治疗人的实体瘤的诺氏梭菌的制作方法

治疗人的实体瘤的诺氏梭菌
1.本技术是申请日为2014年3月28日、申请号为201480028119.8、发明名称为“治疗人的实体瘤的诺氏梭菌”的中国发明专利申请的分案申请。
发明领域
2.本发明提供了方法，所述方法尤其用于治疗或改善人类中存在的实体瘤的效果，用于在人类中减缩实体瘤体积，用于显微镜精确摘除人类中的肿瘤细胞，以及用于消融人类中存在的实体瘤。还提供了诺氏梭菌(c.novyi)cfu的单位剂量和试剂盒。
3.相关申请的交叉引用
4.本发明要求于2013年3月29日申请的美国临时申请序列号.61/806497的权益，美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
5.发明背景
6.成功地靶向并破坏人类癌症的策略识别正常和恶性组织之间的差异(dang等，2001)。这种差异在分子水平上可以被发现，如在遗传畸变的情况下，或在生理像差肿瘤的情况下更全面地被发现。
7.已知的是，恶性实体瘤通常由坏死核心和有生命力的边缘组成。迄今治疗干预已集中在肿瘤大量血管化的外壳，但很少靶向内缺氧核心(jain等，2001)。肿瘤的内部核心具有与正常组织不同的独特的特点。该核心拥有不良的血管供应，因此缺乏营养和氧气。作为主动细胞坏死的部位，缺少功能性血管供应限制有害细胞崩溃的清除和结果在低ph。这样的环境是不适合大多数人细胞的生长，但对于某些厌氧细菌而言是生长的丰富环境。超过60年以前，这种概念导致研究者注射溶组织梭菌(histolyticus)孢子进入荷瘤动物(parker等人，1947)。值得注意的是，细菌仅在肿瘤的坏死核心和液化的肿瘤发芽。在20世纪50年代和60年代，来自丁酸梭菌的孢子注射到具有各种非常晚期的实体瘤恶性肿瘤的患者(mose，1967；mose，1972)。许多患者的肿瘤的大部分有显著的发芽和破坏，但这些患者的非常不健康和晚期使得他们的临床管理困难，缺乏完整的临床反应被抑制的进一步追求这种做法。
8.成功治疗实体瘤仍是一个未能实现的医疗目标。因此，有必要寻找用于实体瘤的治疗。本发明满足这种和其它需要。


技术实现要素：

9.本发明的一个实施方案是用于治疗或改善存在于人类的实体瘤的效果的方法。此方法包括肿瘤内给予人诺氏梭菌菌落形成单位(cfu)的单位剂量，所述单位剂量包括约1
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10
3-1
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107个cfu，所述cfu悬浮在药学上可接受的载体或溶液中。
10.本发明的另一个实施方案是用于减缩存在于人类的实体瘤体积的方法。此方法包括肿瘤内给予人诺氏梭菌cfu的单位剂量，所述单位剂量包括约1
×
10
3-1
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107个cfu，所述cfu悬浮在药学上可接受的载体或溶液中。
11.本发明的一个附加的实施方案是用于减缩存在于人类的实体瘤体积的方法。此方
法包括肿瘤内给予人一到四个周期的诺氏梭菌nt孢子的单位剂量，其包含约1
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104个孢子每个周期，诺氏梭菌nt的每个单位剂量悬浮在药学上可接受的载体或溶液中。
12.本发明的另一个实施方案是用于治疗或改善存在于人类的实体瘤的效果的方法。此方法包括肿瘤内给予人类一到四个周期的诺氏梭菌nt孢子单位剂量，其包含约1
×
104个孢子每个周期，诺氏梭菌nt孢子的每个单位剂量悬浮在药学上可接受的载体或溶液中。
13.本发明的另一个实施方案是用于消融人类中存在的实体瘤的方法。此方法包括肿瘤内给予人诺氏梭菌cfu的单位剂量，所述单位剂量包含约1
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10
3-1
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107个cfu，所述cfu悬浮在药学上可接受的载体或溶液中，其中所述肿瘤被消融而留下正常组织的边缘。
14.本发明的另一个实施方案是诺氏梭菌cfu的单位剂量。此单位剂量包含在药学上可接受的载体或溶液中的约1
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107个cfu，这是有效用于治疗或改善存在于人类的实体瘤的效果。
15.本发明的附加的实施方案是用于治疗或改善存在于人类的实体瘤的效果的试剂盒。这种试剂盒包含含有在药学上可接受的载体或溶液中的约1
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107个cfu的诺氏梭菌cfu的单位剂量和试剂盒使用说明。
16.本发明的另一个实施方案是用于在人中通过显微镜精确切除肿瘤细胞的方法。此方法包括肿瘤内给予人诺氏梭菌nt菌落形成单位(cfu)的单位剂量，所述单位剂量包括约1
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107个cfu，所述cfu悬浮在药学上可接受的载体或溶液中。
17.本发明的另一个实施方案是用于治疗或改善已转移到人中的一个或多个部位的实体瘤的效果的方法。此方法包括肿瘤内给予人诺氏梭菌nt菌落形成单位(cfu)的单位剂量，所述单位剂量包括至少约1
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107个cfu，所述cfu悬浮在药学上可接受的载体或溶液中。
18.附图的简单说明
19.图1a-b示出测试对象“萨莎(sasha)”(图1a)和“桑普森(sampson)”(图1b)在放射治疗和静脉内(iv)诺氏梭菌nt注射后的右远端桡骨/尺骨上的犬骨肉瘤的各种图像。
20.图2a示出的kaplan-meier曲线示出了同基因胶质瘤细胞系(f98)的原位移植后f433 fisher大鼠的存活。外线-肿瘤植入后12-15天诺氏梭菌-nt孢子注射入肿瘤。内线-对照。图2b显示f98胶质瘤细胞原位移植后三个有代表性的f433fisher大鼠中的生物发光(xenogen成像系统)。第0天(诺氏梭菌-nt孢子注射预治疗-天)，it注射诺氏梭菌-nt孢子后第1天，it注射诺氏梭菌-nt孢子后第2天获得图像。图2c示出在第0天(治疗前)，it注射诺氏梭菌-nt孢子后1天，和it注射诺氏梭菌-nt孢子后2天的萤光素酶活性(以百万计)。
21.图3a-b和4a-b示出微观脑肿瘤病变内发芽的诺氏梭菌-nt细菌。在这些图中，革兰氏染色表明营养(vegetative)诺氏梭菌-nt菌(白色或黑色箭头)定位于肿瘤(t)和星状微侵袭(s)，而不是在正常的脑组织(br)。图3a是一个放大100倍的图，表示肿瘤和正常脑的接口。图3b是一个放大400倍的图，表示肿瘤和正常脑的接口。图4a是放大100倍的图，表示正常脑，肿瘤，和肿瘤组织的星状微侵袭的接口。图4b是放大400倍的图，表示星状微侵袭病变中的诺氏梭菌-nt发芽。
22.图5是用于测序样品摘要数据的一个表。
23.图6是犬肉瘤拷贝数改变的表。
24.图7a-f是来自狗11-r01的摄影和ct图像，表示对诺氏梭菌-nt治疗的部分反应。图
像跨越预治疗至诺氏梭菌-nt孢子第一it剂量后70天。图7a示出了外周神经鞘瘤的预治疗的图像。图7b显示在研究的第3天的脓肿形成，程度局限于肿瘤。图7c显示自发脓肿溃疡及坏死和化脓性物质释放后医疗清创，这允许通过第二意向愈合。图7d显示，伤口已在研究的70天完全愈合和发现肿瘤最长直径减少77.6％。图7e是一个预治疗ct图像，第一治疗前4天拍摄，其示出在耳廓和颅骨的交点的肿瘤(圆)的程度。图7f是在研究的第10个天的治疗后ct图像，表示肿瘤的几乎完全减缩体积。
25.图8a-d是来自狗04-r03的摄影和ct图像，表示对诺氏梭菌-nt治疗的完全反应。图像跨越预治疗至诺氏梭菌-nt孢子的第一it剂量后60天。图8a示出了软组织肉瘤的预治疗的图像。图8b示出了位于肿瘤的脓肿形成在研究第15天，诺氏梭菌-nt孢子的第三次剂量后1天。图8c显示，肿瘤减缩体积研究第27天是完全的和健康的肉芽组织已经形成。图8d显示了研究的60天伤口已经完全愈合，并且没有残留肿瘤(完全响应)。图8e是一个预治疗ct图像，第一治疗前5天拍摄，表现出上前臂的肿瘤(圆)程度。图8f是在研究62天的后治疗ct图像，显示肿瘤块完全消失。
26.图9显示了从诺氏梭菌nt孢子初始的it给药到临床过程完成的狗11-r01的肿瘤的大小。
27.图10a示出了it给药诺氏梭菌nt孢子后测试对象“德雷克(drake)”(04-r01)的犬软组织肉瘤的摄影(上图)和ct图像(下图)。ct图像中圈出的区域表示肿瘤的位置。图10b示出了从诺氏梭菌nt初始的it给药，通过三个后续剂量，到临床过程的完成的drake的肿瘤的大小。
28.图11示出了从诺氏梭菌nt孢子初始的it给药，通过两个后续周期，到临床过程的完成的狗04-r03肿瘤的大小。
29.图12a显示了8个测试对象(11-r02，04-r02，26-r01，16-r02，04-r05，16-r03，11-r04，和04-r06)在临床过程中的肿瘤大小，其中诺氏梭菌nt孢子的四个周期被给药。图12b示出在三个测试对象(04-r08，01-r02，和10-r02)中的肿瘤大小，对此来自一个完整临床过程的无法数据获得，其原因在于必要截肢或数据截止。
30.图13示出了在实施例6和7中所公开的it研究治疗的肿瘤的注射方案。
31.图14a-d显示来自人类患者的ct和mri影像。图14a示出第3天采用造影剂的治疗后的ct，展现髓质内和外空气收集的证据。图14b显示右上肱骨预治疗mri(t 1采用钆造影剂)，表示造影剂增强的块涉及软组织并且可能涉及邻近的骨。图14c示出了第4天的治疗后的mri，显示相比基线在肿瘤块中造影剂增强减弱。图14d示出了在第29天的治疗后的mri，表示同质非加强块同正在进行坏死的块一致。肿瘤的显示使用箭头。
32.图15a-d显示在采用诺氏梭菌-nt孢子治疗的人类患者中广泛的肿瘤坏死。图15a和15b示出了预治疗肿瘤活检，分别表示活肿瘤(平滑肌肉瘤)细胞，40倍(a)和100倍(b)的放大倍数。图15c和15d示出了治疗后肿瘤活检，it注射诺氏梭菌-nt孢子后4天，示出肿瘤细胞的广泛坏死，分别是40
×
(a)和100
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(b)的放大倍数。
33.图16a-d显示使用三叉的针的it注射过程的各个方面。图16a示出了三叉的针的照片。图16b和16c示出插入针前和后目标注射区域的的计算机断层扫描(ct)图像。图16d示出了针的三个齿的放大图像。图16e示出具有重叠的测量的ct图象，其用于确定所述针的插入点。
34.发明详述
35.本发明的一个实施方案是用于治疗或改善存在于人类的实体瘤的效果的方法。此方法包括肿瘤内给予人诺氏梭菌菌落形成单位(cfu)的单位剂量，所述单位剂量包括约1
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10
3-1
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107个cfu，所述cfu悬浮在药学上可接受的载体或溶液中。
36.如本文所用，术语“治疗”，“治疗”，“治疗”及其语法变化是指使个体对象(例如，人类患者)经受一个协议(治疗方案)，方案，过程或补救，在其中期望得到在该对象例如，患者的生理反应或结果。特别是，本发明的方法和组合物可被用来减缓疾病症状的发展或延缓疾病或病症的发作，或遏制疾病发展的进展。然而，因为每一个治疗的对象可以不向特定的治疗方案，方案，过程或补救响应，治疗不要求在每一个对象或对象，例如，患者，人群中来实现所需的生理反应或结果。因此，一个特定对象或对象，例如，患者，人群可能对治疗无法响应或不充分反应。
37.如本文所用，术语“改善”，“改良”及其语法变化是指以减少对象中的疾病的症状的严重程度。
38.如本文所使用的，“实体瘤”是指细胞生长的异常肿块。实体瘤可能会发生在身体的任何部位。实体瘤可能是癌性的(恶性)或非癌性(良性)。根据本发明的实体瘤的实例包括肾上腺皮质癌，肛门肿瘤/癌，膀胱肿瘤/癌，骨肿瘤/癌症(如骨肉瘤)，脑肿瘤，乳腺肿瘤/癌症，类癌瘤，癌(carcinoma)，宫颈癌肿瘤/癌细胞，结肠肿瘤/癌，子宫内膜肿瘤/癌，食管癌/肿瘤，肝外胆管肿瘤/癌，尤文家族肿瘤，颅外生殖细胞肿瘤，眼肿瘤/癌，胆囊癌肿瘤/癌，胃肿瘤/癌症，生殖细胞肿瘤，妊娠滋养细胞肿瘤，头颈部肿瘤/癌，下咽癌肿瘤/癌，胰岛细胞癌，肾肿瘤/癌，喉癌肿瘤/癌，平滑肌肉瘤，白血病，唇和口腔肿瘤/癌，肝癌肿瘤/癌症(如肝细胞癌)，肺肿瘤/癌，淋巴瘤，恶性间皮瘤，默克尔(merkel)细胞癌，蕈样肉芽肿病，骨髓增生异常综合征，骨髓增生性疾病，鼻咽肿瘤/癌症，神经母细胞瘤，口腔肿瘤/癌，口咽肿瘤/癌，骨肉瘤，卵巢上皮性肿瘤/直肠癌，卵巢生殖细胞肿瘤，胰腺肿瘤/癌，鼻旁窦和鼻腔肿瘤/癌，甲状旁腺肿瘤/癌，阴茎肿瘤/肿瘤，垂体瘤/癌，浆细胞瘤，前列腺肿瘤/癌，横纹肌肉瘤，直肠肿瘤/癌，肾细胞瘤/癌，移行细胞瘤/肾盂和输尿管癌，唾液腺肿瘤/癌症，塞扎里综合征(sezary syndrome)，皮肤肿瘤(如皮肤t细胞淋巴瘤，卡波西氏肉瘤，肥大细胞瘤和黑色素瘤)，小肠肿瘤/癌，软组织肉瘤，胃肿瘤/癌，睾丸肿瘤/癌，胸腺瘤，甲状腺肿瘤/癌，尿道肿瘤/癌，子宫肿瘤/癌，阴道肿瘤/癌，外阴肿瘤/癌症，和wilms瘤(wilms'tumor)。优选地，所述实体瘤选自由软组织肉瘤，肝细胞癌，乳腺癌，胰腺癌和黑色素瘤组成的组。更优选地，所述实体瘤是平滑肌肉瘤，诸如腹膜后平滑肌肉瘤。
39.如本文所用，“单位剂量”是指给予对象，例如，人的药物在单一剂量中的量。
40.如本文所用，“诺氏梭菌“指属于诺氏梭菌(clostridium novyi)的种或由其衍生的细菌的细菌。诺氏梭菌可以通过商购自例如atcc(#19402)得到，是革兰氏阳性厌氧细菌。诺氏梭菌衍生的细菌可以由通过以下制备，例如，筛选用于具有特定特征的克隆的天然诺氏梭菌。优选诺氏梭菌细菌是那些对于对象如哺乳动物，例如，人是无毒的或具有最低限度毒性的。例如，优选的诺氏梭菌，诺氏梭菌nt，是通过例如，基因工程方法或通过选择程序从已失去其单全身毒素(α-毒素)的基因的天然诺氏梭菌衍生的细菌。诺氏梭菌nt可以由，例如，使用在dang等，2001和美国专利号7344710公开的方法制备。因此，本发明包括诺氏梭菌以及诺氏梭菌nt细菌。
41.药代动力学研究表明，诺氏梭菌nt孢子，如果静脉内注射，被迅速地从循环中清除(大于99％的孢子在1小时内清除)和在网状内皮系统内隔离。长期分布研究表明，这些孢子在一年以内最终从所有组织中被消除。以孢子形式(休眠阶段)递送的诺氏梭菌nt当暴露于肿瘤的低氧区域时发芽(从孢子转换为营养状态)。因此，诺氏梭菌nt中的在荷瘤患者中的毒性预计将比健康的患者中的毒性更大。
42.当静脉内注射诺氏梭菌nt时，不管治疗剂量如何，健康小鼠和兔子均没有显示明显毒性临床症状(发病率，死亡率，或临床表现)。然而，在尸检的组织检查发现，似乎是治疗剂量依赖的肉眼和显微镜下炎症改变。这些发现在剂量为5
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108个孢子/kg或更大时，主要是在肝，脾和肾上腺被注意到。接受较低剂量的健康动物，没有表现出肉眼或显微镜下异常尸检。在接受高剂量的动物中，炎症的分辨率在第28天已经是明显的，在给药后一年在所有的动物中没有炎症的迹象。为了确定诺氏梭菌nt孢子是否会在非肿瘤缺氧组织发芽，研究具有粥样硬化斑块和实验性心肌梗塞的老年小鼠，用诺氏梭菌nt治疗。没有证据表明这些血管病变中的孢子定位或发芽。在研究结束时，在这些小鼠没有任何临床或病理异常(不是预先存在的心血管病变等)。这些研究表明，诺氏梭菌nt在健康的动物中没有引起明显的临床和最小病理毒性。
43.静脉(iv)注射孢子进入免疫感受态的携带肿瘤的小鼠导致肿瘤的裂解和强烈的炎症反应。在小鼠中，三种结果之一被通常观察到：一个子集(25-35％)的小鼠被治愈(一年观察后无肿瘤复发)，并发展对原发肿瘤的长期免疫(agrawal等，2004。)。另一子集(65-75％)经历完整的临床反应，但经历伴有原始肿瘤的再生长的复发。最后，剩余的子集(0至20％，这取决于实验)经历肿瘤破坏，但治疗开始后2-5天发展显著临床毒性。相对简单的措施，诸如水合，能够充分降低这种毒性，往往完全消除这些迹象。在较大的动物(兔)中的研究显示相同的采用诺氏梭菌nt治疗的治愈和复发率，但没有显示出在小鼠中的一个子集所观察到的威胁生命的临床毒性。采用诺氏梭菌nt孢子治疗时，携带肿瘤的小鼠中观察到治疗相关的死亡，但在兔中没有观察到治疗相关的死亡(diaz等人，2005)。在这些研究中，毒性涉及孢子剂量和肿瘤大小。在垂死的小鼠中，没有特异性的临床实验室或病理终末器官损害被发现，独特的显著的发现是肝脾肿大。治愈后的小鼠在肝脏和脾脏具有罕见的残余炎症改变，但与未经治疗的动物相比则没有什么不同。这些研究显示，在荷瘤动物中的毒性在大的肿瘤小鼠中可是显著的(死亡)，但在较大的动物(兔)中极少，并且在小鼠中是采用水合或抗生素可管理的。
44.在携带肿瘤的狗中使用静脉注射诺氏梭菌nt孢子(1
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109孢子/平方米)作为单一试剂的以前工作没有产生危及生命的毒性。狗被保持在液体疗法(2-4ml/kg/hr)，治疗后进行数天,其可能降低毒性。不幸的是，没有针对治疗的任何可测量的肿瘤响应。
45.如本文所用，“菌落形成单位”(”cfu”)指的是细菌的有生活力的形式，其将引起细胞(或集落)的聚集。这样有生活力的形式包括营养和孢子形式，并且本发明包括单独和组合使用的两种形式。集落形成单位测定是本领域已知的。见，例如，breed等，1916年。用于支持诺氏梭菌生长介质的是市售的，如difco(bd，富兰克林湖，新泽西州)的钢筋梭菌培养基(reinforced clostridial medium)(rcm)。如上所述，单位剂量包含约1
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107，例如约1
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104，约1
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105，约1
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106，或约1
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107的诺氏梭菌cfu。
46.在该实施方案的一个方面中，单位剂量包含约1
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107个诺氏梭菌的cfu。在
该实施方案的另一个方面，所述单位剂量包含约1
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104个诺氏梭菌的cfu。令人惊讶的是，本文中公开的用于人体治疗的剂量出乎意料低于针对肿瘤的适应证的典型起始治疗剂量，所述典型起始治疗剂量是由从我们的非啮齿动物模型使用非啮齿类最高无严重毒性剂量确实(hnstd)的1/6简单推断而预见的。见，例如，senderowicz，a.m.，“information needed to conduct first-in human oncology trials in the united states:a view from a former fda medical reviewer”clin.canc.res.,2010,16:1719-25。
47.优选地，本发明中的诺氏梭菌为诺氏梭菌nt。
48.在该实施方案的另一个方面，所述单位剂量包含约1
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107个诺氏梭菌nt孢子。在该实施方案的另一个方面中，单位剂量包含约1
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104个诺氏梭菌nt孢子。
49.在本实施例的另一方面，所述给予步骤包括在单个位置注射单位剂量入肿瘤。在该实施方案的另一个方面，给予步骤包括在多个独特的位置，例如2，3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个独特的位置，注射单位剂量到肿瘤中。优选，给予步骤包括在1-5个独特的位置注射单位剂量进入肿瘤，如在图13所示。在另一优选的实施方案中，给予步骤包括：在5或更多的独特位置注射所述单位剂量进入肿瘤。多部位注射可以如本文公开进行，优选采用多叉的针如(雷克斯-医学，康斯霍肯，pa(rex-medical,conshohocken,pa))。另外，在本发明中，给予步骤，如上所述，包括直接注射进入肿瘤，但是用于给予活性剂，如诺氏梭菌或诺氏梭菌nt至肿瘤的其它方法也可以考虑。这样的方法包括植入，透皮递送，和经粘膜递送。
50.在该实施方案的另一个方面，所述方法还包括对人给药多个治疗周期，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，20，25，30个，或超过30个周期，每个治疗周期包括注射一个单位剂量诺氏梭菌的cfu，如一个单位剂量诺氏梭菌nt孢子，入实体瘤。最好给药1-10个治疗周期。更优选地，给药2-4个治疗周期。每个治疗周期之间的时间间隔是可变的。在优选的实施方案中，每个治疗周期之间的时间间隔为约5-100天。在另一个优选的实施方案中，每个治疗周期之间的间隔约7天。
51.在本实施例的另一方面，该方法进一步包括，诺氏梭菌的cfu，如在每次给予诺氏梭菌nt孢子之前、期间和/或之后，给药静脉内(iv)流体至人类。水合患者的iv流体为本文公开的和本领域公知的。这种流体可以是与血液等渗的流体，如，例如，0.9％的氯化钠溶液，或乳酸林格氏溶液(lactated ringer's solution)。
52.在该实施方案的另一个方面，该方法还包括以一段时间和一定剂量为人类提供抗生素的第一过程，所述一段时间和一定剂量有效治疗或减轻因诺氏梭菌的cfu，如诺氏梭菌nt孢子产生的不良副作用。在本发明中不良副作用(或不良事件，这是与不良副作用互换使用的)可以包括但不限于感染(如那些由开放性创伤产生的)，呕吐，便血，和发热。
