一种可条件性释放并激活的细胞因子融合蛋白及其制备和用途

1.本技术属于医药技术领域，具体涉及一种可条件性释放并激活的细胞因子融合蛋白及其制备方法和用途，更具体的，本技术涉及一种融合蛋白，一种核酸，一种表达载体，一种宿主细胞，一种制备融合蛋白的方法，一种融合蛋白复合体，一种免疫治疗细胞，一种药物组合物，以及融合蛋白或融合蛋白复合体在制备用于治疗或者预防癌症、传染病或自身免疫疾病的药物中的用途。


背景技术：

2.细胞因子在调节免疫应答方面扮演着重要作用，是肿瘤免疫治疗的基石。多种细胞因子(例如il-2，il-7，il-15等)具有显著的抗肿瘤作用，但半衰期短、靶向性差、全身给药易产生毒副作用等缺陷严重限制了其临床研发进展。目前已开发多种技术，包括fc融合、peg修饰、免疫细胞因子、细胞因子前药等，进行下一代细胞因子药物的研究，旨在提高细胞因子的成药性。其中，前体药物能够在正常组织对细胞因子的活性进行掩蔽，在到达肿瘤组织后，通过特异性蛋白酶酶解等方式恢复细胞因子的活性，从而达到靶向抗肿瘤的目标。前体药物在抗体药物领域已有大量研究，且有产品进入临床试验阶段，但在细胞因子领域的应用刚刚开始，是国内外研究的前沿。
3.已有报道的细胞因子前药，包括il-2、il-15、ifn-γ等，均采用具有亲和力的多肽或受体与细胞因子结合，如il-15采用il-15rβ/γ亚基结合，屏蔽其结合靶细胞上的il-15rβ/γ，从而掩蔽其功能。但这种亲和掩蔽的的方式存在潜在的药物开发障碍，例如具有亲和力的多肽或受体在肿瘤微环境被剪切后，游离状态下可能仍对细胞因子具有结合作用，影响细胞因子对靶细胞的识别及活性，进而影响抗肿瘤效果；此外，在前药分子中额外的亲和掩蔽多肽或受体会增加分子量、免疫原性及结构复杂性等，因此，目前的细胞因子前药亟需开发新的掩蔽技术。
4.免疫细胞因子是将单克隆抗体与细胞因子构建双功能融合蛋白，能够利用抗体的靶向性将细胞因子富集到肿瘤部位，提高细胞因子靶向性，并能够发挥抗体和细胞因子的协同抗肿瘤作用。基于临床前研究所表现出的显著的药效及良好的安全性，国内外制药公司均有在研产品进入临床研究。进展最快的分子为瑞士苏黎世大学和philogen公司联合研发的l19-tnf，与阿霉素联合用于治疗转移性软组织肉瘤已进入iii期临床研究。然而，研究发现，免疫细胞因子靶向到肿瘤的比例普遍低于0.1％，其副作用水平与所融合的细胞因子单药类似，导致目前临床试验阶段的免疫细胞因子药物的剂量局限于较低的水平，例如l19-tnf的iii期临床剂量仅有13ug/kg，远远低于一般单克隆抗体10-20mg/kg的剂量水平。因此，安全性依然是限制免疫细胞因子临床应用的主要瓶颈之一，对免疫细胞因子进行结构优化，进一步提高靶向性和安全性，是推动此类分子走向临床的关键。


技术实现要素：

5.鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，本技术期望提供一种细胞因子融合蛋白，能够以空间位阻的方式对细胞因子活性进行掩蔽和调节，并能够与抗体类分子进一步融合，获得免疫细胞因子前药，以提高此类药物的治疗靶向性和治疗效果。
6.在本技术的一个方面，本技术提供了一种融合蛋白，包括第一结构单元、第二结构单元和第三结构单元：所述第一结构单元包含下列的至少之一；其中，fc片段、抗体或其抗原结合片段；所述第二结构单元包含可裂解肽接头，所述可裂解肽接头能够被目的组织特异性酶切断裂；所述第三结构单元包含细胞因子或细胞因子与其受体的复合物；所述第一结构单元通过所述第二结构单元与所述第三结构单元的n端或c端连接。第一结构单元的空间位阻能够对第三结构单元的结构进行掩蔽，从而调节第三结构单元与其靶细胞的结合，改变其活性。第二结构单元包含可裂解肽接头(在本文中又称可裂解连接子、可裂解的连接子)，可被目的组织(如肿瘤部位过表达的蛋白酶，可选为基质金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或天冬酰胺内肽酶)裂解。本文中公开的实验显示，本技术的融合蛋白在裂解前后第三结构单元显示出不同的活性，具有更好的靶向性和安全性。
7.在本技术的一些实施方式中，本技术的融合蛋白的第一结构单元通过第二结构单元连接于第三结构单元的n端。以第一结构单元包含fc片段、第三结构单元为细胞因子il-15与受体的活性复合物为例，融合蛋白的结构如图1a所示，从n端到c端依次包含抗体fc片段、可裂解的连接子、il-15和il-15rα的sushi结构域。本技术发现，与具有完全活性的fc-sushi-il-15超级激动剂蛋白相比(实施例中的lh02融合蛋白)，融合蛋白中il-15的促细胞增殖活性在第二结构单元裂解前明显更低，在裂解后活性大幅增强，在小鼠体内的安全性得到显著改善。
8.在本技术的一些实施方式中，本技术的融合蛋白的第一结构单元通过所述第二结构单元与第三结构单元的c端连接。以第一结构单元包含抗体fc片段第三结构单元为il-15与il-15rαsushi结构域的复合物为例，融合蛋白(命名为lic18)的结构如图1f所示，从n端到c端依次包含il-15rα的sushi结构域、il-15、含有可裂解连接子的第二结构单元和抗体fc片段。其中sushi结构域与il-15之间用柔性连接子连接。本技术发现，相比于sushi-il-15复合物位于fc的c端的融合蛋白，其位于fc的n端的融合蛋白在第二结构单元裂解前的活性明显更低，且在第二结构单元被酶切裂解后，活性大幅增强，靶向性和安全性得到显著改善。
9.在本技术的一些实施方式中，所述第一结构单元为抗体fab，其重链和轻链分别通过所述第二结构单元与第三结构单元的n端或c端连接。
10.在本技术的一些实施方式中，所述第一结构单元为抗体fab，其重链和轻链中的一条通过所述第二结构单元与第三结构单元的n端或c端连接。以第一结构单元为靶向pd-l1的单克隆抗体fab片段、第二结构单元为包含尿激酶底物的可裂解连接子、第三结构单元为细胞因子il-15与含有sushi结构域的il-15rα片段复合物为例，将第三结构单元通过第二结构单元融合于第一结构单元重链的c端，所获得的免疫细胞因子(命名为lic110)结构如图1c所示，其轻链为抗pd-l1单克隆抗体的轻链，其重链从n端到c端依次包含抗pd-l1抗体的重链可变区和ch1区、可裂解的连接子、il-15和含有sushi结构域的il-15rα片段。本技术发现，lic110融合蛋白fab的空间位阻对il-15的活性在酶切之前具有掩蔽作用，在酶切之
后ilr部分被释放，从而空间位阻被解除，活性得到恢复。
11.在本技术的一些实施方式中，本技术融合蛋白的第三结构单元包含il-15及含有sushi结构域的il-15rα片段，其中sushi结构域为65-85个氨基酸长的片段，优选的为85个氨基酸的片段。二者通过柔性的柔性连接子连接，组成il-15超级激动剂(命名为ilr)，相较于单体il-15具有更好的体内稳定性和半衰期，在肿瘤部位对t细胞、nk细胞的激活能力更强，肿瘤治疗效果更好。
12.在本技术的另一方面，本技术了一种核酸，该核酸分子编码前述的融合蛋白。
13.在本技术的一些实施方式中，所述核酸分子为dna。
14.需要说明的是，对于本技术中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本技术中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本技术中的核酸序列包括dna形式或rna形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
15.在本技术的另一方面，本技术提出了一种表达载体，其表达载体携带前述的核酸。在将上述核酸连接到载体上时，可以将核酸与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制核酸的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。当然，该核酸与控制元件进行可操作地连接即可。
16.本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。根据本技术的一些具体实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前述的融合蛋白的表达，进而实现融合蛋白的体外大量获得。
17.在本技术的一些实施方式中，所述表达载体为真核表达载体或原核表达载体，优选地，所述表达载体为质粒表达载体。
18.在本技术的另一方面，本技术提出了一种重组细胞，其包括：携带前述的核酸或前述的表达载体；或，表达前述的融合蛋白。利用该重组细胞在适合条件下，能够在细胞内有效地表达前述的融合蛋白。
19.需要说明的是，本技术中所述的“适合条件”，是指适合本技术融合蛋白表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合融合蛋白表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转染条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的融合蛋白表达的条件。
20.在本技术的一些实施方式中，所述重组细胞是通过将前述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。
21.在本技术的一些实施方式中，所述重组细胞为真核细胞。
22.在本技术的一些实施方式中，所述重组细胞为哺乳动物细胞。
23.在本技术的另一个方面，本技术提供一种融合蛋白复合体，作为可选的方案，本技术的融合蛋白复合体为包含本技术融合蛋白的同源或异源二聚体蛋白质，复合体中各融合蛋白可通过fc区之间形成的链间键连接。
24.在本技术的另一个方面，本技术提供一种免疫细胞因子，其包括：前述的融合蛋白；所述融合蛋白包括抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段靶向肿瘤抗原或免疫检查点。
25.在本技术的一些实施方式中，所述靶向肿瘤抗原或免疫检查点包括egfr、vegf、claudin 18.2、nectin-4、gpc-3、pd-l1、pd-1、tigit、lag3、tim-3和ctla-4的至少之一。
26.在本技术的一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段来自人igg1或igg4抗体。
27.在本技术的一些实施方式中，以第三结构单元为细胞因子il-15与含有sushi结构域的il-15rα片段的复合物(如图1中ilr)为例，其n端可融合靶向pd-l1的单克隆抗体序列，所获得的免疫细胞因子(命名为lh05)结构如图1n所示，从n端到c端依次包含抗pd-l1抗体的fab段、fc片段、可裂解的连接子、il-15和含有sushi结构域的il-15rα片段。本技术发现，免疫细胞因子能够结合pd-l1抗原蛋白，且与具有完全活性的fc-sushi-il-15超级激动剂蛋白相比，免疫细胞因子中il-15的促细胞增殖活性在第二结构单元裂解前明显更低，在裂解后活性大幅增强，在小鼠体内的靶向性和安全性得到显著改善。
28.在本技术的另一个方面，本技术提供一种免疫治疗细胞，其表达前述的融合蛋白。由前可知，融合蛋白能够以空间位阻的方式对细胞因子活性进行掩蔽和调节，并能够与抗体类分子进一步融合，获得免疫细胞因子前药，以提高此类药物的治疗靶向性和治疗效果。由此，该免疫细胞可表达前述的融合蛋白，其可用于治疗传染病、癌症或自身免疫疾病。
29.在本技术的另一个方面，本技术提供一种药物组合物，其包括前述的融合蛋白、前述的核酸、前述的表达载体、前述的重组细胞、前述的融合蛋白复合体、前述的免疫治疗因子或前述的免疫治疗细胞。本技术的药物组合物可用于治疗传染病、癌症或自身免疫疾病。
30.在本技术的另一方面，本技术提供了一种联合药物或药盒，其包括：前述的融合蛋白或前述的融合蛋白复合体作为第一活性成分；靶向肿瘤的单克隆抗体作为第二活性成分。本技术融合蛋白与靶向肿瘤的单克隆抗体药物联用的技术方案，例如本技术的融合蛋白与抗vegf抗体或抗her2抗体联合，在小鼠肿瘤模型中，起到了协同的抗肿瘤药效作用。
31.在本技术的一些实施方式中，所述靶向肿瘤的单克隆抗体包括抗vegf抗体和/或抗her2抗体。
32.在本技术的另一些方面，本技术提供了一种前述的融合蛋白、融合蛋白复合物、免疫治疗细胞、药物组合物或联合药物或药盒在制备用于治疗传染病、癌症或自身免疫疾病的药物中的用途。
附图说明
33.通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
34.图1为本技术的融合蛋白的结构示意图，其中a为fc作为第一结构单元的fc-l-c；b为fab作为第一结构单元的融合蛋白fab-l-c；c为fab作为第一结构单元，且仅在重链或轻链恒定区融合一个细胞因子的fab-l-c；d为scfv作为第一结构单元的scfv-l-c；e为scfv融合形式的fc-l-c；f为fc作为第一结构单元且融合在第三结构单元c端的c-l-fc；g为fab作为第一结构单元的c-l-fab；i为fab作为第一结构单元，且仅在重链或轻链恒定区融合一个细胞因子的c-l-fab；j为scfv作为第一结构单元的c-l-scfv；k为scfv融合形式的c-l-fc；l
为fab作为第一结构单元，且仅在重链或轻链恒定区融合一个细胞因子的fab-l-c与fc融合的蛋白复合物/免疫细胞因子；m为fab作为第一结构单元，且仅在重链或轻链恒定区融合一个细胞因子的c-l-fab与fc融合的蛋白复合物/免疫细胞因子；n为fab与fc-l-c融合的蛋白复合物/免疫细胞因子；其中l代表可裂解连接子，c代表细胞因子或细胞因子与其受体的复合物。
35.图2为本技术实施例1中lic11融合蛋白的protein a亲和层析纯化图。
36.图3为本技术实施例1中纯化后lic11融合蛋白的sds-page电泳图。nr为非还原样品，r为还原样品。fl为protein a亲和层析过程中的流穿液体，e为洗脱的lic11融合蛋白，naoh为层析结束后naoh溶液洗脱的杂质。
37.图4为本技术实施例1中lic11融合蛋白的western blot鉴定。non-reduced为非还原样品，reduced为还原样品。
38.图5为本技术实施例2中lic11融合蛋白被upa酶裂解不用时间的效率检测sds-page图。
39.图6为本技术实施例3中lic11融合蛋白在upa酶裂解前后促进mo7e细胞增殖活性检测的结果图。
40.图7为本技术实施例4中lic15融合蛋白的protein a亲和层析纯化图。
41.图8为本技术实施例4中纯化后lic15融合蛋白的sds-page电泳图。nr为非还原样品，r为还原样品。fl为protein a亲和层析过程中的流穿液体，e为洗脱的lic15融合蛋白，naoh为层析结束后naoh溶液洗脱的杂质。
42.图9为本技术实施例5中lic15融合蛋白被mmp-2酶裂解效率的检测sds-page图。
43.图10为本技术实施例5中lic15融合蛋白对il-15活性的掩蔽作用检测结果图。
44.图11为本技术实施例6中纯化后lic12融合蛋白的sds-page电泳图。nr为非还原样品，r为还原样品。fl为protein a亲和层析过程中的流穿液体，e为洗脱的lic11融合蛋白，naoh为层析结束后naoh溶液洗脱的杂质。
45.图12为本技术实施例6中纯化后lic13融合蛋白的sds-page电泳图。nr为非还原样品，r为还原样品。fl为protein a亲和层析过程中的流穿液体，e为洗脱的lic11融合蛋白，naoh为层析结束后naoh溶液洗脱的杂质。
46.图13为本技术实施例6中纯化后lic14融合蛋白的sds-page电泳图。nr为非还原样品，r为还原样品。fl为protein a亲和层析过程中的流穿液体，e为洗脱的lic11融合蛋白，naoh为层析结束后naoh溶液洗脱的杂质。
