一种提高鸭坦布苏病毒E蛋白亚单位疫苗免疫保护力的方法和应用

一种提高鸭坦布苏病毒e蛋白亚单位疫苗免疫保护力的方法和应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种提高鸭坦布苏病毒e蛋白亚单位疫苗免疫保护力的方法和应用。


背景技术：

2.鸭坦布苏病毒(duck tambusu virus，dtmuv)于2010年4月首次在浙江发现，该病以种鸭和蛋鸭的产蛋下降为主要临床症状，感染率为100％，死亡率在5～30％之间。dtmuv是具备囊膜的单股正链的rna病毒，有一个开放阅读框(open reading frame，orf)可转录翻译为和核衣壳蛋白c、囊膜蛋白e、膜前体蛋白prm三个结构蛋白和ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b、ns5七个非结构蛋白。基因组全长11kb左右，基因组结构为5
′‑
utr-c-prm-e-ns1-ns2a-ns2b-ns3-ns4a-ns4b-ns5-utr-3
′
，基因组结构参阅如图1。
3.在缺乏高效且经济的治疗措施的背景下，疫苗接种是阻断dtmuv传染的主要方法。随着多种dtmuv疫苗的研发和临床应用，dtmuv的流行性质由多地暴发性变为地方流行性，疫苗接种在鸭群免dtmuv侵染方面具有良好效果。因此，需开发安全有效的疫苗以彻底阻dtmuv的传播，为养鸭业提供更为可靠的安全保障。针对dtmuv的国内批准的疫苗类型主要是减毒疫苗和灭活疫苗。dtmuv减毒疫苗的研制往往是将亲代病毒在鸭胚或鸡胚中连续传代以减小病毒毒力而实现的。减毒后的病毒没有丢失其免疫原性，能引起接种鸭群免疫应答从而产生特异性抗体，并提供有效保护。但减毒活疫苗本质为活疫苗具有潜在的毒性和毒力返祖的可能性，且需要较为严格的保存条件。dtmuv灭活疫苗的制备原理是利用理化方法对大量的病毒原液进行灭活，并搭配适当的佐剂制成。但灭活疫苗往往存在接种剂量大，持续免疫时间短，甚至免疫失效等局限性，需配合非免疫原性佐剂以增强机体免疫应答，从而达到完全免疫的效果。亚单位疫苗不同于传统的减毒疫苗和灭活疫苗，其具备更高的安全性，其直接利用体外合成的重组抗原蛋白来诱导宿主的抗病毒反应。理想的疫苗应能够刺激机体产生特异性的免疫反应，并能诱导长期持久的免疫记忆以保护机体免受疾病侵袭。作为一种成功的疫苗，其抗原可被抗原提呈细胞所提呈，并激活机体免疫系统引起抗原特异性免疫反应。
4.e蛋白是dtmuv主要抗原呈递区同时也是最大的结构糖蛋白，其在吸附、进入、病毒组装和抗原呈递中发挥重要作用，被作为基因工程疫苗的理想抗原在禽类疾病防治方面发挥重要的作用。树突状细胞(dc)是已知体内最强的专职抗原提呈细胞，其最大的特点是能够刺激初始细胞增殖和启动机体免疫反应。glaffig m.等在chemmedchem.2018，13(1)：25-29中指出蛋白或抗原甘露糖基化可以增强树突状(dc)细胞上甘露糖受体(mr)识别呈递抗原的效率，甘露糖基化的抗原大大增强了dc识别并结合抗原的能力。目前对于治疗蛋白和抗体的甘露糖基化或偶联主要应用于目标药物(治疗性蛋白/抗体)靶向甘露糖受体阳性巨噬细胞和树突状细胞来改善抗原摄取和呈递。昆虫细胞杆状病毒表达系统的n-糖基化修饰过程更为简单几乎终止于核心五碳糖，以高和低甘露糖型为主，相较于cho细胞表达系统比
mgat1-kd表达的重组e蛋白亚单位疫苗作为cho-e-mgat1-kd组，直接接种不经过mgat1基因敲弱的dtmuv e蛋白亚单位疫苗作为control组，当接种量为80～120μg，cho-e-mgat1-kd组的免疫保护率相比较于control组提高50％。
12.具体地，提高鸭坦布苏病毒e蛋白亚单位疫苗免疫保护率的方法，包括以下步骤：
13.s1.px-sgrna-mgat1质粒的抽提；