53.在优选的实施方案中，诺氏梭菌给予后给药抗生素两周。这种抗生素的非限制性实例包括阿莫西林，克拉维酸盐，甲硝唑，以及它们的组合。
54.在另一个优选的实施方案中，该方法还包括以一段时间和一定剂量为人类提供抗生素的第二过程，所述一段时间和一定剂量有效治疗或减轻因所述诺氏梭菌产生的不良副作用。抗生素的第二过程可以在抗生素的第一过程完成后启动，并被进行1-6个月，如3个月。优选，在第二个过程中使用的抗生素是多西环素，但由医疗专业人员批准的任何抗生素都可以使用。
55.在该实施方案的另一个方面，该方法还包括，通过以下使用组合治疗方案：例如，给予人选自化学疗法，放射治疗，免疫治疗，以及它们的组合的治疗。
56.组合治疗治疗中使用的诺氏梭菌，例如，诺氏梭菌nt孢子和抗癌剂可以同时或在不同的时间给药于人类，如医师认为最适合用。如果诺氏梭菌，例如，诺氏梭菌nt孢子，和其它抗癌剂在不同的时间，例如，连续给药而给药，则诺氏梭菌，例如，诺氏梭菌nt孢子可以在其它抗癌剂之前给药于人。或者，所述其它抗癌剂可以在诺氏梭菌，例如，诺氏梭菌nt孢子之前给药于人。
57.如本文所使用的，“化学疗法”是指任何治疗方案，它与诺氏梭菌，例如，诺氏梭菌nt，本发明的治疗兼容和使用细胞毒性和/或细胞抑制剂，所述细胞毒性和/或细胞抑制剂针对癌细胞或与癌细胞关联或支持癌细胞的细胞。在优选的实施方案中，化学疗法包括给药人类选自以下组成的组中的试剂：抗代谢剂，微管抑制剂，dna损伤剂，抗生素，抗血管生成剂，血管破坏剂，分子靶向剂，以及它们的组合。
58.如本文中所使用的，“抗代谢剂”是一种物质，其降低或抑制细胞使用是正常代谢的部分的化学物质。根据本发明的非限制性的抗代谢剂或类似物的实例包括抗叶酸剂，嘌呤抑制剂，嘧啶抑制剂，以及它们的组合。
59.如本文中所使用的，“抗叶酸剂”是改变，减少，或抑制细胞使用叶酸(维生素b9)的物质。抗叶酸剂的非限制性实例包括甲氨蝶呤(duramed制药公司)，培美曲塞(eli lilly)，普拉曲沙(频谱(spectrum)制药)，氨基蝶呤(sigma aldrich)，其药学上可接受的盐，以及它们的组合。
60.如本文所使用的，“嘌呤”是包含稠合的六元和五元含氮环的化合物。非限制性的那些对细胞代谢重要的嘌呤实例包括腺嘌呤，鸟嘌呤，次黄嘌呤，和黄嘌呤。“嘌呤抑制剂”是改变，降低或抑制细胞生产嘌呤或使用嘌呤的物质。嘌呤抑制剂的非限制性实例包括甲氨蝶呤(duramed制药公司)，培美曲塞(eli lilly)，羟基脲(施贵宝((bristol-myers squibb)))，2-巯基嘌呤(sigma-aldrich公司)，6-巯基嘌呤(sigma-aldrich公司)，氟达拉滨(ben venue实验室)，氯法拉滨(genzyme公司)，奈拉滨(葛兰素史克(glaxosmithkline))，普拉曲沙(光谱制药(spectrum pharmaceuticals))，6-硫代鸟嘌呤(门制药(gate pharmaceuticals))，呋咯地辛(biocryst制药(biocryst pharmaceuticals))，喷司他丁(贝德福德实验室(bedford laboratories))，沙帕他滨(cyclacel制药公司(cyclacel pharmaceuticals,inc.))，氨基蝶呤(sigma aldrich)，硫唑嘌呤(葛兰素史克)，其药学上可接受的盐，以及它们的组合。
61.如本文所使用的，“嘧啶”是包含六元含氮环的化合物。那些对细胞代谢重要的非限制性嘧啶例子包括尿嘧啶，胸腺嘧啶，胞嘧啶，和乳清酸。“嘧啶抑制剂”是改变，降低或抑制细胞生产嘧啶或使用嘧啶的物质。嘧啶抑制剂的非限制性实例包括5-氟尿嘧啶(tocris bioscience公司)，替加氟(lgm制药)，卡培他滨(希罗达)(roche)，克拉屈滨(lgm制药)，吉西他滨(eli lilly)，阿糖胞苷(贝德福德实验室(bedford laboratories))，地西他滨(卫材公司(eisai inc.))，氟尿苷(贝德福德实验室(bedford laboratories))，5-氮杂胞苷(pharmion制药)，去氧氟尿苷(开曼化学品(cayman chemicals))，thiarabine(访问制药(access pharmaceuticals))，曲沙他滨(sgx制药(sgx pharmaceuticals))，雷替曲塞(阿斯利康(astrazeneca))，卡莫氟(圣克鲁斯生物技术公司(santa cruz biotechnology,
inc.))，6-氮杂尿嘧啶(mp biomedicals，llc)，其药学上可接受的盐，以及它们的组合。
62.在本发明的一个优选的方面，抗代谢剂选自5-氟尿嘧啶(tocris bioscience公司)，替加氟(lgm制药)，卡培他滨(希罗达)(roche)，克拉屈滨(lgm制药)，甲氨蝶呤(duramed制药公司)，培美曲塞(礼来(eli lilly))，羟基脲(施贵宝)，2-巯基嘌呤(sigma-aldrich公司)，6-巯基嘌呤(sigma-aldrich公司)，氟达拉滨(奔会场实验室(ben venue laboratories))，吉西他滨(礼来)，氯法拉滨(健赞公司(genzyme corp.))，阿糖胞苷(贝德福德实验室(bedford laboratories))，地西他滨(卫材公司)，氟尿苷(贝德福德实验室(bedford laboratories))，奈拉滨(葛兰素史克)，普拉曲沙(频谱制药)，6-硫鸟嘌呤(门制药(gate pharmaceuticals))，5-阿扎胞苷(pharmion公司制药)，去氧氟尿苷(开曼化学品)，呋咯地辛(biocryst制药(biocryst pharmaceuticals))，喷司他丁(贝德福德实验室(bedford laboratories))，沙帕他滨(cyclacel制药公司)，thiarabine(访问制药)，曲沙他滨(sgx制药)，雷替曲塞(阿斯利康)，氨基蝶呤(sigma aldrich)，卡莫氟(圣克鲁斯生物技术公司)，硫唑嘌呤(葛兰素史克)，6-氮杂尿嘧啶(mp biomedicals公司，llc)，其药学上可接受的盐，以及它们的组合。
63.如本文所使用的，“微管抑制剂”是干扰微管的功能，例如单个微管单元的聚合或解聚的物质。在本发明的一个方面，微管抑制剂可以选自微管去稳定剂，微管稳定剂，及其组合。本发明的微管抑制剂还可选自紫杉烷，长春花生物碱，埃博霉素，以及它们的组合。根据本发明的非限制性的微管抑制剂的例子包括bt-062(生物试验(biotest))，hmn-214(d.西方治疗(d.western therapeutics))，甲磺酸艾立布林(卫材(eisai),)，长春地辛(eli lilly)，ec-1069(endocyte)，ec-1456(endocyte)，ec-531(endocyte)，vintafolide(endocyte)，2-甲氧基雌二醇(entremed)，gtx-230(gtx)，曲妥珠单抗emtansine(罗氏公司(hoffmann-la roche))，crolibulin(免疫制药公司)，d1302a-美登木素生物碱缀合物(maytansinoid conjugates)(免疫制药(immunogen))，imgn-529(免疫制药(immunogen))，lorvotuzumab mertansine(免疫制药(immunogen))，sar-3419(免疫制药(immunogen))，sar-566658(免疫制药(immunogen))，imp-03138(冲击疗法(impact therapeutics))，托泊替康/长春新碱组合(lipocure)，bph-8(分子发现系统(molecular discovery systems))，福他布林氨丁三醇(oxigene)，雌莫司汀磷酸钠(辉瑞(pfizer))，长春新碱(皮埃尔
·
法布尔(pierre fabre))，长春氟宁(皮埃尔
·
法布尔)，长春瑞滨(皮埃尔
·
法布尔)，rx-21101(rexahn)，卡巴他赛(赛诺菲(sanofi))sta-9584(信达制药(synta pharmaceuticals))，长春碱，埃博霉素a，帕妥匹隆(诺华(novartis))，伊沙匹隆(施贵宝)，埃博霉素d(kosan biosciences)，紫杉醇(施贵宝)，多西他赛(赛诺菲-安万特公司(sanofi-aventis))，hai注射用紫杉醇(白蛋白结合型)(紫杉醇纳米粒注射混悬液)(abraxane)，dj-927(第一三共株式会社(daiichi sankyo))，圆皮海绵内酯(discodermolide)(cas号：127943-53-7)，eleutherobin(cas号：174545-76-7)，其药学上可接受的盐，以及它们的组合。
64.本发明的dna损伤剂包括，但不限于，烷化剂，基于铂的药剂，嵌入剂，和dna复制的抑制剂。
65.如本文中所使用的，“烷基化剂”是一种物质，其将一个或多个烷基(c
nhm
，其中n和m是整数)加至核酸。在本发明中，烷基化剂选自氮芥，亚硝基脲，烷基磺酸盐或酯，三嗪，乙烯亚胺，以及它们的组合组成的组。非限制性氮芥的例子包括氮芥(lundbeck)，苯丁酸氮芥
(葛兰素史克)，环磷酰胺(美赞臣公司(mead johnson co.))，苯达莫司汀(安斯泰来(astellas))，异环磷酰胺(百特国际(baxter international))，美法仑(配体(ligand))，美法仑flufen酰胺(oncopeptides)，以及其药学上可接受的盐。非限制性的亚硝基脲的实例包括链脲菌素(teva)，卡莫司汀(卫材)，洛莫司汀(赛诺菲)，和其药学上可接受的盐。烷基磺酸盐或酯的非限制性实例包括白消安(爵士制药(jazz pharmaceuticals))和其药学上可接受的盐。三嗪的非限制性实例包括达卡巴嗪(拜尔(bayer))，替莫唑胺(癌症研究技术(cancer research technology))，和其药学上可接受的盐。非限制性乙烯亚胺的实例包括塞替派(贝德福德实验室(bedford laboratories))，六甲蜜胺(mgi制药)，和其药学上可接受的盐。其他烷化剂包括prolindac(访问)，ac-225 bc-8(锕制药(actinium pharmaceuticals))，alf-2111(alfact创新(alfact innovation))，氯乙环磷酰胺(百特国际(baxter international))，mdx-1203(施贵宝)，硫脲基丁腈(cellceutix)，二溴甘露醇(chinoin)，二溴卫矛醇(chinoin)，尼莫司汀(daiichi sankyo)，葡磷酰胺(eleison制药)，humax-tac和pbd adc组合(genmab)，bp-c1(meabco)，苏消安(medac)，硝呋莫司(metronomx)，甲苯磺酸英丙舒凡(田边三菱制药(mitsubishi tanabe pharma))，雷莫司汀(田边三菱制药)，nd-01(纳米载体(nanocarrier))，hh-1(北欧nanovector(nordic nanovector))，22p1g细胞和异环磷酰胺的组合(nuvilex)，磷酸雌莫司汀(辉瑞)，泼尼莫司汀(辉瑞)，lurbinectedin(pharmamar)，曲贝替定(pharmamar)，altreatamine(赛诺菲)，sgn-cd33a(西雅图遗传学(seattle genetics))，福莫司汀(施维雅(servier))，奈达铂(盐野义制药(shionogi))，heptaplatin(sk控股(sk holdings))，阿帕齐醌(光谱制药(spectrum pharmaceuticals))，sg-2000(spirogen)，tlk-58747(telik)，拉罗莫司汀(崴昂制药(vion pharmaceuticals))，丙卡巴肼(alkem实验室有限公司(alkem laboratories ltd))，及其药学上可接受的盐。
66.如本文所使用的，“基于铂的药剂”是包含金属铂的抗癌物质和这些物质的类似物。铂可以是任何氧化态。本发明的基于铂的药剂包括但不限于，1,2-二氨基环己烷(dach)衍生物，菲并咪唑(phenanthroimidazole)铂(ii)配合物，铂(platiunum)iv族化合物，二-和三-核铂化合物，去甲斑蝥素集成铂络合物(demethylcantharidin-integrated platinum complexes)，铂共轭化合物，顺铂纳米粒子与聚合物胶束，空间位阻的铂复合物(sterically hindered platinum complexes)，奥沙利铂(debiopharm)，沙铂(庄信万丰(johnson matthey))，bbr3464(novuspharma spa)，zd0473(阿斯利康(astra zeneca))，顺铂(日本化药(nippon kayaku))，jm-11(庄信万丰)，pad(顺二氯双环戊基胺铂(ii))，mba((反式-1,2-二氨基环己烷)双溴醋酸根合铂(acetato platinum)(ii))，phm((1,2-环己烷二胺)丙二酸根合铂(malonato platinum)(ii))，shp((1,2-环己烷二胺)硫酸根合铂(ii))，新phm((反式-r，r-1,2-环己烷二胺)丙二酸根合铂(ii))，新的shp((反式-r，r-1,2-环己烷二胺)硫酸根合铂(ii))，jm-82(庄信万丰(johnson matthey))，pyp((1,2-环己烷二胺)双丙酮酸根合铂(ii))，phic((1,2-环己烷二胺)异柠檬酸根合铂(ⅱ))，trk-710((反式-r，r-1,2-环己烷二胺)[3-乙酰基-5-甲基-2,4(3h，5h)-呋喃二酮根合(furandionato)]铂(ⅱ))，bop((1,2-环辛烷二胺)双溴醋酸根合铂(ii))，jm-40(庄信万丰)，恩洛铂(unionpharma)，泽尼铂(lgm制药)，ci-973(帕克-戴维斯(parke-davis))，洛铂(zentaris ag/海南天王国际制药)，cycloplatam(lgm制药)，wa2114r(米铂/乐铂)(chembest研究实验
室(chembest research laboratories,ltd.))，heptaplatin(ski2053r)(sk化学)，tno-6(螺铂)(海航工业株式会社(haihang industry co.,ltd.))，奥马铂(四铂)(lgm制药)，jm-9(异丙铂)(庄信万丰)，bbr3610(novuspharma spa)，bbr3005(novuspharma spa)，bbr3571(novuspharma spa)，bbr3537(novuspharma spa)，aroplatin(l-nddp)(boc科学)，铂-acramtu({[铂(en)cl(acramtu-s)](no3)2(en＝乙烷-1,2-二胺，acramtu＝1-[2-(吖啶-9-基氨基)乙基]-1,3-二甲基硫脲)})，负载顺铂的脂质体(liplasomes)，spi-077(alza)，lipoplatin(调节子(regulon))，lipoxal(调节子)，卡铂(庄信万丰)，奈达铂(盐野义制药(shionogi seiyaku))，米铂水合物(大日本住友制药(dainippon sumitomo pharma))，奥马铂(lgm制药)，恩洛铂(莱德利实验室(lederle laboratories))，ci973(帕克戴维斯)，peg化的(聚乙二醇化的)顺铂，peg化的卡铂，peg化的奥沙利铂，反铂(transplatin)(反式-二氯化二氨铂(diamminedichloroplatinum)(ⅱ)；混合的z：反式-[ptcl2{z-hn＝c(ome)me}(nh3)])，cd-37(雌二醇-铂(ii)杂交分子)，吡铂(匕首制药((poniard pharmaceuticals)))，
[0067][0068]
ah44(komeda等人，2006；harris等，2005；qu等，2004)，三铂nc(harris等，2005；qu等，2004)，prolindac(访问)，其药学上可接受的盐和它们的组合。
[0069]
如本文中所使用的，“嵌入剂”包括，但不限于，多柔比星(阿霉素)，柔红霉素，伊达比星，米托蒽醌，其药学上可接受的盐，前药，以及它们的组合。
[0070]
非限制性的dna复制抑制剂的实例包括，但不限于拓扑异构酶抑制剂。如本文所使用的，“拓扑异构酶抑制剂”是一种物质，其降低拓扑异构酶的表达或活性。根据本发明的拓扑异构酶抑制剂可以抑制拓扑异构酶i，拓扑异构酶ii，或拓扑异构酶i和拓扑异构酶ii二者。根据本发明的非限制性的拓扑异构酶i抑制剂的实例包括依立替康(alchemia)，aph-0804(aphios)，喜树碱(aphios)，可司替康(bionumerik)，托泊替康(葛兰素史克)，贝洛替康盐酸盐(chon昆dang(chon kun dang))，firtecan单抗(firtecan pegol)(enzon)，hn-30181a(韩美(hanmi))，hrs7-sn-38(immunomedics)，拉贝珠单抗-sn-38(immunomedics)，etirinotecan单抗(etirinotecan pegol)(nektar治疗(nektar therapeutics))，nk-012(日本化药)，ser-203(塞里纳治疗(serina therapeutics))，盐酸simmitecan前药(上海海河制药(shanghai haihe pharmaceuticals))，吉马替康(sigma-tau)，那米替康(sigma-tau)，sn-38(supratek制药)，tlc-388盐酸盐(台湾脂质体公司(taiwan liposome company))，片螺素(lamellarin)d(pharmamar)，其药学上可接受的盐，以及它们的组合。非限制性的根据本发明的拓扑异构酶ii型的抑制剂的实例包括adva-27a(advanomics)，zoptarelin多柔比星(zoptarelin doxorubicin)(aeterna zentaris)，戊柔比星(蒽制药(anthra pharmaceuticals))，雷佐生(阿斯利康)，多柔比星(燕麦治疗(avena therapeutics))，安吖啶(施贵宝(bristol-myers squibb))，磷酸依托泊苷(施贵宝)，依托泊苷(诺华)，右丙亚胺(癌症研究技术)，阿糖胞苷/柔红霉素组合(celator制药)，cap7.1(cellact制药)，aldoxorubicin(cytrx)，盐酸氨柔比星(大日本住友制药(dainippon sumitomo pharma))，vosaroxin(大日本住友制药)，柔红霉素(gilead sciences)，米拉珠
单抗/多柔比星组合(immunomedics)，阿柔比星(协和发酵麒麟(kyowa hakko kirin))，米托蒽醌(美达(meda))，吡柔比星(明治(meiji))，表柔比星(辉瑞)，替尼泊苷(诺华)，f-14512(皮埃尔
·
法布尔)，醋酸elliptinium(赛诺菲)，佐柔比星(赛诺菲)，右丙亚胺(topotarget)，索布佐生(zenyaku工业(zenyaku kogyo))，伊达比星(辉瑞)，hu-331(开曼化学(cayman chemical))，金精三羧酸(sigma aldrich)，其药学上可接受的盐，以及它们的组合。
[0071]
根据本发明的化学治疗的抗生素包括，但不限于，放线菌素，蒽环类，戊柔比星，表柔比星，博莱霉素，普卡霉素，丝裂霉素，其药学上可接受的盐，其前药，及其组合。
[0072]
如本文所用的术语“抗血管生成剂”是指防止或延迟从现有的血管新生的血管形成的任何化合物。在本发明中，抗血管生成剂的实例包括，但不限于，培加尼布，雷珠单抗，贝伐单抗(阿瓦斯丁)，羧基氨基三唑，tnp-470，cm101，ifn-α，il-12，血小板因子4，苏拉明，su5416，血小板反应蛋白，vegfr拮抗剂，抑制血管的类固醇(angiostatic steroids)和肝素，软骨衍生的血管生成抑制因子，基质金属蛋白酶抑制剂，血管抑制素，内皮抑制素，2-甲氧基雌二醇，tecogalan，催乳素，αvβ3抑制剂，三羧氨基喹啉，vegf-trap，氨基固醇，可的松，酪氨酸激酶抑制剂，抗血管生成的sirna，补体系统的抑制剂，血管破坏剂，以及它们的组合。优选地，该抗血管生成剂是贝伐单抗。
[0073]
本发明的vegfr拮抗剂包括，但不限于，帕唑帕尼，瑞戈非尼，lenvatinib，索拉非尼，舒尼替尼，阿昔替尼，凡德他尼，cabozantinib，伐他拉尼(vatalanib)，司马沙尼，zd6474，su6668，ag-013736，azd2171，aee788，mf1/mc-18f1，dc101/imc-1c11，雷莫芦单抗和莫替沙尼。vegfr拮抗剂还可以包括，vegf抑制剂如贝伐单抗，阿柏西普，2c3，r84，vegf-trap以及雷珠单抗。
[0074]
本发明的抑制血管的类固醇包括抑制，减弱，防止血管发生或新血管形成，或导致病理血管形成消退的任何类固醇。本发明的抑制血管的类固醇包括那些在欧洲专利申请号ep1236471 a2中公开，以及在美国专利序列号4599331中公开的那些20-取代的类固醇，在美国专利序列号4771042中公开的那些21-羟基类固醇，在国际申请号wo 1987/02672中公开的那些c
11
官能化类固醇，6α-氟17α，21-二羟基-16α-甲基孕-4,9(11)-二烯-3,20-二酮-21-乙酸酯或盐，6α-氟-17α，21-二羟基-16β-甲基孕-4,9(11)-二烯-3,20-二酮，6α-氟-17α，21-二羟基-16β-甲基孕-4,9(11)-二烯-3,20-二酮21-膦酰氧基和其药学上可接受的盐，氢化可的松，四氢皮质醇，17α-羟基-孕酮，11α-表氢化可的松(epihydrocortisone)，11-脱氢皮甾醇，皮质酮，去氧皮质酮，地塞米松，可的松21-乙酸酯，氢化可的松21-磷酸酯，17α-羟基-6α-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-17-乙酸酯，6α-氟-17α，21-二羟基-16α-甲基孕-4,9(11)-二烯-3,20-二酮，和δ9(11)-5β-雄烷甲酸(etianic)酯或盐，在国际申请号wo 1990/015816 a1中公开的所有类固醇。
[0075]
软骨衍生的血管生成抑制剂因子包括，但不限于，肽肌钙蛋白和软骨调节因子i。
[0076]