47.图14为本技术实施例7中不同linker长度对lic11融合蛋白酶切效率的影响sds-page图。
48.图15为本技术实施例7中不同linker长度对lic11融合蛋白促mo7e细胞增殖活性的影响结果图。
49.图16为本技术实施例8中lic11融合蛋白小鼠体内给药后体重变化结果图。
50.图17为本技术实施例8中lic11融合蛋白小鼠体内给药后脾脏照片及称重图。
51.图18为本技术实施例8中lic11融合蛋白小鼠体内给药后外周血cd8
+
t细胞计数结果图。
52.图19为本技术实施例8中lic11融合蛋白小鼠体内给药后外周血nk细胞计数结果
图。
53.图20为本技术实施例9中lic110融合蛋白的protein l亲和层析纯化图。
54.图21为本技术实施例9中纯化后lic110融合蛋白的sds-page电泳图。fl为protein a亲和层析过程中的流穿液体，e为洗脱的lic110融合蛋白。
55.图22为本技术实施例10中lic110融合蛋白在upa酶裂解前后促进mo7e细胞增殖活性检测的结果图。
56.图23为本技术实施例11中lic18融合蛋白的protein a亲和层析纯化图。
57.图24为本技术实施例11中纯化后lic18融合蛋白的sds-page电泳图。
58.图25为本技术实施例12中lic18融合蛋白在upa酶裂解前后促进mo7e细胞增殖活性检测的结果图。
59.图26为本技术实施例13中lh05融合蛋白的protein a亲和层析纯化图。
60.图27为本技术实施例13中纯化后lh05融合蛋白的sds-page电泳图。
61.图28为本技术实施例13中lh05融合蛋白western blot鉴定图(anti-igg(h+l)抗体)；
62.图29为本技术实施例13中lh05融合蛋白western blot鉴定图(anti-il-15抗体)；
63.图30为本技术实施例14中lh05融合蛋白对人pd-l1抗原的亲和力检测结果图。
64.图31为本技术实施例14中lh05融合蛋白对小鼠pd-l1抗原的亲和力检测结果图。
65.图32为本技术实施例15中lh05融合蛋白被upa酶裂解的sds-page图。
66.图33为本技术实施例16中lh05融合蛋白在upa酶裂解前后促进mo7e细胞增殖活性检测的结果图。
67.图34为本技术实施例17中lh05融合蛋白小鼠体内给药后毒性检测结果图。a为体重变化曲线，b为生存率曲线。
68.图35为本技术实施例17中lh05融合蛋白小鼠体内给药后安全性检测结果图。a为脾脏重量；b为外周血cd8
+
t细胞和nk细胞计数；c为血浆炎症因子ifn-γ、il-6的水平；
69.图36为本技术实施例18中lh05融合蛋白治疗小鼠rm-1肿瘤的肿瘤生长曲线图；
70.图37为本技术实施例18中lh05融合蛋白治疗小鼠rm-1肿瘤的小鼠生存率曲线图；
71.图38为本技术实施例19中lh05融合蛋白与抗vegf单克隆抗体联用治疗小鼠ht-29移植瘤的肿瘤生长曲线图；
72.图39为本技术实施例20中纯化后lic23融合蛋白的sds-page电泳图。
73.图40为本技术实施例21中lic23融合蛋白被mmp酶裂解的sds-page图。
74.图41为本技术实施例22中lic23融合蛋白在mmp酶裂解前后促进mo7e细胞增殖活性检测的结果图。
75.图42为本技术实施例23中lic31融合蛋白治疗小鼠u87移植瘤的小鼠肿瘤生长曲线图。
具体实施方式
76.下面结合实施例对本技术作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。
77.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相
互组合。
78.需要说明的是，在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
79.需要说明的是，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。
80.本技术提供一种融合蛋白，其包括第一结构单元、第二结构单元和第三结构单元；其中，所述第一结构单元包含下列的至少之一：fc片段、抗体或抗原结合片段；所述第二结构单元包含可裂解肽接头，所述可裂解肽接头能被目的组织特异性酶切断裂；所述第三结构单元包含细胞因子或细胞因子与其受体的复合物；所述第一结构单元通过所述第二结构单元与所述第三结构单元的n端或c端连接。
81.在本发明的融合蛋白中，第一结构单元、第二结构单元的空间位阻能够对第三结构单元的结构进行掩蔽，从而调节第三结构单元与其靶细胞的结合，改变其活性；并且，可裂解肽接头能被目的组织特异性酶切断裂后，第三结构单元可脱离第一结构单元，使第三结构单元有更大的自由度，有利于其发挥活性。
82.也就是说，本技术的融合蛋白各结构域的连接顺序自n端至c端为选自下列中的任意一种：
83.1)抗体fc片段，可裂解连接子，细胞因子或细胞因子与其受体的复合物(如图1的a所示)；
84.2)细胞因子或细胞因子与其受体的复合物，可裂解连接子，抗体fc片段(如图1的f所示)；
85.上述1)和2)结构的融合蛋白能够进一步与抗原结合片段(例如fab、scfv)融合为新的融合蛋白(如图1的e、k、n所示)。
86.3)抗体或抗原结合片段，可裂解连接子，细胞因子或细胞因子与其受体的复合物(如图1的b、c、d所示)；
87.4)细胞因子或细胞因子与其受体的复合物，可裂解连接子，抗体或其抗原结合片段(如图1的g、i、j所示)；
88.上述3)和4)结构的融合蛋白能够进一步与抗体fc片段融合为新的融合蛋白(如图1的l、m所示)；其中，抗体fc片段的两个肽段可同时融合上述结构的融合蛋白，也可是其中一个肽段融合上述结构的融合蛋白，具体类型不受限制，均在本发明的保护范围内。
89.其中，第三结构单元受到第一结构单元、第二结构单元的空间位阻影响，在融合状态下与受体的结合受到限制，导致生物学活性较低，在第二结构单元可连接连接子被切割后，第三结构单元被释放，恢复对受体的亲和力，生物学活性恢复至较高水平，由此降低其对非靶标组织毒副作用的同时提高对靶标的治疗效果。
90.在一些实施方式中，本技术的第二结构单元为可裂解连接子，优选的，所述可裂解
连接子为可被目的组织，如肿瘤组织过表达的蛋白酶裂解的肽接头。本技术的融合蛋白到达目的组织，如肿瘤组织后，连接子被目的组织中过表达的蛋白酶裂解，释放第三结构单元的细胞因子或细胞因子与其受体的复合物。
91.在本技术的一些实施方式中，第一结构单元位于融合蛋白的n末端，第一结构单元包含免疫球蛋白分子或免疫球蛋白fc片段，如图1的e、l、n所示。
92.在本技术的一些实施方式中，第一结构单元位于融合蛋白的c末端，第一结构单元包含免疫球蛋白分子或免疫球蛋白fc片段，如图1的k、m所示。
93.在一种可选的方式中，第一结构单元通过第二结构单元连接到第三结构单元的n端。以第一结构单元为抗体fc片段、第三结构单元为il-15以及含sushi结构域的il-15r元片段为例，融合蛋白从n端到c端依次包含fc片段、可裂解连接子、il-15和含sushi结构域的il-15r连片段(下文简称为lic11，如图1的a所示)。本技术发现，fc和连接子对il-15与其受体的结合区域形成空间位阻，从而影响il-15的活性，导致lic11在裂解前活性被掩蔽，相对较低，而在裂解后il-15被释放，空间位阻解除，活性得以恢复。这使得lic11的肿瘤靶向性和安全性与il-15单体相比显著提升。
94.在一种可选的方式中，第一结构单元通过第二结构单元连接到第三结构单元的n端。以第一结构单元为抗体fab片段、第三结构单元为il-15以及含sushi结构域的il-15r构片段为例，fab的轻链和重链的c端分别与可裂解连接子、il-15和含sushi结构域的il-15r解片段依次融合(下文简称为lic19，如图1的b所示)。本技术发现，fab和连接子对il-15与其受体的结合区域形成空间位阻，从而影响il-15的活性，导致lic19在裂解前活性被掩蔽，相对较低，而在裂解后il-15被释放，空间位阻解除，活性得以恢复。这使得lic19的肿瘤靶向性和安全性与il-15单体相比显著提升。
95.在一种可选的方式中，第一结构单元通过第二结构单元连接到第三结构单元的n端。以第一结构单元为抗体fab片段、第三结构单元为il-15以及含sushi结构域的il-15r构片段为例，fab的轻链或重链的c端与可裂解连接子、il-15和含sushi结构域的il-15r接片段依次融合(下文简称为lic110，如图1的d所示)。本技术发现，fab和连接子对il-15与其受体的结合区域形成空间位阻，从而影响il-15的活性，导致lic110在裂解前活性被掩蔽，相对较低，而在裂解后il-15被释放，空间位阻解除，活性得以恢复。这使得lic110的肿瘤靶向性和安全性与il-15单体相比显著提升。
96.在一种可选的方式中，第一结构单元通过第二结构单元连接到第三结构单元的n端。以第一结构单元为抗体scfv、第三结构单元为il-15以及含sushi结构域的il-15r元片段为例，融合蛋白从n端到c端依次包含scfv、可裂解连接子、il-15和含sushi结构域的il-15r子片段(下文简称为lic111，如图1的e所示)。本技术发现，fab和连接子对il-15与其受体的结合区域形成空间位阻，从而影响il-15的活性，导致lic111在裂解前活性被掩蔽，相对较低，而在裂解后il-15被释放，空间位阻解除，活性得以恢复。这使得lic111的肿瘤靶向性和安全性与il-15单体相比显著提升。
97.在本技术的另一些实施方式中，第一结构单元位于融合蛋白的c末端，所述第一结构单元包括所述抗体fc片段。
98.在本技术的一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段可选自靶向肿瘤抗原或免疫检查点的抗体或抗体片段，产生新的免疫细胞因子。这些抗原和免疫检查点包括egfr、
vegf、claudin 18.2、nectin-4、gpc-3、pd-l1、pd-1、tigit、lag3、tim-3和ctla-4的至少之一。
99.本技术中“egfr”为是表皮生长因子受体，其突变或过表达一般会引发肿瘤。egfr二聚化后激活细胞下游信号通路，与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。结合egfr的抗体或抗原结合片段能够抑制egfr活性，阻止其磷酸化，进而抑制下游信号通路激活，可达到抑制抗肿瘤效果。
100.本技术中“vegf”为血管内皮生长因子，可通过旁分泌机制作用于内皮细胞，在促进血管形成、抑制内皮细胞的凋亡及提高血管通透性等方面发挥重要作用。vegf在几乎所有的人体肿瘤和肿瘤细胞株中皆有过表达。结合vegf的抗体或抗原结合片段能够抑制vegf与其位于内皮细胞上的受体vegfr-1和vegfr-2结合，从而使vegf失去生物活性而减少肿瘤的血管生成，因此抑制了肿瘤的生长。
101.本技术中“claudin 18.2”为紧密连接蛋白claudin家族的18.2异构体分子，是一个高度特异性的细胞表面分子，在正常的组织中仅表达在分化的胃粘膜上皮细胞上，在胃癌、胰腺、卵巢、胆癌和肺腺癌等实体瘤中高表达。结合claudin 18.2的抗体能够特异性识别肿瘤细胞，引发抗体依赖性细胞毒性(adcc)、补体依赖性细胞毒性(cdc)，凋亡和抑制细胞增殖，具有清除癌细胞和控制疾病的强大能力。
102.本技术中“pd-l1”为程序性死亡受体-配体1，是一种免疫检查点蛋白，肿瘤细胞通过过度表达pd-l1，持续激活pd-1/pd-l1信号通路造成多种免疫抑制。结合pd-l1的抗体或抗原结合片段作为免疫检查点蛋白的阻断剂，可抑制pd-1/pd-l1通路，阻断cd80和pd-l1的共抑制功能，有利于全面激活t细胞功能和促进细胞因子产生。
103.本技术中“pd-1”为程序性死亡蛋白1，是可在t细胞、b细胞、单核细胞、自然杀伤细胞表面诱导表达的共抑制受体。
104.本技术中“tigit”为含t细胞免疫球蛋白和itim结构域蛋白，在多种肿瘤中可发现其表达异常，能够导致免疫细胞功能障碍，与肿瘤进展、预后不良相关，通过阻断tigit可以逆转免疫细胞功能衰竭，发挥抗肿瘤效应，是新一代免疫治疗靶点。
105.本技术中“lag3”为淋巴细胞活化基因-3，“tim-3”为t细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3，“ctla-4”为细胞毒性t淋巴细胞相关抗原-4，三者均作为免疫抑制受体参与t细胞免疫调控。
106.本技术上述实施例的融合蛋白中，所述第一结构单元、所述第二单元结构和所述第三单元结构均采用单体形式，其具有与二聚体形式相似的半衰期和靶向性。其中在本技术的另一些实施方式中，所述第一结构单元、所述第二单元结构和所述第三单元结构的至少之一为二聚体形式。
107.在本技术的一些实施方式中，本技术的第二结构单元包含可被基质金属蛋白酶裂解的肽接头。本领域已知的可被基质金属蛋白酶裂解的肽接头，例如wo2019010219a中公开的肽接头均可用于本技术，在此将上述文献通过引用并入本文。在一些实施方式中，第二结构单元的氨基酸序列包括基质金属蛋白酶mmp-2/9/14的底物sgqllgflta。
108.在本技术的一些实施方式中，所述目的组织包括蛋白酶；任选地，所述蛋白酶选自在肿瘤组织中过表达的蛋白酶。在本技术的一些优选实施方式中，蛋白酶为基质金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或天冬酰胺内肽酶。
109.示例性地，丝氨酸蛋白酶选自尿激酶、胰蛋白酶。本领域已知的可被丝氨酸蛋白酶裂解的肽接头均可用于本技术。在一些实施方式中，可裂解肽接头包括尿激酶底物lsgrsdnh。
110.在本技术的一些实施方式中，可裂解肽接头包含可被天冬酰胺内肽酶裂解的肽接头。本领域已知的可被天冬酰胺内肽酶裂解的肽接头均可用于本技术。在一些实施方式中，第二结构单元的氨基酸序列包括天冬酰胺内肽酶底物aanl。
111.在本技术的一些实施方式中，所述可裂解肽接头包括柔性肽段和/或蛋白酶底物序列。
112.在本技术的一些实施方式中，所述柔性肽段的氨基酸序列包括选自(gs)n、(ggs)n、(ggsg)n、(gssg)n、(gggs)n、(ggggs)n和(gsggs)n中的至少之一，n为1～20之间的任意整数。
113.示例性地，n可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
114.在本技术的一些实施方式中，所述柔性肽段的氨基酸序列长度为1～30个。
115.在本技术的一些实施方式中，所述可裂解肽接头包括柔性肽段和蛋白酶底物序列。
116.在本技术的一些实施方式中，所述可裂解肽接头具有如seq id no:29～seq id no:32任一项所示的氨基酸序列。本发明发现，融合蛋白中可裂解肽接头的长短可以调节第一结构单元和第三结构单元之间的空间掩蔽作用强度。进一步地，在本发明范围内的可裂解肽接头，相较于较短的可裂解肽接头，总体趋势为其长度越长，掩蔽作用越弱，融合蛋白的裂解效率越高。
117.在本技术的一些实施方式中，所述可裂解肽接头具有如seq id no:29所示的氨基酸序列。
118.在本技术的一些实施方式中，所述细胞因子与其受体的复合物为il-15与其受体sushi结构域的复合物。在本技术的一些实施方式中，所述il-15与其受体sushi结构域的复合物包括il-15-柔性连接子-sushi结构域的融合蛋白。即为本技术il-15与其受体sushi结构域的复合物中的il-15与il-15rα的sushi结构域通过柔性连接子结合，组成il-15超级激动剂，相较于单体il-15具有更好的体内稳定性和半衰期，在生产工艺和质量控制方面能够降低难度、提高效率。所述柔性连接子包含选自gs、gsggs、ggggs和/或gggs序列的重复；在本技术的一些实施方式中，所述柔性连接子的氨基酸序列如seq id no:34所示。
