一种高纯度槐角提取物的制备方法

1.本发明涉及药物提取技术领域，特别是涉及一种高纯度槐角提取物的制备方法。


背景技术：

2.子宫发育不良多由下丘脑-垂体-卵巢性腺轴功能失调，雌、孕激素分泌不足，子宫发育受限或停止生长所致，可属于内分泌疾病范畴。子宫发育不良中的幼稚子宫为双侧副中肾管融合形成子宫后停止发育所致，子宫体较小，可有宫腔和内膜。卵巢发育正常。幼稚子宫月经稀少，检查时可见子宫体小，相对宫颈较长。幼稚子宫主张雌激素加孕激素序贯周期治疗。雌激素的长期应用，容易增加骨质疏松、心脏病、宫颈癌、乳腺癌的患病风险。
3.槐角为豆科植物槐(sophorajaponica l.)的干燥成熟果实，性苦、寒，集中分布于河南、天津、河北、山东等地。槐角具有清热泻火、凉血止血之功效，临床用于肠热便血、痔肿出血、肝热头痛、眩晕目赤等症，现代研究发现槐角中含多种黄酮类化合物，其中槐角苷是槐角的主要活性成分之一，常温下为白色精细粉末，药理研究表明槐角苷具有抗炎、抑制免疫、抗生育和雌激素样等作用，可用于改善子宫发育不良。然而现有的槐角苷提取方法，不仅提取率较低，而且得到的槐角苷纯度低。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明提供一种高纯度槐角提取物的制备方法，该制备方法得到的槐角提取物的提取率较高，且纯度也较高。
5.为了达到上述目的，本发明提供一种高纯度槐角提取物的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
6.制备提取液：将槐角与吸附辅料混合，加入溶剂，采用超声波提取法和/或微波萃取法进行初步提取，得到初步提取液，加入提取辅料，采用超声波提取法和/或微波萃取法进行提取，得到提取液；
7.分离、纯化：将提取液过滤，得到滤液，将滤液通过大孔树脂吸附法进行分离、纯化，得到分离液；
8.减压浓缩：将分离液进行减压浓缩，得到初步浓缩液，初步浓缩液静置，过滤，得到滤过液，将滤过液减压浓缩，得到浓缩液，浓缩液静置，过滤，得到沉淀，将沉淀干燥，得到槐角提取物。
9.上述制备方法在提取过程中采用辅料与超声波提取法和/或微波萃取法配合使用，从而提高槐角的提取率，该辅料包括吸附辅料和提取辅料，吸附辅料能将槐角中的有效物质吸附至自身表面，使溶剂与其充分反应，提高槐角提取物的提取率；提取辅料能够使槐角提取物保持稳定。同时，采用大孔树脂配合使用，对中极性和弱极性色度等有较强吸附性，又通过分级浓缩除去色素等脂溶性成分，可极大地提高产物的纯度。
10.在其中一个实施例中，所述吸附辅料包括纳米羟基磷灰石，所述提取辅料包括纳米二氧化锰和壳聚糖，所述槐角、纳米羟基磷灰石、纳米二氧化锰、壳聚糖的重量份比为30：
(1-2)：(0.5-1)：(0.05-0.1)。
11.采用上述原料作为吸附辅料或提取辅料的优势在于：纳米羟基磷灰石的表面具有一定数量的活性羟基，可将槐角中的有效物质吸附至纳米羟基磷灰石的表面，从而使溶剂能与有效物质充分反应，能够提高槐角提取物的提取率；纳米二氧化锰则充当有效物质的载体，为其提供结构支撑的作用，从而保证有效物质的物理、化学结构的稳定性；同时，因为上述2个辅料均为纳米材料，在提取过程中容易发生黏连，因此加入壳聚糖，避免纳米材料黏连，起到支持和保护的作用。
12.槐角提取物在纳米羟基磷灰石(hap)表面发生吸附的过程，实际上是有效物质分子从溶液中向hap材料表面迁移、富集的过程。而导致这一过程发生的作用力主要有静电作用、氢键和范德华力，其中，主要以氢键作用为主。当纳米羟基磷灰石的用量大于上述范围时，氢键可能断裂，吸附作用降低，吸附量随(hap)的增大而减小；当纳米羟基磷灰石的用量小于上述范围时，吸附量不足。