本发明的基质金属蛋白酶抑制剂包括但不限于，琥珀酰基异羟肟酸盐或酯如马立马司他和sc903，磺酰胺异羟肟酸盐如cgs27023a，膦酰胺羟肟酸盐，羧酸，羧酸盐，或羧酸酯抑制剂例如bay12-9566，硫醇抑制剂如化合物b，氨甲基苯并咪唑类似物，肽如regasepin，和四环素类，例如米诺环素。
[0077]
αvβ3抑制剂包括，但不限于，is20i，p11肽，emd 85189，和66203，rgd肽，rgd模拟物
如s 36578-2，锯鳞血抑肽，针对αvβ3整联蛋白的抗体或抗体片段如vitaxin，其靶向二聚体的细胞外域，西仑吉肽，和诸如s247的肽模拟物。
[0078]
抗血管生成的sirna包括，但不限于，靶向那些在血管生成过程中上调的mrna的sirna，任选的靶向vegf或vegfr mrna的聚乙二醇化的sirna，和靶向upr(未折叠蛋白应答)-ire1α，xbp-1，和atf6的mrna的sirna。此外，已经表明，无论靶序列的长度如何，sirna是，在最低限度，21个核苷酸，抑制血管形成(克莱因曼(kleinman)，等人，2008)，并且可以包含在本发明的抗血管发生的sirna中。
[0079]
补体系统的抑制剂包括，但不限于，经修饰的天然补体成分如可溶性补体受体1型，可溶性补体受体1型缺乏长同源重复(lacking long homologous repeat)-a，可溶性补体受体1型－唾液酰lewis(sialyl lewis)
x
，补体受体2型，可溶性衰变加速因子，可溶性膜辅因子蛋白，可溶性cd59，衰变加速因子cd59杂化物(hybrid)，膜辅因子蛋白衰变加速因子杂化物，c1抑制剂和c1q受体，补体抑制性抗体，如抗c5单克隆抗体和抗-c5单链fv，补体激活的合成抑制剂如拮抗肽和靶向c5a受体的类似物，和天然存在的阻断补体活化的化合物，例如肝素和有关的葡糖胺聚糖化合物。由makrides(makrides，1998年)公开的补体系统的附加抑制剂。
[0080]
如本文所用，术语“血管破坏剂”是指靶向现有脉管系统(vasculature)，例如肿瘤脉管系统，损坏或毁坏该脉管系统，和/或导致中央肿瘤坏死(central tumor necrosis)的任何化合物。在本发明中，血管破坏剂的实例包括，但不限于，abt-751(abbott)中，ave8062(安万特(aventis))，bcn105(生物学特性(bionomics))，bmxaa(antisoma)，ca-4-p(oxigene)，ca－1-p(oxigene)，cyt997(cytopia)，mpc-6827(myriad pharmaceuticals)，mn-029(medicinova)，npi-2358(海神(nereus))，oxi4503(oxigene)，tzt-1027(大地药业(daichi pharmaceuticals))，zd6126(阿斯利康和angiogene(astrazeneca and angiogene))，其药学上可接受的盐，以及它们的组合。
[0081]
如本文所使用的，“分子靶向剂”是当给予对象时干扰单个分子或一组分子的功能，优选那些参与肿瘤的生长和发展的物质。本发明的分子靶向剂的非限制性实例包括信号转导抑制剂，基因表达和其他细胞的功能的调节剂，免疫系统调节剂，抗体-药物缀合物(adc)，以及它们的组合。
[0082]
如本文所使用的，“信号转导抑制剂”是破坏细胞之间的通信，如当细胞外信号传导分子激活细胞表面受体时破坏细胞之间的通信的物质。本发明的信号转导抑制剂的非限制性实例包括间变性淋巴瘤激酶(alk)的抑制剂，b-raf抑制剂，表皮生长因子抑制剂(egfri)，erk抑制剂，janus激酶抑制剂，mek抑制剂，雷帕霉素的哺乳动物靶标(mtor)抑制剂，磷酸肌醇3-激酶抑制剂(pi3ki)，和ras抑制剂。
[0083]
如本文中所使用的，“间变性淋巴瘤激酶(alk)抑制剂”是一种物质，所述物质(
ⅰ
)直接与alk，例如，通过结合alk相互作用和(ii)降低alk的的表达或活性。本发明的间变性淋巴瘤激酶(alk)抑制剂的非限制性实例包括crizotinib(辉瑞，纽约，纽约州)，ch5424802(中外制药公司，东京，日本(chugai pharmaceutical co.,tokyo,japan))，gsk1838705(葛兰素史克公司，英国)，chugai 13d(中外制药有限公司，日本东京)，cep28122(梯瓦制药工业有限公司，以色列(teva pharmaceutical industries,ltd.,israel))，ap26113(ariad制药公司制药，剑桥，马萨诸塞州(ariad pharmaceuticals,cambridge,ma))，cephalon 30
(梯瓦制药工业有限公司，以色列)，x-396(xcovery，西棕榈滩，佛罗里达州(xcovery,inc.,west palm beach,fl))，amgen 3(amgen制药公司，千橡，ca(amgen pharmaceuticals,thousand oaks,ca)，asp3026(安斯泰来制药美国公司，诺斯布鲁克，伊利诺伊州(astellas pharma us,inc.,northbrook,illinois))和amgen 49(amgen制药公司，千橡，ca)，其药学上可接受的盐，以及它们的组合。
[0084]
如本文所用，本发明的“b-raf抑制剂”是一种物质，所述物质(
ⅰ
)直接与b-raf，例如，通过结合的b-raf相互作用和(ii)降低b-raf的表达或的活性。b-raf抑制剂可以通过它们各自的结合模式被分类成两种类型。如本文所用，“1型”b-raf抑制剂是那些靶向在其活性构象的激酶atp结合部位的抑制剂。“2型”b-raf抑制剂是那些优先结合所述激酶的无活性构象的抑制剂。非限制性的本发明的1型的b-raf抑制剂实例包括：
[0085]
化合物7(li等人,2010),
[0086]
化合物9(同上(id.)),
[0087]
化合物10(同上),
[0088]
化合物13(同上),
[0089]
化合物14(同上),dabrafenib(葛兰素史克)，gdc-0879(genentech)，l-779450b-raf(merck)，plx3202(plexxikon)，plx4720(plexxikon)，sb-590885(葛兰素史克公司)，sb-699393(葛兰素史克)，vemurafenib(plexxikon)，其药学上可接受的盐，以及它们的组合。优选的是，1型raf抑制剂是dabrafenib或其药学上可接受的盐。
[0090]
非限制性的本发明的2型的b-raf抑制剂的实例包括：
[0091]
化合物15(li等人,2010),
[0092]
化合物16(同上),
[0093]
化合物18(同上),
[0094]
化合物19(同上),
[0095]
化合物20(同上),
[0096]
化合物21(同上),
[0097]
化合物22(同上),
[0098]
化合物23(同上),
[0099]
化合物24(同上),化合物25(同上),
[0100]
化合物26(同上),
[0101]
化合物27(同上),
[0102]
化合物28(同上),
[0103]
化合物30(同上),
[0104]
化合物31(同上),
[0105]
化合物32(同上),
[0106]
化合物33(同上),
[0107]
化合物34(同上),
[0108]
化合物35(同上),
[0109]
化合物36(同上),
[0110]
化合物37(同上),
[0111]
化合物38(同上),
023(cytomx治疗)，cudc-101(curis)，dacomitinib(辉瑞)daph(cas#145915-58-8)，瑞香素(圣克鲁斯生物技术)，乳酸度维替尼(诺华)，egfr抑制剂(cas#879127-07-8)，epitinib(和记黄埔中国的meditech(hutchison china meditech))，erbstatin类似物(cas#63177-57-1)，厄洛替尼(astellas)，吉非替尼(阿斯利康(astrazeneca))，gt-mab 5.2-gex(糖表位(glycotope))，gw 583340(cas#388082-81-3)，gw2974(cas#202272-68-2)，hds 029(cas#881001-19-0)，金丝桃素(圣克鲁斯生物技术)，盐酸埃克替尼(icotinib)(betapharma)，jnj-26483327(强生(johnson&johnson))，jnj-28871063(强生)，kd-020(kadmon制药(kadmon pharmaceuticals))，二甲苯磺酸拉帕替尼(葛兰素史克)，(灰)薰草菌素(lavendustin)a(sigma公司)，(灰)薰草菌素c(sigma)，ly-3016859(eli lilly)，mehd-7945a(罗氏公司)，mm-151(梅里马克(merrimack))，mt-062(medisyn技术(medisyn technologies))，奈昔木单抗(礼来)，奈拉替尼(辉瑞)，尼妥珠单抗(分子免疫学中心(center of molecular immunology))，nt-004(newgen治疗(newgen therapeutics))，pantiumumab(amgen)，pd 153035(cas#153436-54-5)，pd 161570(cas#192705-80-9)，pd 168393，pd 174265(cas#216163-53-0)，pirotinib(四环医药(sihuan pharmaceutical))，poziotinib(韩美)，pp 3(cas#5334-30-5)，pr-610(proacta)，pyrotinib(江苏恒瑞医药)，rg-13022(cas#136831-48-6)，rindopepimut(celldex治疗(celldex therapeutics))，rpi-1(cas#269730-03-2)，s-222611(盐野义制药(shionogi))，tak 285(cas#871026-44-7)，tas-2913(大宝(taiho))，theliatinib(和记黄埔中国的meditech)，酪氨酸磷酸化抑(tyrphostin)制剂47(rg-50864，ag-213)(cas#118409-60-2)，酪氨酸磷酸化抑制剂51(cas#122520-90-5)，酪氨酸磷酸化抑制剂ag 1478(cas#175178-82-2)，酪氨酸磷酸化抑制剂ag 183(cas#126433-07-6)，酪氨酸磷酸化抑制剂ag 528(cas#133550-49-9)，酪氨酸磷酸化抑制剂ag 99(cas#118409-59-9)，酪氨酸磷酸化抑制剂b42(圣克鲁斯生物技术)，酪氨酸磷酸化抑制剂b44(圣克鲁斯生物技术)，酪氨酸磷酸化抑制剂rg 14620(cas#136831-49-7)，凡德他尼(阿斯利康)，varlitinib(阵列生物制药(array biopharma))，伐他拉尼(诺华公司)，wz 3146(cas#1214265-56-1)，wz 4002(cas#1213269-23-8)，wz8040(cas#1214265-57-2)，xl-647(exelixis)，z-650(hec药业(hec pharm))，zm 323881(cas#324077-30-7)，其药学上可接受的盐，以及它们的组合。优选地，egfr抑制剂选自帕木单抗，埃罗替尼，其药学上可接受的盐，以及它们的组合组成的组。
[0116]
如本文中所使用的，“erk抑制剂”是一种物质，所述物质(
ⅰ
)直接与erk，包括erk1和erk2，例如，通过结合到erk相互作用和(ii)降低erk的蛋白激酶的表达或活性。因此，作用erk上游的抑制剂诸如mek抑制剂和raf抑制剂不是根据本发明的erk抑制剂。非限制本发明的erk抑制剂的实例包括aezs-131(aeterna zentaris)，aezs-136(aeterna zentaris)，sch-722984(默克公司(merck&co.))，sch-772984(默克公司)，sch-900353(mk-8353)(默克公司)，其药学上可接受的盐，以及它们的组合。
[0117]
如本文所使用的，“janus激酶抑制剂”是一种物质，所述物质(
ⅰ
)直接与janus激酶，例如，通过结合到janus激酶相互作用和(ii)降低janus激酶的表达或活性。本发明的janus激酶包括tyk2，jak1，jak2，和jak3。本发明的janus激酶抑制剂的非限制性实例包括ruxolitinib(incyte公司，wilmington，de(incyte corporation,wilmington,de))，baricitinib(incyte公司，wilmington，de)，tofacitinib(辉瑞，纽约，纽约州)，vx-509
(vertex制药，波士顿，马萨诸塞州(vertex pharmaceuticals,inc.,boston,ma))，glpg0634(加拉帕戈斯nv，比利时(galapagos nv,belgium))，cep-33779(泰华制药，以色列(teva pharmaceuticals,israel))，其药学上可接受的盐，以及它们的组合
[0118]
如本文所使用的，“mek抑制剂”是一种物质，所述物质(
ⅰ
)直接与mek，例如，通过结合到mek相互作用和(ii)降低mek的表达或活性。因此，作用于mek上游的抑制剂，如ras抑制剂和raf抑制剂，不是根据本发明的mek抑制剂。mek抑制剂可分为两种类型，这取决于抑制剂是否与atp竞争。如本文所使用的，“1型”mek抑制剂是与atp竞争结合mek的抑制剂。“2型”mek抑制剂是不与atp竞争结合mek的抑制剂。根据本发明非限制性的1型mek抑制剂的例子，包括贝马莫德((merck kgaa))，l783277(merck)，ro092210(roche)，其药学上可接受的盐，以及它们的组合。优选的是，1型mek抑制剂是ro092210(roche)或其药学上可接受的盐。根据本发明非限制性的2型的mek抑制剂的实例包括炭疽毒素，炭疽毒素的致死因子部分，arry-142886(6-(4-溴-2-氯-苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3h苯并咪唑-5-甲酸(2-羟基-乙氧基)-酰胺)(阵列生物制药)，arry-438162(阵列生物制药(array biopharma))，as-1940477(astellas)，mek162(阵列生物制药)，pd 098059(2-(2'-氨基-3'-甲氧基苯基)-氧杂萘-4-酮)，pd 184352(ci-1040)，pd-0325901(pfizer公司)，pimasertib(santhera制药)，refametinib(阿斯利康)，司美替尼(azd6244)(阿斯利康)，tak-733(武田)，trametinib(日本烟草(japan tobacco))，u0126(1,4-二氨基-2,3-二氰基-1,4-双(2-氨基苯硫基)丁二烯)(sigma)，rdea119(鹭biosciences公司/拜耳(ardea biosciences/bayer))，其药学上可接受的盐，以及它们的组合。优选的是，2型mek抑制剂是trametinib或其药学上可接受的盐。其他mek抑制剂包括，但不限于，安卓奎諾爾(金生物技术(golden biotechnology))，as-1940477(astellas)，as-703988(merck kgaa)，bi-847325(勃林格殷格翰公司(boehringer ingelheim))，e-6201(卫材)，gdc-0623(hoffmann-罗氏(hoffmann-la roche))，gdc-0973，rg422，ro4987655，ro5126766，sl327，wx-554(wilex)，yopj多肽，其药学上可接受的盐，以及它们的组合。
[0119]
如本文中所使用的，“mtor抑制剂”是一种物质，所述物质(
ⅰ
)直接与mtor，例如，通过结合mtor相互作用和(ii)降低mtor的表达或活性。根据本发明非限制性的mtor抑制剂的实例包括唑罗莫司(艾伯维(abbvie))，umirolimus(生物传感器(biosensors))，坦西莫司(辉瑞)，西罗莫司(辉瑞)，西罗莫司纳米晶体(elan公司制药技术(elan pharmaceutical technologies))，西罗莫司透皮(透皮)(sirolimus transderm(transderm))，西罗莫司-pnp(三养(samyang))，依维莫司(诺华)，biolimus a9(生物传感器)，地磷莫司(ariad)，雷帕霉素，tcd-10023(泰尔茂(terumo))，de-109(macusight)，ms-r001(macusight)，ms-r002(macusight)，ms-r003(macusight)，perceiva(macusight)，xl-765(exelixis)，奎纳克林(克利夫兰生物实验室(cleveland biolabs))，pki-587(辉瑞)，pf-04691502(辉瑞)，gdc-0980(genentech和piramed(genentech and piramed))，dactolisib(诺华公司)，cc-223(celgene)，pwt-33597(途径治疗(pathway therapeutics))，p-7170(皮拉马尔生命科学(piramal life sciences))，ly-3023414(eli lilly)，ink-128(武田)，gdc-0084(genentech)，ds-7423(daiichi sankyo)，ds-3078(daiichi sankyo)，cc-115(celgene)，cblc-137(克利夫兰生物实验室)，azd-2014(阿斯利康)，x-480(xcovery)，x-414(xcovery)，ec-0371(endocyte)，vs-5584(verastem)，pqr-401(piqur)，pqr-316(piqur)，
inc.,la jolla,ca))，pi3-δ抑制剂，治疗途径-1(途径治疗公司(pathway therapeutics ltd.))，pi3-δ抑制剂，治疗途径-2(途径治疗公司)，pi3-δ/γ抑制剂，cellzome(cellzome ag)，pi3-δ/γ抑制剂，cellzome(cellzome ag)，pi3-δ/γ抑制剂，intellikine(intellikine公司)，pi3-δ/γ抑制剂，intellikine(intellikine公司)，pi3-δ/γ抑制剂，治疗途径(途径治疗有限公司(pathway therapeutics ltd.))，pi3-δ/γ抑制剂，治疗途径(途径治疗有限公司)，pi3-γ抑制剂evotec(evotec)，pi3-γ抑制剂，cellzome(cellzome ag)pi3-γ抑制剂，途径治疗(途径治疗有限公司)，pi3kδ/γ抑制剂，intellikine-1(intellikine公司)，pi3kδ/γ抑制剂，intellikine-1(intellikine公司)，pictilisib(gdc-0941)(罗氏控股公司)，pik-90(cas#677338-12-4)，sc-103980(辉瑞，纽约，纽约州)，sf-1126(semafore制药，印第安纳波利斯，in(semafore pharmaceuticals,indianapolis,in))，sh-5，sh-6，四氢姜黄素，tg100-115(targegen公司，圣迭戈，加利福尼亚州(targegen inc.,san diego,ca))，曲西立滨，x-339(xcovery，西棕榈滩，佛罗里达州(xcovery,west palm beach,fl))，xl-499(evotech，德国汉堡(evotech,hamburg,germany))，其药学上可接受盐，以及它们的组合。优选地，pi3k/akt途径的抑制剂是pictilisib(gdc-0941)或其药学上可接受的盐。
[0122]
如本文所使用的，“ras抑制剂”是一种物质，所述物质(
ⅰ
)直接与ras，例如，通过结合ras相互作用和(ii)降低ras的表达或活性。根据本发明的非限制性的ras抑制剂的实例包括法尼基转移酶抑制剂(如，例如，替匹法尼和氯那法尼)，含有法尼基的小分子(诸如，例如，沙利雷塞和tln-4601)，dcai，如由毛雷尔所述的(毛雷尔，等人，2012)((maurer,et al.,2012))，kobe0065和kobe2602，如岛(岛等人，2013年)((shima,et al.,2013))和hbs 3(patgiri，等人，2011)所描述的，和aik-4(allinky)，其药学上可接受的盐，以及它们的组合。
[0123]
如本文所使用的，“基因表达”是将来自dna的信息用于多肽的形成中的过程。“基因表达和其它细胞功能的调节剂”是影响基因表达和其他细胞的功能的物质。此类调节剂的非限制性实例包括激素，组蛋白脱乙酰酶抑制剂(hdaci)，而细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cdki)，和聚adp核糖聚合酶(parp)抑制剂。
[0124]
在本发明中，“激素”是由机体的一部分中的细胞释放的而影响机体的另一部分细胞的物质。非限制性的本发明的激素的实例包括前列腺素，白三烯，前列腺环素，血栓素，糊精(amylin)，antimullerian激素，脂联素，促肾上腺皮质激素，血管紧张素原，血管紧张素，加压素，脂联素，脑利钠肽，降钙素，缩胆囊素，促肾上腺皮质激素释放激素，脑啡肽，内皮素，促红细胞生成素，卵泡刺激素，促生长激素神经肽，胃泌素，胃促生长素，胰高血糖素，促性腺激素释放激素，生长激素释放激素，人绒毛膜促性腺激素，人胎盘催乳素，生长激素，抑制素，胰岛素，生长调节素，瘦素，liptropin，促黄体激素，黑素细胞刺激素，促胃动素，食欲素(阿立新)，催产素，胰多肽，甲状旁腺激素，催乳激素，促乳素释放激素，松弛素，肾素，促胰液素，生长抑素，血小板生成素，促甲状腺激素，睾酮，去氢表雄酮，雄烯二酮，双氢睾酮，醛固酮，雌二醇，雌酮，雌三醇，皮质醇，孕酮，骨化三醇，和骨化二醇。
[0125]
一些化合物干扰某些激素的活性或停止生产某些激素。根据本发明的非限制性的激素干扰化合物实例包括他莫昔芬阿那曲唑来曲唑
和氟维司群这种化合物也本发明中的激素的含义内。
[0126]
如本文中所使用的，“hdac抑制剂”是一种物质，所述物质(
ⅰ