14.根据mgat1基因序列的关键点进行设计sgrna，并将其连接到含bbsi酶切位点的载体上，抽提得到所述px-sgrna-mgat1质粒；
15.s2.转染和筛选单克隆
16.通过脂质体转染方法将所述px-sgrna-mgat1质粒转染鸭坦布苏e蛋白的细胞株；通过阳性确认获取所述mgat1基因敲弱单克隆细胞株；
17.s3.免疫保护率评价
18.通过病毒分离法评价攻毒后疫苗免疫保护率。
19.优选地，s2中，所述含sgrna的多聚双链寡核苷酸序列片段与所述含bbsi酶切位点的载体的质量比为1∶0.5～2；。
20.优选地，所述脂质体转染方法中选用neofect
tm
非阳离子脂质体进行转染；转染后36～72小时后利用有限稀释法获的所述mgat1基因敲弱单克隆细胞。
21.优选地，所述px-sgrna-mgat1质粒中，sgrna根据mgat1基因序列进行设计，sgrna序列包括seq no：1～s no：4四个序列，分别为
22.seq no：1 caccgtccaagcagacacacacca
23.seq no：2 aaacttggtgtgtgtctgcttggac
24.seq no：3 caccggccgtaagggtgtgagcca
25.seq no：4 aaactggctcacacccttacggcc。
26.优选地，所述px-sgrna-mgat1质粒包括将含sgrna的多聚双链寡核苷酸序列连接到含bbsi酶切位点的载体上，通过抽提得到所述px-sgrna-mgat1质粒。
27.优选地，所述px-sgrna-mgat1质粒的制备方法包括：
28.将所述含sgrna的多聚双链寡核苷酸序列和所述bbsi酶切载体片段加入连接酶进行反应后，利用无内毒素质粒快速小提试剂抽提无内毒素的目标质粒，即得到所述px-sgrna-mgat1质粒。
29.优选地，所述bbsi酶切的载体片段通过所述含bbsi酶切位点的载体进行酶切并回收得到。
30.优选地，所述含sgrna的多聚双链寡核苷酸序列与所述bbsi酶切载体片段的质量比为10∶1～3∶1。
31.优选地，所述含bbsi酶切位点的载体包括px330、px459、px458的任一种；
32.优选地，所述含sgrna的多聚双链寡核苷酸序列包括将sgrna序列中seq no：1和seq no：2的nebuffer-2混合液与seq no：3和seq no：4的nebuffer-2混合液退火合成得到；其中，seq no：1和seq no：2的质量比为1～3∶1；seq no：3和seq no：4的质量比为1～3∶1。
33.更优选地，seq no：1～seq no：4添加量分别为20-200ng/10μl。
34.进一步地，为了评价本发明采用的基因敲弱方法对增强e蛋白亚单元疫苗的免疫保护力的可靠性，运用western blotting方法从蛋白水平鉴单克隆细胞株mgat1基因的敲
弱水平，同时还进行了动物攻毒保护试验，并对动物病毒中和抗体、特异性抗体、细胞免疫水平进行评价。
35.本发明技术方案的技术效果：
36.1.采用本发明的技术方案，通过将cho细胞中敲弱mgat1，提高dtmuv e蛋白中高甘露糖型相对含量提升显著，相比较未敲弱mgatl的疫苗组，免疫保护率提高50％以上，从而实现降低接种量，达到降低接种成本的目的。
37.2.采用本发明的技术方案，其目的在于提高dtmuv e蛋白亚单位疫苗免疫保护，从提高e蛋白高甘露糖基化入手，利用蛋白或抗原甘露糖基化可以增强树突状(dc)细胞上甘露糖受体(mr)识别呈递抗原的效率的作用机理。通过mgat1基因敲弱来提高dtmuv e蛋白n-糖基化修饰中的高甘露糖型相对含量，从而提高e蛋白的高甘露基化，从而增强樱谷鸭在免疫高甘露糖基化的dtmuv e疫苗后提高对鸭坦布苏病毒的免疫抵抗力，从而提高dtmuv e蛋白亚单位疫苗的免疫保护率。
38.3.采用本发明的技术方案，可通过继续优化完全敲除mgat1基因的方法得到更高比例的高甘露型，具备继续提高免疫保护率的开发潜力。