13.而纳米二氧化锰是一种两性过渡金属氧化物，纳米级mno2具有粒径小、比表面积大、吸附活性高等特点，吸附机理主要是静电作用和内配位化合物的形成。与纳米羟基磷灰石按照上述用量配比，可形成稳定的支撑体系，能够与纳米羟基磷灰石(hap)稳定存在，不分散，并具有一定孔隙率，有利于更好地吸附槐角提取物。
14.同时，壳聚糖的加入防止了纳米材料的聚集黏连，通过“吸附架桥”和“电中和”作用，利用天然胶体保护作用使纳米材料保持稳定，防止过度交联，保证提取液的稳定。采用上述范围值的用量，能保持提取液的稳定，不出现浑浊、悬浮和颗粒感，使整个体系保持平衡状态。若超过上述用量范围，壳聚糖自身会发生结构变化，出现结团现象。
15.在其中一个实施例中，所述溶剂为乙醇，体积分数为75％-95％；所述槐角与所述溶剂的体积比为1：(5-15)。
16.在其中一个实施例中，所述大孔树脂吸附法中的大孔树脂包括以下树脂中的至少1种：d101树脂，da201树脂，d113树脂，d3520树脂，dm301树脂，ds-401树脂，ads-f8树脂，ab-8树脂，hpd100树脂，hpd300树脂，ads-17树脂，ads-21树脂，s-8树脂，x-5树脂，或lx-32树脂。
17.在其中一个实施例中，所述大孔树脂包括dm301树脂和lx-32树脂，所述dm301树脂、lx-32树脂的体积比为1：(1-8)。
18.在其中一个实施例中，所述大孔树脂吸附法中的大孔树脂为预处理后的大孔树脂，所述预处理包括以下步骤：将大孔树脂放入乙醇溶液中，进行溶胀，搅拌，除气泡，静置，水洗，碱液冲洗，水洗至ph为7，酸洗，水洗至ph为7。
19.在其中一个实施例中，所述大孔树脂吸附法中上样流速为0.5～2.0个柱体积/hr，吸附时间为1-3h。
20.在其中一个实施例中，所述制备提取液步骤中，所述初步提取的时间为0.1-1.5h，所述初步提取的温度为20-25℃；所述提取的时间为0.1-1h，所述提取的温度为20-25℃；
21.所述减压浓缩步骤中，所述初步浓缩液与所述分离液的体积比为1：(2-5)，所述初步浓缩液静置的时间为1-4h；所述浓缩液与所述分离液的体积比为1：(5-10)，所述浓缩液静置的时间为4-24h；所述干燥的温度为40-105℃，干燥的时间为3-12h。
22.控制上述初步提取、提取步骤的温度在20-25℃，使其保持为低温提取，能有效保
证槐角提取物的活性。
23.在其中一个实施例中，所述制备提取液步骤中，采用超声波提取法进行初步提取，得到初步提取液，加入提取辅料，采用超声波提取法进行提取，得到提取液，所述超声波提取法的超声波的功率为400-600w；
24.所述制备提取液步骤中，采用微波萃取法进行初步提取，得到初步提取液，加入提取辅料，采用微波萃取法进行提取，得到提取液，所述微波萃取法的微波的功率为500-800w；
25.或，所述制备提取液步骤中，采用超声波提取法进行初步提取，得到初步提取液，加入提取辅料，采用微波萃取法进行提取，得到提取液，所述超声波提取法的超声波的功率为400-600w，所述微波萃取法的微波的功率为500-800w。
26.在其中一个实施例中，所述槐角提取物为槐角苷，所述槐角苷的纯度≥90％，提取率≥90％。
27.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
