一种检测高毒力肺炎克雷伯菌的荧光定量PCR引物组、试剂盒及其应用

no:8所示，或与上述序列相似性大于75％的序列；用于检测peg-344的引物为f3/r3，如seq id no:9/seq id no:10所示，或与上述序列相似性大于75％的序列；用于检测rmpa的引物为f4/r4，如seq id no:11/seq id no:12所示，或与上述序列相似性大于75％的序列。
8.本发明同时提供一种检测高毒力肺炎克雷伯菌的荧光定量pcr试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括和模板dna。上述和模板dna。上述包括引物、sybr green i或evagreen荧光染料、dna聚合酶、dntps、mg
2+
；上述模板dna为待测菌液的基因组dna。
9.优选的，上述试剂盒中各引物终浓度分别为0.1-0.6μm。
10.优选的，上述试剂盒中引物f1/r1终浓度分别可选0.2μm或0.3μm，引物f2/r2终浓度可选0.2μm，引物f3/r3终浓度可选0.2μm，引物f4/r4终浓度可选0.5μm。
11.更优选的，上述试剂盒中，可选用20μl扩增反应体系，其包含更优选的，上述试剂盒中，可选用20μl扩增反应体系，其包含10μl，模板dna 2μl，其余用灭菌ddh2o补足。
12.上述试剂盒，所述荧光定量pcr反应程序为：第一阶段：预变性95℃/5min，第二阶段：95℃/30sec，58℃/30sec，共40个循环，第三阶段：65℃
–
95℃，0.1℃/sec升温直至95℃。
13.上述试剂盒，所述读取结果为：熔解曲线峰出现在87.5℃附近、85.0℃附近、76.0℃附近或78.5℃附近，说明样品中含有高毒力相关基因iuca、irob、peg-344或rmpa，则该菌株可判定为高毒力肺炎克雷伯菌。
14.本发明具有如下有益效果：本方法采用闭管反应，基于熔解曲线峰进行结果判定，检测完毕直接处理，避免开盖造成气溶胶污染，可以快速、准确地进行高毒力肺炎克雷伯菌的检测。
附图说明
15.图1高毒力相关基因iuca、peg-344双重荧光定量pcr熔解曲线
16.图2高毒力相关基因irob、peg-344双重荧光定量pcr熔解曲线
17.图3高毒力相关基因iuca、rmpa双重荧光定量pcr熔解曲线
18.图4荧光定量pcr方法特异性评价
具体实施方式
19.为更好的理解本发明，下面的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。实施例1：高毒力相关基因iuca、peg-344双重荧光定量pcr检测
20.(1)引物设计与制备
21.基于iuca特异性1725bp序列，如seq id no:1所示和peg-344特异性903bp序列，如seq id no:3所示，限定引物长度为18-24nt，使用引物设计相关软件或网站进行检索，选取评分较高的引物，iuca特异性引物序列如seq id no:5/seq id no:6所示，peg-344特异性引物序列如seq id no:9/seq id no:10所示。
22.引物由生物工程合成相关公司负责合成、纯化与确证。
23.(2)肺炎克雷伯菌dna提取
24.用微量移液器吸取2ml菌液于离心管，12000rpm高速离心2min，弃去上清。
25.向菌体沉淀中加入200μl的缓冲液，用枪头吹打使菌体彻底悬浮。
26.向管中加入20μl蛋白酶k溶液，混匀。
27.向管中加入220μl的缓冲液，振荡15s，置于70℃金属孵育器10min，简短离心去除管盖内壁的水珠。
28.向管中加入220μl的无水乙醇，振荡15s。
29.将上一步所得的溶液和沉淀加入到吸附柱中，吸附柱放入到收集管中，静置3-5min使得dna充分被吸附柱吸附，12000rpm高速离心1min，弃去收集管中的废液。
30.将吸附柱放入收集管中，加入500μl缓冲液，12000rpm离心1min，弃去废液，将吸附柱放入到收集管中。
31.向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000rpm离心1min，弃去废液，并重复操作1次。
32.将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2min，弃去废液，取出吸附柱置于室温15min，彻底晾干残余的漂洗液。
33.将晾晒干的吸附柱放入已灭菌的2ml离心管中，向吸附柱中悬空加入100μl的洗脱缓冲液，即得待测基因组dna。
34.(3)肺炎克雷伯菌dna的pcr扩增与熔解曲线分析
35.反应总体系为20μl，包括10μldna模板2μl、灭菌ddh2o 8μl，其中iuca、peg-344引物终浓度均为0.2μm。
36.反应程序为：第一阶段：预变性95℃/5min，第二阶段：95℃/30sec，58℃/30sec，共40个循环，第三阶段：65℃
–
95℃，0.1℃/sec升温直至95℃。
37.结果判读为：熔解曲线的峰出现在87.5℃附近或76.0℃附近，说明样品中含有高毒力相关基因iuca或peg-344，则该菌株可判定为高毒力肺炎克雷伯菌。实施例2：高毒力相关基因irob、peg-344双重荧光定量pcr检测
38.(1)引物设计与制备