)直接与hdac，例如，通过结合hdac相互作用和(ii)降低hdac的表达或活性。根据本发明非限制性的hdac抑制剂的实例包括4sc-201(4sc ag)4sc-202(武田)，abexinostat(塞莱拉公司(celera))，an-1(泰坦制药公司(titan pharmaceuticals,inc.))，apicidine(默克公司(merck&co.,inc.))，ar-42(阿诺治疗(arno therapeutics))，arq-700rp(arqule)，avugane(topotarget as)，壬二酸-1-氧肟酸盐-9-酰苯胺(azelaic-1-hydroxamate-9-anilide)(aaha)，贝林司他(topotarget)，丁酸酯或盐(恩佐生命科学公司(enzo life sciences,inc.))，cg-1255(武士修炼的基因治疗学，llc(errant gene therapeutics,llc))，cg-1521(武士修炼的基因治疗学，llc)，cg-200745(crystalgenomics公司(crystalgenomics,inc.))，西达本胺(chidamide)(深圳微芯生物科技(shenzhen chipscreen biosciences))，chr-3996(色度治疗(chroma therapeutics))，cra-024781(pharmacyclics)，cs-3158(深圳微芯生物科技(shenzhen chipscreen biosciences))，cu-903(curis)，dac-60(genextra)，恩替司他(拜耳)，透明质酸丁酸酯(ha-but)，ikh-02(ikerchem)，ikh-35(ikerchem)，itf-2357(italfarmaco)，itf-a(italfarmaco)，jnj-16241199(强生)，ka-001(karus治疗(karus therapeutics))，kar-3000(karus治疗)，kd-5150(kalypsys)，kd-5170(kalypsys)，klyp-278(kalypsys)，klyp-298(kalypsys)，klyp-319(kalypsys)，klyp-722(kalypsys)，间羧基肉桂酸双-羟基酰胺(cbha)，mg-2856(methylgene)，mg-3290(methylgene)，mg-4230(methylgene)，mg-4915(methylgene)，mg-5026(methylgene)，mgcd-0103(methylgene公司(methylgene inc.))，莫西司他(methylgene)，ms-27-275(先灵ag(schering ag))，nbm-hd-1(naturewise)，nvp-laq824(novartis)，ocid-4681-s-01(兰花制药(orchid pharmaceuticals))，oxamflatin((2e)-5-[3-[(苯基磺酰基)氨基苯基]-戊-2-烯-4-基异羟肟酸((2e)-5-[3-[(phenylsufonyl)aminol phenyl]-pent-2-en-4-ynohydroxamic acid))，帕比司他(诺华)，pci-34051(pharmacyclics)，丁酸苯酯(恩佐生命科学公司(enzo life sciences,inc.))，新戊酰氧基甲基丁酸酯(an-9，泰坦制药公司(an-9,titan pharmaceuticals,inc.))，pivanex(太阳神制药公司(titan pharmaceuticals,inc.))，pracinostat(sbio)，px-117794(topotarget as)，pxd-118490(leo-80140)(topotarget as)，pyrox酰胺(辛二酰-3-氨基吡啶酰胺异羟肟酸)，resminostat(武田)，rg-2833(repligen)，ricolinostat(acetylon)，罗米地辛(安斯泰来(astellas))，sb-1304(s*bio)，sb-1354(s*bio)，sb-623(梅林研究我有限公司(merrion research i limited))，sb-624(梅林研究我有限公司)，sb-639(梅林研究我有限公司)，sb-939(s*bio)，scriptaid(n-羟基-1,3-二氧代-1h-苯并[de]异喹啉-2(3h)-己酰胺)，sk-7041(in2gen/sk化学公司(in2gen/sk chemical co.))，sk-7068(in2gen/sk化学公司)，辛二酰苯胺异羟肟酸(saha)，磺酰胺异羟肟酸，三丁酸甘油酯(sigma aldrich)，曲古抑菌素a(tsa)(sigma aldrich)，丙戊酸(vpa)(sigma aldrich)，伏林司他(zolinza)，wf-27082b(藤泽药品公司(fujisawa pharmaceutical company,ltd.))，其药学上可接受的盐，以及它们的组合。优选，hdac抑制剂是罗米地辛，其药学上可接受的盐，以及它们的组合。
[0127]
如本文所用，“cdk”是调节细胞周期的蛋白激酶的家族。已知的cdk包括cdk1，cdk2，ckd3，ckd4，cdk5，cdk6，cdk7，cdk8，cdk9，cdk10和cdk11。“cdk抑制剂”是一种物质，所
述物质(i)直接与cdk，例如通过结合cdk相互作用和(ii)降低cdk的表达或活性。根据本发明非限制性的cdk抑制剂的实例包括2-羟基铼，3-ata，5-碘-靛玉红-3'-单肟，9-氰基paullone，aloisine a，alsterpaullone 2-氰乙基，阿伏西地(赛诺菲)，am-5992(amgen)，氨基purvalanol a，arcyriaflavin a，at-7519(astex制药)，azd 5438(cas#602306-29-6)，bms-265246(cas#582315-72-8)，bs-181(cas#1092443-52-1)，丁内酯i(cas#87414-49-1)，cdk/crk的抑制剂(cas#784211-09-2)，cdk1/5抑制剂(cas#40254-90-8)，cdk2抑制剂ii(cas#222035-13-4)，cdk2抑制剂iv，nu6140(cas#444723-13-1)，cdk4抑制剂(cas#546102-60-7)，cdk4抑制剂iii(cas#265312-55-8)，cdk4/6抑制剂iv(cas#359886-84-3)，cdk9抑制剂ii(cas#140651-18-9)，cgp 74514a，cr8，cyc-065(cyclacel)，dinaciclib(配位体)，(r)-drf053二盐酸盐(cas#1056016-06-8)，fascaplysin，flavopiridol，hygrolidin，靛玉红，lee-011(astex制药)，ly-2835219(eli lilly)，马来酸milciclib(nerviano医学科学(nerviano medical sciences))，mm-d37k(麦克斯韦生物技术(maxwell biotech))，n9异丙基-奥罗莫星，nsc 625987(cas#141992-47-4)，nu2058(cas#161058-83-9)，nu6102(cas#444722-95-6)，奥罗莫星，on-108600(onconova)，on-123300(onconova)，羟吲哚i，p-1446-05(皮拉马尔(piramal))，p-276-00(皮拉马尔)，palbociclib(辉瑞)，pha-767491(cas#845714-00-3)，pha-793887(cas#718630-59-2)，pha-848125(cas#802539-81-7)，purvalanol a，purvalanol b，r547(cas#741713-40-6)，ro-3306(cas#872573-93-8)，roscovitine，sb-1317(sbio)，sch 900776(cas#891494-63-6)，sel-120(selvita)，塞利西利(cyclacel)，sns-032(cas#345627-80-7)，su9516(cas#377090-84-1)，whi-p180(cas#211555-08-7)，其药学上可接受的盐，以及它们的组合。优选的是，cdk抑制剂选自dinaciclib，palbociclib，其药学上可接受的盐，以及它们的组合组成的组。
[0128]
如本文所使用的，“多聚adp核糖聚合酶(parp)抑制剂”是一种物质，其降低了多聚adp核糖聚合酶(parps)或下游蛋白的表达或活性。本发明的非限定性的多聚adp核糖聚合酶(parp)抑制剂的例子包括，pf01367338(辉瑞，纽约，纽约州)，奥拉帕利(阿斯利康公司，英国)，iniparib(赛诺菲-安万特，巴黎，法国(sanofi-aventis,paris,france))，veliparib(雅培实验室，雅培公园，il(abbott laboratories,abbott park,il))，mk 4827(merck，白宫站，新泽西州(merck,white house station,nj))，cep 9722(梯瓦制药，以色列(teva pharmaceuticals,israel))，lt-673(biomarin，圣拉斐尔，ca(biomarin,san rafael,ca))和bsi401(赛诺菲-安万特，巴黎，法国)，其药学上可接受的盐，以及它们的组合。
[0129]
在优选的实施方案中，化学疗法包括给予人类选自以下组成的组中的试剂：吉西他滨，红豆杉醇(泰素)，亚德里亚霉素，异环磷酰胺，曲贝替定，帕唑帕尼，注射用紫杉醇(白蛋白结合型)(紫杉醇纳米粒注射混悬液)(abraxane)，阿瓦斯丁，依维莫司，及其组合。
[0130]
如本文所用，“放射治疗”是指任何治疗方案，其与本发明的诺氏梭菌，例如，诺氏梭菌nt，治疗兼容并在其中放射被递送给对象，例如，人，以用于治疗癌症。放射治疗可通过，例如，机体外的机器(外线束放射疗法(放射治疗))或机体内的放射性物质(近距离放射治疗，全身放射治疗)送至，例如，人对象。
[0131]
外线束放射疗法(放射治疗)包括，但不限于，三维适形放射治疗，强度调节放射疗法(放射治疗)，图像引导的放射治疗，断层放射治疗，立体定向放射外科手术，体部立体定
向放射治疗(stereotactic body radiation therapy)，质子疗法，和其它带电粒子束疗法，如电子束疗法。外线束放射疗法(放射治疗)被广泛用于癌症治疗和是那些本领域技术人员所公知的。
[0132]
近距离放射治疗装置放射治疗通过被植入对象的身体，或放置在对象的身体上而被递送。近距离放射治疗包括但不限于间质短距离放射疗法(放射治疗)，腔内近距离放射治疗，和巩膜上的近距离放射治疗。近距离放射治疗技术也广泛用于癌症治疗和是那些本领域技术人员所公知的。
[0133]
全身放射治疗装置放射治疗通过注射到对象或由对象摄取而被递送。全身放射治疗的一个例子是放射性碘治疗。放射性碘是放射性标记的碘分子，在对象如，例如，人类中安全和有效地使用。根据本发明非限制性的放射性碘的例子可以选自以下组成的组：
123
i,
124
i,
125
i,
131
i,以及它们的组合。优选地，放射性碘是
131
i。
[0134]
如本文所用，“免疫治疗”是指任何抗癌治疗方案，它与本发明的诺氏梭菌，例如，诺氏梭菌nt，治疗兼容，和使用通过增加或减少免疫系统产生抗体或敏化细胞的能力改变免疫应答的物质，所述抗体或敏化细胞识别和与引发其生产的抗原反应。免疫治疗可以是重组的，合成的，或天然的制剂和包括细胞因子，皮质类固醇，细胞毒性剂，胸腺素，和免疫球蛋白。一些免疫治疗是天然存在于体内，和某些这些免疫治疗是在药理学制剂中提供。免疫治疗的实例包括，但不限于，粒细胞集落刺激因子(g-csf)，干扰素，咪喹莫特和来自细菌的细胞膜级分，il-2，il-7，il-12，ccl3，ccl26，cxcl7，和合成的胞嘧啶磷酸盐-鸟苷(cpg)。
[0135]
在优选的实施方案中，免疫治疗包括给予人类免疫检查点抑制剂(checkpoint inhibitor)。如本文中所使用的，“免疫检查点抑制剂”是指一种物质，其阻止参与衰减免疫反应的分子的活性。此类分子包括，例如，细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4(ctla-4)和程序性细胞死亡蛋白质1(pd-1)。本发明的免疫检查点抑制剂包括但不限于，伊匹木单抗(施贵宝(bristol-myers squibb))，曲美木单抗(辉瑞)，mdx-1106(medarex有限公司(medarex,inc.))，mk3475(merck)，ct-011(curetech有限公司(curetech,ltd.))，amp-224(ampimmune)，mdx-1105(medarex有限公司(medarex,inc.))，imp321(immutep sa)和mga271(macrogenics)。
[0136]
在本实施例另一方面中，本发明的诺氏梭菌，例如的，诺氏梭菌nt，治疗有效对抗，例如，实体瘤，所述实体瘤能够抵抗选自以下组成的组中的治疗：化学疗法，放射治疗，免疫治疗，以及它们的组合。
[0137]
在该实施方案的另一个方面，所述实体瘤是标准疗法或实体瘤是没有可用的标准疗法，但本发明的诺氏梭菌，例如，诺氏梭菌nt，治疗可有效对抗此类肿瘤。
[0138]
如本文所使用的，“能够抵抗”和“难治的”可互换使用。对一种疗法而言是“难治的”意味着，与成为能够抵抗治疗之前的同一对象相比，现有的一种治疗或多种治疗在如治疗癌症或杀死癌细胞中功效已降低。
[0139]
如本文所用，术语“标准疗法”是指那些被医疗专业人员普遍接受为适用于治疗特定癌症，优选特别是实体瘤的疗法。对于不同类型的肿瘤标准疗法可以是相同或不同的。标准疗法通常被不同管理机构，如，例如，美国食品和药物管理局认可。
[0140]
在该实施方案的另一个方面，该方法在人类中诱导有力的局部炎症反应和获得性免疫应答。
[0141]
如本文中所使用的，“炎性反应”是对细胞损伤，病原体，或刺激物的局部反应，其可以包括，但不限于，毛细血管扩张，白细胞浸润，肿胀，发红，发热，瘙痒，疼痛，功能丧失和它们的组合。
[0142]
如本文所用，“适应性免疫应答”涉及对象的免疫系统的b和t细胞。在暴露于致病物质，例如，癌细胞后，b细胞可以产生针对致病物质的抗致病抗原的抗体，和t细胞有可能成为能够靶向病原体以用于最终破坏。某些群体的b和t细胞，特异于给定抗原，通过免疫系统被保留并在随后暴露于致病抗原的事件中被召集。适应性免疫应答因此耐用，并且为宿主对象的免疫系统提供了识别和破坏特定致病抗原呈递病原体的持续能力。
[0143]
本发明的另一个实施方案是用于减缩存在于人类的实体瘤体积的方法。此方法包括肿瘤内给予人诺氏梭菌，优选诺氏梭菌nt，cfu的单位剂量，其包括约1x 10
3-1x 107个cfu，所述cfu悬浮在药学上可接受的载体或溶液中。
[0144]
如本文所使用的，“减缩实体瘤体积”意指，减少实体瘤中的癌症的大小或数目。这样的方法是姑息性的，并且可以用于增强治疗的有效性，包括放射疗法(放射治疗)，化学疗法，或截肢。在本实施方案中，实体瘤是如上所述。优选地，所述实体瘤选自由软组织肉瘤，肝细胞癌，乳腺癌，胰腺癌和黑色素瘤组成的组。更优选地，所述实体瘤是平滑肌肉瘤，诸如腹膜后平滑肌肉瘤。
[0145]
本发明的一个附加的实施方案是用于减缩存在于人类的实体瘤体积的方法。此方法包括肿瘤内给予人类一到四个周期的诺氏梭菌nt孢子的单位剂量，其包含约1
×
104个孢子每个周期，诺氏梭菌nt的每个单位剂量悬浮在药学上可接受的载体或溶液中。在本实施方案中，实体瘤的类型如上所述。优选地，所述实体瘤选自由软组织肉瘤，肝细胞癌，乳腺癌，胰腺癌和黑色素瘤组成的组。
[0146]
本发明的另一个实施方案是用于治疗或改善存在于人类的实体瘤的效果的方法。此方法包括肿瘤内给予人类一到四个周期的诺氏梭菌nt孢子单位剂量，其包含约1
×
104个孢子每个周期，诺氏梭菌nt孢子的每个单位剂量悬浮在药学上可接受的载体或溶液中。各种类型的实体瘤如上所述。优选地，所述实体瘤选自由软组织肉瘤，肝细胞癌，乳腺癌，胰腺癌和黑色素瘤组成的组。
[0147]
本发明的另一个实施方案是用于消融人类中存在的实体瘤的方法。此方法包括肿瘤内给予人诺氏梭菌，优选诺氏梭菌nt cfu的单位剂量，其包含约1
×
10
3-1
×
107个cfu，所述cfu悬浮在药学上可接受的载体或溶液中，其中所述肿瘤被消融至留下正常组织的边缘。
[0148]
如本文所用，“消融”实体瘤意味着该过程中除去所有的实体瘤。在此过程中，进行治疗后，正常组织边缘被留下，从而环绕其中肿瘤曾经滞留的区域。在本实施方案中，实体瘤的类型如上所述。优选地，实体瘤是肉瘤。更优选地，所述实体瘤是平滑肌肉瘤，诸如腹膜后平滑肌肉瘤。
[0149]
本发明的另一个实施方案是诺氏梭菌cfu的单位剂量。此单位剂量包含在药学上可接受的载体或溶液中的约1
×
10
3-1
×
107个cfu，这是有效用于治疗或改善存在于人类的实体瘤的效果。如上所述，诺氏梭菌cfu可以是营养和孢子的形式。
[0150]
在该实施方案的一个方面，诺氏梭菌为诺氏梭菌nt。优选地，单位剂量在药学上可接受的载体或溶液中包含约1
×
10
4-1
×
107个诺氏梭菌nt孢子，例如约1
×
10
6-1
×
107个诺氏梭菌nt孢子。优选地，单位剂量在药学上可接受的载体或溶液中包含约1
×
104个诺氏梭
菌nt孢子。
[0151]
本发明的附加的实施方案是用于治疗或改善存在于人类的实体瘤的效果的试剂盒。这种试剂盒包含含有在药学上可接受的载体或溶液中的约1
×
10
3-1
×
107个cfu的诺氏梭菌cfu的单位剂量和试剂盒使用说明。所述试剂盒可以被划分成一个或多个隔室，并且可以具有一个或多个容器，所述容器用于各种试剂。所述试剂盒可进一步适于支持存储和装运各组分。
[0152]
在该实施方案的一个方面，所述试剂盒还包含一种或多种抗生素，所述抗生素有效治疗或减轻因诺氏梭菌cfu产生的不良副作用。该cfu可能是营养或孢子形式。合适的抗生素如上述。优选地，该试剂盒还包括1-4个单位剂量诺氏梭菌，其用于进行1-4个治疗周期。
[0153]
在该实施方案的另一个方面，诺氏梭菌为诺氏梭菌nt。优选地，单位剂量在药学上可接受的载体或溶液中包含约1
×
10
4-1
×
107个诺氏梭菌nt孢子，例如约1
×
10
6-1
×
107个诺氏梭菌nt孢子，或约1
×
104个诺氏梭菌nt孢子。同样优选地，试剂盒还包括1-4个单位剂量诺氏梭菌nt孢子，其用于进行1-4个治疗周期。
[0154]
本发明的另一个实施方案是用于在人中通过显微镜精确切除肿瘤细胞的方法。此方法包括肿瘤内给予人诺氏梭菌nt菌落形成单位(cfu)的单位剂量，所述单位剂量包括约1
×
10
3-1
×
107个cfu，所述cfu悬浮在药学上可接受的载体或溶液中。
[0155]
如本文所用，“过显微镜精确切除”是指消除对象的靶组织，例如，病原性组织，所述消除在细胞水平基本上对致病组织是特异性的，同时使对附近的“健康“组织的损害最小或无损害。消除目标组织可以是，但不限于，细胞凋亡，坏死，和细胞裂解。此实施方案可通过使用，例如，尖端分叉的递送装置，诸如尖端分叉的针的ct引导瘤内注射精密递送，例如，本发明的诺氏梭菌nt孢子来实现。
[0156]
另外，在本发明中，诺氏梭菌孢子，如诺氏梭菌nt孢子以任何医药上合适的方式肿瘤内递送给对象，例如，人患者。例如，可通过在肿瘤的一个或多个部位使用单一的针递送诺氏梭菌nt孢子。可替代地，多叉的递送媒介物，如多叉的针，可以用于递送，例如，诺氏梭菌nt孢子，至肿瘤。例如，孢子的递送可以是达到在肿瘤中的一个或多个部位的同一或多个深度。所选择的递送媒介物可以通过手动操作或电子控制。所述递送媒介物可通过手动或远程控制的设备而被定位和/或重新定位在或肿瘤内，和注射部位的可视化可以使用本领域中已知的各种成像技术，如ct成像被增强。可以在本发明中可以使用的多叉的递送媒介物包括在，例如，mcguckin，jr.等人，美国专利号6905480和7331947中公开的那些，所述专利在此引入作为参考。
[0157]
本发明的另一个实施方案是用于治疗或改善已转移到人中的一个或多个部位的实体瘤的效果的方法。此方法包括肿瘤内给予人诺氏梭菌nt菌落形成单位(cfu)的单位剂量，所述单位剂量包括至少约1
×
10
3-1
×
107个cfu，所述cfu悬浮在药学上可接受的载体或溶液中。优选，转移的至少一个部位是远离原始实体瘤。
[0158]
如本文所用的“转移”及其语法变体是指病原性细胞，即肿瘤细胞，从机体的原始的，原发区域的扩散到机体的继发区域。转移可以是区域性或远端的，这取决于与原始原发肿瘤部位的距离。转移是否是区域性或远端的(regional or distal)可以由医师确定。例如，已经扩散到大脑的乳腺癌是远端的，而乳腺癌细胞扩散到腋下淋巴结是区域性的。
[0159]
在本发明中，本文中公开的化合物或组合物的“有效量”或“治疗有效量”是这样的化合物或组合物给予对象时足以实现如本文描述的有益或期望结果的量。有效的剂型，给药方式，剂量的量如本文公开或由医疗专业人员进行修改。由本领域技术人员理解的是，该剂量的量将随给药途径，排泄速率，治疗的持续时间，任何其它给药的药物的认定，患者的年龄和大小，和药物领域中公知的类似因素而变化。在一般情况下，根据本发明的组合物合适的剂量将是组合物有效产生所期望的效果的最低剂量的量。本发明的组合物的有效剂量如上所述。另外，本发明的组合物可以与其他治疗结合给药。
[0160]
本发明的组合物包含一种或多种活性成分，所述一种或多种活性成分与一种或多种药学上可接受的载体和任选的一种或多种其它化合物，药物，成分和/或材料混合。无论选择何种给药途径，本发明的试剂/化合物通过本领域的那些技术人员已知的常规方法配制成药学上可接受的单位剂量形式。见，例如，雷明顿，药学科学与实践(第21版，利平科特
·
威廉姆斯和威尔金斯，费城，宾夕法尼亚州)(remington,the science and practice of pharmacy(21
st edition,lippincott williams and wilkins,philadelphia,pa.))。
[0161]
药学上可接受的载体或溶液是众所周知的(参见，例如，雷明顿，药学科学与实践(第21版，利平科特
·