28.本发明的制备方法，首先通过超声波提取法和/或微波萃取法得到提取液，微波的非电离的电磁辐射力以及超声波的剧烈机械效应、冲击对细胞产生的空化作用力，能够提高传质速率，提高槐角苷的提取率；同时，本制备方法在分离、纯化步骤采用不同类型的大孔树脂配合使用，对中极性和弱极性色度等有较强吸附性，又通过分级浓缩除去色素等脂溶性成分，可极大地提高产物的纯度。本制备方法通过乙醇提取后得到的提取液，无需浓缩，直接进入大孔树脂进行分离、纯化，无需水洗脱杂质，减少了中间环节，并且整套制备方法降低了时间成本，减少了资源浪费，最终得到的槐角苷的提取率≥90％，纯度≥90％。
附图说明
29.图1为实施例2中单独使用dm301树脂洗脱后的液相色谱图；
30.图2为实施例2中使用dm301﹕lx-32(重量份比1﹕4)树脂洗脱后的液相色谱图；
31.图3为实施例2中使用dm301﹕lx-32(重量份比1﹕5)树脂洗脱后的液相色谱图。
具体实施方式
32.为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
33.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
34.定义：
35.超声波提取法：是指利用超声波具有的机械效应，空化效应和热效应，通过增大介质分子的运动速度、增大介质的穿透力以提取生物有效成分的方法。
36.微波萃取法：又称微波辅助提取(microwave-assisted extraction，mae)，是指使
用适当的溶剂在微波反应器中从植物、矿物、动物组织等中提取各种化学成分的技术和方法。
37.大孔树脂吸附法：将溶液通过大孔树脂，吸附其中的有效成分，再经洗脱回收，除掉杂质的一种纯化精制方法。
38.来源：
39.纳米羟基磷灰石(粒径60-80nm，购自上海麦克林生化科技有限公司)、纳米二氧化锰(100nm，购自上海麦克林生化科技有限公司)。
40.本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；试验方法如无特殊说明，均为本领域的常规试验方法。
41.实施例1
42.确定提取液步骤的工艺条件。
43.一、将槐角药材或饮片，60℃烘干，粉碎，过(24)目筛，得到槐角粗粉。
44.二、为提高提取率，对提取过程中的各项工艺条件通过大量实验进行构建和筛选，以下列出部分示例性实验。
45.1、称取槐角粗粉30份，加入体积份数为槐角的10倍量的乙醇作为溶剂，该乙醇的体积分数为95％，采用超声波提取法进行提取，该超声波的超声功率为600w，温度保持20℃～25℃，提取时间为45min，提取2次，获得提取液1。
46.2、称取槐角粗粉30份，加入体积份数为槐角的10倍量的乙醇作为溶剂，该乙醇的体积分数为95％，采用超声波提取法进行提取，该超声波的超声功率600w，室温提取(室温为25-27℃)，不控制温度。提取时间为45min，提取2次，获得提取液2。
47.3、称取纳米羟基磷灰石和槐角粗粉，其中纳米羟基磷灰石1份，槐角粗粉30份，加入体积份数为槐角的10倍的乙醇作为溶剂，该乙醇的体积分数为95％，采用超声波提取法进行初步提取，该超声波的超声功率600w，初步提取的提取时间为30min，温度保持20℃～25℃，得到初步提取液，然后在初步提取液中加入纳米二氧化锰0.5份，壳聚糖0.05份，继续采用超声波提取法进行提取15min，超声波的超声功率、温度与初步提取相同，得到提取液3。
48.4、称取纳米羟基磷灰石和槐角粗粉，其中纳米羟基磷灰石1份，槐角粗粉30份，加入体积份数为槐角的10倍的乙醇作为溶剂，该乙醇的体积分数为95％，采用微波萃取法进行初步提取，提取时间为10min，微波功率500w，温度保持20℃～25℃，得到初步提取液，然后在初步提取液中加入纳米二氧化锰1份，壳聚糖0.05份，继续采用微波萃取法进行提取10min，微波功率、温度和初步提取相同，得到提取液4。