39.基于irob特异性1116bp序列，如seq id no:2所示和peg-344特异性903bp序列，如seq id no:3所示，限定引物长度为18-24nt，使用引物设计相关软件或网站进行检索，选取评分较高的引物，irob特异性引物序列如seq id no:7/seq id no:8所示，peg-344特异性引物序列如seq id no:9/seq id no:10所示。
40.引物由生物工程合成相关公司负责合成、纯化与确证。
41.(2)肺炎克雷伯菌dna提取
42.用微量移液器吸取2ml菌液于离心管，12000rpm高速离心2min，弃去上清。
43.向菌体沉淀中加入200μl的缓冲液，用枪头吹打使菌体彻底悬浮。
44.向管中加入20μl蛋白酶k溶液，混匀。
45.向管中加入220μl的缓冲液，振荡15s，置于70℃金属孵育器10min，简短离心去除管盖内壁的水珠。
46.向管中加入220μl的无水乙醇，振荡15s。
47.将上一步所得的溶液和沉淀加入到吸附柱中，吸附柱放入到收集管中，静置3-5min使得dna充分被吸附柱吸附，12000rpm高速离心1min，弃去收集管中的废液。
48.将吸附柱放入收集管中，加入500μl缓冲液，12000rpm离心1min，弃去废液，将吸附柱放入到收集管中。
49.向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000rpm离心1min，弃去废液，并重复操作1次。
50.将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2min，弃去废液，取出吸附柱置于室温15min，彻底晾干残余的漂洗液。
51.将晾晒干的吸附柱放入已灭菌的2ml离心管中，向吸附柱中悬空加入100μl的洗脱缓冲液，即得待测基因组dna。
52.(3)肺炎克雷伯菌dna的pcr扩增与熔解曲线分析
53.反应总体系为20μl，包括10μldna模板2μl、灭菌ddh2o 8μl，其中irob、peg-344引物终浓度均为0.2μm。
54.反应程序为：第一阶段：预变性95℃/5min，第二阶段：95℃/30sec，58℃/30sec，共40个循环，第三阶段：65℃
–
95℃，0.1℃/sec升温直至95℃。
55.结果判读为：熔解曲线的峰出现在85.0℃附近或76.0℃附近，说明样品中含有高毒力相关基因irob或peg-344，则该菌株可判定为高毒力肺炎克雷伯菌。实施例3：高毒力相关基因iuca、rmpa双重荧光定量pcr检测
56.(1)引物设计与制备
57.基于iuca特异性1725bp序列，如seq id no:1所示和rmpa特异性633bp序列，如seq id no:4所示，限定引物长度为18-24nt，使用引物设计相关软件或网站进行检索，选取评分较高的引物，iuca特异性引物序列如seq id no:5/seq id no:6所示，rmpa特异性引物序列如seq id no:11/seq id no:12所示。
58.引物由生物工程合成相关公司负责合成、纯化与确证。
59.(2)肺炎克雷伯菌dna提取
60.用微量移液器吸取2ml菌液于离心管，12000rpm高速离心2min，弃去上清。
61.向菌体沉淀中加入200μl的缓冲液，用枪头吹打使菌体彻底悬浮。
62.向管中加入20μl蛋白酶k溶液，混匀。
63.向管中加入220μl的缓冲液，振荡15s，置于70℃金属孵育器10min，简短离心去除管盖内壁的水珠。
64.向管中加入220μl的无水乙醇，振荡15s。
65.将上一步所得的溶液和沉淀加入到吸附柱中，吸附柱放入到收集管中，静置3-5min使得dna充分被吸附柱吸附，12000rpm高速离心1min，弃去收集管中的废液。
66.将吸附柱放入收集管中，加入500μl缓冲液，12000rpm离心1min，弃去废液，将吸附柱放入到收集管中。
67.向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000rpm离心1min，弃去废液，并重复操作1次。
68.将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2min，弃去废液，取出吸附柱置于室温15min，彻底晾干残余的漂洗液。
69.将晾晒干的吸附柱放入已灭菌的2ml离心管中，向吸附柱中悬空加入100μl的洗脱缓冲液，即得待测基因组dna。
70.(3)肺炎克雷伯菌dna的pcr扩增与熔解曲线分析
71.反应总体系为20μl，包括10μl、dna模板2μl、灭菌ddh2o 8μl，其中iuca、rmpa引物终浓度分别为0.3μm和0.5μm。
72.反应程序为：第一阶段：预变性95℃/5min，第二阶段：95℃/30sec，58℃/30sec，共40个循环，第三阶段：65℃
–
95℃，0.1℃/sec升温直至95℃。
73.结果判读为：熔解曲线的峰出现在87.5℃附近或78.5℃附近，说明样品中含有高毒力相关基因iuca或rmpa，则该菌株可判定为高毒力肺炎克雷伯菌。实施例4：特异性检测
74.为评估所建立高毒力肺炎克雷伯菌荧光定量pcr方法的特异性，选取经典肺炎克雷伯菌进行检测。