119.在本技术的一些实施方式中，所述柔性连接子包含选自(gs)n、(gsggs)n、(ggggs)n和/或(gggs)n中的至少之一，n为1～20之间的任意整数。
120.示例性地，n可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
121.本技术中“细胞因子”意指一类具有广泛生物学活性的低分子量蛋白质，包括白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、造血因子、生长因子、趋化因子等家族，通过结合细胞表面相应的细胞因子受体而发挥生物学作用。因此，本技术的融合蛋白通过第一结构单元和第二结构单元的空间位阻对细胞因子的受体结合区域进行掩蔽，干扰其与受体的结合，从而影响其生物学活性。在第二结构单元被酶切后，细胞因子部分释放，恢复与细胞表面受体的结合能力，从而恢复活性。本技术中“融合蛋白”意指通过基因重组方法、化学方法或其他适当方法连结(亦即，融合)的生物性活性多肽与效应物分子。若有需要，融合分子可经由氨基
酸连接子于一个或数个位置融合。融合蛋白可以以单体或多聚体(例如二聚体)的形式存在。在本技术的一些实施方式中，“il-15”是指白细胞介素15，包括任何天然(野生型)的il-15、其功能性片段或突变体，优选为哺乳动物白细胞介素15，更优选为人白细胞介素15。在一些实施方式中，哺乳动物白细胞介素15包括但不限于为源自鼠、猪、兔、羊、猴、猫的白细胞介素15。在本技术的一些实施方式中，所述il-15为人il-15分子或人il-15分子的突变体。
122.在一些实施方式中，人il-15分子的氨基酸序列如seq id no:1所示。在一些实施方式中，人il-15分子的突变体为天然人il-15分子通过一个或多个氨基酸替换、增加和/或缺失获得，例如截短的人il-15多肽序列。在一些实施方式中，人il-15分子的突变体为具有选自c42s、l45c、q48c、v49c、l52c、e53c、e87c和e89c的一个或多个氨基酸取代的突变体。在一些实施方式中，人il-1 5分子的突变体为具有选自n1d、n4d、d8n、d30n、d61n、e64q、n65d和q108e的一个或多个氨基酸取代的突变体。例如，在一些实施方式中，氨基酸取代是q108e。在一些实施方式中，氨基酸取代是n65d。在一些实施方式中，氨基酸取代是n1d/n65d。在一些实施方式中，氨基酸取代是n4d/n65d。在一些实施方式中，氨基酸取代是d30n/e64q/n65d。优选的，人il-15分子的突变体为具有n72d突变的突变体，本技术发现，包含n72d突变的il-15突变体的本发明融合蛋白显示增强的生物活性。优选的，本技术的il-15的氨基酸序列如seq id no:4所示。
123.本技术中“il-15rα的sushi结构域”是指il-15的α受体胞外结构域中的功能性片段，长度为65-85个氨基酸，可以是任何物种的il-15rα功能性片段或突变体，优选为人il-15rα。在一些实施方式中，本技术的il-15rα具有ncbi参考序列号np_002180.1所示的氨基酸序列。在另一些实施方案中，使用含sushi结构域的il-15rα胞外区片段，氨基酸序列如seq id no:5所示。
124.本技术中“抗体”是指通常由两对多肽链，每对具有一条轻链(l链)和一条重链(h链)组成的免疫球蛋白分子。从一般意义上，重链可以理解为抗体中分子量较大的多肽链，轻链是指抗体中分子量较小的多肽链。各重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)组成。重链恒定区由3个结构域(ch-1、ch-2和ch-3)组成，各轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成，轻链恒定区由一个结构域cl组成，vh和vl区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(cdr))，各重链/轻链对的可变区(vh和vl)分别形成抗体结合部位。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同种型的抗体，例如，igg或其突变体，iga1，iga2，igd，ige或igm抗体。在本技术的一些实施方式中，所述结合肿瘤抗原或免疫检查点的抗体为全长免疫球蛋白，包括igg1、igg2、igg3和igg4。
125.在本技术中“抗原结合片段”是指包含全长抗体的一部分或全部的多肽，其缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但仍能保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为抗原结合部分。例如，该片段可包含抗体cdr的一部分或全部，此类片段具生物活性，因为其结合至抗原，且可与其他抗原结合分子(包括完整抗体)竞争结合至给定表位。可通过重组dna技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在本技术的一些实施方式中，所述抗体包括选自多抗、全长单抗、fab抗体、fab’抗体、f(ab’)2抗体、fv抗体、单链抗体、单域抗体以及最小识
别单位中的至少之一；或者所述抗原结合片段包括选自f(ab’)2片段、fab’片段、fab片段、f(ab)2片段、fv片段、scfv片段、scfv-fc融合蛋白、scfv-fv融合蛋白和最小识别单位中的至少之一。
126.在本技术的一些优选实施例中，所述抗体的抗原结合片段为fab、fab’、(fab’)2、fv、scfv或vhh，或fab、fab’、(fab’)2、fv、scfv、vhh与scfv的融合形式。
127.在本技术中“fab”是通过用木瓜蛋白酶(切割h链的224位的氨基酸残基)处理抗体分子所获得的片段，其中h链n端侧的约一半和整个l链通过二硫键结合在一起。
128.在本技术中“f(ab’)
2”是通过用胃蛋白酶消化抗体分子铰链区中两个二硫键的下方部分而获得的分子量约为100,000da并包含在铰链位置相连的两个fab区的抗体片段。
129.在本技术中“fab
’”
是通过切割上述f(ab')2的铰链区的二硫键而获得的抗体片段。fab'可以通过用还原剂例如二硫苏糖醇处理特异性识别并结合抗原的f(ab')2来生产。
130.在本技术中“fv”是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能片段，由轻链可变区和重链可变区组成，二者通过非共价键结合在一起。
131.在本技术中“scfv”是指包含抗体的重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的抗体片段，scfv的大小一般是一个完整抗体的1/6，优选是由一个核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。
132.在本技术中“vhh”是重链抗体的单独的可变区，具有抗原结合能力。
133.在本技术中“抗体fc片段”是指可结晶段，相当于抗体分子的ch-2和ch-3结构域。在一些实施方式中，抗体fc片段衍生自人igg1或igg4，与野生型相比包括一个或多个氨基酸替换、增加或者缺失，使得所述融合蛋白减弱甚至消除adcc和/或cdc功能，降低非特异性免疫反应。
134.在本技术的一些实施方式中，所述第一结构单元的n端与靶向pd-l1的fab进一步融合，获得具有pd-l1靶向性的融合蛋白。在一个实施例中，第三结构单元为il-15与il-15rα的sushi结构域，所获得的的新的融合蛋白为anti-pd-l1/il-15免疫细胞因子，命名为lh05(如图1中的n所示)。所述lh05轻链的氨基酸序列如seq id no:2所示，重链的氨基酸序列如seq id no:6。在一个实施方式中，编码lh05的轻链和重链的核苷酸序列分别如seq id no:7和seq id no:8所示。
135.在另一些实施方式中，第三结构单元通过可裂解的第二结构单元连接在第三结构单元的n端；或者，第三结构单元通过可裂解的第二结构单元连接在第三结构单元的c端。示例性地，第三结构单元通过可裂解的第二结构单元连接在结合pd-l1的人igg1免疫球蛋白fab的轻链c端，在此实施方式中，融合蛋白的轻链由n端至c端包括结合pd-l1的人igg1免疫球蛋白的轻链、可裂解连接子、il-15与il-15rα的sushi结构域，融合蛋白的重链为结合pd-l1的人igg1免疫球蛋白的重链(如图1中的l所示)。
136.在本技术的一些实施方式中，所述融合蛋白具有如seq id no:11、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:20、seq id no:21和seq id no:22任一项所示的氨基酸序列；或者
137.所述融合蛋白具有氨基酸序列如seq id no:6所示的第一肽段和具有氨基酸序列如seq id no:2所示的第二肽段；或者
138.所述融合蛋白具有氨基酸序列如seq id no:24所示的第一肽段和具有氨基酸序
列如seq id no:2所示的第二肽段；或者
139.所述融合蛋白具有氨基酸序列如seq id no:35所示的第一肽段和具有氨基酸序列如seq id no:37所示的第二肽段；或者
140.所述融合蛋白具有氨基酸序列如seq id no:36所示的第一肽段和具有氨基酸序列如seq id no:39所示的第二肽段。
141.本技术的一个实施方式涉及融合蛋白复合体，本技术的融合蛋白复合体可以是包括两个不同或相同的融合蛋白结合而成的二聚体蛋白；也就是，融合蛋白复合体可以是同源二聚体，也可以是异源二聚体。融合蛋白复合体中各融合蛋白可通过fc片段之间形成的链间键连接，优选的通过fc片段间形成的二硫键共价连接成为二聚体。在一些实施方式中，融合蛋白复合体中包含两个本技术的融合蛋白。
142.本技术还提供编码融合蛋白的核酸、相应的表达载体和重组细胞。
143.本技术的核酸可以是dna分子或rna分子，也可以是核酸类似物。在本技术中的核酸分子可以包含天然存在的核酸残基或人工生成的核酸残基。本技术的核酸分子可以是单链或双链的、线性或环状的、天然的或合成的，并且若没有另外指出，则没有任何大小限制。核酸分子还可以包含启动子，启动子可以是同源或异源的。
144.本技术的核酸分子可以克隆到载体中。本技术的“载体”包括质粒、粘粒、病毒、噬菌体和其它在遗传工程中通常使用的载体。在一些实施方式中，这些载体适用于转化细胞、真核生物细胞如真菌细胞、微生物的细胞诸如酵母或原核细胞。在一个优选的实施方式中，这些载体适用于细菌细胞的稳定转化，例如以转录本技术的核酸分子。
145.本技术的载体可以是表达载体。已经在文献中广泛描述的合适的真核表达载体都可用于本技术。在一个实施方式中，表达载体可以含有标志基因和确保在选择的宿主中复制的复制起点、启动子以及转录终止信号。在启动子和终止信号之间，优选地，有至少一个能够插入期望表达的核酸序列/分子的限制性位点。优选的，本技术的表达载体选自pet系列表达载体、pgex系列表达载体、pcdna系列表达载体、pcmv系列表达载体，更优选本技术的表达载体是pmf09表达载体。
146.在一个实施方式中，在重组细胞中表达融合蛋白，随后分离抗体，并通常纯化到药学可接受的纯度。对于蛋白质表达，通过标准方法将编码其蛋白质的核酸插入表达载体中。在合适的稳定重组细胞中实施表达，并且从所述细胞(上清液或裂解后的细胞)中回收蛋白质。
147.在另一个实施方式中，可以将本技术的核酸分子和/或其中含有本技术核酸分子的载体转导、转化或转染、或者以其它方式导入宿主细胞中。例如，宿主细胞是真核或原核细胞，优选是真核细胞。作为一个非限制性例子，宿主细胞是哺乳动物细胞。本技术的宿主细胞可以是人、酵母或真菌细胞，例如中国仓鼠的卵巢细胞(cho)、幼仓鼠的肾脏细胞(bhk,atcc ccl 10)、幼鼠的塞尔托利细胞(sertoli cells)、猴的肾脏细胞(cos细胞)、通过sv40(cos-7,atcc crl 1651)转化的猴的肾脏cvi细胞、人的胚肾细胞(hek-293)、猴肾脏细胞(cvi，atcc ccl-70)、非洲绿猴的肾脏细胞(vero-76,atcc crl-1587)、人的子宫颈癌细胞(hela,atcc ccl-2)等。优选的，本技术的宿主细胞是人hek293细胞。
148.本技术还提供制备如上所述的融合蛋白的方法，包括如下步骤：在适合表达融合蛋白的条件下培养本技术的重组细胞，并从细胞或细胞培养物上清液回收融合蛋白。在一
个实施方式中，制备本技术融合蛋白的方法包括以下步骤：构建包含融合蛋白编码基因的表达载体，通过瞬时转染重组细胞的方法构建包含表达载体的重组细胞，培养重组细胞并收集细胞上清，通过填料为proteina/g的亲和层析纯化融合蛋白。
149.合适的表达所述融合蛋白的条件对于本领域技术人员来说应该是已知的，本领域技术人员可根据经验选择适用的培养基，在适于重组细胞生长的条件下进行培养。当重组细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。
150.分离和纯化融合蛋白的方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
151.本技术还提供包含本技术融合蛋白、核酸、表达载体、重组细胞和/或融合蛋白复合体的药物组合物。
152.在一些实施方式中，本技术的药物组合物还包括靶向肿瘤抗原或免疫检查点的单克隆抗体，例如pd-1、pd-l1、lag3、tim-3、ctla-4、her2、egfr、claudin 18.2、vegf、claudin 18.2、nectin-4、gpc-3、vegf、cd20、cd33等的抗体，与本技术融合蛋白的联用可以发挥协同抗肿瘤作用，提高疾病治疗效果。
153.在一些实施方式中，本技术的药物组合物可以进一步包含药学可接受载体。药学上可接受的载体是指是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂和水等，填充剂如淀粉、蔗糖，乳糖、微晶纤维素等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠，羟丙纤维素，交联羧甲基纤维素，琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇，十二烷基硫酸钠；吸附载体如高龄土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、微粉硅胶和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
154.合适的药用载体的例子是本领域中公知的。可以通过公知的常规方法配制包含这类载体的药物组合物。在一些实施方式中，本技术的药物组合物中还可以含有其他用于治疗的活性成分。
155.可以通过不同方式，例如经肠、口服(例如丸剂、片剂、含服、舌下、崩散剂、胶囊剂、薄膜、液体溶液或悬浮液、粉末、固体晶体或液体)、直肠(例如栓剂、灌肠剂)、经由注射(例如静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内、皮内)、经由吸入(例如支气管内)、表面、阴道、皮肤上或鼻内施用本发明的药物组合物。优选的，本发明的药物组合物为冻干制剂或水溶液的形式。临床给药剂量方案会由主治内科医生和临床因素决定。如医学领域中公知的，针对任何一位患者的剂量取决于许多因素，包括患者体格、体表面积、年龄、待施用的药物、性别、施用时间和路径、一般健康、和同时施用的其它药物。可以局部或系统施用本发明药物组合物。优选地，可通过静脉内或皮下进行施用。也可以对靶部位直接施用本发明的药物组合物，例如通过对内部或外部靶部位进行靶向给药的方式来进行。
