量浓度分别为20-50mg
·
l-1
，200-500mg
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l-1
，2-10mg
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l-1
，200-500mg
·
l-1
的混合对照品溶液2；测定：取供试品溶液和对照品溶液分别采用超高效液相色谱法检测，以acquity uplc csh c18色谱柱为色谱柱，以乙腈为流动相a，以体积分数0.1％的磷酸溶液为流动相b进行梯度洗脱，流速为0.25～0.35ml/min。

技术总结
本申请公开一种厚朴七物汤的质量控制方法，包括以下步骤：包括以下步骤：S1.供试品溶液的制备；S2.对照品溶液的制备；S3.测定：分别吸取对照品溶液与供试品溶液注入液相色谱仪进行高效液相色谱分析，记录色谱峰，获得厚朴七物汤的指纹图谱；高效液相色谱条件包括以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以体积分数0.1％的磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱，指纹图谱采用双波长进行测定：0～32min时的检测波长为320nm，32～70min时的检测波长为254nm。运用超高效液相色谱法建立了厚朴七物汤基准样品的指纹图谱，同时测定了甘草苷等12种指标成分的含量，以此反映厚朴七物汤基准样品的质量特征。汤基准样品的质量特征。汤基准样品的质量特征。


技术研发人员：邓亚利 何建 冼少华 凌一平 相雨 卢国扬 潘树球 吴锐华 陈基辉 陈英杰 冯宝颖
受保护的技术使用者：国药集团德众（佛山）药业有限公司
技术研发日：2023.05.04
技术公布日：2023/8/14