威廉姆斯和威尔金斯，费城，宾夕法尼亚州)和国家处方集(美国药物协会，华盛顿特区(american pharmaceutical association,washington,d.c.))，并包括糖(例如，乳糖，蔗糖，甘露醇和山梨糖醇)，淀粉，纤维素制剂，磷酸钙(例如磷酸二钙，磷酸三钙和磷酸氢钙)，柠檬酸钠，水，水溶液(例如，盐水，氯化钠注射液，林格氏注射液，葡萄糖注射液，葡萄糖和氯化钠注射液，乳酸林格氏注射液)，醇(例如，乙醇，丙醇，苄醇)，多元醇(例如，甘油，丙二醇，和聚乙二醇)，有机酯(如油酸乙酯和甘油三酯类(tryglycerides))，可生物降解的聚合物(例如，聚交酯-聚乙交酯或盐，聚(原酸酯)，和聚(酸酐))，弹性体基质，脂质体，微球，油(例如，玉米油，胚芽油，橄榄油，蓖麻油，芝麻油，棉籽油，和花生油)，可可脂，蜡(例如，栓剂蜡)，石蜡，硅酮，滑石，silicylate等根据本发明的单位剂量中使用的每个可药学上可接受的载体或溶液必须是“可接受的”，意思是与制剂的其它成分相容和不损害对象。适于所选剂型和预期给药途径的载体或溶液，例如，it，是本领域公知的，并且用于所选择的剂型和给药的方法的可接受的载体或溶液可通过使用本领域普通技术来确定。
[0162]
本发明的单位剂量可任选地包含药物组合物中常用的其他成分和/或材料。这些成分和材料是现有技术公知的，包括(1)填充剂或增量剂，如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇，和硅酸；(2)粘合剂，如羧甲基纤维素，藻酸盐或酯，明胶，聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基甲基纤维素，蔗糖和阿拉伯胶；(3)保湿剂，例如甘油；(4)崩解剂，如琼脂-琼脂，碳酸钙，马铃薯或木薯淀粉，藻酸，某些硅酸盐或酯，淀粉羟乙酸钠，交联羧甲基纤维素钠和碳酸钠；(5)溶解阻滞剂，如石蜡；(6)吸收促进剂，如季铵化合物；(7)润湿剂，如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，如高岭土和膨润土粘土；(9)润滑剂，如滑石，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，和月桂基硫酸钠；(10)悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇，聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯，微晶纤维素，偏氢氧化铝，膨润土，琼脂和黄蓍胶；(11)缓冲剂；(12)赋形剂，例如乳糖，奶糖，聚乙二醇，动物和植物脂肪，油，蜡，石蜡，可可脂，淀粉，黄蓍胶，纤维素衍生物，聚乙二醇，硅酮，膨润土，硅酸，滑石，水杨酸盐或酯，氧化锌，氢氧化铝，硅酸钙，和聚酰胺粉末；(13)惰性稀释剂，例如水或其他溶剂；(14)防腐剂；(15)表面活性剂；(16)分散剂；(17)控制释放或吸收延迟剂，如羟丙基甲基纤维素，其它聚合物基质，可生物降解的聚合物，脂
质体，微球体，单硬脂酸铝，明胶，和蜡；(18)遮光剂；(19)辅料；(20)润湿剂；(21)乳化剂和悬浮剂；(22)，增溶剂和乳化剂，如乙醇，异丙醇，碳酸乙酯，乙酸乙酯，苄醇，苯甲酸苄酯，丙二醇，1,3-丁二醇，油(特别是棉籽油，花生油，玉米油，胚芽油，橄榄油，蓖麻油和芝麻油)，甘油，四氢呋喃醇，聚乙二醇和脱水山梨醇脂肪酸酯；(23)推进剂，例如氯氟烃和挥发性未取代烃，如丁烷和丙烷；(24)抗氧化剂；(25)试剂，其使制剂与预期接受者的血液等渗，例如糖和氯化钠；(26)增稠剂；(27)涂层材料，例如卵磷脂；和(28)甜味剂，调味剂，着色剂，芳香剂和防腐剂。每个这样的成分或材料必须是在与制剂的其它成分相容和不损害对象的意义上“可接受的”。适于所选剂型和预期给药途径的成分和材料是本领域熟知的，并且用于选定剂型和给药方法的可以接受的成分和材料可以使用普通的技术来确定。
[0163]
液体剂型包括可药用乳液，微乳液，液体和悬浮液。液体剂型可以含有在本领域中常用的合适的惰性稀释剂。除了惰性稀释剂，口服组合物也可包括辅料，如润湿剂，乳化剂和悬浮剂，着色剂和防腐剂。悬浮液可以含有悬浮剂。
[0164]
肿瘤内给药的剂型包括溶液，分散体，悬浮液或乳剂，或无菌粉末。活性剂/化合物可以与合适的药学上可接受的载体在无菌条件下混合。
[0165]
本发明单位剂量可以可选地包括一种或多种活性剂，例如，诺氏梭菌cfu或诺氏梭菌nt孢子，其与无菌粉末组合，所述粉末可在使用前被重新构建成无菌可注射溶液或分散体，所述粉末可以含有合适的抗氧化剂，缓冲剂，使制剂与预定接受者的血液等渗的溶质，或悬浮剂或增稠剂。例如，通过使用包衣材料，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，适当的流动性可以被维持。这些组合物也可含有合适的辅料，如润湿剂，乳化剂和分散剂。也可能希望的是包含等渗剂。此外，可注射药物形式的延长吸收可以通过包含延迟吸收的试剂来实现。
[0166]
瘤内注射的储库形式可以通过形成生物可降解聚合物中的活性成分的微囊化基质来制备。根据活性成分与聚合物的比例，以及所用特定聚合物的性质，活性成分的释放速率可以得到控制。储库注射制剂也可以通过将活性剂包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中而制备。
[0167]
如上所述，制剂可存在于单位剂量或多剂量密封的容器中，例如，安瓿和小瓶，并且可以存储在冷冻干燥条件下，其仅需要在使用前立即加入无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可以由上述类型的无菌粉末，颗粒和片剂制备。
[0168]
提供了以下实施例以进一步说明本发明的方法。这些实施例仅是说明性的并且不旨在限制本发明在任何方面的范围。
实施例
[0169]
实施例1
[0170]
组合诺氏梭菌nt的静脉内(iv)给药与放射
[0171]
进行在采用外线束放射治疗后的自发性肿瘤犬中诺氏梭菌nt孢子单一iv给药(剂量)的研究。
[0172]
诺氏梭菌nt孢子的制造及最终制剂是由约翰霍普金斯开发实验室根据以下方法进行。根据dang等人，2001产生的诺氏梭菌nt孢子接种到丰富孢子形成培养基，并在37℃在厌氧室中培养17-19天。孢子通过顺序连续的percoll梯度离心随后广泛磷酸盐缓冲盐水洗
涤而纯化。孢子保存在2-8℃。孢子在装运前制备，悬浮在无菌的磷酸盐缓冲盐水和稀释在50毫升0.9％的氯化钠中。
[0173]
诺氏梭菌nt孢子重新溶解在50ml的生理盐水袋和过夜递送到测试部位。经由20份递送了大约为54gy的放射剂量：诺氏梭菌nt静脉注射前11份，注射后9份。单次注射给药诺氏梭菌nt孢子，采用1
×
109个孢子/m2的剂量，根据体表面积。在具有不渗透衬垫的吸收垫上将孢子转移于注射器。22号针头与3路开关连接并插入囊中。封闭的化学疗法系统(onguard
tm
，teva医疗设备有限公司)的插入式配件部分附着在开关的端口。完整的内容物从袋取而放入60立方厘米(cc)的注射器，其附着有在封闭系统的凹形部分。在15分钟内将孢子通过iv导管注射到各对象，导管附着有化学疗法封闭系统的插入式配件。输注之后是10毫升盐水冲洗。输注后对象如下被密切监视6小时：第一个60分钟每15分钟监测生命体征，血压，和氧饱和度，然后在接下来的60分钟每30分钟监测，然后在接下来的120分钟每60分钟监测。每60分钟进行后续检查，共6小时。
[0174]
试验对象住院以进行最初的3个星期的治疗：2周的放射治疗，和诺氏梭菌nt iv治疗1周。治疗后长达6个月，在第1，2，3，和6月进行随后后续访问。样品治疗时间表见表1和2。
[0175]
[0176]
[0177][0178]
截至2012年，9月10日，五只狗以这种方式进行治疗。五只中，2只发展一个脓肿，1只保持病情稳定，2只死亡或被安乐死。在整个治疗中拍摄该发展脓肿两只测试对象，如图
1a和1b。
[0179]
图1a示出治疗过程中位于右侧远端桡骨/尺骨的犬骨肉瘤。测试对象，莎莎(sasha)，在第3天表现出发热和肿胀与在第6天表现出突发脓肿。第8天由于开放性伤口开始抗生素，和之后，坏死骨和组织被除去。莎莎完成了19个放射治疗中的12个，在2012年9月10号，被治愈，病情稳定。
[0180]
图1b还示出在治疗过程中位于右侧远端桡骨/尺骨的犬骨肉瘤。对象，桑普森(sampson)，在第5天表现出发热和肿胀。在第6天，脓肿被切开和启动抗生素。桑普森完成了20个放射治疗中的14个，在2012年9月10号，被治愈，病情稳定。
[0181]
其他对象，chipper，贝利(bailey)和ruskin，表现出不同的结果。chipper带有左下颌的鳞状细胞癌。在治疗的过程中，chipper在肿瘤部位已肿胀和接受20个放射治疗中的20个。截至9月10日，2012年，chipper病情稳定。
[0182]
另一个对象，贝利，表现为具有左腋窝区域的软组织肉瘤。在治疗过程中，贝里去世了，其经历了败血症，急性肾功能衰竭，潜在的弥漫性血管内凝血，心跳骤停。然而，尸检显示肿瘤内的所有坏死的组织，没有肿瘤细胞。
[0183]
剩下的对象，ruskin，表现为具有右肱骨近端骨肉瘤。在治疗过程中，ruskin有肿瘤部位的肿胀，并完成了20/20放射治疗。然而，第30天，肿瘤部位产生大量脓性物质和ruskin经历肾功能衰竭。当肾功能状况没有改善时，所有者决定安乐死。截至2012年9月10日，尸检结果仍悬而未决。
[0184]
实施例2
[0185]
it注射的诺氏梭菌-nt孢子大鼠中特异性靶向肿瘤组织和延长生存在-方法
[0186]
细胞系和组织培养
[0187]
通过荧光素酶构建体转染的大鼠f98胶质瘤细胞系被维持在dulbecco改进的eagle培养基(dmem)，其补充有10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素和链霉素。
[0188]
大鼠实验
[0189]
6周岁雌性f344 fisher大鼠(体重100-150克)，从美国国家癌症研究所购买。对于植入过程，通过腹膜内(ip)注射在无菌的nacl(0.9％)溶液中的盐酸氯胺酮(75毫克/千克；100毫克/毫升的hcl氯胺酮；阿博特实验室)，甲苯噻嗪(7.5毫克/千克；100毫克/毫升xyla-ject；菲尼克斯制药，伯林格姆，ca)，和乙醇(14.25％)，麻醉雌性f344 fisher大鼠。f98胶质瘤细胞(2
×
104)通过钻孔被立体定位植入位于前囟的3毫米横向和2mm前方的右额叶，如(bai等人，2011)之前所述。肿瘤大小通过xenogen仪器评估，在肿瘤细胞植入后12天采用ip注射8毫克/大鼠d-萤光素钾盐。随后，3百万诺氏梭菌-nt孢子，如先前所述产生(dang，等人，2001年，bettegowda，等人，2006)，被使用如上所述相同的坐标而立体定位注射到颅内肿瘤，并且前2天采用10mg/kg/天ip地塞米松治疗大鼠。按照约翰霍普金斯大学动物护理和使用指南，每日观察动物是否有恶化，嗜睡，神经毒性，或疼痛的任何迹象。如果痛苦的症状存在，采用水化和强力霉素(15毫克/公斤的ip负荷剂量，随后为10mg/kg的每12小时的维护)的支持疗法被引发并继续一个7天的时期。如果症状持续存在和/或导致虚弱，奄奄一息的动物被安乐死。采用kaplan-迈耶存活曲线评估it注射诺氏梭菌-nt孢子的有效性，以及对脑切片的剩余的肿瘤负荷。对于后者，死后收集大脑，置于甲醛中，并包埋在石蜡中，以用于额外病理学研究。革兰氏染色的载玻片，反染色番红，和h&e-载玻片按照标准程序准则获
得。
[0190]
统计分析
[0191]
通过使用graphpad prism v.5.00(格拉夫派得软件，圣地亚哥，ca)的曼特尔-cox检验创建与分析kaplan-meier生存曲线。
[0192]
实施例3
[0193]
it注射诺氏梭菌-nt孢子在大鼠中特异性靶向肿瘤组织和延长生存-结果
[0194]
晚期的神经胶质瘤全手术切除几乎总是不可能的，这些肿瘤无情地复发。虽然这种肿瘤类型一般不发生转移，没有可能用于治疗它的非常有效的药物治疗。因此神经胶质瘤似乎代表一个肿瘤类型，对于所述肿瘤类型局部注射诺氏梭菌-nt孢子可以是治疗上有用的。为了评估这种可能性，f98大鼠神经胶质瘤细胞原位植入6周龄f433 fisher大鼠，导致局部侵袭性肿瘤迅速成为致命的(图2a)。it注射诺氏梭菌-nt孢子进入这些大鼠的肿瘤导致在24小时内其发芽和在荧光素酶活性方面在24-48小时内迅速下降，荧光素酶活性是肿瘤负荷的指示物，(图2b和2c)。诺氏梭菌-nt发芽由细菌的营养形式的出现证明。引人注目的是，诺氏梭菌-nt精确地定位于肿瘤，不影响只相距几微米的距离的相邻正常细胞(图3a和3b)。而且，可以看到，这些营养细菌在微侵袭肿瘤细胞的岛内特异性生长并同时破坏微侵袭肿瘤细胞的岛，所述微侵袭肿瘤细胞埋在正常脑实质内(图4a和4b)。在这个非常侵袭的鼠模型中，这种细菌生物外科(biosurgery)导致显著的生存优势(图2a，p-值《0.0001)。
[0195]
例4
[0196]
犬软组织肉瘤类似于人类的肿瘤-方法
[0197]
用于测序的基因组dna分离
[0198]
根据制造商的协议，使用所述的qiaamp dna迷你试剂盒(qiagen，瓦伦西亚，ca)，从外周血淋巴细胞(pbls)和福尔马林固定，石蜡包埋的肿瘤组织提取来自参与it诺氏梭菌-nt孢子的比较研究的犬的基因组dna。
[0199]
测序和生物信息学分析
[0200]
肿瘤和正常样品的基因组净化，库建设，外显子组(exome)捕获，新一代测序和生物信息学分析在个人基因组诊断(pgdx，马里兰州巴尔的摩市(pgdx,baltimore,md))进行。简言之，来自肿瘤和正常样品的基因组dna被片段化并用于illumina truseq文库构建(illumina公司，圣地亚哥，ca)。外显子区域是根据制造商的说明(安捷伦，圣克拉拉，ca)，使用安捷伦犬所有外显子试剂盒被捕获在溶液中。配对末端测序，产生来自所述片段的每个末端的100个碱基，是使用hiseq 2000基因组分析仪(illumina公司，圣地亚哥，ca)进行。使用casava 1.7软件的伊兰算法(canfam2.0)(illumina公司，圣地亚哥，ca)使该标签对准于犬参考序列。illumina公司的basecall软件的纯洁滤波器用来选择用于随后分析的序列读数。casava 1.7软件的eland算法(illumina公司，圣地亚哥，ca)然后用于鉴定点突变，小的插入和缺失。记录在dbsnp131(canfam2.0)的已知多态性从分析中除去。潜在的体细胞突变被过滤，如先前所描述的(jones等人，2010)进行目视检查。
[0201]
例5
[0202]
犬软组织肉瘤类似于人类的肿瘤-结果
[0203]
抗癌药物临床前动物研究往往不重述人中所观察到的效果。然而，在狗中，临床使
用的治疗剂诱导相似于人的毒性和效果(paoloni，等人，2008)。研究性治疗犬研究可以代表临床前动物实验和人体临床研究之间的重要桥梁。特别是，犬软组织肉瘤是一个极好的模型，因为它们是狗许多品种中常见的，并有显著接近于人体软组织肉瘤的临床和组织病理学特征(paoloni，等，2008年，韦尔，等人，2000年)。然而，虽然在基因组学的最新进展显著扩大了人癌症遗传学的认识，相对鲜为人知的是，犬癌症的遗传景观。因此，为了确定犬的肿瘤是否在遗传上类似于人类的，来自参与比较研究的11只犬肿瘤的外显子组和匹配的正常dna被进行测序(图5)。该分析涉及包括dna的32.9个兆碱基(megabases)(mb)的30194个额定基因的考察。狗中有10只具有软组织肉瘤(六只外围神经鞘瘤)和一只有软骨母细胞性骨肉瘤。平均来说，生成的序列的15.7亿碱基(gigabases)(gb)(范围：8.1-23.3gb)被映射到基因组中，并在目标区域92.1％碱基被至少10个肿瘤的dna独特的读数覆盖。类似地，平均16.3gb(范围：14.6-19.7gb)的序列被映射到在正常的dna中的基因组，目标碱基的93.6％被至少10个的不同读数所涵盖。肿瘤中每个目标碱基的平均覆盖率为153倍(范围：73-227倍)，并在匹配的正常样本中为152倍(范围：130-178倍)。
[0204]
使用严格的分析标准，10个软组织肉瘤中156个体细胞突变和28个体细胞拷贝数的改变被确定(表3和图6)。体细胞突变的范围为0～95，平均值是14个每个肿瘤。在软组织肉瘤中突变发生率低，平均为0.47每mb(范围：0.00-2.89每mb)。排除一个样本异常值，采用95个体细胞改变，平均发病率是0.21突变每mb(范围：0.00-0.61每mb)(图5)，类似于在人类儿科横纹肌样瘤(lee等人，2012)和其他软组织肉瘤(约瑟夫等人，2013年(joseph,et al.,2013))的突变率的估计。体细胞改变的最常见的类型是错义突变，占优势的是c至t(45.5％)和g至a转换(34.0％；表4a和4b)。
[0205]
[0206]
[0207]
[0208]
[0209]
[0210]
[0211]
[0212]
[0213]
[0214]
[0215]
[0216]
[0217]
[0218]
[0219]
[0220][0221]
表4a
[0222]
体细胞变化类型跨越犬软组织肉瘤观察
[0223][0224]
indels
–
插入和缺失；cna-拷贝数的变化
[0225]
表4b
[0226]
犬软组织肉瘤中的体细胞突变型
[0227]
体细胞改变的类型数量百分比1bp缺失31.93bp缺失10.61bp缺失10.6a:t》c:g31.9a:t》g:c42.6a:t》t:a31.9c:g》a:t42.6c:g》g:c21.3c:g》t:a7145.5g:c》a:t5334.0g:c》c:g31.9g:c》t:a42.6t:a》a:t10.6t:a》c:g10.6t:a》g:c21.3总的156100
[0228]
扩增和缺失均较少见，平均为3个每肿瘤(范围：0-17)(图5)。10个软组织肉瘤的七个无扩增或缺失。软骨细胞瘤外显子组类似于软组织肉瘤外显子组，其中14个体细胞突变和4个扩增(表3和图6)。
[0229]
单碱基置换在4种肿瘤抑制基因中被确定，所述肿瘤抑制基因在人类肿瘤中被频繁突变(nf1，mll3，tp53，和ptch1)。此外，mdm4，在人类癌症中已经显示出被扩增而不是点突变的癌基因，在犬肿瘤中被发现被扩增(但不是点突变的)(lee等，2012，barretina，等，
2010年，chmielecki，等人，2013年，沃格尔斯坦，等人，2013年)。突变在一个以上的肿瘤中突变的独特基因是atp7b(在两种肿瘤中错义突变)和aig1(在两种肿瘤中扩增)。有趣的是，也发现了在人类脂肪肉瘤(约瑟夫等人，2013年)中atp7b突变。犬肿瘤中184个体细胞突变中的二十二个出现在基因中，其先前被显示于人体软组织肉瘤中被突变(表5)。
[0230]
表5基因突变在人类和犬类癌症
[0231][0232][0233]
将需要在这两个物种中的软组织肉瘤的更大规模的研究，以确定是否这些代表驱动突变，所述突变表示重要，保守致瘤性途径。无论如何，在遗传改变数目和突变谱的方面，犬肿瘤的遗传景观是类似于人类。具体地讲，他们排除以下可能，犬肿瘤有非常大的数目的突变，所述非常大的数目的突变可能使它们比人类中类似的肿瘤类型更可能发动免疫应答。
[0234]
实施例6
[0235]
肿瘤内(it)给予诺氏梭菌nt-研究1方法
[0236]
为了研究本发明的方法的安全性和有效性，在自发产生的实体瘤的16只犬中进行了比较研究(表6)。
[0237]
[0238][0239]
于参与动物临床肿瘤学研究网络(aci，华盛顿特区)的多个地点招收狗(犬)和在招收之前获得主人的书面知情同意书。治疗，管理和研究评价是由委员会认证的兽医肿瘤
学家监督。针对给客户拥有的犬进行招收，所述犬具有自发性实体瘤并优先具有软组织肉瘤，所述犬已无法采用标准疗法或它的所有者已经减少这种疗法。参与被限制在荷瘤犬，其具有1和7厘米之间的最长直径的目标病变。具有位于脓肿发展将是灾难性的区域中的肿瘤(例如，鼻肿瘤，其扩展到脑或显著肺转移性疾病)的狗被排除在研究之外。
[0240]
具有要求诺氏梭菌-nt孢子治疗七天内全身抗生素治疗或21天内的癌症疗法(化学疗法，放射疗法(放射治疗)，和免疫治疗)活性细菌感染的证据的狗均不合格。狗被要求为具有0或1(表7)的表现得分和将可用于招收的研究的全部持续时间。禁止同时使用抗癌药物和参与其他临床试验。怀孕或可能怀孕的狗不包括在这项研究。同样，不能用于整个研究持续时间的狗，和被研究者或医务主任认为不适合研究招收的狗没有包括在研究中。
[0241]
表7表现状态的评估
[0242][0243]
在筛选访问期间，每只犬被分配至一个独特的研究的狗识别号码，包括5位数字代码(可能没有连续按照筛选狗的数量)。前2位数字表示研究现场(01至99)，中间的数字表示该研究'r'，最后2位数字描述的研究地点(01～99)内研究狗的数量。例如，被招收于地点9的第11个狗被分配为研究狗数字09-r11。研究狗的数字是按顺序时间顺序分配的，所述顺序是于给定的研究地点狗被招收的顺序。狗当它符合纳入和排除标准时，被认为是被招收入这项研究。
[0244]
根据食品和药物管理局的工业185cvm指南进行总病理和组织病理学。在尸检中，针对总病理和病理组织学对下面的组织(表8)进行了评估，并且在尸检报告中描述前述评估。收集具有总异常的脑，心脏，肺，肝，脾，肾，肌肉，骨，小肠，大肠和与任何组织样本以用于微生物学。
[0245]
表8
[0246]
由总病理和组织病理学检查的组织名单
[0247]
脑垂体脑骨和骨髓甲状腺脊髓骨髓涂片甲状旁腺眼睛脾肾上腺肺脏胃胰腺肌肉十二指肠卵巢乳腺空肠
子宫肝回肠睾丸胆囊结肠前列腺肾盲肠附睾膀胱胸腺心脏淋巴结注射部位脑室皮肤任何不正常的组织
[0248]
所有的狗从第0天(天0)(d0)到第4天(d4)(天4)住院，和然后任选在每个后续治疗后(根据研究者的判断)住院24至48小时以进行临床观察。在诺氏梭菌nt治疗后在住院过程中将输液(流体)给予所有的研究狗。在给药(给予)天，所有的狗被以4ml/kg/hr静脉内(iv)给予类晶体2小时。每个it注射诺氏梭菌-nt孢子后狗被密切监视六小时。在下次访问时(4天后)所有的狗都皮下(sq)给予类晶体20毫升/公斤。如果狗被住院和要被给予sq类晶体的天接受iv类晶体，没有必要给sq剂量。
[0249]
研究访问和事件总结于表9，为4剂量治疗方案的一个例子。如果狗要采用重复给药治疗，该给药间隔被建议为每周。由于因不良事件或研究者的决定，针对在研究的过程中发生的重复给药，延迟治疗。
[0250][0251]a筛选评价在治疗前1-14天进行.b患治疗后监测者6小时。治疗后第1小时每15分钟，治疗后第2小时每30分钟和治疗后第3-6小时每60分钟，作出评估。c实验室值包括：全血细胞计数，血清生化评价，凝血酶原时间，凝血酶原时间和尿检。(x)-研究者的决定。d诊断
成像包括：放射线照片，超声检查或计算机体层摄影术。e在4ml的/kg/小时的类晶体，两小时.f类晶体在20毫升/公斤.g下面的研究完成后，如果要求全身抗生素来管理不良事件，建议的是将强力霉素5～10毫克/公斤口服给予狗，每日两次(po bid)，持续3个月.