156.本技术还提供本技术所述的融合蛋白、融合蛋白复合体在制备用于治疗癌症、传染病或自身免疫疾病的药物中的用途。其中，癌症包括但不限于白血病(例如，急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、急性成髓细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白
血病、急性骨髓单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性红细胞性白血病、慢性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(何杰金氏症、非何杰金氏症)、巨球蛋白血症及实体肿瘤，如肉瘤及恶性肿瘤(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、依汶氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状上皮细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳突癌、乳突腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精母细胞瘤、胚胎性癌、威尔姆氏肿瘤、子宫颈癌、子宫癌、睪丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶瘤、星状细胞瘤、神经管胚细胞瘤、颅咽瘤、类室管膜瘤、松果腺瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、寡树突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经胚细胞瘤、及视网膜胚细胞瘤)。传染病包括但不限于天花病毒感染、hiv感染、细菌感染、真菌感染、hbv感染。自身免疫性疾病包括，但不限于多发性硬化症、银屑病、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、克罗恩病、胃炎、黏膜炎。
157.在本技术中，所述药物包括治疗性细胞，诸如car t、car nk等，本技术的融合蛋白表达或修饰在细胞的表面，帮助提高细胞在肿瘤部位的存活和活性，从而提高对疾病进行细胞治疗时的疗效。
158.在本技术中“治疗”指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述药物给予有需要的个体。
159.本技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本技术的实践了解到。
160.实施例1：可裂解释放il-15的lic11融合蛋白的制备
161.1、构建编码lic11融合蛋白的表达载体
162.通过基因合成和pcr技术制备如seq id no:13所示的核苷酸序列，该核苷酸序列编码氨基酸序列如seq id no:14所示的lic11融合蛋白。如图1a所示，lic11融合蛋白中fc片段位于n端，通过可裂解的连接子(即为可裂解肽接头)与il-15复合物相连。il-15复合物包含由柔性连接子(氨基酸序列如seq id no:34所示)连接的il-15(氨基酸序列如seq id no:1所示)和il-15rαsushi结构域(氨基酸序列如seq id no:5所示)的融合蛋白。
163.将获得的片段通过同源重组插入pmf09质粒的hind iii与not i酶切位点之间，将同源重组产物转化dh5α菌株，得到表达载体pmf09/lic11。通过测序验证载体构建正确的菌株。培养至对数生长期后，加入终浓度为20％的甘油长期保存于-80℃。
164.2、质粒扩增
165.按照1：100倍接菌量扩大体积培养表达载体pmf09/lic11的菌，使用omega公司提供的e.z.n.a endo-free plasmid maxi kit试剂盒(货号：d6926-03)，通过碱裂解法抽提质粒，质粒经无菌滤膜过滤后保存于-20℃。
166.3、细胞培养及瞬时转染表达lic11融合蛋白
167.1)细胞准备
168.悬浮培养人hek293细胞，培养基成分配方为sfm4hek293 medium(hyclone,usa)与freestyle 293expression medium(invitrogen,usa)两种培养基按照1:1体积混合，再加入终浓度为2％的胎牛血清。悬浮液以1
×
106/ml密度传代至新鲜培养基中，在37℃恒温摇床(5％ co2)中以125rpm转速悬浮培养。
169.转染前一天，将细胞传代至500ml锥形培养瓶，调整细胞状态及密度至4
×
106个/ml，培养体积200ml。
170.转染时细胞密度达到为6
×
106/ml，细胞活率95％以上时进行转染；取100ml培养液，离心收集细胞，用freestyle293培养基洗涤一次。用100ml freestyle293培养基重悬细胞；
171.2)质粒稀释
172.按0.5μg质粒/106个细胞的质量取质粒，用freestyle293培养基稀释到40ng/μl，混匀。
173.质量/μg300浓度ng/μl780稀释至40ng/μl体积/ml385μl
→
7.5ml
174.3)pei包裹质粒
175.质粒：pei质量比为1：5，则取1.5ml pei(聚乙烯亚胺，转染试剂，购自polysciences公司)，加入到稀释好的质粒中，混匀，静置包裹10-15min，控制时间，混合液会变浑浊。
176.4)pei转染
177.将pei包裹好的质粒加入到细胞中，放到摇床培养。
178.5)4h后补液
179.4h后补加等体积100ml sfm4hek293培养基，1ml vpa(200x，750mmol/l，终浓度为3.75mmol/l)，400μl g418(50mg/ml)。
180.6)24h后补液
181.补加200μl anti-clumping(1000x)，5.0ml 20％的tn1(终浓度为0.5％)。
182.7)监测细胞存活率变化，培养6-7天后至细胞存活率下降至50％以下，收集细胞培养上清液进行下一步纯化。
183.4、lic11融合蛋白的纯化
184.1)样品准备：将细胞悬液7000rpm离心30分钟后弃沉淀，上清液经0.45μm滤膜过滤后待用；
185.2)20％乙醇冲洗蛋白纯化系统，分别用10倍柱体积双蒸水和上样缓冲液冲洗和平衡protein a柱；
186.3)利用蛋白纯化仪蠕动泵上样，流速按照柱体积设定，一般不超过1个柱体积/分钟，收集流穿液；
187.4)上样结束后，利用10倍柱体积的上样缓冲液再次平衡protein a柱；
188.5)使用洗脱缓冲液(柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，ph＝2.8)进行洗脱，洗脱液分管收集，每1ml收集一管，并根据紫外280nm吸收值观察洗脱峰；将洗脱峰的收集管加入适量ph为
9.0的1m tris-hcl使得目的蛋白溶液ph被调整到7.0至8.0左右；融合蛋白lic11的protein a亲和层析纯化图如图2所示，可以看到超过1000mau的紫外吸收峰，显示目标蛋白被洗脱缓冲液洗脱。
189.6)用150mm naoh溶液冲洗protein a柱；后依次用10倍柱体积的双蒸水及20％乙醇冲洗protein a柱，最后使得乙醇完全浸没柱填料；
190.7)通过sds-page检测各洗脱管纯度，合并各洗脱管，经超滤、置换buffer操作后使蛋白溶于pbs中，待下一步操作；经亲和层析纯化后融合蛋白lic11的sds-page电泳图如图3所示，经亲和层析后得到目标蛋白，经非还原处理的样品分子量在100kda与150kda之间，经还原处理的样品单链分子量在50kda与70kda之间，并且条带单一。
191.5、western blot验证lic11融合蛋白的表达
192.1)取适量经过亲和层析纯化的lic11融合蛋白进行sds-page。电泳条件：90v，20min；100v，70min；
193.2)通过湿转法将目标蛋白转到pvdf膜上。转膜条件：200ma，90min；
194.3)转膜结束后，用5％的脱脂奶粉将pvdf膜室温封闭2h或4度过夜；
195.4)选用羊抗人重链及轻链-hrp抗体直接作为二抗验证lic11融合蛋白中抗体片段的表达。孵育时间：室温1h；
196.5)通过洗膜、ecl法显色后得到如图4所示结果，证明了经非还原处理的lic11融合蛋白条带在100-150kda处，经还原处理的融合蛋白重链分子量在50kda与70kda之间，与此前蛋白纯化的sds-page情况一致。并且western blot中二抗对lic11融合蛋白抗体片段的结合确定了该部分的表达。
197.实施例2：lic11融合蛋白的体外酶切裂解
198.将实施例1制备的融合蛋白lic11与尿激酶upa(0.25μg/μl)以质量比20：1的比例加至ep管中，lic11为10μg，尿激酶0.5μg，用pbs补至体积20μl。25℃下分别裂解4h，7h，10h和12h，通过sds-page验证不同时间下的裂解情况。如图5所示，lic11能够被尿激酶裂解，而且孵育时间越长裂解的越充分。sds-page结果显示未酶切的lic11融合蛋白分子量约70kda，upa酶切后在35kda左右有条带为fc片段，40kda有模糊的条带为il-15复合物(简称ilr)。释放后的ilr为糖基化蛋白，由于糖基化影响使得在sds-page位置弥散且高于理论分子量(23.5kda)，因此仅能在40kda左右观察到模糊的条带。
199.实施例3：lic11融合蛋白的活性检测
200.融合蛋白处理：
201.1)取4μl upa(浓度为0.25μg/μl)于ep管中，加入实施例1制备的20μg(即20μl)lic11融合蛋白，混匀之后37℃下裂解12h。
202.2)将上述反应液用rpmi 1640+10％fbs稀释至500μl，0.22μm滤膜过滤，然后3倍梯度稀释。取20μl未裂解的lic11融合蛋白用rpmi 1640+10％ fbs稀释至500μl，0.22μm滤膜过滤，然后3倍梯度稀释，作为对照组。另采用实施例1相同的方法制备阳性对照lh02蛋白，其氨基酸序列如seq id no:9所示，编码核苷酸序列如seq id no:10所示。取il-15阳性对照lh02用rpmi 1640+10％ fbs稀释至500μl，0.22μm滤膜过滤，然后3倍梯度稀释。
203.细胞处理：
204.1)用含有10ng/ml商业化重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hgm-csf)的1640
完全培养基(rpmi 1640，gibco，usa)悬浮培养mo7e细胞。
205.2)当细胞处于良好的状态，用不含hgm-csf的完全培养基洗涤两次，将细胞密度稀释至4
×
105/ml，96孔板每孔加入50μl细胞悬液，即每孔20000个细胞。
206.增殖检测：
207.1)将细胞饥饿4h后，每孔加入50μl上述经尿激酶裂解的梯度稀释的lic11，未裂解的lic11作为对照组。
208.2)37℃培养4天后加入10μl/孔cck-8(cell counting kit-8，cck-8)溶液，37℃孵育2-3小时后检测在450nm波长处吸收值。
209.3)数据经处理软件graphpad prism8进行四参数拟合，对融合蛋白促淋巴细胞中增殖效果进行评估。结果如图6所示，阳性对照lh02对mo7e的增殖活性为4.50nm，未经尿激酶裂解的lic11对mo7e细胞的增殖活性较弱，在600nm的浓度下都未达到平台期，其活性至少减弱150倍。而lic11经裂解之后计算其ec
50
＝22.53nm，对mo7e的增殖活性较未裂解lic11至少增强20倍。这提示未裂解时，fc片段和细胞因子复合物对细胞因子的活性发挥遮蔽作用，连接子裂解后所释放的细胞因子复合物具有较高的生物活性，由此使得lic11融合蛋白具有更好的安全性及生物活性，在显著抗肿瘤的同时降低了全身毒副作用。
210.本实验例还显示，虽然同为fc与il-15超级激动剂的融合蛋白，但当il-15与受体复合物的融合方式为sushi-il-15时(命名为rli)，其融合在fc的c端，即lh02的结构，fc对il-15的生物学活性无掩蔽作用；仅当il-15融合于fc的c端及sushi结构域的n端时，fc能够发挥对il-15的活性掩蔽作用。
211.实施例4：lic15融合蛋白的制备
212.lic11中可裂解的连接子包含尿激酶底物序列，将其替换为基质金属蛋白酶底物序列后，融合蛋白命名为lic15。lic15的结构与lic11相似，如图1a所示，lic15融合蛋白中fc片段位于n端，通过可裂解的连接子与il-15复合物相连。采用实施例1相同的方法制备lic15融合蛋白，其中通过化学基因合成和pcr技术制备的核苷酸序列如seq id no:15所示，该核苷酸序列编码氨基酸序列如seq id no:16所示的lic15融合蛋白。protein a亲和层析洗脱峰、sds-page分别如图7和图8所示。可以看到超过1000mau的紫外吸收峰，显示目标蛋白被洗脱缓冲液洗脱，经非还原处理的lic15融合蛋白条带在100-150kda处，经还原处理的融合蛋白单链分子量在70kda左右，并且条带单一。
213.实施例5：lic15融合蛋白的酶切和活性检测
214.采用与实施例2类似的方法检测基质金属蛋白酶对lic15融合蛋白的酶解效率进行检测。将1μg激活的基质金属蛋白酶rhmmp-2加入到100μg lic15融合蛋白(质量比1:100)，37℃孵育过夜，sds-page检测酶切前后蛋白条带的变化。结果如图9所示，还原样品在酶解前重分子量约为70kda，mmp-2酶解后在35kda左右有条带为fc片段，40kda有模糊的条带为释放的il-15和sushi结构域的复合物ilr。
215.采用与实施例3相同的方法检测lic15融合蛋白促进mo7e增殖活性，并以lh02位阳性对照。结果如图10所示，lh02和lic15融合蛋白促进mo7e细胞增殖的活性ec
50
分别为2.74nm和48.56nm，说明lic15的设计实现了融合蛋白中fc片段对il-15活性的掩蔽作用，使其体内应用时能够避免在正常组织激活外周免疫细胞，从而提高il-15的用药安全性。
216.实施例6：不同长度连接子的融合蛋白的制备
217.在lic11结构基础上，对其第二结构单元(可裂解的连接子)的长度进行调整，以此评估不同长度的连接子对酶切效率和细胞因子活性掩蔽程度的影响。采用实施例1相同的方法制备lic12、lic13和lic14融合蛋白，第二结构单元即可裂解的连接子分别较lic11缩短了8、16或13个氨基酸，更具体的，在酶切底物序列和il-15之间的柔性肽段分别较lic11缩短了0、8或13个氨基酸，其中，lic11、lic12、lic13、lic14融合蛋白中采用的可裂解的连接子的氨基酸序列分别如seq id no:29、seq id no:30、seq id no:31和seq id no:32所示。通过化学基因合成和pcr技术制备的核苷酸序列分别如seq id no:17、seq id no:18和seq id no:19所示，该核苷酸序列编码lic12\lic13和lic14融合蛋白氨基酸序列分别如seq id no:20、seq id no:21和seq id no:22所示。经protein a亲和层析，sds-page分别如图11、图12和图13所示，经非还原处理的lic12，lic13和lic14融合蛋白条带均在100-150kda处，经还原处理的融合蛋白单链分子量均在70kda左右。