附图说明
39.图1为本发明的dtmuv基因组结构图。
40.图2为本发明cho细胞中mgat1基因在n-糖基化修饰示意图。
41.图3为本发明实施例1的mgat1基因敲弱单克隆细胞株mgat1基因的电泳图。
42.图4为本发明实施例1的mgat1基因的敲弱mgat1蛋白表达水平。
43.图5为本发明实施例1的mgat1基因敲弱后dtmuv e蛋白n-糖基化图谱糖型分布图。
44.图6为分别免疫本发明实施例1和含mgat1基因敲弱单克隆细胞株表达的重组e蛋白作为抗原的疫苗和对比例1的未进行mgat1基因敲弱单克隆细胞株表达的重组e蛋白作为抗原疫苗后动物病毒中和抗体水平检测结果对比图。
45.图7为分别免疫本发明实施例1和含mgat1基因敲弱单克隆细胞株表达的重组e蛋白作为抗原的疫苗和对比例1的未进行mgat1基因敲弱单克隆细胞株表达的重组e蛋白作为疫苗后动物病毒特异性抗体水平检测结果对比图。
46.图8为分别免疫本发明实施例1和含mgat1基因敲弱单克隆细胞株表达的重组e蛋白作为抗原的疫苗和对比例1的未进行mgat1基因敲弱单克隆细胞株表达的重组e蛋白作为疫苗后il-4和ifn-γ水平体细胞免疫水平检测结果对比图。
47.图8a和图b为分别免疫本发明实施例1中含mgat1基因敲弱单克隆细胞株表达的重组e蛋白作为抗原的疫苗和对比例1的未进行mgat1基因敲弱单克隆细胞株表达的重组e蛋白作为疫苗免疫保护率评价结果对比图。
48.图9为本发明实施例1 cho-e-mgat1-kd组与对比例1中control组中分别接种相同的剂量后免疫保护力对比图。
具体实施方式
49.使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本技术一部分实施例，而不是全部的实
施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
50.下面通过具体的实施例来进一步详细说明本发明的技术方案。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
51.实施例1
52.本实施例用来说明本发明中提供的一种提高鸭坦布苏病毒(dtmuv e)e蛋白亚单位疫苗免疫保护力的方法，并对该方法进行了评价。
53.具体地，包括如下步骤：
54.1.根据中华仓鼠mgat1(gene id：100682529)基因序列利用grna设计sgrna，sgrna序列包括seq no：1、seq no：2、seq no：3和seq no：4
55.seq no：1 caccgtccaagcagacacacacca
56.seq no：2aaacttggtgtgtgtctgcttggac
57.seq no：3caccggccgtaagggtgtgagcca
58.seq no：4aaactggctcacacccttacggcc。
59.其中，magt1基因序列为：
60.[0061][0062]
2.含sgrna的多聚双链寡核苷酸序列退火合成
[0063]
将100ng的seq no：1和seq no：2等比例混合，加入1μlneb buffer 2，最后加入ddh2o补足体积10μl。
[0064]
将100ng的seq no：3和seq no：4等比例混合，加入1μlneb buffer 2，最后加入ddh2o补足体积10μl。
[0065]
反应条件均为95℃，15min。
[0066]
3.px-sgrna-mgat1质粒的抽提
[0067]
经步骤2退火合成的含sgrna的多聚双链寡核苷酸序列连接到含bbsi酶切位点的px330载体上，并完成px-sgrna-mgat1质粒抽提，包括由seq no：1和seq no：2混合后合成的px-sgrna-mgat1质粒包括px-sgrna1-mgat1质粒和seq no：3和seq no：4合成的px-sgrna1-mgat1质粒两种；质粒抽提的具体方法包括：