49.5、称取纳米羟基磷灰石和槐角粗粉，其中纳米羟基磷灰石1份，槐角粗粉30份，加入体积份数为槐角的10倍的乙醇作为溶剂，该乙醇的体积分数为95％，采用超声波提取法进行初步提取，该超声波的超声功率600w，不控制温度，提取时间为45min，提取2次，得到提取液5。
50.6、和提取液3的制备方法基本相同，区别在于，在初步提取液中加入纳米二氧化钛0.5份、壳聚糖0.05份，其他步骤基本相同，得到提取液6。
51.三、对上述提取液进行检测。
52.1、检测方法。
53.槐角提取物的主要成分为槐角苷，根据高效液相色谱法(中国药典2020版四部通则0512)对槐角苷进行测定，并且计算上述提取液的提取率，计算公式为：提取率＝(提取液中槐角苷的浓度
×
提取液体积)
÷
药材中槐角苷的量
×
100％。
54.色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-0.07％磷酸溶液(12∶20∶68)为流动相；检测波长为260nm。理论板数按槐角苷峰计算应不低于3000。
55.2、检测结果。
56.检测结果如下表所示。
57.表1各提取液的检测结果3、结果分析。
58.提取液的颜色由深到浅依次为：提取液4(微波加热)
→
提取液2(不控温度)
→
提取液5(不控温度、吸附)
→
提取液1(控温)
→
提取液3(控温、吸附)、提取液6(控温、吸附)。
59.澄清度：提取液3、4、6均为半澄清，但提取液6有明显漂浮物，说明提取液中含有明显不溶性杂质；提取液4的提取率略高于提取液3。
60.提取率：提取液1、2的提取率均低于90％，提取液3的提取率达到了92％，提取液5的提取率虽然达到了90％以上，但提取液5是非澄清状态，不利于后续的纯化工序。
61.经过大量实验，本发明人确定了本发明制备提取液步骤的工艺条件，具体如下：称取纳米羟基磷灰石和槐角粗粉，其中纳米羟基磷灰石1～2份，槐角粗粉30份。加入体积份数为槐角的5～15倍的乙醇作为溶剂，在本实施例中，乙醇的体积分数为75％-95％。采用超声波提取法和/或微波萃取法进行初步提取，初步提取的提取时间为0.1～1.5h，得到初步提取液，然后加入纳米二氧化锰0.5～1份，壳聚糖0.05～0.1份，采用超声波提取法和/或微波萃取法进行继续提取0.1～1.0h，得到提取液。
62.上述初步提取和继续提取过程中控制温度为20～25℃。上述超声波提取法中的超声功率实验设备400-600w，所采用的微波功率为500-800w。如混合提取，先进行超声提取，再进行微波提取。
63.实施例2
64.确定分离、纯化步骤的工艺条件。
65.一、将实施例1得到的提取液3过滤，得到滤液。
66.二、为提高纯度，对分离、纯化过程中的各项工艺条件通过大量实验进行构建和筛选，以下列出部分示例性实验。
67.1、取不同型号的大孔树脂，大孔树脂与滤液的重量份比为(3-4)：1，将滤液通过预先处理的大孔树脂柱，上样流速为0.5～2.0个柱体积/hr，上样完毕后，吸附1～3小时，再用体积分数为45％～95％的乙醇洗脱，待洗脱完毕，合并流出液，获得分离液。
68.上述大孔树脂的预先处理包括以下步骤：将称取得到的不同型号的大孔树脂，分别至于95％乙醇中溶胀，不断搅拌除去气泡，静置24h，充分溶胀后，使用蒸馏水洗至无醇味。先后使用2～5％naoh溶液冲柱，然后用蒸馏水冲至中性，然后用2％～5％hcl溶液洗涤，再用蒸馏水清洗至中性。
69.其中，上述大孔树脂的种类选自：d101、da201、d113、d3520、dm301、ds-401、ads-f8、ab-8、hpd100、hpd300、ads-17、ads-21、s-8、x-5、lx-32树脂。选择不同种类的大孔树脂对滤液进行分离、纯化。