[0252]
十六只狗，9只阉割的雄性，1只整个(完整的)雄性，6只绝育的雌性，分别被招收入所述研究。(表6)。他们的人群和肿瘤的特点列于表6。已招收的病例表现出多样的品种，重量和年龄。病例被先前诊断患有自然发生的癌症，其代表各种组织学起源：13只狗具有软组织肉瘤的诊断(81.3％)，1只骨肉瘤(6.3％)，1只黑素瘤(6.3％)和1只肥大细胞瘤(6.3％)。13只软组织肉瘤中，11只可供组织学类型，其中包括：4只血管外皮细胞瘤(30.8％)，3只周围神经鞘瘤(23.1％)，1只滑膜细胞肉瘤(7.7％)，1只粘液肉瘤(7.7％)，1只横纹肌肉瘤(7.7％)和1只纤维肉瘤(7.7％)。在试验的狗平均体重为29.4千克(范围8.1-44.3千克)和他们的平均年龄为10.9岁(范围：7.2-14.3岁)。十三只狗具有软组织肉瘤的诊断，和各一只有骨肉瘤，恶性黑色素瘤，肥大细胞瘤的诊断。13只软组织肉瘤中，六只可供免疫组织化学(ihc)。针对平滑肌肌动蛋白，所有六只对s100呈阳性和呈阴性，这表明肉瘤亚型的诊断称为外周神经鞘肿瘤。肿瘤中的七只是i级，五只是ii级，四只是iii级。八只犬之前已经有过手术治疗的癌症。
[0253]
诺氏梭菌-nt孢子的制备和将其it注射入自发犬肿瘤
[0254]
如前所述制作在对比犬研究中使用的诺氏梭菌-nt孢子(dang，等人，2001年，bettegowda，等，2006)。简言之，细菌培养于孢子形成培养基，持续至少两周，以确保成熟孢子最大产量。成熟孢子，通过两个连接的，连续的percoll梯度随后洗涤四次，并重新悬浮在pbs中纯化。根据fda 21cfr610.12准则通过在大豆酪蛋白消化培养基和硫乙醇酸盐培养基培养产品，进行最终产品的无菌试验(尼尔森实验室，盐湖城，ut)。在厌氧条件，在布鲁氏琼脂上，用5％马血进行发芽效率测定，以确保孢子满足预设有活力标准。孢子被包装在无菌1.8毫升冷冻管，其具有o环圈密封螺旋盖(simport，贝来尔，加拿大)，采用1000微升体积和1
×
10 9
个孢子/毫升诺氏梭菌-nt的浓度，冷冻管保存在2-8℃。为了给药(给予)，储备孢子液0.4毫升的等分部分包装入0.5毫升冷冻管。给药后，根据用于处理生物安全等级2的材料丢弃适用的法规，丢弃冷冻管和未使用的诺氏梭菌-nt孢子。it注射之前，用旋涡重新悬浮孢子，在最大速度下混合10秒，共三次，之后被抽出到1ml的注射器。注射部位是无菌制备。如果可用，超声或计算机断层扫描(ct)被用来确定肿瘤的坏死区域。如果坏死区域没有确定，注射是针对肿瘤的中心。将针一次插入进入预定义区域和100μl的孢子悬浮液(1
×
108个诺氏梭菌-nt孢子)用均匀的压力进行分配。注射针被慢慢除去和对注射部位进行消毒。所有的狗接受至少1个周期的在100μl的生理盐水中的1
×
108个孢子(生物外科)的it剂量：3只狗接受单次治疗周期，13只狗接受多于1和最多4个的治疗周期。狗可以接受多达4个周期的生物外科，周期之间为一周的时间间隔。第一个it注射后跟踪治疗的狗至少90天。当可以获得时，保证针对疾病进展及生存的扩展随访。由于毒性或疾病进展允许提前退出研究。
[0255]
如表9中描述进行研究评价。在所述生物外科的第一个周期之前1至14天进行了预筛选评价。在研究期间在住院和门诊的基础上定期监测狗。如表9所定义的进行实验室取样和包含全血细胞计数，血清生物化学，凝血酶原时间，部分凝血活酶时间，和尿分析。在筛选进行成像和包括区域ct，胸部放射线照相术和腹部超声检查。可以根据研究者的判断在研究中进行额外的影像。
[0256]
在可能情况下，使用兽医合作社肿瘤组-不良事件通用术语标准(veterinary co-operative oncology group
–
common terminology criteria for adverse events)(vcog-ctcae)v1.0(兽医合作社肿瘤组，2004年)(veterinary co-operative oncology group,2004)对不良事件进行了评价，采用来自药物相关事务兽医字典(veddra)4版(欧洲药品管理局，2012)的术语。涉及诺氏梭菌-nt发芽的不良事件(目标病变反应)的术语在表10中定义。没有适当veddra或目标病变反应术语的临床观察被分别归类为未编码的征兆(表11)。与诺氏梭菌-nt治疗的关系由报告研究者确定。
[0257]
表10
[0258]
编码的术语用于描述与诺氏梭菌-nt活性相关的肿瘤不良事件
[0259][0260]
表11
[0261]
针对潜在临床实体或诺氏梭菌-nt相关的目标病变反应不能归因于
[0262]
veddra的征兆
[0263]
[0264]a研究者报告的血嗜酸性粒细胞iv级减少。
[0265]
目标(注射的)病变最长直径肿瘤测量在治疗后第0天，第7天，第14天，第21天，第60天及第90天(表9)进行。非目标和新的病变被记录，但没有被测量。在21天的研究访问或之后对最佳的总体目标响应进行了评估：完全响应(cr)定义为目标病变完全消失；部分响应(pr)定义为目标病变的最长直径的至少30％减小；和进行性目标疾病(pd)定义为目标病变的最长直径的至少20％增加或新非目标病变的出现。稳定的疾病(sd)定义为目标病变的最长直径降低或增加不足以认定为cr，pr，或pd。在诺氏梭菌-nt相关脓肿的情况下，坏死组织的医疗或清创手术是由研究者斟酌。
[0266]
手术样品和尸检评价都是由委员会认证的兽医病理学家进行。组织样品固定在10％中性缓冲的福尔马林并包埋于石蜡中。根据标准程序准则制备用于评估革兰氏染色的用h&e染色的载玻片和或载玻片。为了免疫组织化学(ihc)，福尔马林固定的，石蜡包埋的肿瘤组织以5微米切开，在二甲苯脱蜡，并通过分级的醇水化。使用去掩蔽溶液(vector laboratories，burlingame，ca)已完成抗原修复。第一抗体s100(dako，carpinteria，ca)和抗平滑肌肌动蛋白(dako，carpinteria，ca)以1：100使用。dab标记的第二抗体(vector laboratories，burlingame，ca)以1：500使用。切片采用abc试剂孵育(vector laboratories，burlingame，ca)和用苏木精对比染色。根据公布的标准将肿瘤等级分配给每个肿瘤(丹尼斯，等人，2011，帕特奈克，等人，1984，史沫特莱，等人，2011，sabattini，等人，2014年)。
[0267]
实施例7
[0268]
诺氏梭菌-nt的肿瘤内(it)给予-研究1结果
[0269]
所有的狗接受至少一个周期的生物外科，用计划的最多的64中的53个周期。大多数的狗，16只中的10只，接受了预期的四个周期。生物外科的周期典型地间隔一周。无安慰剂对照或屏蔽被使用。
[0270]
对于第一个周期后显示出早期肿瘤响应，毒性或疾病进展的狗，随后的周期被停止。最常见的不良事件与在诺氏梭菌-nt孢子注射部位局部感染一致，其中包括：发热(17起事件)，肿瘤炎症(12起事件)，肿瘤脓肿(10起事件)，厌食(9起事件)，以及嗜睡(6起事件)(表12)。在注射目标病变部位的炎症反应的临床症状，在16只中的14只狗中被观察到(87.5％)，其中：肿瘤炎症(12/14)，肿瘤脓肿(7/14)，肿瘤疼痛(5/14)，和肿瘤排出(4/14)(表13)。
[0271]
表12整个研究中观察到的不良事件的总结
[0272]
[0273][0274]
表13来自诺氏梭菌-nt治疗的发芽和响应的临床证据摘要
[0275][0276]a在研究的第0天或以后的诺氏梭菌-nt发芽的临床证据，并且包括目标病变反应(图5)。b目标病变的最佳响应，由研究方案定义，在研究第21天之后：cr-完全响应；pr-部分响应；sd-稳定的疾病；pd-进行性疾病；ne-在研究第21天或之后无法评价响应。
[0277]
早发性的不良事件
[0278]
早发性的不良事件指在第一治疗周期(13只犬)或单一治疗周期(3只犬)后前7天内出现的事件。各种不良(ae)事件的调查结果被发现在多个病例中。第一治疗周期(已经接受多个周期的13只犬)之后或单一的治疗周期(已经接受仅一个周期的3只狗)之后7天内发生的早发性不良事件总结于表14。
[0279]
表14
[0280]
第一治疗周期中任何级别的早期发病a不良事件的总结
[0281][0282]a第一次治疗后最多和不到7天。b具有任何级的至少一个不良事件的犬数
[0283]
常见的早发性不良事件调查结果包括：目标肿瘤病变反应，改变一般体征和症状，以及血液和淋巴系统异常。多数早期发病不良事件为轻度至中度的(
ⅰ‑ⅱ
级)，肿瘤炎症，厌食，肿瘤水肿，发烧是最通常观察到的事件。iii级肿瘤脓肿及iii级肿瘤炎症在两起病例中被注意到(10-r02和16-r03)。早发性不良事件的调查结果显示与来自诺氏梭菌-nt治疗剂的作用机制得到的预期肿瘤炎症反应是一致的。
[0284]
迟发性不良事件
[0285]
3只狗的一个子集只接受单一治疗周期(如在2012年12月2日的)。迟发性不良事件指单一治疗周期后7天后发生事件，并总结在表15中，针对3只狗(04-r04，10-r02，和11-r01)。多数迟发性不良事件为轻度至中度(ⅰ～ⅱ级)和12中的11个晚发病的调查结果被发现在单一对象04-r04。此犬表现为右前肢软骨母细胞性骨肉瘤，在基线ld测量为94.5毫米(不可用ct测量)。诺氏梭菌-nt孢子注射后20天，由于进行性疾病，进行截肢。另两个对象都很好地耐受单一治疗周期。他们的迟发性不良反应(不良事件)是仅限于轻度发热(i级)。
[0286]
表15第一个治疗周期后任何等级后发病a不良事件的总结
[0287][0288]a仅单次治疗后7天之后。b具有任何级的至少一个不良事件的狗数目。c从第一治疗的天算起。
[0289]
综上所述，一个治疗周期的诺氏梭菌-nt it给予的1
×
108个孢子后观察到的安全性暗示合适的耐受性。早发性和迟发性的不良事件与来自诺氏梭菌-nt的作用机制得到的预期肿瘤炎症反应是一致的。不良事件已被监测和有效管理的，如本文所公开。
[0290]
当狗由it给予诺氏梭菌-nt的多个治疗周期时注意到的不良事件总结在表9(针对任何等级不良事件(ae))和在表10(针对iii级及以上的不良事件。
[0291]
多次周期的治疗后不良事件种类和发生率的调查结果大致相似于在单次治疗周期后观察到的。同样地，事件的发生似乎与在单次治疗周期后所观察到的大体一致：在所有病例中的169个的调查结果中，只有30个在现有的剂量后七天以上被注意到。同样地，肿瘤炎症，厌食，和发烧是最通常观察到的事件。发生在一个以上的病例中的不良事件包括：目标病变反应，一般体征和症状改变，血液和淋巴系统异常，跛行，高血压，淋巴结肿大，腹泻和新的块。发现的大部分(约95％)为轻度到中度(ⅰ至ii级)。
[0292]
严重不良事件
[0293]
严重不良事件(iii级和更大)被发现在5个病例(表16)。对象04-r05经历了中性粒细胞计数iii级提高。对象10-r01经历了ⅲ级贫血，嗜睡，肌肉无力，肌炎，疼痛和斜卧。广泛转移性疾病，在基线没有观察到，在第60天尸病例10-r01检后被确诊；进行性疾病可能在这种情况下影响不良事件的调查结果。对象10-r02经历了iii级肿瘤脓肿。对象11-r01在第一个治疗周期后93天经历了iv级血小板计数降低，其在没有干预的情况下消退。在93天的访问后21天，在没有任何医学治疗的情况下症状消退。值得注意的是，这一对象筛查和基线，分别也表现出血小板减少症的一级和iii级症状。对象16-r03经历了ⅲ级腹泻，跛行和肿瘤炎症，其在一周内消退。
[0294]
表16对于所有治疗周期大于或等于iii级的不良事件总结
[0295][0296]a具有任何级中的至少一个不良事件的犬数。
[0297]
在研究过程中两只狗已经被记录有新的块(肿块)。在82日在受04-r04中确定直肠肿块和在第9天t1对象10-r01中确定裂解脊椎病变。这些发现可能代表了转移或第二个不同的病理。在这两种情况下，与诺氏梭菌-nt疗法的关系不明确。
[0298]
来自诺氏梭菌-nt治疗的响应
[0299]
总之，伴侣犬中诺氏梭菌-nt it治疗的每治疗周期1
×
10 8
个孢子的剂量在长达4个过程中耐受性良好。可能或可能与药物相关的大于iii级的最不良的事件均在一周内消退。预计的不良事件与肿瘤内治疗以后的局部的炎症变化在很大程度上有关，一般在一周内消退。不良事件和严重不良事件已被有效监测和管理，如本文所公开。
[0300]
鉴于诺氏梭菌-nt it给予是伴随着生物活性的广泛的证据，使用recist 1.1制成原发性肿瘤响应的初步评估，并总结于下表17。
[0301]
表17
[0302]
来自诺氏梭菌-nt治疗的发芽和响应临床证据总结
[0303][0304]
在研究第21天或之后对狗最好的响应进行了评估。三只对于治疗具有完全响应(cr)，3只部分响应(pr)，5只具有稳定的疾病(sd)，三只有进行性疾病(pd)，以及两只狗(04-r04和04-r08)不能得到对响应的评价，因为21天前注射的肿瘤被手术切除。生物外科的客观响应率为37.5％(16只狗中的6只；95％的置信区间：15.2-64.6％)。一至四个周期的生物外科后发生肿瘤脓肿和响应。单一周期后狗11-r01经历了pr，三个周期后04-r03有cr，四个周期之后犬04-r02和04-r05拥有pr，而四个周期之后04-r01和04-r06具有cr。图7a-f和图8a-f显示犬中代表性变化，分别为局部(11-r01)和完全响应(04-r03)。脓肿消退伴随清创发生和2至4周后伤口愈合已经完成。然而，客观反应前不总是观察到明显的脓肿形成。狗04-r01和04-r06接受4个周期的生物外科，伴随肿瘤的炎症，但无脓肿，其被观察到21天的研究访问。即便如此，在这两个狗中，分别在第42天(计划外的访问)和第60研究访问发现完全响应。
[0305]
个体对象在下面更详细地讨论：
[0306]
安迪(11-r01，图7a-f)，10岁，雄性绝育，马尔济斯犬，呈现在左侧耳廓ii级软组织肉瘤。他的治疗史包括在招收之前的手术。他在2012年6月18日接受诺氏梭菌-nt孢子单一剂量。在第1天安迪经历了i级肿瘤肿胀(2012年6月19号)。脓肿形成导致了肿瘤的溃疡及脓性，坏死物质排出。由此产生的伤口愈合，无并发症。在延长随访期，在第93天ⅳ级血小板减少症被观察到(2012年9月19日)，所述ⅳ级血小板减少症在几个星期后一次例行的后续拜访时消退。伤口愈合后中约为8mm的增厚皮肤区域保持(见图9，在研究过程中持续肿瘤测量的时间过程)。这可能表现疤痕组织或残余肿瘤。
[0307]
莫莉(11-r02)，12岁，雌性绝育，拉布拉多犬，表现为左侧膝关节ii级软组织肉瘤。她在招收之前没有治疗史。她接受了3个周期的it诺氏梭菌-nt孢子，接着在所述第三个it剂量后7天接受1个it剂量的1
×
10 8
个诺氏梭菌-nt孢子，。她的第1，第2和第3的it剂量分别在2012年7月11日，2012年7月18日和2012年7月25日。诺氏梭菌-nt孢子的单一iv剂量在2012年8月1日被给予，由于缺乏采用现有的it剂量观察到的生物活性。在第3次it剂量后被发现的唯一的不良事件是i级高血压。高血压是短暂和自限性的，在1小时内消退。莫莉的肿瘤在第30天(2012年8月10号)被手术切除用于组织学分析。块(肿块)被证实是软组织肉瘤，其具有坏死和炎症的领域。革兰氏染色中不存在细菌，这支持在这个病例中缺乏生物活性。
[0308]
瑞奇(10-r01)，13岁，雄性绝育，金毛猎犬，表现为口腔黑色素瘤。他的治疗史包括在招收之前的手术。他接受了2个周期的it诺氏梭菌-nt孢子。诺氏梭菌-nt it治疗在2012年8月2日和2012年8月9日被给予。在第9日(2012年8月11日)，第二个治疗周期后2天，瑞奇发展颈部痛的突然发作和后腿神经功能缺损。iii级贫血也被发现。进行mri检查，并揭示可能的颈部脂肪组织炎和颈部脊髓受压。皮质类固醇和胃肠防护剂被给药，3天后瑞奇恢复。注意到，口腔黑素瘤没有变化，并没有额外的诺氏梭菌-nt治疗被给予。第21天(2012年八月23日)，进行mri和显示改善了前述脂肪组织炎；然而，通过胸部计算机体层摄影术注意到转移性肺结节。进行口服黑素瘤的切除。人类酪氨酸酶黑色素瘤疫苗开始于2012年8月30日。在第42天(2012年9月13日)，接受黑素瘤疫苗后2周，瑞奇表现为反复发作颈部痛和前肢疼痛(皮质类固醇停药后2周)。采用止痛药的医疗管理4天后没有导致改善，因此，皮质类固醇被重新启动。在第46天，ⅲ级贫血和尿素氮(bun)升高被注意到。采用胃肠道保护剂治疗假定的消化道出血。在第60日，瑞奇虚脱和发展吐血。进行人道安乐死。尸检揭示播散的转移性黑素瘤，包括颌下淋巴结，纵隔淋巴结，肠系膜淋巴结，肾和在颈部区域的髓周的脂肪。没有发现胃或肠道溃疡的任何证据。推测的两次脊椎疼痛原因是转移性黑色素瘤。与诺氏梭菌-nt的关系是不确定的。
[0309]
芬尼根(04-r02)，一个11岁的，完整雄性，金毛猎犬，在右外侧掌(骨)呈现出软组织肉瘤(血管外皮细胞瘤)。他的治疗史包括在招收之前的手术。他接受了4个周期的it诺氏梭菌-nt孢子。不良事件轻微且耐受性良好。4个周期治疗后发生肿瘤的完全消融，在肿瘤的部位周围留下正常组织边缘。芬尼根于2012年8月3日，2012年8月10日8月17日，2012年和2012年8月24日，分别接受了他的第1，第2，第3和第4个治疗周期。诺氏梭菌-nt的给予与第1，第2和第3个周期后报告的唯一i级不良事件相关。i和ii级的不良事件在第四给药后48小时被注意到。肿瘤感染被注意到并包括发热，白细胞增多，中性粒细胞和肿瘤相关的疼痛，和脓肿形成。感染发展到形成脓肿和以第4剂后96小时发生的最小清创消融整个肿瘤。在这次访问的肿瘤测量被记录在上午，之后，当天稍后完成大体肿瘤消融。在第25日肢体截肢被需求，而不是开放的伤口管理(2012年8月28日)，并使用了抗生素。芬尼根从手术恢复良好，他的第一次治疗后94天仍然保持显著无瘤(2012年11月5日)。