[0068]
3-1.用1μg的bbsi酶酶切2000μgpx458载体在温度为37℃的条件下水浴反应4h，反应完成后在1％琼脂糖凝胶电泳后，利用赛默飞genejet凝胶回收试剂盒(k0692)回收酶切后的载体片段。优选地，载体还可以选择px330或px459。
[0069]
3-2.将步骤2中退火合成的含sgrna的多聚双链寡核苷酸序列：酶切后的载体片段按照摩尔质量比为6：1加入1μl t4 dna连接酶，10
×
t4 dna连接酶缓冲液1μl(赛默飞thermo scientific
tm t4 dna ligase，5u/μl，el0014试剂盒)，ddh2o补足至10μl，在温度为22℃的条件下水浴反应4h。
[0070]
3-3.dh5α感受态大肠杆菌转化：从-80℃取出dh5α感受态大肠杆菌，在冰上迅速融化，每50μl菌液加入5μl连接产物；于冰上静置30min，42℃水浴热激活90s后，于冰上静置2min；加入400μl lb培养基，放入37℃180rpm恒温摇床4h；吸取100μl菌液均匀涂布在含氨苄抗性的lb平板上，置于37℃恒温培养箱；倒置培养12h后，每个平板上挑取3个单克隆菌落到含10μg/l氨苄青霉素的lb培养基中，放入37℃180rpm恒温摇床4h；菌液pcr鉴定阳性克隆，确定t4连接的片段已正确连接到载体上，便于后续得到正确质粒转染。
[0071]
作为一种优选地实施方式之一，含bbsi酶切位点的载体也可以选自px459或px330。
[0072]
3-4.进行px458-sgrna-mgat1质粒合成抽提：利用天根无内毒素质粒快速小提试剂抽提无内毒素的目的px458-sgrna-mgat1质粒，使用使分光光度计测定抽提目标质粒的浓度，用于确定转染的质量。
[0073]
参阅图3，为步骤3-1中敲弱的单克隆cho-e-mgat1-kd重组细胞株细胞株mgat1基因的1％琼脂糖核酸电泳进行表征的电泳图，由图可见，目标细胞株mgat1基因n端存在200bp左右片段缺失，电泳图中下面的条带比上面的条带少大约200bp，缺失的基因片段序列为：
[0074][0075]
4.转染
[0076]
通过neofect
tm
非阳离子脂质体转染方法将步骤3中合成的负载在载体上的px458-sgrna1-mgat1质粒与px458-sgrna2-mgat1质粒按照质量比1∶1转染到表达的鸭坦布苏e蛋白的细胞株中。
[0077]
5.筛选单克隆
[0078]
转染后的48小时，将步骤4的鸭坦布苏e蛋白的细胞株进行细胞消化后放置空板内，利用有限稀释法获取单克隆，铺板密度0.5cells/well。在铺板后(6h)使仪器对孔内的单克隆细胞进行阳性确认，获取目标单克隆拍照记录，将阳性单克隆所在孔编号标记，以待后续步骤使用。
[0079]
6.基因水平鉴定敲弱细胞株
[0080]
将步骤5中确定为单克隆重组细胞株置于t25细胞培养瓶中继续扩增，对其进行细胞pcr，将其pcr产物测序，获得mgat1基因敲弱单克隆细胞株，即为单克隆cho-e-mgat1-kd重组细胞株。
[0081]
7.蛋白水平鉴定单克隆细胞株mgat1基因的敲弱水平
[0082]
运用western blotting的方法从蛋白水平鉴定单克隆cho-e-mgat1-kd重组细胞株mgat1基因的敲弱水平。
[0083]
鉴定结果参阅图4，结果表明mgat1基因的敲弱mgat1蛋白表达水平下降。
[0084]
具体地，蛋白水平鉴定的操作步骤包括：
[0085]
取2
×
106个步骤4转染后的鸭坦布苏e蛋白的细胞株在1000rpm离心5min，弃去上清；加入1ml细胞裂解液(碧云天，p0013)和10μl100
×
蛋白酶抑制剂(购自生工生物，no.c600387)，用移液器吹打混匀，冰上裂解30min；13000rpm离心5min，取上清用于测定细胞裂解液蛋白浓度。利用赛默飞bca蛋白浓度试剂盒测量细胞裂解液蛋白浓度，绘制吸光度与蛋白浓度的标准曲线，测量待测蛋白浓度。