218.实施例7：lic12、lic13和lic14的体外酶切裂解及活性检测
219.采用与实施例2相同的方法检测尿激酶对含有不同长度可裂解的连接子融合蛋白的酶切效率，25℃孵育14h。如图14所示，含有不同长度可裂解的连接子的融合蛋白均可被尿激酶裂解，连接子长度最长的lic11裂解效率最高，其次是lic12，连接子较短的lic13和lic14裂解效率相较于licc11则显著降低，说明第二结构单元长度缩短时，融合蛋白的裂解效率具有降低的趋势。此外，删除13个氨基酸的lic14裂解效率最低，甚至低于删除16个氨基酸的lic13，对比二者的序列发现，酶切底物与il-15序列之间，lic13有柔性肽段进行连接，而lic14没有此柔性肽段，说明il-15的空间位阻影响了蛋白酶对底物的识别。因此，上述结果说明第二结构单元的序列和长度均可显著影响裂解效率。
220.进一步地，采用与实施例3相同的方法检测上述融合蛋白裂解前后对mo7e增殖活性的影响。如图15所示，相较于阳性对照lh02，含有不可裂解的连接子的lh03(较lh02缺少了upa底物序列，因此不能被upa裂解，其重链氨基酸序列如seq id no:33)、含有可裂解连接子的lic11、lic12、lic13和lic14对mo7e的增殖活性均显著减弱，ec
50
分别为2.26nm,713.3nm,331.1nm,216.6nm,209.3nm和431.8nm(顺序为lh02、lh03、lic11、lic12、lic13、lic14)。经upa裂解后lic11、lic12、lic13、lic14的mo7e增殖活性ec50分别为19.0nm，25.0nm，22.0nm，37.3nm。根据上述数据，相较于阳性对照lh02，lic11、lic12、lic13和lic14活性分别减弱了146、96、93和191倍，裂解后活性分别恢复了17.4，8.6，9.5和11.6倍。上述结果提示可裂解的连接子的序列及长度能够显著影响融合蛋白中il-15活性掩蔽的程度及裂解效率。
221.实施例8：lic11融合蛋白的安全性评价
222.实施例3的体外细胞增殖实验结果显示，实施例1制备的lic11结构中il-15的活性被有效掩蔽，这提示lic11具有较低的外周免疫刺激活性和系统性毒副作用，用6-8周龄balb/c小鼠来评价lic11的安全性。雌性balb/c小鼠在第1天和第4天静脉注射pbs、lh02(0.25mg/kg)或者lic11(0.5、2.5、5mg/kg)，称量小鼠体重并观察存活状态。实验结果显示lh02在0.25mg/kg剂量下给药2次，诱导小鼠体重严重下降、行动迟缓及毛发卷曲，而lic11在5mg/kg才显著诱导小鼠体重下降(图16)。6天后处死小鼠，分离其脾脏，观察并称重，结果如图17所示，lh02在0.25mg/kg剂量显著刺激脾脏肿大，而lic11融合蛋白在0.25mg/kg剂量时脾脏肿大不明显，2.5mg/kg剂量时对脾脏刺激作用显著低于lh02，在5mg/kg剂量时刺激
脾脏肿大的作用与lh02组相当。该结果说明相较阳性对照lh02，lic11因对il-15活性的掩蔽作用使得其在小鼠体内的安全性获得显著改善。
223.为了进一步探究lic11安全性改善的内在机制，对上述给药后的小鼠进行眼眶取血，然后采用达科为公司的淋巴细胞分裂液分离外周血中的淋巴细胞，流式细胞术分析外周血中cd8
+
t和nk细胞的变化，具体操作如下：
224.1)血液淋巴细胞的提取：新鲜采集的小鼠抗凝血液0.3ml用rpmi 1640稀释一倍。在15ml离心管中加入3ml淋巴细胞分离液。小心地将经过稀释的血液平铺在淋巴细胞分离液液面上层，避免两种液体界面混合。室温，设置第三档的加速度和减速度，水平转子800g离心20min。后续步骤与小鼠脾脏淋巴细胞分离操作相同。
225.2)红细胞裂解：上步所得单细胞悬液3000rpm离心5min，弃去上清，或收集得到的淋巴细胞加入0.5ml红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温裂解2min。400
–
500g离心5min，4℃，弃去红色上清。
226.3)流式细胞术：采用pbs+0.5％ fbs重悬细胞后，准备2份样品分别用于检测nk、cd8
+
t细胞：加入anti-cd16/32，4℃避光孵育15min。对膜上指标进行染色，nk细胞(anti-cd45.2-pe,anti-cd3-fitc,anti-nkp46-alexa flour647)；cd8
+
t细胞(anti-cd45.2-pe,anti-cd3-fitc,anti-cd8-apc)，4℃避光孵育30min后，用pbs+0.5％ fbs洗涤细胞，上机检测。
227.检测结果如图18和19所示，相较于pbs组，lh02显著刺激了外周血cd8
+
t细胞和nk细胞的增殖，而lic11在3种剂量下对外周血中cd8
+
t细胞和外周血中nk细胞的增殖作用均显著弱于lh02。上述结果提示lic11的安全性显著优于lh02，这也证明本发明专利的创新性与实用性。
228.实施例9：lic110融合蛋白的制备
229.本实施例中，采用pd-l1抗体的fab作为第一结构单元，在其重链的c端融合可裂解连接子及il-15和sushi的复合物，融合蛋白命名为lic110，其结构如图1c所示。采用实施例1相同的方法制备lic110融合蛋白，其中通过化学基因合成和pcr技术制备的lic110重链核苷酸序列如seq id no:23所示，该核苷酸序列编码lic110融合蛋白的重链(seq id no:24)，lic110轻链核苷酸和氨基酸与anti-pd-l1轻链(其氨基酸序列和核苷酸序列分别如seq id no:2和seq id no:7所示)一致。protein l亲和层析洗脱峰、sds-page分别如图20和图21所示。可以看到超过650mau的紫外吸收峰，显示目标蛋白被洗脱缓冲液洗脱，未经非还原处理的lic110融合蛋白条带在100kda左右，且条带单一。
230.实施例10：lic110的体外酶切裂解及活性检测
231.实施例9制备的lic110中可裂解的连接子包含尿激酶底物，采用与实施例3相同的方法检测其被尿激酶裂解前后对mo7e增殖活性的差异。如图22所示，相较于阳性对照lh02，lic110对mo7e的增殖活性显著减弱，ec
50
分别为0.69nm和60.2nm，活性减弱了87倍。而相较于裂解前，裂解后活性恢复了7.7倍。上述结果提示当第一结构单元为fab片段时，细胞因子的活性能够被有效掩蔽并在酶切释放后恢复。
232.实施例11：lic18融合蛋白的制备
233.采用实施例1相同的方法制备lic18融合蛋白，其中通过化学基因合成和pcr技术制备的核苷酸序列如seq id no:12所示，该核苷酸序列编码氨基酸序列如seq id no.11所
h2so4)终止反应，每孔50μl。在450nm下测定吸光值。用graphpad 7.0处理数据，如图30和图31所示。可以看出，lh05融合蛋白对human和murine pd-l1均具有较高的亲和力。
245.实施例15：lh05融合蛋白的体外酶切裂解
246.采用与实施例2相同的方法检测尿激酶对实施例13制备的lh05融合蛋白的酶解效率。16℃下孵育24h后进行sds-page和western blot(鼠抗人il-15抗体作为一抗，羊抗鼠-hrp抗体作为二抗)检测裂解情况，如图32所示，lh05能够被尿激酶裂解，western blot结果显示25-35kda之间有裂解后新增条带，可见尿激酶可将il-15和il-15rα-sushi的复合物ilr释放出来(理论分子量23.5kda)。
247.实施例16：lh05融合蛋白的活性检测
248.采用与实施例3相同的方法检测实施例13制备的lh05融合蛋白裂解前后对mo7e增殖活性的影响。作为lh05分子的对照，制备了lh01分子，其为pd-l1抗体的c端依次融合sushi和il-15的免疫细胞因子，具有很高的il-15活性，其结构参考mol ther.2022aug30；s1525-0016(22)00504-4(同下文)。结果如图33所示，lh01、lh05和upa酶切后的lh05促进mo7e细胞增殖的活性ec
50
分别为0.88nm、147.5nm和4.9nm，提示lh05未裂解时，融合蛋白中抗pd-l1的抗体部分对il-15的活性发挥掩蔽作用，当连接子被酶切后所释放的ilr恢复其较高的生物活性，由此使得lh05融合蛋白在体内应用时，在正常组织维持完整结构，il-15不激活外周免疫细胞，到达肿瘤组织后，酶切释放的ilr恢复免疫激活功能，与抗pd-l1抗体部分发挥协同抗肿瘤作用，因此与lh01相比，lh05具有更好的安全性及肿瘤靶向性，在发挥抗肿瘤的同时避免全身毒副作用。
249.实施例17：lh05融合蛋白的安全性评价
250.实施例16的体外细胞增殖实验结果显示，lh05结构中il-15的活性被有效掩蔽，这提示lh05具有较低的外周免疫刺激活性和系统性毒副作用，采用与实施例8相同的方法来评价lh05的安全性。如图34所示，lh01(在5mg/kg剂量下腹腔给药2次，诱导小鼠体重严重下降、行动迟缓及毛发卷曲。而lh05在10mg/kg剂量下对小鼠体重没有显著影响。lh01在5mg/kg剂量下给药2次后诱导了小鼠的全部死亡，而lh05连续给药5次(每3天给药1次)仍没有诱导小鼠的死亡。上述结果表明相较lh01，lh05的安全性获得显著改善。
251.为了进一步探究lh05安全性改善的内在机制，收集小鼠脾脏和外周血进行分析，发现lh05组的脾脏重量显著高于pbs组，这表明lh05的免疫刺激活性没有被完全掩蔽，但lh05组的脾脏重量显著低于lh01组，这也表明lh05的外周免疫刺激活性被很大程度上掩蔽(图35-a)。外周血中cd8
+
t细胞和nk细胞计数显示lh01显著刺激了外周血cd8
+
t细胞和nk细胞的增殖，而lh05对外周血中cd8
+
t细胞的影响较小，虽显著诱导了外周血中nk细胞的增殖，但却显著弱于lh01(图35-b)。相较于pbs组，lh01显著诱导了血浆中炎症因子(ifn-γ、il-6)水平的提高，而lh05对血浆炎症因子水平(ifn-γ、il-6)的上调幅度较小，这表明lh05导致细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,crs)的风险较小(图35-c)。
252.实施例18：lh05融合蛋白的抗肿瘤药效学研究
253.培养前列腺癌rm-1细胞，用pbs重悬后皮下接种到c57小鼠，每只小鼠接种5
×
105个细胞/100μl，接种后第9、12、15天静脉注射给药，分别给予阳性对照lh01 2.5mg/kg、阴性对照igg 10mg/kg和实施例13制备的lh05 10mg/kg，同时给予不可裂解形式的lh05(lh03)10mg/kg，以及抗pd-l1抗体10mg/kg和lh02 0.25mg/kg的联用。记录小鼠肿瘤生长曲线(图
36)和生存曲线(图37)，可见lh05的抑瘤效果和小鼠生存期均显著优于阴性对照、阳性对照、以及抗pd-l1抗体和il-15超级激动剂lh02的联合治疗组，验证了可裂解释放活性il-15的融合蛋白具有显著的抗肿瘤作用，且安全性良好。
254.实施例19：lh05融合蛋白与抗vegf单克隆抗体联用的抗肿瘤研究
255.培养人ht-29细胞，用pbs重悬至密度为3
×
107个/ml，接种到免疫缺陷型nod-scid小鼠，每只小鼠荷3
×
106个细胞。随后尾静脉注射人pbmc细胞，用pbs将pbmc重悬至细胞密度为3
×
107个/ml，活率90％以上，每只小鼠注射的细胞量为3
×
106个/100μl。小鼠荷瘤一周后给药，抗vegf单抗(齐鲁制药贝伐珠单抗注射液)和实施例13制备的lh05融合蛋白的给药剂量均为10mg/kg，阴性对照组注射pbs，每3天给药1次，静脉注射。持续观察记录小鼠肿瘤生长情况，绘制肿瘤生长曲线如图38。从图中可以看出，anti-vegf单药组肿瘤抑制率为40.6％，lh05单药组tgi为53.6％，联合给药组tgi为74.5％，可见二者联用具有最佳的药效，且联用组与单药组的肿瘤体积具有统计学差异。经synergyfinder software软件计算，联合指数(combination index，ci)值为1.03，该值》1说明lh05与抗vegf单抗联合用药发挥了协同抗肿瘤作用。
256.实施例20：可裂解释放il-15活性的anti-egfr/il-15免疫细胞因子(lic23)的制备
257.将实施例13制备的lh05中靶向pd-l1的抗体可变区置换为靶向egfr的抗体可变区，将上述lh05中的lic11置换为实施例5的lic15融合蛋白的序列，采用实施例1相同的方法制备lic23融合蛋白，如图1n所示，其中，lic23融合蛋白的重链(或称第一肽段)中，egfr抗体的重链位于n端，其c端通过含有金属基质蛋白酶的可裂解的连接子与il-15及il-15rα-sushi片段依次融合，即为lic23具有氨基酸序列如seq id no:25所示的重链和氨基酸序列如seq id no:26所示的轻链(或称第二肽段)。从序列上，lic23是将抗egfr的抗体fab融合在lic15的n端。所制备的lic23融合蛋白进行sds-page电泳检测如图39所示，经亲和层析后得到目标蛋白，经还原处理的样品重链分子量在80kda与100kda之间，轻链分子量约为25kda，并且条带单一。
258.实施例21：lic23融合蛋白的酶切检测
259.采用与实施例2类似的方法检测基质金属蛋白酶对实施例20制备的lic23融合蛋白的酶解效率进行检测。将1μg激活的基质金属蛋白酶rhmmp-2加入到100μg lic23融合蛋白(质量比1:100)，37℃孵育过夜，sds-page检测酶切前后蛋白条带的变化，如图40所示，酶解前重链分子量为80-100kda，酶解后降低为50kda左右，说明mmp-2将il-15和il-15rα-sushi的复合物ilr从重链释放出来(理论分子量23.5kda)。释放后的ilr由于糖基化修饰导致其分子量不均一，条带弥散，且裂解后蛋白总量较低，因此在图40中难以清晰观察到。
260.实施例22：lic23融合蛋白的活性检测
261.采用与实施例3相同的方法检测实施例20制备的lic23融合蛋白裂解前后对mo7e增殖活性的影响。采用实施例6中的lh01分子作为il-15活性的阳性对照。结果如图41所示，lh01促进mo7e细胞增殖的活性ec
50
为1.06nm，lic23在100μg/ml的浓度未体现出mo7e增殖活性，当其被mmp酶切后，ec
50
恢复到125.39nm。该结果说明lic23未裂解时，融合蛋白中抗egfr的抗体部分对il-15的活性发挥掩蔽作用，当连接子被酶切后所释放的ilr恢复其较高的生物活性，由此使得lh05融合蛋白在体内应用时，在正常组织维持完整结构，il-15不激活外
周免疫细胞，到达肿瘤组织后，酶切释放的ilr恢复免疫激活功能，与抗egfr抗体发挥协同抗肿瘤作用，因此与抗egfr抗体及il-15超级激动剂相比，lic23具有更好的安全性及肿瘤靶向性，在发挥抗肿瘤的同时避免全身毒副作用。
262.实施例23：可裂解释放il-15活性的anti-pd-1/il-15免疫细胞因子(lic31)的制备和抗肿瘤研究
263.将实施例20制备的lic23中靶向egfr的抗体可变区置换为靶向pd-1的抗体可变区，采用实施例1相同的方法制备lic31融合蛋白。如图1n所示，lic31融合蛋白中pd-1抗体位于n端，其c端通过含有金属基质蛋白酶的可裂解连接子与il-15及il-15rα-sushi片段依次融合。从序列上，lic31是将抗pd-1的抗体fab融合在lic15的n端，即为lic31具有氨基酸序列如seq id no:27所示的重链(即为第一肽段)和氨基酸序列如seq id no:28所示的轻链(或称第二肽段)。
264.在免疫缺陷ncg小鼠模型上，接种人胶质瘤细胞u87，用pbs重悬至密度为2.5