70.2、减压浓缩。
71.将不同大孔树脂分离、纯化得到的分离液进行减压浓缩，浓缩过程中，如有沉淀析出，需要分次过滤，得到初步浓缩液，初步浓缩液与分离液的体积比为1：(2-5)时，将初步浓缩液静置沉淀1-4h，进行过滤，收集滤过液。
72.将收集的滤过液继续减压浓缩得到浓缩液，浓缩液与分离液的体积比为1：(5-10)，浓缩液静置沉淀4-24h，进行过滤，得到沉淀，将沉淀进行常压干燥或减压干燥，在本实施例中，进行常压干燥，干燥的温度为40℃-105℃，干燥时间为3-12h，得到槐角苷粉末。
73.3、对各分离液得到的槐角苷粉末进行纯度检测。
74.①
检测方法。
75.树脂吸附量＝(c0v-c
1v1
)/树脂重
76.树脂解吸率＝c
2v2
/吸附量
×
100％
77.树脂解吸量＝c
2v2
/树脂重
78.纯度＝m1/m2×
100％
79.式中：
80.c0为吸附前样液中槐角苷的浓度(mg/ml)，c1为吸附后流出液槐角苷的浓度(mg/ml)，c2为解吸液中槐角苷的浓度(mg/ml)，m1是固形物总质量(g)，m2为固形物中槐角苷的量(g)，v0吸附前上样液体积(ml)，v1吸附后流出液体积(ml)，v2为解吸液体积(ml)。
81.②
检测结果。
82.表2各分离液得到的槐角苷粉末的检测结果
[0083][0084]
注：上表中，槐角苷粉末7是通过dm301和lx-32按照重量份比1:4混合后装柱后，分离、纯化得到的分离液，进而减压浓缩得到的槐角苷粉末；槐角苷粉末8是通过dm301和lx-32按照重量份比1:5混合后装柱后，分离、纯化得到的分离液，进而减压浓缩得到的槐角苷粉末。槐角苷粉末9是通过dm301和ab-8按照重量份比1:4混合后装柱后，分离、纯化得到的分离液，进而减压浓缩得到的槐角苷粉末；槐角苷粉末10是通过dm301和da201按照重量份比1:4混合后装柱，分离、纯化得到的分离液，进而减压浓缩得到的槐角苷粉末。
[0085]
单独使用dm301树脂洗脱后，液相色谱检测得到的槐角苷的含量为87.35％，如图1所示，液相色谱测得的槐角苷的含量87.35％。分别按照dm301﹕lx-32(重量份比1﹕4)和dm301﹕lx-32(重量份比1﹕5)进行配伍后，液相色谱检测得到的槐角苷的含量分别为92.82％、91.49％，如图2、图3所示，均达到了90％以上，且呈现浅黄色，说明两种树脂配伍
后，不但起到吸附色素的效果，槐角苷的含量也得到了提升。
[0086]
③
结果分析。
[0087]
dm-301型大孔吸附树脂是苯乙烯型中极性共聚体，适用于具有弱极性和极性的有机化合物,分离、纯化效果良好。lx-32为中性大孔树脂，为苯乙烯—二乙烯苯共聚物骨架大孔吸附树脂，该树脂拥有较高的比表面积，内部孔道结构均匀，树脂吸附载量高，对于脱色素有非常好的效果。将lx-32和dm301混合使用时，对槐角苷不仅分离效果好，洗脱时间短，而且洗脱效率高。
[0088]
实施例3
[0089]
一种栓剂。
[0090]
将实施例2中的槐角苷粉末7制成栓剂。
[0091]
一、将槐角苷粉末进行微粉化后，过800～1000目筛得到槐角苷最细粉或者极细粉；其中微粉化具体采用球磨粉碎、超微粉碎；在本实施例中采用的是球磨粉碎。
[0092]
二、将水溶性基质和脂溶性基质单独使用或混合后使用，在温度为40℃～85℃条件下加热融化，在转速为60～300转/分钟的条件下搅拌，其中，水溶性基质可选择甘油明胶基质、聚乙二醇(peg)基质或山梨醇酐单棕榈酸酯(s-40)；脂溶性基质可选择半合成甘油酸酯，如混合硬脂酸甘油酯等。在本实施例中，采用水溶性基质peg-600、peg-4000。