[0086]
利用雅酶page凝胶快速制备试剂盒制备page凝胶，待其完全凝固即可使用。将待测蛋白样本稀释到1μg/μl取25μl上述稀释的蛋白样本和5μl 5
×
雅酶变性还原型蛋白上样缓冲液，混合均匀，100℃水浴10min，短暂离心将收集ep管壁上的液体混合物。
[0087]
用20μl移液枪移取液体混合物体进行上样，且上样时保证每孔蛋白的总量和上样的体积保持一致，电泳时恒流150v，60min。
[0088]
pvdf膜使用前用甲醛浸泡1-2min，小心取出电泳后的pade膜保持湿润；按照黑色板-湿润海绵-湿润无气泡3层滤纸-page胶-pvdf膜-湿润无气泡3层滤纸-湿润海绵-白色板次序夹好，夹好后反复驱赶气泡并且注意保持整体湿润，黑色板面对准负级，插入转膜以仪时同时插入冷却槽，并且整个仪器放到冰盆里；转膜时恒流200ma 90min。
[0089]
转膜结束后，用封闭液封闭pvdf膜，常温封闭1h，注意标记膜的正反面。用一抗稀释液将mgat1鼠原一抗用1∶2000比例稀释，于37℃孵育，1h后收集一抗弃去，水平摇床上tbst洗涤15min，重复三次。用二抗稀释液将兔抗鼠二抗以1∶10000比例稀释，于37℃孵育，1h后收集二抗4℃备用，水平摇床上tbst洗涤15min，重复三次。
[0090]
利用化学发光成相仪(天能4600)拍照时提前打开仪器，在避光条件下将雅酶ecl显色液的a液和b液按体积比例1∶1混合避光暂存，将pvdf膜的正面朝上放入仪器的黑色拍摄台上，将发光液小心滴到膜上，打开软件，设置单次长时间拍摄照片，8bit格式保存照片。
[0091]
对比例1
[0092]
本对比例以未进行mgat1基因的敲弱的dtmuv单克隆细胞株(即，cho-e细胞株)作为control组将其与实施例1进行对比。control组使用的细胞株为dtmuv-md细胞株，参阅中国发明专利cn 110237244 a。
[0093]
control组注射的疫苗的制备方法包括：
[0094]
油相制备：取注射用marcol 52白油94份加热，加热过程中先后加入6份司本-80和2份硬脂酸铝，边加边搅拌至透明，126℃高压灭菌30分钟，自然冷却后备用。
[0095]
水相制备：按v/v为4％的比例，向灭活病毒液中加入灭菌吐温-80，边加边搅拌，使吐温-80彻底溶解后即为水相。
[0096]
乳化：将油相2份(体积)导入胶体磨或乳化罐中，开动电机，缓慢加入1份(体积)(浓度250μg/mle蛋白)抗原，慢速搅拌1分钟，充分搅拌混匀后，停机1分钟；充分搅拌90秒，出现小气泡后再搅拌30秒，乳化完成。
[0097]
取样10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml，即为成品疫苗，该疫苗成品每1ml所含82μg e蛋白。
[0098]
对比分析结果包括：
[0099]
1.鉴定mgat1基因敲弱后dtmuv e蛋白n-糖基化图谱糖型分布
[0100]
确定dtmuv e蛋白甘露糖基化水平变化。参阅图5，mgat1基因表达量的变化图谱，具体e蛋白甘露糖基化表达量变化参见表1，cho-e-mgat1-kd组中e蛋白n-糖基化和control组相比，dtmuv e蛋白中man5的相对含量由7％提高到了19％左右，高甘露糖含量大幅度提高，得到表达甘露糖基化程度高的dtmuv e蛋白。
[0101]
表1实施例1和对比例1的dtmuv e蛋白甘露糖基化水平变化对比
[0102][0103]
2.动物攻毒保护试验
[0104]