×
107个/ml，每只小鼠接种体积为100μl。4天后接种人pbmc，每只小鼠尾静脉注射细胞量为4
×
106个/100μl。在第5天，小鼠随机分为4组(n＝6)，分别注射人免疫球蛋白igg(阴性对照)、抗pd-1单抗、抗pd-1单抗联合il-15超级激动剂lh02、lic31，给药剂量抗体及免疫球蛋白为10mg/kg，il-15超级激动剂为1mg/kg。每3天腹腔给药一次。以游标卡尺测定肿瘤长和宽，计算各组肿瘤体积。图42为肿瘤生长曲线，可见lic31融合蛋白的抑瘤效果显著优于抗pd-1单抗治疗组或其与il-15超级激动剂lh02的联合治疗组，验证了可裂解释放活性il-15的融合蛋白具有显著的抗肿瘤作用。
265.综上，在具体实施例中，本发明的第一结构单元包含靶向其他肿瘤抗原或免疫检查点的抗体或其抗原结合片段时，可选自如claudin 18.2、gpc3、lag3、tim-3和ctla-4等，融合蛋白具有与上述所列举融合蛋白相似的细胞因子活性掩蔽及组织靶向释放效果，本技术不再一一列举。
266.本发明中具体的氨基酸序列和核苷酸序列如下所示：
267.人il-15的氨基酸序列(seq id no:1)：
268.nwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasi hdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints；
269.抗pd-l1抗体轻链(或称lh05融合蛋白轻链)的氨基酸序列(seq id no:2)：
270.diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvstavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec；
271.pd-l1单克隆抗体重链的氨基酸序列(seq id no:3)：
272.evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdswihwvrqapgkglewvawispyggstyyadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycarrhwpggfdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk；
273.人il-15n72d突变体的氨基酸序列(seq id no:4)：
274.nwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasi hdtvenliilandslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints；
275.人il-15rα的sushi结构域的氨基酸序列(seq id no:5)：
276.itcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslk cirdpalvhqrpappstvttagv；
277.lh05融合蛋白重链的氨基酸序列(seq id no:6)：
278.evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdswihwvrqapgkglewvawispyggstyyadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycarrhwpggfdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkgssggsggsggsglsgrsdnhgssggsggsggsgnwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilandslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfintssggsggggsgggsggggslqitcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcirdpalvhqrpappstvttagv；
279.抗pd-l1抗体轻链(或称lh05融合蛋白轻链)的核苷酸序列(seq id no:7)：
280.gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcaggacgtgagcaccgccgtggcttggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatagcgcatccttcttgtatagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagtacct gtatcacccggccacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtttacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt；
281.编码lh05融合蛋白重链的核苷酸序列(seq id no:8)：
282.gaggttcaacttgttgaaagtggaggtggactggttcaaccaggaggctctttgagattgtcatgcgcagctagtggattcactttctcagacagctggatccattgggtgagacaagcaccaggaaagggacttgagtgggttgcttggatctccccctacggaggcagcacctactatgctgatagtgttaagggaagattcactatttcagccgataccagcaagaatactgcttaccttcagatgaactcattgagggcagaagatacagcagtgtactattgcgctagacggcattggcctgggggatttgattattggggacaaggaacattggttactgtttctagtgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgaccgtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttccctgctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagtggagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccatcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgccagcacgtacc
gtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaagagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccaggtaaaggaagctctggaggctctggaggctctggcggatctggactgagcggcagatctgataatcatggatctagcggcggatctggcggatctggaggctccggaaactgggtgaacgtgatctcggacctgaagaagatcgaggacctcatccagtcgatgcacatcgacgcgacgctgtacacggagtcggacgtccacccgtcgtgcaaggtcacggcgatgaagtgcttcctcctggagctccaagtcatctcgctcgagtcgggggacgcgtcgatccacgacacggtggagaacctgatcatcctggcgaacgactcgctgtcgtcgaacgggaacgtcacggagtcgggctgcaaggagtgcgaggagctggaggagaagaacatcaaggagttcctgcagtcgttcgtgcacatcgtccagatgttcatcaacacgtcgagcggaggatctggcggaggaggctctggaggaggatctggaggcggaggaagcctgcagatcacgtgcccgccccccatgtccgtggagcacgcagacatctgggtcaagagctacagcttgtactcccgggagcggtacatctgcaactcgggtttcaagcggaaggccggcacgtccagcctgacggagtgcgtgttgaacaaggccacgaatgtcgcccactggacgaccccctcgctcaagtgcatccgcgacccggccctggttcaccagcggcccgcgccaccctccaccgtaacaacagcgggagtgtga；
283.lh02融合蛋白的氨基酸序列(seq id no:9)：
284.apellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkitcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcirdpalvhqrpappstvttagvsggsggggsgggsggggslqnwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilandslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints；
285.lh02融合蛋白的核苷酸序列(seq id no:10)：
286.gcacctgaactcctggggggaccatcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgccagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaagagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccaggtaaaatcacgtgcccgccccccatgtccgtggagcacgcagacatctgggtcaagagctacagcttgtactcccgggagcggtacatctgcaactcgggtttcaagcggaaggccggcacgtccagcctgacggagtgcgtgttgaacaaggccacgaatgtcgcccactggacgaccccctcgctcaagtgcatccgcgacccggccctggttcaccagcggcccgcgccaccctccaccgtaacaaca gcgggagtgagcggaggatctggcggaggaggctctggaggaggatctggaggcggaggaagcctgcagaactgggtgaacgtgatctcggacctgaagaagatcgaggacctcatccagtcgatgcacatcgacgcgacgctgtacacggagtcggacgtccacccgtcgtgcaaggtcacggcgatgaagtgcttcctcctggagctccaagtcatctcgctcgagtcgggg
gacgcgtcgatccacgacacggtggagaacctgatcatcctggcgaacgactcgctgtcgtcgaacgggaacgtcacggagtcgggctgcaaggagtgcgaggagctggaggagaagaacatcaaggagttcctgcagtcgttcgtgcacatcgtccagatgttcatcaacacgtcg；
287.lic18融合蛋白的氨基酸序列(seq id no:11)：
288.itcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcirdpalvhqrpappstvttagvsggsggggsgggsggggslqnwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfintsgssggsggsggsglsgrsdnhgssggsggsggsgeskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk；
289.lic18融合蛋白的核苷酸序列(seq id no:12)：
290.atcacgtgcccgccccccatgtccgtggagcacgcagacatctgggtcaagagctacagcttgtactcccgggagcggtacatctgcaactcgggtttcaagcggaaggccggcacgtccagcctgacggagtgcgtgttgaacaaggccacgaatgtcgcccactggacgaccccctcgctcaagtgcatccgcgacccggccctggttcaccagcggcccgcgccaccctccaccgtaacaacagcgggagtgagcggaggatctggcggaggaggctctggaggaggatctggaggcggaggaagcctgcagaactgggtgaacgtgatctcggacctgaagaagatcgaggacctcatccagtcgatgcacatcgacgcgacgctgtacacggagtcggacgtccacccgtcgtgcaaggtcacggcgatgaagtgcttcctcctggagctccaagtcatctcgctcgagtcgggggacgcgtcgatccacgacacggtggagaacctgatcatcctggcgaacaactcgctgtcgtcgaacgggaacgtcacggagtcgggctgcaaggagtgcgaggagctggaggagaagaacatcaaggagttcctgcagtcgttcgtgcacatcgtccagatgttcatcaacacgtcgggaagctctggaggctctggaggctctggcggatctggactgagcggcagatctgataatcatggatctagcggcggatctggcggatctggaggctccggagagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaa；
291.lic11融合蛋白的核苷酸序列(seq id no:13)：
292.gagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcc
tggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaaggaagctctggaggctctggaggctctggcggatctggactgagcggcagatctgataatcatggatctagcggcggatctggcggatctggaggctccggaaactgggtgaacgtgatctcggacctgaagaagatcgaggacctcatccagtcgatgcacatcgacgcgacgctgtacacggagtcggacgtccacccgtcgtgcaaggtcacggcgatgaagtgcttcctcctggagctccaagtcatctcgctcgagtcgggggacgcgtcgatccacgacacggtggagaacctgatcatcctggcgaacgactcgctgtcgtcgaacgggaacgtcacggagtcgggctgcaaggagtgcgaggagctggaggagaagaacatcaaggagttcctgcagtcgttcgtgcacatcgtccagatgttcatcaacacgtcgagcggaggatctggcggaggaggctctggaggaggatctggaggcggaggaagcctgcagatcacgtgcccgccccccatgtccgtggagcacgcagacatctgggtcaagagctacagcttgtactcccgggagcggtacatctgcaactcgggtttcaagcggaaggccggcacgtccagcctgacggagtgcgtgttgaacaaggccacgaatgtcgcccactggacgaccccctcgctcaagtgcatccgcgacccggccctggttcaccagcggcccgcgccaccctccaccgtaacaacagcgggagtg；