[0093]
三、称取保湿剂、促溶剂、促渗剂、防腐剂等助剂，如甘油、泊洛沙姆、吐温-80、氮酮等，或按需要称取适量的防腐剂尼泊金酯类(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯)，并于保温和状态下混匀。上述助剂可采用吐温-80、尼泊金酯、氮酮、甘油复配，加入比例分别为：0.2％～5.0％、0.05％～1.0％、0.1％～5.0％、0.8-1.2％。
[0094]
四、称取本实施例步骤一获得的槐角苷最细粉、极细粉或超细粉适量，与步骤二和步骤三获得基质、助剂按重量份比1：(5-20)，于40℃～85℃条件下保温并搅拌的条件下，分次加入，并混合均匀，得到含槐角苷的熔融基质。
[0095]
将步骤四得到的含槐角苷的熔融基质，倾入已冷却并涂有润滑剂的栓模中，至稍有溢出模口为度，冷却，等完全凝固后，用刀削去溢出部分，开启模具，推出即得栓剂，或采用栓剂生产设备进行罐注、封口和冷却，最终制得含槐角苷的栓剂。
[0096]
在本实施例中，含槐角苷的栓剂采用如本实施例步骤一制备得到的槐角苷超细粉末作为基础原料，采用peg-600、peg-4000以重量份比2:3混合作为基质，通过上述方法制备得到；其中槐角苷的质量百分比为1.2％，吐温80的质量百分比为1.2％，甘油的质量百分比为1.0％，尼泊金酯的质量百分比为0.05％，氮酮的质量百分比为0.1％，基质的质量百分比为96.45％。
[0097]
实施例4
[0098]
一种阴道凝胶。
[0099]
将实施例2中的槐角苷粉末7制成阴道凝胶。
[0100]
一、将槐角苷粉末进行微粉化后，过800～1000目筛得到槐角苷最细粉或者极细粉；其中微粉化具体采用球磨粉碎、超微粉碎；在本实施例中采用的是球磨粉碎。
[0101]
阴道凝胶的原料为：槐角苷最细粉或者极细粉、甘油、羟丙甲纤维30000、羟丙甲纤维80000、聚乙二醇200、无水乙醇、吐温80，上述原料的质量百分比分别为1.2％、3％、2％、1％、8％、8％、1.5％，余量为纯化水。
[0102]
二、将纯化水与羟丙甲纤维30000、羟丙甲纤维80000、聚乙二醇200、甘油混合，加热至75℃，搅拌4h，使羟丙甲纤维素充分溶胀分散；用1m的naoh溶液调节ph至4.0
±
0.1。
[0103]
三、将槐角苷最细粉或者极细粉、纯化水、吐温80、无水乙醇混合均匀，获得槐角苷混悬液。
[0104]
四、在60℃，200r/min的条件下，将本实施例步骤二和步骤三混合搅拌至均匀，乳化30min。冷却至室温得到凝胶。
[0105]
实验例
[0106]
验证实施例2中的槐角苷粉末7、实施例3的栓剂、实施例4的阴道凝胶对子宫发育不良大鼠的治疗作用。
[0107]
一、模型建立与给药。
[0108]
50只sd雌性大鼠适应性喂养3天后，随机分为5组，每组10只。除空白对照组外，其余40只大鼠采用肌注地塞米松337.5μg/kg/d，连续注射7天，同时复合双侧卵巢切除技术建立子宫发育不良模型。后将模型大鼠分为四组，模型组，组1(栓剂)，阴道给药，给药剂量为8.1mg/kg；组2(阴道凝胶)，阴道给药，给药剂量为8.1mg/kg；组3(槐角苷粉末)，口服给药，给药剂量为16.2mg/kg，连续给药30天。
[0109]
二、测定指标。
[0110]
停药12小时候处死，腹主动脉取血测定血清中雌二醇(e2)、孕酮(p)、促卵泡素(fsh)及黄体生成素(lh)水平，并解剖，统计子宫湿重并计算子宫指数。取各组大鼠子宫内膜标本按常规福尔马林固定，石蜡切片，he染色，并采用免疫组化abc法，dab显色检测er(雌激素受体)阳性细胞。采用阳性细胞百分比法，选择阳性细胞最密集处计数500个细胞，以阳性细胞数统计结果。