将饲养至50日龄的樱谷鸭16只，随机分为2组，每组8只。每组都在相同的环境下饲养。各胸部肌肉接种含82μg e蛋白的1.0ml乳化苗，免疫两次首免和二次免之间2周，首次免疫后第1、2、3和5周采血，并分离血清进行dtumv特异性抗体、中和抗体检测、il-4和ifn-γ细胞因子检测。二次免疫后28日，所有实验鸭肌肉注射含有dtmuv-hb毒原液0.5ml(含100个did50)该毒原液来自扬州优邦生物。攻毒后4-5日，观察记录所有鸭的临床症状，剖杀所有鸭，取出各组鸭的脾脏病理切片观察。
[0105]
3.动物病毒中和抗体、特异性抗体、细胞免疫水平评价
[0106]
3.1动物病毒中和抗体水平检测
[0107]
检测步骤包括：接种疫苗后中和抗体在96孔板中对bhk-21细胞铺板，当细胞生长汇度到90％且单层时，弃去原有培养基，添加100μl细胞维持液；与首免1，2，3，5从雏鸭翅下静脉采集血液并分离血清，56℃补体灭活1h；取无菌96孔板，孔内接种50μl含200个tcid50的dtmuv-hb毒原液的细胞维持液，再加入50μl补体灭活的不同稀释梯度的血清样本，每个样本的稀释2-1～2-1010个梯度，每个梯度设置四个平行孔，同时设置未接种疫苗鸭血清的阴性对照，37℃中和1h；将病毒血清中和样本100μl接种到更换细胞维持液的96孔板中，37℃5％co2培养箱中培养72h，观察细胞病变情况，当bhk-21细胞回缩变圆，细胞间出现明显空隙判定为病变，记录病变的孔。实验结果计算：用兽药典2020版中reed-muench法计算病毒血清中和抗体效价。
[0108]
结果如图6所示，首免后第2周到第5周，cho-e-mgat1-kd的中和抗体水平都高于control组的cho-e细胞株，在各个时期cho-e-mgat1-kd组中和抗体滴度有一定程度的提高，存在更高的免疫保护力且与control组相比有统计学差异(p＜0.05)。
[0109]
3.2特异性抗体水平检测
[0110]
检测步骤包括：在包被e蛋白抗原的elisa反应板上中加入100μl稀释样本的同时，两孔加入100μl稀释后的阴性对照，两孔加入100μl稀释后的阳性对照；盖板膜封住反应板，室温孵育90min；弃去孔内液体，加入300μl洗涤液洗3次，每次都要甩干；用2号稀释液将浓缩酶结合物稀释10倍为酶结合物，每孔加入100μl稀释后的酶结合物；膜封住反应板，室温孵育30min；弃去孔内液体，加入300μl洗涤液洗3次；加入100μl底物溶液，室温避光孵育
15min；每孔加入100μl终止液；450nm波长读取吸光值；实验成立条件为阴性对照组平均od值(odnc)大于0.700，阳性对照组平均od值与阴性对照组平均od值比值小于0.3；数据处理：特异性抗体水平＝1-(od样本/odnc)。
[0111]
结果如图7所示，与control组相比较于cho-e-mgat1-kd组诱导更高水平特异性抗体，大约高于control组别30％，存在显差异(p＜0.01)。
[0112]
3.3 il-4和ifn-γ水平体细胞免疫水平检测
[0113]
il-4和ifn-γ水平可以间接反映细胞免疫水平细胞免疫水平，通过检测il-4和ifn-γ水平来评价面以后的体细胞免疫水平。
[0114]
检测步骤包括：将来自酶联的il-4和ifn-γ的酶标板的待测样品孔中加入40μl稀释液和10μl待测样本轻轻晃动酶标板混合，加样时不要触碰到酶标板底部；除空白孔外加入酶标试剂100μl每孔；封板37℃封闭1h；揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加入300μl洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗版5次；每孔分别加入显色液a和b各50μl，37℃避光显色15分钟；每孔加入终止液50μl，终止反应；以空白孔调零，在终止反应后15min以内测定450nm波长下各孔的吸光度。
[0115]
结果如图8a和图8b所示，首免后第1周到第5周cho-e-mgat1-kd组的ifn-γ和il-4水平与control组相比存在一定程度升高，有统计学差异(p＜0.05)，cho-e-mgat1-kd组免疫后存在更高水平的细胞免疫。