75.通过拉丝试验和全基因组测序来筛选经典肺炎克雷伯菌和高毒力肺炎克雷伯菌，其中拉丝试验的具体操作如下：将肺炎克雷伯菌接种在5％绵羊血平板上，37℃培养16h，用细菌接种环轻柔向上挑起平板上菌落，重复牵拉两次或两次以上，若两次均有粘液丝形成并且长度大于5mm，即判为高黏液表型阳性，即该菌株为高毒力肺炎克雷伯菌株；若无粘液丝形成，即可判为高粘液表型阴性，即该菌株为经典肺炎克雷伯菌株。
76.结果可知用iuca引物，如seq id no:5/seq id no:6所示；irob引物，如seq id no:7/seq id no:8所示；peg-344引物，如seq id no:9/seq id no:10所示；rmpa引物，如seq id no:11/seq id no:12所示，均无法获得扩增产物，即建立的荧光定量pcr方法只能特异性的针对高毒力肺炎克雷伯菌进行扩增。

技术特征：
1.一种检测高毒力肺炎克雷伯菌荧光定量pcr的引物，所述高毒力相关基因分别为iuca、irob、peg-344和rmpa，其特征在于，所述引物基于iuca特异性1725bp序列，如seq id no:1所示；基于irob特异性1116bp序列，如seq id no:2所示；基于peg-344特异性903bp序列，如seq id no:3所示；基于rmpa特异性633bp序列，如seq id no:4所示；或与上述序列相似性大于75％的序列作为检测序列设计得到。2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，用于检测iuca的引物为f1/r1，如seq id no:5/seq id no:6所示，或与上述序列相似性大于75％的序列；用于检测irob的引物为f2/r2，如seq id no:7/seq id no:8所示，或与上述序列相似性大于75％的序列；用于检测peg-344的引物为f3/r3，如seq id no:9/seq id no:10所示，或与上述序列相似性大于75％的序列；用于检测rmpa的引物为f4/r4，如seq id no:11/seq id no:12所示，或与上述序列相似性大于75％的序列。3.一种检测高毒力肺炎克雷伯菌的荧光定量pcr试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括和模板dna。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述包括权利要求1或2所述的引物，sybr green i或evagreen荧光染料，dna聚合酶，dntps，mg
2+
等。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述模板dna为待测菌液的基因组dna。6.一种检测高毒力肺炎克雷伯菌的荧光定量pcr试剂盒，其特征在于，所述荧光定量pcr反应：第一阶段：预变性95℃/5min，第二阶段：95℃/30sec，58℃/30sec，共40个循环，第三阶段：65℃
–
95℃，0.1℃/sec升温直至95℃；所述读取结果：熔解曲线的峰出现在87.5℃附近、85.0℃附近、76.0℃附近或78.5℃附近，说明样品中含有高毒力相关基因iuca、irob、peg-344或rmpa，则该菌株可判定为高毒力肺炎克雷伯菌。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量pcr反应采用20μl扩增体系，其包含10μl、dna模板2μl，其余用灭菌ddh2o补足。

技术总结
本发明提供一种检测高毒力肺炎克雷伯菌的荧光定量PCR引物组、试剂盒及应用。本发明针对高毒力肺炎克雷伯菌中编码铁摄取系统相关基因iucA、iroB，代谢转运相关基因peg-344，荚膜多糖相关基因rmpA，分别设计了针对基因iucA的特异性引物SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:6、针对iroB基因的特异性引物SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:8、针对peg-344基因的特异性引物SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:10和针对rmpA基因的特异性引物SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:12，建立了可检测肺炎克雷伯菌中高毒力相关基因iucA、iroB、peg-344、rmpA的荧光定量PCR方法，通过对高毒力相关基因的检测来判定菌株为高毒力肺炎克雷伯菌或经典肺炎克雷伯菌。本发明方法采用闭管反应，基于熔解曲线峰进行结果判定，检测完毕直接处理，避免开盖造成气溶胶污染，可以快速、准确地进行高毒力肺炎克雷伯菌的检测。准确地进行高毒力肺炎克雷伯菌的检测。准确地进行高毒力肺炎克雷伯菌的检测。


技术研发人员：李成龙 杜向党 许春燕 姚红 武一帅 邢梦然 赵莉莹 覃璐 孙佳蕊 崔静宇 杜姊娴
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：2023.01.09
技术公布日：2023/8/14