293.lic11融合蛋白的氨基酸序列(seq id no:14)：
294.eskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgkgssggsggsggsglsgrsdnhgssggsggsggsgnwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilandslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfintssggsggggsgggsggggslqitcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcirdpalvhqrpappstvttagv；
295.lic15融合蛋白的核苷酸序列(seq id no:15)：
296.gagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaaggaagctctggaggctctggaggctctggcggatctggacagctgctgggcttcctgaccgccggatctagcggcggatctggcggatctggaggctccggaaactgggtgaacgtgatctcggacctgaagaagatcgaggacctcatccagtcgatgcacatcgacgcgacgctgtacacggagtcggacgtccacccgtcgtgcaaggtcacggcgatgaagtgcttcctcctggagctccaagtcatctcgctcgagtcgggggacgcgtcgatccacgacacggtggagaacctgatcatcctggcgaacgactcgctgtcgtcgaacgggaacgtcacggagtcgggctgcaaggagtgcgaggagctggaggagaagaacatcaaggagttcctgcagtcgttcgtgcacatcgtccagatgttcatcaacacgtcgagcggaggatctggcggaggaggctctggaggaggatctggaggcggaggaagcctgcagatcacgtgcccgccccc
catgtccgtggagcacgcagacatctgggtcaagagctacagcttgtactcccgggagcggtacatctgcaactcgggtttcaagcggaaggccggcacgtccagcctgacggagtgcgtgttgaacaaggccacgaatgtcgcccactggacgaccccctcgctcaagtgcatccgcgacccggccctggttcaccagcggcccgcgccaccctccaccgtaacaacagcgggagtg；
297.lic15融合蛋白的氨基酸序列(seq id no:16)：
298.eskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgkgssggsggsggsgqllgfltagssggsggsggsgnwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilandslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfintssggsggggsgggsggggslqitcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcirdpalvhqrpappstvttagv；
299.lic12融合蛋白的核苷酸序列(seq id no:17)：
300.gagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaaggaagctctggaggctctggaggctctggcggatctggactgagcggcagatctgataatcatggatctagcggcggaaactgggtgaacgtgatctcggacctgaagaagatcgaggacctcatccagtcgatgcacatcgacgcgacgctgtacacggagtcggacgtccacccgtcgtgcaaggtcacggcgatgaagtgcttcctcctggagctccaagtcatctcgctcgagtcgggggacgcgtcgatccacgacacggtggagaacctgatcatcctggcgaacgactcgctgtcgtcgaacgggaacgtcacggagtcgggctgcaaggagtgcgaggagctggaggagaagaacatcaaggagttcctgcagtcgttcgtgcacatcgtccagatgttcatcaacacgtcgagcggaggatctggcggaggaggctctggaggaggatctggaggcggaggaagcctgcagatc acgtgcccgccccccatgtccgtggagcacgcagacatctgggtcaagagctacagcttgtactcccgggagcggtacatctgcaactcgggtttcaagcggaaggccggcacgtccagcctgacggagtgcgtgttgaacaaggccacgaatgtcgcccactggacgaccccctcgctcaagtgcatccgcgacccggccctggttcaccagcggcccgcgccaccctccaccgtaacaacagcgggagtg；
301.lic13融合蛋白的核苷酸序列(seq id no:18)：
302.gagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcc
tggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaaggaagctctggaggcctgagcggcagatctgataatcatggatctagcggcggaaactgggtgaacgtgatctcggacctgaagaagatcgaggacctcatccagtcgatgcacatcgacgcgacgctgtacacggagtcggacgtccacccgtcgtgcaaggtcacggcgatgaagtgcttcctcctggagctccaagtcatctcgctcgagtcgggggacgcgtcgatccacgacacggtggagaacctgatcatcctggcgaacgactcgctgtcgtcgaacgggaacgtcacggagtcgggctgcaaggagtgcgaggagctggaggagaagaacatcaaggagttcctgcagtcgttcgtgcacatcgtccagatgttcatcaacacgtcgagcggaggatctggcggaggaggctctggaggaggatctggaggcggaggaagcctgcagatcacgtgcccgccccccatgtccgtggagcacgcagacatctgggtcaagagctacagcttgtactcccgggagcggtacatctgcaactcgggtttcaagcggaaggccggcacgtccagcctgacggagtgcgtgttgaacaaggccacgaatgtcgcccactggacgaccccctcgctcaagtgcatccgcgacccggccctggttcaccagcggcccgcgccaccctccaccgtaacaacagcgggagtg；
303.lic14融合蛋白的核苷酸序列(seq id no:19)：
304.gagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaaggaagctctggaggctctggaggctctggcggatctggactgagcggcagatctgataatcataactgggtgaacgtgatctcggacctgaagaagatcgaggacctcatccagtcgatgcacatcgacgcgacgctgtacacggagtcggacgtccacccgtcgtgcaaggtcacggcgatgaagtgcttcctcctggagctccaagtcatctcgctcgagtcgggggacgcgtcgatccacgacacggtggagaacctgatcatcctggcgaacgactcgctgtcgtcgaacgggaacgtcacggagtcgggctgcaaggagtgcgaggagctggaggagaagaacatcaaggagttcctgcagtcgttcgtgcacatcgtccagatgttcatcaacacgtcgagcggaggatctggcggaggaggctctggaggaggatctggaggcggaggaagcctgcagatcacgtgcccgccccccatgtccgtggagcacgcagacatctgggtcaagagctacagcttgtactcccgggagcggtacatctgcaactcgggtttcaagcggaaggccggcacgtccagcctgacggagtgcgtgttgaacaaggccacgaatgtcgcccactggacgaccccctcgctcaagtgcatccgcgacccggccctggttcaccagcggcccgcgccaccctccaccgtaacaacagcgggagtg；
305.lic12融合蛋白的氨基酸序列(seq id no:20)：
306.eskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgkgssggsggsggsglsgrsdnhgssggnwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilandslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfintssgg
sggggsgggsggggslqitcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcirdpalvhqrpappstvttagv；
307.lic13融合蛋白的氨基酸序列(seq id no:21)：
308.eskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvl dsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgkgssgglsgrsdnhgssggnwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilandslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfintssggsggggsgggsggggslqitcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcirdpalvhqrpappstvttagv；
309.lic14融合蛋白的氨基酸序列(seq id no:22)：
310.eskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgkgssggsggsggsglsgrsdnhnwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilandslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfintssggsggggsgggsggggslqitcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcirdpalvhqrpappstvttagv；
311.lic110融合蛋白重链的核苷酸序列(seq id no:23)：
312.gaggttcaacttgttgaaagtggaggtggactggttcaaccaggaggctctttgagattgtcatgcgcagctagtggattcactttctcagacagctggatccattgggtgagacaagcaccaggaaagggacttgagtgggttgcttggatctccccctacggaggcagcacctactatgctgatagtgttaagggaagattcactatttcagccgataccagcaagaatactgcttaccttcagatgaactcattgagggcagaagatacagcagtgtactattgcgctagacggcattggcctgggggatttgattattggggacaaggaacattggttactgtttctagtgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgaccgtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttccctgctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagtgggaagctctggaggctctggaggctctggcggatctggactgagcggcagatctgataatcatggatctagcggcggatctggcggatctggaggctccggaaactgggtgaacgtgatctcggacctgaagaagatcgaggacctcatccagtcgatgcacatcgacgcgacgctgtacacggagtcggacgtccacccgtcgtgcaaggtcacggcgatgaagtgcttcctcctggagctccaagtcatctcgctcgagtcgggggacgcgtcgatccacgacacggtggagaacctgatcatcctggcgaacgactcgctgtcgtcgaacgggaacgtcacggagtcgggctgcaaggagtgcgaggagctggaggagaagaacatcaaggagttcctgcagtcgttcgtgcacatcgtccagatgttcatcaacacgtcgagcggaggatctggcggaggaggctctggaggaggatctggaggcggaggaagcctgcagatcacgtgcccgccccccatgtccgtggagcacgcagacatctgggtcaagagctacagcttgtactcccgggagcggtacatctgcaactcgggtttcaagcggaaggccggcacgtccagcctgacggagtgcgtgttgaacaaggccacgaatgtcgcccactggacgaccccctcgctcaagtgcatccgcgacccggccctggttcaccagcggcccgcgccaccctccaccgtaacaacagcgggagtggagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccatcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacacc
ctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgccagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaagagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccaggtaaa；
313.lic110融合蛋白重链的氨基酸序列(seq id no:24)：
314.evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdswihwvrqapgkglewvawispyggstyyadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycarrhwpggfdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvgssggsggsggsglsgrsdnhgssggsggsggsgnwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilandslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfintssggsggggsgggsggggslqitcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcirdpalvhqrpappstvttagvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsr eemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk；
315.lic23融合蛋白的重链的氨基酸序列(seq id no:25)：
316.qvqlkqsgpglvqpsqslsitctvsgfsltnygvhwvrqspgkglewlgviwsggntdyntpftsrlsinkdnsksqvffkmnslqsndtaiyycaraltyydyefaywgqgtlvtvsaastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkgssggsggsggsgqllgfltagssggsggsggsgnwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilandslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfintssggsggggsgggsggggslqitcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcirdpalvhqrpappstvttagv；
317.lic23融合蛋白的轻链(即为抗egfr的轻链)的氨基酸序列(seq id no:26)：
318.dilltqspvilsvspgervsfscrasqsigtnihwyqqrtngsprllikyasesisgipsrfsgsgsgtdftlsinsvesediadyycqqnnnwpttfgagtklelkrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec；
319.lic31融合蛋白的重链的氨基酸序列(seq id no:27)：
320.qvqlvesgggvvqpgrslrldckasgitfsnsgmhwvrqapgkglewvaviwydgskryyadsvkgrftisrdnskntlflqmnslraedtavyycatnddywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyasty
rvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkgssggsggsggsgqllgfltagssggsggsggsgnwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilandslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfintssggsggggsgggsggggslqitcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcirdpalvhqrpappstvttagv；
321.lic31融合蛋白的轻链(即为抗pd-1的轻链)的氨基酸序列(seq id no:28)：
322.dvvmtqsplslpvtlgqpasiscrssqslldsdggtylywfqqrpgqsprrliylvstlgsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqlthwpytfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec。
323.可裂解肽接头：
324.gssggsggsggsglsgrsdnhgssggsggsggsg(seq id no:29)；
325.gssggsggsggsglsgrsdnhgssgg(seq id no:30)；
326.gssgglsgrsdnhgssgg(seq id no:31)；
327.gssggsggsggsglsgrsdnh(seq id no:32)；
328.lh03融合蛋白重链的氨基酸序列(seq id no:33)：
329.evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdswihwvrqapgkglewvawispyggstyyadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycarrhwpggfdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggps vflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgksgggsggggsggggsnwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilandslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfintssggsggggsgggsggggslqitcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcirdpalvhqrpappstvttagv；
[0330][0331]
柔性连接子：
[0332]
sggsggggsgggsggggslq(seq id no:34)；
[0333]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本技术的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0334]
尽管上面已经示出和描述了本技术的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本技术的限制，本领域的普通技术人员在本技术的范围内可以对上述实施例进行修改、替换和变型。

技术特征：
1.一种细胞因子融合蛋白，其特征在于，包括第一结构单元、第二结构单元和第三结构单元；其中，所述第一结构单元包含下列的至少之一：fc片段、抗体或抗原结合片段；所述第二结构单元包含可裂解肽接头，所述可裂解肽接头能被目的组织特异性酶切断裂；所述第三结构单元包含细胞因子或细胞因子与其受体的复合物；所述第一结构单元通过所述第二结构单元与所述第三结构单元的n端或c端连接。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述目的组织包括蛋白酶；任选地，所述蛋白酶选自在肿瘤组织中过表达的蛋白酶；优选地，所述蛋白酶为基质金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或天冬酰胺内肽酶。3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述可裂解肽接头包括柔性肽段和/或蛋白酶底物序列；任选地，所述柔性肽段的氨基酸序列包括选自(gs)n、(ggs)n、(ggsg)n、(gssg)n、(gggs)n、(ggggs)n和(gsggs)n中的至少之一，n为1～20之间的任意整数；任选地，所述柔性肽段的氨基酸序列长度为1～30个；任选地，所述可裂解肽接头包括柔性肽段和蛋白酶底物序列；任选地，所述可裂解肽接头具有如seq id no:29～seq id no:32任一项所示的氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述细胞因子与其受体的复合物为il-15与其受体sushi结构域的复合物；任选地，所述il-15与其受体sushi结构域的复合物包括il-15-柔性连接子-sushi结构域的融合蛋白。5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述柔性连接子包含选自(gs)n、(gsggs)n、(ggggs)n和/或(gggs)n中的至少之一，n为1～20之间的任意整数；优选的，所述柔性连接子的氨基酸序列如seq id no:34所示。6.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述il-15与其受体sushi结构域的复合物中sushi结构域的氨基酸序列如seq id no:5所示。7.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述il-15为人il-15分子或人il-15分子的突变体；任选地，所述人il-15分子的氨基酸序列如seq id no:1所示；优选的，与所述人il-15分子的氨基酸序列相比，所述人il-15分子的突变体包含n72d突变；优选的，所述人il-15分子的突变体的氨基酸序列如seq id no:4所示。8.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗体包括选自多抗、全长单抗、fab抗体、fab’抗体、f(ab’)2抗体、fv抗体、单链抗体、单域抗体以及最小识别单位中的至少之一；或者所述抗原结合片段包括选自f(ab’)2片段、fab’片段、fab片段、f(ab)2片段、fv片段、scfv片段、scfv-fc融合蛋白、scfv-fv融合蛋白和最小识别单位中的至少之一；任选地，所述第一结构单元通过所述第二结构单元与所述第三结构单元的n端连接；
任选地，所述融合蛋白具有如seq id no:14、seq id no:16、seq id no:20、seq idno:21和seq id no:22任一项所示的氨基酸序列；或者所述融合蛋白具有氨基酸序列如seq id no:6所示的第一肽段和具有氨基酸序列如seq id no:2所示的第二肽段；或者所述融合蛋白具有氨基酸序列如seq id no:24所示的第一肽段和具有氨基酸序列如seq id no:2所示的第二肽段；或者所述融合蛋白具有氨基酸序列如seq id no:25所示的第一肽段和具有氨基酸序列如seq id no:26所示的第二肽段；或者所述融合蛋白具有氨基酸序列如seq id no:27所示的第一肽段和具有氨基酸序列如seq id no:28所示的第二肽段；任选地，所述第一结构单元通过所述第二结构单元与所述第三结构单元的c端连接；任选地，所述融合蛋白具有如seq id no:11所示的氨基酸序列。9.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1～8任一项所述的融合蛋白。10.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求9所述的核酸；任选地，所述表达载体为真核表达载体；优选地，所述表达载体为慢病毒载体。11.一种重组细胞，其特征在于，包含：携带权利要求9所述的核酸或权利要求10所述的表达载体；或者表达权利要求1～8任一项所述的融合蛋白；任选地，所述重组细胞是通过将权利要求10所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。12.一种融合蛋白复合体，其特征在于，包含权利要求1～8任一项所述融合蛋白。13.一种免疫细胞因子，其特征在于，包括：权利要求1～8任一项所述的融合蛋白；所述融合蛋白包括抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段靶向肿瘤抗原或免疫检查点。14.根据权利要求9所述的免疫细胞因子，其特征在于，所述靶向肿瘤抗原或免疫检查点包括egfr、vegf、claudin 18.2、nectin-4、gpc-3、pd-l1、pd-1、tigit、lag3、tim-3和ctla-4的至少之一。15.根据权利要求13所述的免疫细胞因子，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段来自人igg1或igg4抗体。16.一种免疫治疗细胞，其特征在于，表达权利要求1～11任一项所述的融合蛋白。17.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1～8任一项所述的融合蛋白、权利要求9所述的核酸、权利要求10所述的表达载体、权利要求11所述的重组细胞、权利要求12所述的融合蛋白复合体、权利要求13～15任一项所述的免疫治疗因子或权利要求16所述的免疫治疗细胞。18.一种联合药物或药盒，其特征在于，包括：权利要求1～8任一项所述的融合蛋白或权利要求12所述的融合蛋白复合体作为第一活性成分；
靶向肿瘤或免疫检查点的单克隆抗体和/或化疗药物作为第二活性成分；任选地，所述靶向肿瘤的单克隆抗体包括抗vegf抗体、抗pd-1/pd-l1抗体和/或抗her2抗体。19.根据权利要求1～8任一项所述的融合蛋白、根据权利要求12所述的融合蛋白复合体、根据权利要求13～15任一项所述的免疫治疗细胞、根据权利要求16所述的免疫治疗细胞、根据权利要求17所述的药物组合物或根据权利要求17所述的或药盒在制备用于治疗癌症、传染病或自身免疫疾病的药物中的用途。

技术总结
本申请的实施例公开了一种可条件性释放并激活的细胞因子融合蛋白及其制备方法和用途。所述融合蛋白包括包括第一结构单元、第二结构单元和第三结构单元；其中，所述第一结构单元包含下列的至少之一：Fc片段、抗体或抗原结合片段；所述第二结构单元包含可裂解肽接头，所述可裂解肽接头能被目的组织特异性酶切断裂；所述第三结构单元包含细胞因子或细胞因子与其受体的复合物；所述第一结构单元通过所述第二结构单元与所述第三结构单元的N端或C端连接。本申请的融合蛋白能够提高细胞因子的治疗安全性、靶向性及疗效，并能够与抗体Fab、scFv、VHH或抗原结合肽进一步融合，获得可条件性释放并激活的免疫细胞因子。性释放并激活的免疫细胞因子。性释放并激活的免疫细胞因子。


技术研发人员：路慧丽 史文强 汪阳 宋露瑶 刘泽馨 曾琼雅
受保护的技术使用者：上海交通大学
技术研发日：2023.03.30
技术公布日：2023/8/14