[0116]
4.免疫保护率评价
[0117]
最后本研究通过病毒分离法评价攻毒后疫苗免疫保护率。具体操作步骤包括：鸭坦布苏病毒攻毒后2日，经翅下静脉采血，抽取血液4ml，将血液注入5ml一次性无菌真空采血管中，分离血清。每只鸭的血清以0.1ml/胚的剂量经卵黄囊途径接种6日龄spf鸡胚5枚，置37℃孵育，24小时死亡鸡胚弃去。采用rt-pcr方法测定24～72小时死亡鸡胚的dtmuv核酸，至少1枚鸡胚死亡且dtmuv核酸阳性的鸭判为dtmuv感染鸭。计算每组整体的疫苗免疫保护率。
[0118]
结果如图9所示，cho-e-mgat1-kd组相较于control组接种相同的剂量(含82μg e蛋白的疫苗)，免疫保护力明显提高，免疫保护率提高了50％，免疫效果提高显著。
[0119]
综上，本发明利用蛋白或抗原甘露糖基化可以增强树突状(dc)细胞上甘露糖受体(mr)识别呈递抗原的效率的作用机理。通过mgat1基因敲弱来提高dtmuv e蛋白n-糖基化修饰中的高甘露糖型相对含量，从而提高e蛋白的高甘露基化，从而增强樱谷鸭在免疫该疫苗后对鸭坦布苏病毒(dtmuv)的免疫抵抗力，从而提高dtmuv e蛋白亚单位疫苗的免疫保护率。与传统疫苗相比其具备更高的安全性，与正常cho表达系统表达的e蛋白亚单位疫苗相比相同的接种剂量具高的免疫保护率，具备极大的技术优势，可用于我国禽类dtmuv的防治。采用本发明提供的mgat1基因敲弱的单克隆细胞株表达的重组e蛋白作为抗原的亚单位疫苗通过肌肉注射接种在樱谷鸭体内，接种量在80～120μg，相较于未敲弱mgat1基因原始cho-e细胞株表达的e蛋白作为抗原的疫苗免疫保护率至少提高50％。
[0120]
显然，通过基因敲弱后，采用相同剂量的接种，e蛋白作为抗原的亚单位疫苗通过肌肉注射接种在樱谷鸭体内其免疫力大大提高，从而能够节约成本，提高雏鸭养殖的经济效益。
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以上仅为本发明的优选实施例而已，其并非因此限制本发明的保护范围，对于本
领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，通过常规的替代或者能够实现相同的功能在不脱离本发明的原理和精神的情况下对这些实施例进行变化、修改、替换、整合和参数变更均落入本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种提高鸭坦布苏病毒e蛋白亚单位疫苗免疫保护力的方法，包括通过cho细胞中mgat1基因敲弱，获得cho-e-mgat1-kd重组细胞株，使mgat1蛋白表达量下降进而提高鸭坦布苏病毒e蛋白n-糖基化修饰中的高甘露糖型的相对含量，提高在免疫dtmuv e蛋白亚单位疫苗后的免疫保护力。2.根据权利要求1所述的提高鸭坦布苏病毒e蛋白亚单位疫苗免疫保护力的方法，其特征在于，通过脂质体转染方法将px-sgrna-mgat1质粒转染至鸭坦布苏病毒e蛋白的细胞株上，通过筛选获得mgat1基因敲弱的单克隆cho-e-mgat1-kd重组细胞株；其中，mgat1基因敲弱后，mgat1基因n端存在～200bp片段的缺失。3.根据权利要求2所述的提高鸭坦布苏病毒e蛋白亚单位疫苗免疫保护力的方法，其特征在于，将含有所述mgat1基因敲弱的单克隆cho-e-mgat1-kd重组细胞株表达的重组dtmuv e蛋白通过肌肉注射接种到樱谷鸭体内，免疫保护率提高50％。4.根据权利要求1-3任一项所述的提高鸭坦布苏病毒e蛋白亚单位疫苗免疫保护力的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1.px-sgrna-mgat1质粒的抽提；根据mgat1基因序列的关键点进行设计sgrna，并将将含sgrna的多聚双链寡核苷酸序列片段连接到含bbsi酶切位点的载体(px)上，抽提得到所述px-sgrna-mgat1质粒；s2.