[0111]
三、统计学处理。
[0112]
各组实验数据均采用均数
±
标准差(x
±
s)表示，多个样本均数先进行方差分析，由统计学意义再进行两两比较，用q检验。
[0113]
四、结果。
[0114]
1、各组大鼠血清中e2、p、fsh、lh的含量。
[0115]
与空白对照组相比，模型组大鼠血清中e2水平明显降低，经过各种给药途径治疗后发现，组1、组2、组3均能明显升高e2水平，其中组1、组2效果最为显著(p《0.01)；，模型组大鼠孕酮水平降低(p《0.05)，除组1有明显回调作用外(p《0.05)，其他各组虽有上升趋势，但是并不具有统计学意义，具体结果见表3。
[0116]
与空白对照组相比，模型组大鼠血清中促卵泡素及黄体生成素水平明显降低(p《0.01)，组1、组2可明显升高两者水平(p《0.01)，组3与组1、组2相比，作用强度较小，但也具有明显的回调作用(p《0.05)，具体结果见表3。
[0117]
表3各组大鼠血清中e2、p、fsh、lh的含量及分析(x
±
sd)
[0118][0119]
2、各组大鼠子宫湿重及子宫指数。
[0120]
与空白对照组相比，模型组大鼠子宫湿重及子宫指数有极明显的降低(p《0.01)；经过组1、组2、组3的治疗后，子宫湿重及子宫指数有明显增加，组1子宫指数增加74.60％(p《0.01)，组2子宫指数增加55.56％，组3子宫指数增加30.16％。
[0121]
表4各组大鼠子宫湿重及子宫指数的比较(x
±
sd)
[0122][0123]
3、提高子宫内膜er含量作用。
[0124]
与空白对照组相比，模型大鼠子宫内膜中雌激素受体明显降低(p《0.05)；组1、组2、组3可明显降低雌激素受体含量，均具有显著性差异(p《0.01)。
[0125]
表5各组大鼠子宫内膜雌激素受体的含量比较(x
±
sd)
[0126][0127]
4、结论。
[0128]
从以上结果，可以看出组1、组2、组3均可以提高子宫成熟，并能提高子宫腺体中雌激素受体含量，调整血清中性激素水平；从调节程度来看，组1的效果最为明显，其次是组2、组3。
[0129]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0130]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种高纯度槐角提取物的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：制备提取液：将槐角与吸附辅料混合，加入溶剂，采用超声波提取法和/或微波萃取法进行初步提取，得到初步提取液，加入提取辅料，采用超声波提取法和/或微波萃取法进行提取，得到提取液；分离、纯化：将提取液过滤，得到滤液，将滤液通过大孔树脂吸附法进行分离、纯化，得到分离液；减压浓缩：将分离液进行减压浓缩，得到初步浓缩液，初步浓缩液静置，过滤，得到滤过液，将滤过液减压浓缩，得到浓缩液，浓缩液静置，过滤，得到沉淀，将沉淀干燥，得到槐角提取物。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述吸附辅料包括纳米羟基磷灰石，所述提取辅料包括纳米二氧化锰和壳聚糖，所述槐角、纳米羟基磷灰石、纳米二氧化锰、壳聚糖的重量份比为30：(1-2)：(0.5-1)：(0.05-0.1)。