[0310]
德雷克(04-r01，图10a)，7岁，雄性绝育，金毛猎犬，在右上颌中部区域呈现出软组织肉瘤(纤维肉瘤)。他没有在招收之前的治疗史。他接受了4个周期的it诺氏梭菌-nt孢子。不良事件轻微且耐受性良好。4个周期后发生肿瘤完全消融，留下正常组织边缘，其围绕肿瘤的部位。德雷克在2012年8月13日，2012年8月20日，2012年8月27日和2012年9月4日，分别接受了他的第一，第二，第三和第四治疗第一，第二，和第三剂量之间的间隔为7天；而第三
和第四剂量之间的间隔为8天，其原因是国家节日。诺氏梭菌-nt的给予是与第一个周期后24-48小时报道的轻度的不良事件，包括i级嗜睡及食欲不振，ⅱ级呕吐及便血相关。这些不良事件采用抗催吐剂和抗生素被成功治疗。第四剂量24小时内不良事件被发现，包括i级肿瘤疼痛和肿胀。未观察到肿瘤感染和脓肿形成的进一步证据。在第60天肿瘤消融是明显的(2012年十月12日)和肿瘤是不能被测定(见图10b，在研究过程中持续肿瘤测量值的时间过程)。该区域是坚挺的和保持微肿，并进行ct扫描。在1日剂量后第86天(2012年11月7日)德雷克仍然是没有肿瘤的。
[0311]
巴克斯特(04-r03，图8a-f)，一个9岁，雄性绝育，柏塞狗，呈现在左中前臂的ii级软组织肉瘤。他没有在招收之前的治疗史。他接受了it诺氏梭菌-nt孢子的三个周期。不良事件轻微且耐受性良好。三次注射后发生肿瘤的完全消融，留下正常组织边缘，其围绕肿瘤的部位。巴克斯特在2012年8月17日，2012年8月24日和2012年8月31日，分别接受了他的第一，第二和第三剂量的诺氏梭菌-nt孢子。诺氏梭菌-nt的给予耐受性良好，第一或第二剂后没有报道研究剂相关的毒性。研究相关的不良事件第3剂后24小时被发现。这些不良事件均与肿瘤感染相关，包括发烧，厌食，嗜睡和肿瘤相关的疼痛，肿胀和出血。不良事件为轻度(ii级或更低)，并采用支持治疗和止痛药得到管理。诺氏梭菌-nt相关肿瘤感染发展到涉及整个肿瘤及脓肿形成。2012年9月2日的肿瘤外科清创导致的不良事件(aes)的迅速消退。伤口愈合，无并发症和截止2012年10月16日伤口愈合完全。在他的第一个治疗后第94天(2012年11月19日)巴克斯特仍然显著无瘤(见图11在研究过程中持续肿瘤测量的时间过程)。
[0312]
哈雷(26-r01)，7岁，雄性绝育，拉布拉多犬，在右爪呈现出ⅱ级软组织肉瘤(血管外皮细胞瘤)。他没有在招收之前的治疗史。他接受了4个周期的it诺氏梭菌-nt孢子。第1，第2，第3和第4个剂量在2012年8月20日，2012年8月27日，2012年9月4日和2012年9月10日分别给予。剂量之间的间隔时间为6-8天。在第一和第二剂量的时间温度的基线升高被注意到。诺氏梭菌-nt孢子it治疗耐受性良好，没有报告不良事件。对治疗没有响应。
[0313]
厄休拉(04-r-04)，一个11岁，雌性绝育，杂交圣伯纳犬(saint bernard mix)，表现为右前肢的软骨母细胞性骨肉瘤。她的治疗史包括在招收之前的手术。她接受诺氏梭菌-nt孢子单一it剂量。在被招收时无转移性疾病。在2012年8月31日第一次治疗后，第一个24小时内肿瘤脓肿的形成和肿瘤周围炎症是明显的，用止痛药，热敷及静脉类晶体进行医疗管理。在无改善后，在第2天将肿瘤/脓肿切口(2012年9月2日)。中度血清血液的流体存在。厌氧培养分离诺氏梭菌。在第4天(2012年9月4日)开始给予抗生素。该切口被管理作为一个开放的伤口，直到第20日(2012年九月二十日)，在当日针对进行性疾病进行截肢。病理组织学显示严重坏死和出血，伴随持续的软骨母细胞性骨肉瘤。截肢之后，切口部位感染被记录在案。培养没有揭示诺氏梭菌。截肢之后没有进行辅助治疗。在第81日(2012年11月21号)，厄休拉呈现出直肠脱垂，并且被发现有直肠息肉。在本评价时进行的胸部放射照相显示肺转移。
[0314]
加布里埃尔(16-r02)，一个9岁，雄性绝育，拉布拉多犬，在左大腿外侧呈现i级软组织肉瘤。他的治疗史包括在招收之前的手术。他接受了4个周期的it诺氏梭菌-nt孢子。诺氏梭菌-nt的it给予被一般耐受性良好，在第一和第二剂量之间有1周的延迟，由于响应医疗管理的ii级腹泻。加布里埃尔在2012年9月12日，2012年9月26日，2012年10月3日和2012年10月10日分别获得了第一，第二，第三和第四剂量。毒性轻微，主要包括腹泻，组成症状。
每次给药后ii级腹泻被注意到，对医疗管理响应良好。在第1剂量后，实施1周的剂量延迟，造成了第一和第二剂量间的14天的时间间隔。没有实现剂量延迟，由于进一步的ii级腹泻剂量。此外，ii级肿瘤肿胀在第4天(2012年9月16日)被观察。肿瘤大小从d0(第0天，天0)(2012年9月12号)至d63(第63天，天63)(2012年11月14号)最近一次研究访问保持稳定。
[0315]
巴迪(04-r05)，13岁，雄性绝育，谢德兰牧羊犬，在右侧前臂表现为软组织肉瘤(横纹肌肉瘤)。他的治疗史包括被招收前的手术，化学疗法，和先前诺氏梭菌-nt临床试验。在研究开始时无转移性疾病被注意到。他接受了4个周期的it诺氏梭菌-nt孢子。第3周期的治疗后，与诺氏梭菌-nt同时代的临床上显著的不良事件被分离到iii级中性粒细胞减少和发热。采用静脉注射抗生素及输液治疗(流体治疗)的医疗管理48小时之内此事件得到解决。巴迪在2012年9月20日，2012年9月27日，2012年10月5号和2012年10月12日接受了他的第1，第2，第3和第4个治疗周期。轻度肿瘤炎症(红斑，发热，肿胀)被发现与4个周期中的2是相关的。在第4天(2012年9月24日)肿瘤的大小短暂的下降被注意到。在第21天(2012年10月12号)新的非目标病变被注意到在原发肿瘤部位附近。在第61天原发靶肿瘤稳定。
[0316]
琥珀(16-r03)，10岁，雌性绝育，shepherd(牧羊犬)，在左爪、掌(骨)和背侧表面呈现出i级软组织肉瘤。她的治疗史包括在招收之前的手术。她接受了4个周期的it诺氏梭菌-nt孢子。第1，第2，第3和第4个剂量在2012年9月26日，2012年10月3日，2012年10月15日，和2012年10月24日分别被获得。剂量之间的间隔为7-12天。琥珀在她的第1次和第2次剂量后经历ii级肿瘤肿胀和疼痛。i级食欲不振被发现在第2天(2012年9月28日)。在第8天(2012年10月4日，2次剂量后1日)，i级发烧，ii级肿瘤的温暖和iii级跛行被记录在案。她的肿瘤被切口和给予止痛药。iii级腹泻在11日被注意到(2012年10月7号)和进行管理医疗。由于肿瘤相关的不良事件和腹泻，第三剂量被推迟到第19日(2012年10月15日)。ii级肿瘤肿胀在诺氏梭菌-nt的第3剂后，在第19日再次被观察到，这是采用止痛药进行管理。第4剂量后无不良事件被发现，。
[0317]
六(11-r04)，一个9岁，雄性绝育，哈斯基犬，在右爪呈现i级软组织肉瘤。她没有在招收之前的治疗史。她接受了4个周期的it诺氏梭菌-nt孢子。六在2012年10月1日，2012年10月8日，2012年10月15号和2012年10月22日分别接受第一，第二，第三和第四剂量。诺氏梭菌-nt孢子的给予耐受性良好，仅出现轻微的不良事件。在第1剂量后，i级高血压，发烧被注意到。发热和高血压是自限性的，分别在给药的1和2个小时内消退。在第4天(2012年10月5日)，肿瘤是主观柔软的，在前活检的部位溃疡面积小(ⅰ级)被观察到。溃疡持续至第31天(2012年11月1日)，最新的研究访问。这种溃疡可与任一研究试剂或需要进行研究招收的活检的并发症有关。
[0318]
百丽(04-r06)，一个11岁，雌性绝育，拉布拉多猎犬，在右后3指表现为肥大细胞瘤(原被抽出为软组织肉瘤)，转移至腘窝淋巴结。她没有在招收之前的治疗史。她接受了4个周期的it诺氏梭菌-nt孢子。不良事件轻微，仅限于一级发热和i级肿瘤炎症。百丽于2012年10月19号，2012年10月26日，2012年11月2日和2012年11月9日获得了第一，第二，第三和第四个治疗周期。i级发烧与诺氏梭菌-nt治疗和肿瘤炎症同时发生。发热和炎症是自我消退的，不需要医疗管理，所述医疗管理不是皮下流体所需的方案，所述流体在预定研究访问被给药。肿瘤溃疡在第21天(2012年11月9日)被注意到。由养犬人送交至研究者的肿瘤的照片显示溃疡的消退，标志着块(肿块)消退。一个计划外的访问在第46日(2012年12月4日)被进
行以获取肿瘤响应评估。肿瘤完全消退被发现。
[0319]
弗里达(11-r01)，7岁，雌性绝育，德国牧羊犬组合(mix)，在右后爪呈现软组织肉瘤(血管外皮细胞瘤)，有可能的淋巴结转移(基于ct)。她的治疗史包括在招收之前的手术。她与来自墨西哥的她的主人前往参加本次临床试验。她接受it诺氏梭菌-nt孢子的3个周期。不良事件不限于消长发烧48小时，其被采用静脉注射液和nsaids而消退。弗里达于2012年11月6日，2012年11月14号和2012年11月21日接受第一，第二，和第三治疗周期。唯一的显著不良事件包括i级发烧，其需要住院治疗，并第4天开始输液(流体)(2012年11月10日)，并在第5天发展至ⅱ级发烧(2012年11月11日)。在48小时后发热(发烧)消退。在第18天(2012年11月24日)治疗的第3次周期后，i级发烧还被发现。在第21天(12年11月27日)肿瘤进展提示截肢手术。
[0320]
mhija(01-r02)，7岁，雄性绝育，边境牧羊犬，在左侧胸部的侧肋表现为软组织肉瘤(外周神经鞘瘤(周围神经鞘瘤))。她没有在招收之前的治疗史。她曾获得it诺氏梭菌-nt孢子的3个周期。不良事件轻微且耐受性良好。肿瘤炎症，发热(发烧)和血清血液的至粘液脓性排出是可能与诺氏梭菌-nt活性相关。诺氏梭菌-nt孢子的第4个周期被计划。mhija在2012年11月12日，2012年十一月二十日，和2012年11月27日分别接受第一，第二和第三剂量。第一和第二剂量之间的间隔为8天；而第二和第三剂量之间的间隔为7天。诺氏梭菌-nt的给予与轻度，i-ii级毒性有关。在第1剂量后i级恶心和反胃被注意到，第3剂量后i级食欲不振和嗜睡被发现。采用医疗管理后短期内消退毒性。大多数毒性分别定位到肿瘤部位，i或ii级的严重程度(发热(发烧)，炎症，瘙痒症，血清血液的至粘液脓性排出和红斑)和诺氏梭菌-nt的给药的2天内发生。此外，第一和第三剂量后2天i-ii级腹水肿被观察到。
[0321]
坦克(10-r02)，10岁，雄性绝育，混合品种，在右肋表现为软组织肉瘤(血管外皮细胞瘤)。他的治疗史包括在招收之前的手术。他在2012年11月12日接受了it诺氏梭菌-nt孢子的1该周期。在治疗后第4天(2012年11月16号)i级发烧，食欲下降，肿瘤周围ii级浮肿，和iii级肿瘤脓肿者被发现。医疗管理，包括止痛药，静脉输液(iv流体)和广谱抗生素被用于管理脓肿。肿瘤炎症和周围水肿消退在第11天(2012年11月23日)。坦克于2012年12月3日接受了第二次治疗周期。周期的时间间隔为21天。第二剂量延误的原因是抗生素清除期。
[0322]
来自8只犬的肿瘤测量的时间进程显示在图12a。图12b显示三个时间过程，其由于截肢或数据截止被缩短。
[0323]
综上所述，以每个周期1
×
108个孢子并且最多4个周期治疗的剂量由it注射给药的诺氏梭菌-nt显示，在天然存在的实体瘤的伴侣犬中有意义生物和抗肿瘤活性和似乎是良好耐受的。肿瘤响应是迅速的，显著肿瘤坏死和显著的疾病消退发生在诺氏梭菌-nt给药的数天内。多数不良事件被限制为1级和2级，并与从诺氏梭菌-nt治疗预期的基于机制的肿瘤炎症反应是一致的。几起病例目前正在被长期随访以评估发展和生存。
[0324]
实施例8
[0325]
诺氏梭菌-nt的肿瘤内(it)给予-研究2方法
[0326]
正在执行一项研究，其表征由it注射的诺氏梭菌-nt给予的剂量和体积，所述给予用于实体瘤(不包括骨肉瘤或肥大细胞瘤)犬的治疗。
[0327]
对具有实体瘤(除骨肉瘤或肥大细胞瘤)任何重量，品种，性别，年龄的狗进行了筛选招收。入选标准是类似于实施例6中提出的，所不同的是每条狗有除骨肉瘤或肥大细胞瘤
之外的任何癌症的细胞学或病理诊断，以及每个狗至少有1个可测量的肿瘤病变，其具有最长直径≥1厘米。
[0328]
初步筛选访问期间每只狗被分配一个独特的研究狗的识别号码，其包括5位数字代码(这可能不是依次按照筛选狗的数字的顺序)。第2位数字表示的研究地点(01至99)，中间的数字表示研究“5”，最后2位数字描述研究地点(01～99)在研究狗的数量。例如，被招收于地点9的第11只狗被分配研究狗数字09-511。研究狗的数字是以在狗被招收于一个给定的研究地点的顺序而按时间顺序分配。狗当它符合纳入和排除标准时被认为招收入这项研究。
[0329]
总病理，组织病理学和尸体剖检，按实施例6中所述进行。
[0330]
在装运前如前所述制备诺氏梭菌-nt孢子，采用1
×
108个孢子/ml的浓度，并且诺氏梭菌-nt孢子在2ml冷冻管中悬浮在无菌盐水。诺氏梭菌治疗的每个周期包括至多5次注射的1毫升孢子悬浮液(1
×
108个孢子)，其用于每次注射到单个目标病变。含1
×
108个孢子的孢子悬浮液装在用于每个1毫升注射的个体冷冻管，和小瓶，注射器中，以及每次注射后针头被丢弃。
[0331]
该用于注射的方案示于图13。五个1毫升注射部位(如用正方形表示)分布于肿瘤内：中心，和在肿瘤内四个(4)均匀地分配的注射部位。对于每个1毫升注射的部位进一步包括个5重定向部位(位置)(由圆圈在图13中表示)。每个重定向的部位接受200微升孢子悬液。针首先被定向至注射部位的中心内，然后均匀重定向到注射部位的四角，不抽出针。当完成了第一个1毫升注射后，针被撤回和注射器被丢弃。每次注射的深度应适当分布，使得最好分布得以实现。建议的注射器大小为1ml，其用于每次注射，推荐的针头是22号至25号。针的足够的长度应根据肿瘤病变的深度来选择。
[0332]
所有的狗从d0(第0天)住院到d2(第2天)，然后每次后续治疗后根据研究者的自由裁量住院24～48小时，以用于临床观察。诺氏梭菌-nt治疗后在住院期间流体(输液)分别给予一切研究的狗。在给予天，所有的狗都被iv给药晶体溶液，采用4毫升/hg/小时，以用于采用诺氏梭菌-nt的2小时治疗。
[0333]
研究访问和事件总结在表18中，作为8个周期治疗方案的一个例子。给药间隔被建议每周一次，如果意图是采用多个治疗周期治疗狗。
[0334]
表18研究访问和活动总结
[0335][0336]
*在临床时上从d0(第0天)到d2(第2点)所有者(主人)将离开他们的狗，和在医院iv类晶体将给予所有的狗。对于后续周期，研究者根据研究的相对于d0的天数在d中填写号码。
[0337]
**狗将被给予iv类晶体。
[0338]
***仅仅是胸部x光片。
[0339]
狗可能不会接受8个周期。在这项研究中，对于病例，继续决定后续给药周期将取决于，医疗主任，研究者和赞助商之间的磋商的病例的基础。
[0340]
研究完成后，如果被要求全身应用抗生素来管理不良事件，建议给予强力霉素5～10毫克/千克po bid至狗，持续3个月。
[0341]
例9
[0342]
诺氏梭菌-nt的肿瘤内(it)给予-研究2间断结果
[0343]
截至2012年12月2日，已在研究中两只伴侣犬经治疗。这两只种动物获得了5
×
108个孢子剂量水平，所述孢子每个治疗周期在5个独特的it注射部位被给予。
[0344]
第一狗巴迪(04-503)，一个9岁，雄性绝育，比利时马林诺斯犬，在左侧腕骨表现为软组织肉瘤，在基线具有69毫米ld测量(4.4
×
3.3
×
0.7厘米，通过ct)。他的治疗史包括在招收之前的手术。他接受了2个周期的it诺氏梭菌-nt孢子。不良事件轻微，仅限于一级发热和i级肿瘤炎症。巴迪在2012年11月21日，2012年11月28日接受了第1和第2治疗周期。第一次注射的6小时范围内一级发烧，肿瘤发红，肿胀和疼痛加重被注意到。在采用nsaid卡布洛芬治疗后6小时内发热消退。在治疗后轻度肿瘤溃疡被发现在第2天(2012年11月23日)。在
第7天(2012年十一月28日，)，块(肿块)块的大小略有下降被发现(-12.0％)。治疗的每个周期耐受性良好，无高于i级的不良事件。
[0345]
第二个狗，吉尼斯(04-502)，一个9岁，雄性绝育，惠顿梗犬(wheaton terrier)，左肩上表现为鳞状细胞癌，在基线有122毫米的ld测量(9.1x 9.3
×
14.5厘米，经ct)，后支腿有低级血管肉瘤，和证据肺转移(基于ct)。他的治疗史包括在招收之前的手术。基于扩招前进行超声心动图已经明确原有二尖瓣疾病明显。他在2012年11月28日，接受了it诺氏梭菌-nt孢子单一剂量。采用静脉输液(iv流体)进行的医疗管理的治疗的6小时内iii级发烧被发现。在第1天(2012年11月29日)，块(肿块)的肿胀，脓性分泌物(排出物)，和中性粒细胞被发现。静脉输液(iv流体)被继续，和止痛药物(包括nsaids)被启动。在第2天(2012年十一月三十日，)，进行性肿瘤肿及败血症(发热，白细胞减少，低血糖，低蛋白血症)的证据，促使切开肿瘤和冲洗。广谱抗生素，羟乙基淀粉和人血白蛋白被给药。在第3天(2012年12月1日)，在状态中的逐渐下降被注意到，导致呼吸窘迫。安乐死溶液被给药。执行了尸检。总临床显著发现包括营养性心内膜炎，化脓性肺结节，和全身皮下出血和水肿。来自从各种组织和器官(肺，肝，心脏，肾，脾，胃肠道，胃)的死后需氧培养显示多种微生物的细菌生长(金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌，大肠杆菌，链球菌物种)；来自所有器官和组织的厌氧培养物对于诺氏梭菌-nt生长为阴性，除了在肿瘤组织和膀胱中。受影响的组织病理学仍在进行中。脓毒性毒血症休克被认为是死亡的最可能的原因和在这个时候与诺氏梭菌-nt治疗的关系是未知。