转染和筛选单克隆通过脂质体转染方法将所述px-sgrna-mgat1质粒转染至鸭坦布苏e蛋白的细胞株上；通过阳性确认获取所述mgat1基因敲弱的单克隆cho-e-mgat1-kd重组细胞株；s3.免疫保护率评价通过病毒分离法评价攻毒后疫苗免疫保护率。5.根据权利要求4所述的提高鸭坦布苏病毒e蛋白亚单位疫苗免疫保护力的方法，其特征在于，s2中，所述含sgrna的多聚双链寡核苷酸序列片段与所述含bbsi酶切位点的载体的质量比为1∶0.5～2；所述脂质体转染方法中选用neofect
tm
非阳离子脂质体进行转染；转染后36～72小时后利用有限稀释法获的所述mgat1基因敲弱的单克隆cho-e-mgat1-kd重组细胞株。6.根据权利要求5所述的提高鸭坦布苏病毒e蛋白亚单位疫苗免疫保护力的方法，其特征在于，所述px-sgrna-mgat1质粒中，sgrna根据mgat1基因序列进行设计，得到含sgrna的多聚双链寡核苷酸序列，具体地，包括seq no：1～seq no：4四个序列：seq no：1 caccgtccaagcagacacacaccaseq no：2 aaacttggtgtgtgtctgcttggacseq no：3 caccggccgtaagggtgtgagccaseq no：4 aaactggctcacacccttacggcc。7.根据权利要求6所述的提高鸭坦布苏病毒e蛋白亚单位疫苗免疫保护力的方法，其特征在于，所述px-sgrna-mgat1质粒包括将含sgrna的多聚双链寡核苷酸序列片段连接到含bbsi酶切位点的载体上，通过抽提得到所述px-sgrna-mgat1质粒。8.根据权利要求7所述的提高鸭坦布苏病毒e蛋白亚单位疫苗免疫保护力的方法，其特征在于，所述px-sgrna-mgat1质粒的制备方法包括：将所述含sgrna的多聚双链寡核苷酸序列片段和所述bbsi酶切载体片段加入连接酶进
行反应后，利用无内毒素质粒快速小提试剂抽提无内毒素的目标质粒，即得到所述px-sgrna-mgat1质粒；其中和/或，所述含sgrna的多聚双链寡核苷酸序列片段与所述bbsi酶切载体片段的质量比为10∶1～3∶1；和/或，所述含bbsi酶切位点的载体包括px330、px459、px458的任一种；和/或，所述含sgrna的多聚双链寡核苷酸序列包括将sgrna序列中seq no：1和seq no：2的nebuffer-2混合液与seq no：3和seq no：4的nebuffer-2混合液退火合成得到；其中，seq no：1和seq no：2的质量比为1～3∶1；seq no：3和seq no：4的质量比为1～3∶1。9.如权利要求1-8任一项所述的提高鸭坦布苏病毒e蛋白亚单位疫苗免疫保护率的方法在鸭坦布苏病毒e蛋白在亚单位疫苗中的应用。10.一种鸭坦布苏病毒e蛋白亚单位疫苗，至少包括cho细胞中mgat1基因敲弱后得到cho-e-mgat1-kd重组细胞株表达的重组e蛋白。

技术总结
本发明提供了一种提高鸭坦布苏病毒E蛋白亚单位疫苗免疫保护率的方法，包括通过CHO细胞中mgatl基因敲弱，获得CHO-E-mgat1-KD重组细胞株，使MGAT1蛋白表达量下降来提高鸭坦布苏病毒E蛋白N-糖基化修饰中的高甘露糖型的相对含量，从而提高在免疫DTMUV E蛋白亚单位疫苗后的免疫保护力。采用本发明的技术方案，通过将CHO细胞中敲弱mgat1，提高DTMUV E蛋白中高甘露糖型相对含量提升显著，相比较未敲弱mgat1基因的疫苗组，免疫保护率提高50％以上。免疫保护率提高50％以上。免疫保护率提高50％以上。


技术研发人员：冯硕 易小萍 黄明志 李群 何存亚
受保护的技术使用者：华东理工大学
技术研发日：2023.05.10
技术公布日：2023/8/14