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为乙醇，体积分数为75％-95％；所述槐角与所述溶剂的体积比为1：(5-15)。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂吸附法中的大孔树脂包括以下树脂中的至少1种：d101树脂，da201树脂，d113树脂，d3520树脂，dm301树脂，ds-401树脂，ads-f8树脂，ab-8树脂，hpd100树脂，hpd300树脂，ads-17树脂，ads-21树脂，s-8树脂，x-5树脂，或lx-32树脂。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂包括dm301树脂和lx-32树脂，所述dm301树脂、lx-32树脂的体积比为1：(1-8)。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂吸附法中的大孔树脂为预处理后的大孔树脂，所述预处理包括以下步骤：将大孔树脂放入乙醇溶液中，进行溶胀，搅拌，除气泡，静置，水洗，碱液冲洗，水洗至ph为7，酸洗，水洗至ph为7。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂吸附法中上样流速为0.5～2.0个柱体积/hr，吸附时间为1-3h。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备提取液步骤中，所述初步提取的时间为0.1-1.5h，所述初步提取的温度为20-25℃；所述提取的时间为0.1-1h，所述提取的温度为20-25℃；所述减压浓缩步骤中，所述初步浓缩液与所述分离液的体积比为1：(2-5)，所述初步浓缩液静置的时间为1-4h；所述浓缩液与所述分离液的体积比为1：(5-10)，所述浓缩液静置的时间为4-24h；所述干燥的温度为40-105℃，干燥的时间为3-12h。9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备提取液步骤中，采用超声波提取法进行初步提取，得到初步提取液，加入提取辅料，采用超声波提取法进行提取，得到提取液，所述超声波提取法的超声波的功率为400-600w；所述制备提取液步骤中，采用微波萃取法进行初步提取，得到初步提取液，加入提取辅料，采用微波萃取法进行提取，得到提取液，所述微波萃取法的微波的功率为500-800w；或，所述制备提取液步骤中，采用超声波提取法进行初步提取，得到初步提取液，加入提取辅料，采用微波萃取法进行提取，得到提取液，所述超声波提取法的超声波的功率为400-600w，所述微波萃取法的微波的功率为500-800w。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述槐角提取物为槐角苷，所述槐角苷的纯度≥90％，提取率≥90％。

技术总结
本发明涉及一种高纯度槐角提取物的制备方法，涉及药物提取技术领域。该制备方法包括采用超声波提取法和/或微波萃取法进行提取，然后通过大孔树脂吸附法进行分离、纯化，在减压浓缩得到槐角提取物。该制备方法在提取过程中采用辅料与超声波提取法和/或微波萃取法配合使用，从而提高槐角的提取率，该辅料包括吸附辅料和提取辅料，吸附辅料能将槐角中的有效物质吸附至自身表面，使溶剂与其充分反应，提高槐角提取物的提取率；提取辅料能够使槐角提取物保持稳定。取物保持稳定。


技术研发人员：王伟明 宁夏 霍金海 李梦雪 董文婷 刘华石 冯丽娜 韩德强
受保护的技术使用者：黑龙江省中医药科学院
技术研发日：2023.03.21
技术公布日：2023/8/14