[0346]
实施例10
[0347]
在人类的诺氏梭菌-nt的肿瘤内(it)给予-方法
[0348]
it注射的诺氏梭菌-nt孢子的一期的人临床试验
[0349]
单一的it注射的诺氏梭菌-nt孢子的，开放标签，非随机的，多中心i期安全性研究目前在治疗难治性实体瘤的中患者正在进行。临床研究方案由各参与机构的机构审查委员会(irb)审查和批准，以及在美国食品和药物管理局(fda)的指导下，进行所有的监管措施(编号nct01924689)。要求所有的患者在纳入研究前签署书面知情同意书(icf)。
[0350]
这个一期研究的主要目的是确定it注射诺氏梭菌-nt的安全性，剂量限制性毒性(dlt)和最大耐受剂量(mtd)。此外，对治疗剂的抗肿瘤活性进行了探讨。
[0351]
一期研究中诺氏梭菌-nt孢子的制备和it注射
[0352]
诺氏梭菌-nt孢子临床供应被包装在单次使用2ml的无菌和无热原的，具有橡胶塞和铝密封以及防撬帽的i型硼硅酸盐玻璃管形瓶中，采用8.52x108个孢子/毫升的浓度，其悬浮在无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs)，采用1.0毫升填充体积。在恒温监测下在控制温度环境将小瓶贮存在2-8℃。该gmp产品由omnia生物制品公司(马里兰州洛克维尔)生产和配制。
[0353]
在患者参加了试验后，一小瓶被运到研究地点。诺氏梭菌-nt的进一步制备是必要的，发生于it注射的同一天。在指定生物安全柜中，使用无菌生理盐水(0.9％)的适当大小输液袋进行浓缩的孢子悬浮液的稀释，所述输液袋用于实现基于分配的组所需剂量。注射体积(3ml)然后从盐水袋被取出并在放射照像指导下被注射。诺氏梭菌-nt孢子注射采用18号多叉的针(rex-医疗，康斯霍肯，pa)。
[0354]
人体临床试验的设计和实施
[0355]
这项研究是采用标准的3+3剂量递增的设计进行的。患者必须已经诊断为患有晚期的实体瘤的恶性，靶肿瘤是可测量的，可触知的或在超声或射线照相引导下被清楚识别
并适合于经皮注射诺氏梭菌-nt孢子。目标的病变必须有一个最长直径≥1cm，并且是可以衡量，如由recist 1.1标准定义的。主要的合格标准包括治疗难治性恶性肿瘤病史；年满18岁；东部肿瘤协作组(ecog)表现状态≤2；能在急诊室的45分钟驱动时间内停留，并且在it注射后需要护理员，持续28天。主要排除标准是怀孕；原发性脑恶性肿瘤或脑转移；临床显著的腹水或临床证据或门体静脉高血压或肝硬化病史；格拉斯哥昏迷评分(gcs)《15；血清肌酸酐水平》1.5x标准上限(uln)，慢性肾功能衰竭需要血液透析或腹膜透析；血氧饱和度(spo2)《95％(室内空气)；平均动脉血压(bp)《70毫米汞柱；血小板计数≤100,000/立方毫米；血红蛋白《9.0克/升；绝对中性粒细胞计数(anc)《1000/mm3；临床显著胸水，心包积液，圆周心包积液，或任何在环绕心脏的任何位置大于1.0厘米的积液；需要用免疫抑制剂正在进行的治疗；实体器官移植史；全身或局部感染。
[0356]
符合条件的患者被招收并参加到剂量组。按照方案，孢子给药后患者仍然保持住院和被观察8天，患者返回到临床的地点以进行常规调度的随访，持续12个月，在此期间，进行安全性和有效性的时间评估。
[0357]
使用recist版本1.1对临床反应和进展进行了评价。客观应答通过串行ct或注射肿瘤的mri扫描，以及远处转移(最多5个目标病变)进行测定。感染并发症或其他治疗后出现的不良事件的安全监测连续进行12个月。
[0358]
实施例11
[0359]
在人类中的诺氏梭菌-nt的肿瘤内(it)给予-结果
[0360]
诺氏梭菌-nt引起快速肿瘤局部破坏人类第一次患者
[0361]
在比较犬试验中生物外科的有希望的结果和有利的风险/收益性质，与在大鼠中观察到的结果相结合，提供了一种基本原理，其用于在人类中尝试生物外科。因此，在人类实体瘤患者中一期调查研究被开始，所述实体瘤是采用标准疗法难治的或没有可用的标准治疗(nct01924689)。参加这项试验的第一个患者在此处被报道：一名53岁的女性，在2006年8月被诊断为腹膜后平滑肌肉瘤。患者接受了几种手术切除，并在2007年3月获得多个化学疗法和放射治疗的治疗，包括右肾癌根治术和放射治疗，化学疗法采用吉西他滨，红豆杉醇(泰素)，多柔比星(阿霉素)，异环磷酰胺，在2008年11月切除肝转移，右侧肺转移的多个楔形切除于2009年12月，从2010年3月至2011年4月采用曲贝替定治疗，在2010年12进行左侧肺转移的多个楔形切除术，帕唑帕尼治疗于2011年4月，2011年10月进行左下肺叶切除术，hai注射用紫杉醇(白蛋白结合型)(紫杉醇纳米粒注射混悬液)，吉西他滨和贝伐单抗从2012年2月至2013年1月，依维莫司和帕唑帕尼从2013年2月至2013年7月，在温和淡动脉肝动脉栓塞于2013年8月和2013年9月。然而，患者进展，目前转移性疾病在她的肝，肺，腹膜，和右肩的软组织和相邻右肱骨。
[0362]
进行生物外科，将1
×
104个诺氏梭菌-nt孢子的计划的起始剂量注射到她的转移性右肩瘤，采用18号多叉的针(第0天，2013年11月19日)。
[0363]
ct引导下肿瘤内注射采用三叉的针
[0364]
采用芬太尼使对象处于轻度镇静和精通35分钟。18号的quadra-保险丝装置(雷克斯医学)(图16a)是通过将3叉针(27克)插在目标注射区域(图16b和16c)在ct引导下用于注射。三尖齿(每一个都具有2个通孔，用于4个流体出口)(图16d)被部署在4，3，和2厘米处的位置(图16e)，在阶段性回缩的过程注射1毫升等分试样的诺氏梭菌-nt孢子溶液。部署的尖
v1.0.veterinary and comparative oncology 2,195-213(2004)。
[0392]
vogelstein,b.,等人cancer genome landscapes.science 339,1546-1558(2013)。
[0393]
本技术中引用的所有文献通过引用并入本文，犹如在本文完全描述所述所有文献。
[0394]
尽管本发明的说明性实施方案已在本文中描述，但是应当理解，本发明并不限于所描述的那些，并且可以由本领域的技术人员在不脱离本发明的范围或精神的情况下进行各种其它变化或修改。
[0395]
本技术还包括下述具体实施方案：
[0396]
1.诺氏梭菌菌落形成单位在制备用于治疗或改善存在于人类的实体瘤的效果的药物中的用途，其中所述药物具有单位剂量，所述单位剂量包含约1
×
10
3-1
×
107个菌落形成单位，所述菌落形成单位悬浮在药学上可接受的载体或溶液中，所述用途包括将所述药物肿瘤内给予人类。
[0397]
2.根据具体实施方案1的用途，其中所述实体瘤选自由软组织肉瘤，肝细胞癌，乳腺癌，胰腺癌和黑色素瘤组成的组。
[0398]
3.根据具体实施方案1的用途，其中所述实体瘤是平滑肌肉瘤。
[0399]
4.根据具体实施方案3的用途，其中所述实体瘤是腹膜后平滑肌肉瘤。
[0400]
5.根据具体实施方案1的用途，其中所述单位剂量包含约1
×
10
6-1
×
107个诺氏梭菌菌落形成单位。
[0401]
6.根据具体实施方案1的用途，其中所述单位剂量包含约1
×
104个诺氏梭菌菌落形成单位。
[0402]
7.根据具体实施方案1所述的用途，其中所述诺氏梭菌菌落形成单位选自营养和孢子形式。
[0403]
8.根据具体实施方案1的用途，其中所述的诺氏梭菌为诺氏梭菌nt。
[0404]
9.根据具体实施方案8的用途，其中所述单位剂量包含约1
×
10
4-1
×
107个诺氏梭菌nt孢子。
[0405]
10.根据具体实施方案8的用途，其中所述单位剂量包含约1
×
10
6-1
×
107个诺氏梭菌nt孢子。
[0406]
11.根据具体实施方案8的用途，其中所述单位剂量包含约1
×
104个诺氏梭菌nt孢子。
[0407]
12.根据具体实施方案1的用途，其中所述给予步骤包括在单一的位置将单位剂量注射入肿瘤。
[0408]
13.根据具体实施方案1的用途，其中所述给予步骤包括在多个独特的位置将单位剂量注射入肿瘤。
[0409]
14.根据具体实施方案1的用途，其中所述给予步骤包括在1-5个独特的位置将单位剂量注射入肿瘤。
[0410]
15.根据具体实施方案1的用途，其中给予步骤包括注射在5或更多个独特的位置将单位剂量注射入肿瘤。
[0411]
16.根据具体实施方案1的用途，还包括将多个治疗周期给予人类，每个治疗周期
包括将诺氏梭菌菌落形成单位的一个单位剂量注射入实体瘤。
[0412]
17.根据具体实施方案16的用途，所述的1-10个治疗周期被给予。
[0413]
18.根据具体实施方案16的用途，其中2-4个治疗周期被给予。
[0414]
19.根据具体实施方案16的用途，其中，每个治疗周期之间的时间间隔为约5-100天。
[0415]
20.根据具体实施方案16，其中，每个治疗周期之间的时间间隔为约7天。
[0416]
21.根据具体实施方案9的用途，还包括在诺氏梭菌nt孢子的每次给予之前，期间，和/或后将静脉输液给予至人。
[0417]
22.根据具体实施方案9的用途，还包括将多个治疗周期给予人类，每个治疗周期包括将诺氏梭菌nt孢子一个单位剂量注射入实体瘤。
[0418]
23.根据具体实施方案22的用途，其中2-4个治疗周期被给予。
[0419]
24.根据具体实施方案1的用途，还包括在诺氏梭菌的每次给予之前，期间，和/或后将静脉输液给予至人。
[0420]
25.根据具体实施方案1的用途，还包括以有效治疗或减轻因所述诺氏梭菌产生的不良副作用的一定剂量和一段时间提供抗生素的第一过程至人。
[0421]
26.根据具体实施方案25的用途，其中诺氏梭菌给予后给予抗生素两周。
[0422]
27.根据具体实施方案25的用途，其中所述抗生素选自阿莫西林，克拉维酸盐，甲硝唑，及其组合的组。
[0423]
28.根据具体实施方案25的用途，还包括提供以有效治疗或减轻因所述诺氏梭菌产生的不良副作用的一定剂量一段时间和提供抗生素的第二过程至人。
[0424]
29.根据具体实施方案28的用途，其中抗生素的第一过程完成后开始抗生素的第二过程，并且所述抗生素的第二过程被进行1-6个月。
[0425]
30.根据具体实施方案28的用途，其中抗生素的第一过程完成后开始抗生素的第二过程，并且所述抗生素的第二过程进行3个月。
[0426]
31.根据具体实施方案28的用途，其中在第二过程中使用的抗生素是多西环素。
[0427]
32.根据具体实施方案1的用途，还包括给予人选自由化学疗法，放射治疗，免疫治疗以及它们的组合组成的组的治疗。
[0428]
33.根据具体实施方案32的用途，其中所述的免疫治疗包括给予人免疫检查点抑制剂。
[0429]
34.根据具体实施方案1的用途，其中所述实体瘤对选自化学疗法，放射治疗，免疫治疗以及它们的组合的治疗有抗性。
[0430]
35.根据具体实施方案32的用途，其中所述化学疗法包括给予人试剂，所述试剂选自抗代谢剂，微管抑制剂，dna损伤剂，抗生素，抗血管生成剂，血管破坏剂，分子靶向剂，以及它们的组合。
[0431]
36.根据具体实施方案32的用途，其中所述化学疗法包括给予人试剂，所述试剂选自吉西他滨，红豆杉醇(泰素)，多柔比星(阿霉素)，异环磷酰胺，曲贝替，帕唑帕尼，注射用紫杉醇(白蛋白结合型)(紫杉醇纳米粒注射混悬液)，阿瓦斯丁，依维莫司，及其组合。
[0432]
37.根据具体实施方案1的用途，其中所述实体瘤是通过标准疗法难治的或针对实体瘤没有可用的标准疗法。
[0433]
38.根据具体实施方案1的用途，其诱导人的强效局部的炎性反应和适应性免疫应答。
[0434]
39.诺氏梭菌nt菌落形成单位在制备用于在人类中通过显微镜精确切除肿瘤细胞的药物中的用途，其中所述药物具有单位剂量，所述单位剂量包含约1
×
10
3-1
×
107个菌落形成单位，所述菌落形成单位悬浮在药学上可接受的载体或溶液中，所述用途包括将所述药物肿瘤内给予人类。
[0435]
40.诺氏梭菌nt菌落形成单位在制备用于治疗或改善已转移到人类的一个或多个部位中的实体瘤的效果的药物中的用途，其中所述药物具有单位剂量，所述单位剂量包含至少约1
×
10
3-1
×
107个菌落形成单位，所述菌落形成单位悬浮在药学上可接受的载体或溶液中，所述用途包括将所述药物肿瘤内给予人类。
[0436]
41.根据具体实施方案40的用途，其中至少一个部位是远离原始实体瘤的。
[0437]
42.诺氏梭菌菌落形成单位制备用于减缩人类中存在的实体瘤体积的药物中的用途，其中所述药物具有单位剂量，所述单位剂量包含约1
×
10
3-1
×
107个菌落形成单位，所述菌落形成单位悬浮在药学上可接受的载体或溶液中，所述用途包括将所述药物肿瘤内给予人类。
[0438]
43.根据具体实施方案42的用途，其中所述实体瘤选自由软组织肉瘤，肝细胞癌，乳腺癌，胰腺癌和黑色素瘤组成的组。
[0439]
44.诺氏梭菌nt孢子在制备用于减缩人类中存在的实体瘤体积的药物中的用途，所述药物具有单位剂量，所述单位剂量包含约1
×
104个孢子/周期，所述诺氏梭菌nt孢子悬浮在药学上可接受的载体或溶液中，所述用途包括将一至四个周期的所述药物肿瘤内给予人类。
[0440]
45.诺氏梭菌nt孢子在制备用于治疗或改善人类中存在的实体瘤的效果的药物中的用途，所述药物具有单位剂量，所述单位剂量包含约1
×
104个孢子/周期，所述诺氏梭菌nt孢子悬浮在药学上可接受的载体或溶液中，所述用途包括将一至四个周期的所述药物肿瘤内给予人类。
[0441]
46.诺氏梭菌菌落形成单位在制备用于消融存在于人类的实体瘤的药物中的用途，其中所述药物具有单位剂量，所述单位剂量包括约1
×
10
3-1
×
107个菌落形成单位，所述菌落形成单位悬浮在药学上可接受的载体或溶液中，所述用途包括将所述药物肿瘤内给予人类，其中所述肿瘤被消融而留下正常组织边缘。
[0442]
47.根据具体实施方案46的用途，其中所述肿瘤是肉瘤。
[0443]
48.诺氏梭菌菌落形成单位的单位剂量，包含在药学上可接受的载体或溶液中的约1
×
10
3-1
×
107个菌落形成单位，其有效用于治疗或改善存在于人类的实体瘤的效果。
[0444]
49.根据具体实施方案48的单位剂量，其中所述诺氏梭菌菌落形成单位选自营养和孢子形式。
[0445]
50.根据具体实施方案48的单位剂量，其中所述诺氏梭菌为诺氏梭菌nt。
[0446]
51.根据具体实施方案50的单位剂量，其中所述单位剂量包含在药学上可接受的载体或溶液中的约1
×
10
4-1
×
107个诺氏梭菌nt孢子。
[0447]
52.根据具体实施方案50的单位剂量，其中所述单位剂量包含在药学上可接受的载体或溶液中的约1
×
10
6-1
×
107个诺氏梭菌nt孢子。
[0448]
53.根据具体实施方案50的单位剂量，其中所述单位剂量包含在药学上可接受的载体或溶液中的约1
×
104个诺氏梭菌nt孢子。
[0449]
54.一种用于治疗或改善存在于人类的实体瘤的效果的试剂盒，包括包含在药学上可接受的载体或溶液中的约1
×
10
3-1
×
107个菌落形成单位的诺氏梭菌菌落形成单位的单位剂量，和用于使用所述试剂盒的说明书。
[0450]
55.根据具体实施方案54的试剂盒，还包括一种或多种抗生素，所述抗生素有效治疗或减轻因诺氏梭菌菌落形成单位产生的不良的副作用。
[0451]
56.根据具体实施方案54的试剂盒，其中所述诺氏梭菌菌落形成单位选自营养和孢子形式。
[0452]
57.根据具体实施方案54的试剂盒，其中所述诺氏梭菌为诺氏梭菌nt。
[0453]
58.根据具体实施方案57的试剂盒，其中所述单位剂量包含在药学上可接受的载体或溶液中的约1
×
10
4-1
×
107个诺氏梭菌nt孢子。
[0454]
59.根据具体实施方案57的试剂盒，其中所述单位剂量包含在药学上可接受的载体或溶液中的约1
×
10
6-1
×
107个诺氏梭菌nt孢子。
[0455]
60.根据具体实施方案57的单位剂量，其中所述单位剂量包含在药学上可接受的载体或溶液中的约1
×
104个诺氏梭菌nt孢子。
[0456]
61.根据具体实施方案54的试剂盒，还包括1-4个单位剂量的诺氏梭菌，其用于进行1-4个治疗周期。
[0457]
62.根据具体实施方案58的试剂盒，还包括1-4个单位剂量的诺氏梭菌nt孢子，其用于进行1-4个治疗周期。

技术特征：
1.诺氏梭菌菌落形成单位在制备用于治疗或改善存在于人类的实体瘤的效果的药物中的用途，其中所述药物具有单位剂量，所述单位剂量包含约1
×
10
3-1
×
107个菌落形成单位，所述菌落形成单位悬浮在药学上可接受的载体或溶液中，所述用途包括将所述药物肿瘤内给予人类。2.根据权利要求1的用途，其中所述实体瘤选自由软组织肉瘤，肝细胞癌，乳腺癌，胰腺癌和黑色素瘤组成的组。3.根据权利要求1的用途，其中所述实体瘤是平滑肌肉瘤。4.根据权利要求3的用途，其中所述实体瘤是腹膜后平滑肌肉瘤。5.根据权利要求1的用途，其中所述单位剂量包含约1
×
10
6-1
×
107个诺氏梭菌菌落形成单位。6.根据权利要求1的用途，其中所述单位剂量包含约1
×
104个诺氏梭菌菌落形成单位。7.根据权利要求1所述的用途，其中所述诺氏梭菌菌落形成单位选自营养和孢子形式。8.根据权利要求1的用途，其中所述的诺氏梭菌为诺氏梭菌nt。9.根据权利要求8的用途，其中所述单位剂量包含约1
×
10
4-1
×
107个诺氏梭菌nt孢子。10.根据权利要求8的用途，其中所述单位剂量包含约1
×
10
6-1
×
107个诺氏梭菌nt孢子。

技术总结
本发明尤其提供，用于治疗或改善存在于人类的实体瘤的效果。这些方法包括肿瘤内给予人诺氏梭菌，优选诺氏梭菌NT，菌落形成单位(CFU)，其含有约1


技术研发人员：S
受保护的技术使用者：约翰
技术研发日：2014.03.28
技术公布日：2023/8/14