具有高效溶藻能力的假交替单胞菌的培养方法及其应用

1.本发明涉及溶藻菌领域，具体为具有高效溶藻能力的假交替单胞菌的培养 方法及其应用。


背景技术：

2.赤潮通常是指一些海洋微藻、原生动物或细菌在水体中过度繁殖或聚集造成水体变色的现象，而国际科学界则将其中造成危害的赤潮统称为有害藻华。夜光藻作为典型的赤潮生物之一，在全球多个海域曾形成过严重赤潮，对海洋生态系统构成一定威胁。夜光藻赤潮暴发时，会分泌大量的黏液粘附在鱼类鳃上使其窒息而亡，夜光藻的增殖也会消耗水体中大量的氧气并在周围水域释放高浓度的氨，严重影响着水产养殖业和海洋生态系统、甚至危及人类健康。鉴于夜光藻赤潮的危害性及其发生趋势，开展其赤潮防治等相关研究工作变得尤为重要和迫切。
3.目前，国内外对有害藻华的治理主要通过物理法、化学法和生物方法。撒播粘土是如今最为常见的物理学方法，该方法操作简单，但容易危害底栖海洋生物生存，而且大范围使用时成本较高。化学法是指利用化学试剂等外来添加物，这一系列方法特异性较差，并且会给环境带来二次污染。相比于目前赤潮治理常用的化学法和物理法，生物法因其具有经济有效且不会对环境造成污染的优点吸引了越来越多人的关注。生物防治技术主要通过生物之间的营养竞争关系来实现控藻，利用在海洋微藻环境中与其共同生长的生物对赤潮藻的生长进行控制，这些生物主要包括一些水生植物、水生动物和海洋微生物等。其中，溶藻菌被认为是目前最具潜力的溶藻方法，它可以通过直接或间接作用使藻类的生长受到抑制，甚至使藻细胞裂解，表现出杀藻效应，溶藻菌的提出为生物防治方法提供了新的思路，由于其原理是利用水生生物自身竞争优势、捕食规则或其分泌的天然产物对赤潮藻进行有效的控制，没有向环境中引入其他化学物质，环境友好且控藻效率较高，具有一定的应用前景，然而针对夜光藻的溶藻菌却鲜有报道，为此提供了具有高效溶藻能力的假交替单胞菌的培养方法及 其应用。


技术实现要素：

4.本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供具有高效溶藻能力的假交替单胞菌的培养方法及其应用，以解决上述背景技术提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：具有高效溶藻能力的假交替单胞菌的培养方法，具体步骤如下：
6.s1：溶藻菌的分离和筛选：菌种分离自沿海城市海域；将采集的水样分别通过梯度稀释涂布的方式接种到2216e固体培养基上，然后进行恒温培养；
7.s11：挑取特征差异明显的单菌落进行分区划线，28℃恒温培养48h，重复以上操作两次，获得纯化的细菌；
8.s12：将纯化的菌株接种至2216e液体培养基中，28℃、180rpm培养36h后以2％体积
比接种到夜光藻藻液中，即在24孔板中每孔分别加入20μl菌液 和1ml藻液；
9.s13：每4h在倒置显微镜下观察记录藻细胞形态变化，并计算其溶藻率；选出溶藻效果最强且最稳定的菌株作后续试验，并将该株细菌代号为ld-b6；
10.s2：ld-b6菌株鉴定及保藏：
11.s21：挑取溶藻菌单菌落于50μl无菌水中，100℃温浴10min后快速转移至冰上，取2μl的细菌裂解液用作模板，利用细菌鉴定通用引物16s-27f和16s-1492r进行pcr扩增；
12.s22：对扩增子进行测序；测序结果显示其与pseudoalteromonasflavipulchra同源性为99％，因此鉴定为假交替单胞菌pseudoalteromonasflavipulchra，命名为假交替单胞菌ld-b6；
13.s3：假交替单胞菌ld-b6的培养方法：
14.s31：将前期纯化的菌株转接到2216e固体斜面培养基上，28℃恒温培养48h后，4℃保存；
15.s32：在无菌条件下从固体斜面培养基上挑取单菌落于10ml 2216e液体培养基中，28℃、180rpm培养至指数生长期(od
600
:0.6-0.7)获得初级培养菌液；
16.s33：将初级培养菌液以1％浓度比接种于100ml液体培养基中，28℃、180rpm培养36h，获得假交替单胞菌ld-b6的菌液。
17.作为本发明的一种优选技术方案，所述s13中的溶藻率(％)＝(1-实验组藻细胞浓度/对照组藻细胞浓度)
×
100％；其中夜光藻的藻细胞浓度使用肉眼观察法计数。
18.具有高效溶藻能力的假交替单胞菌的应用，包括不同浓度溶藻菌对夜光藻的溶藻效果；假交替单胞菌ld-b6的溶藻方式；假交替单胞菌ld-b6溶藻物质的稳定性；假交替单胞菌ld-b6对典型有害藻种的作用和假交替单胞菌ld-b6菌剂的制作。
19.作为本发明的一种优选技术方案，所述不同浓度溶藻菌对夜光藻的溶藻效果的实验方法如下：
20.将假交替单胞菌ld-b6的菌液与经过抗生素处理的夜光藻以0.5％、1％、2％和5％不同体积比进行共培养，设置空白对照，对照组加入相同体积的2216e液体培养基；实验组与对照组均设置3个重复；每4h进行藻细胞浓度计数，并进一步计算溶藻率。
21.作为本发明的一种优选技术方案，所述假交替单胞菌ld-b6溶藻方式的具体过程如下：
22.步骤1：取培养至稳定生长期(36h)的菌液分别作不同方式的处理：
23.①
为原菌液，即不经任何处理；
②
为菌液经12000rpm离心10min，取上清经0.22μm滤膜过滤后所得无菌滤液(平板菌落计数法证明无菌)；
③
为菌液经12000rpm离心10min后弃去上清，菌体经无菌ddh2o清洗3次，重悬于与菌液相同体积的无菌ddh2o中，即菌悬液；
24.步骤2：将以上三种不同方式处理得到的菌液，无菌滤液和菌悬液，按体积比(2％)与经过抗生素处理的夜光藻共培养；以相同体积的2216e液体培养基为对照，实验组和对照组均设置三组平行；
25.步骤3：在光学显微镜下观测溶藻效果，并计算各处理组溶藻率。
26.作为本发明的一种优选技术方案，所述假交替单胞菌ld-b6溶藻物质稳定性的探究实验步骤如下：
27.步骤1：将制备的无菌滤液分别在-80、-20、0、15、30、80和100℃下静置2h，然后在
室温下解冻或冷却；
28.步骤2：将滤液接种到藻液中，每个处理组设置三个平行；
29.步骤3：12h时计算各处理组溶藻率来检测溶藻物质的热稳定性。
30.作为本发明的一种优选技术方案，所述假交替单胞菌ld-b6对典型有害藻种的作用：
31.首先：将溶藻细菌ld-b6菌液以2％的体积浓度接种于无菌的对数生长期赤潮异弯藻、海洋原甲藻、伊姆裸甲藻、亚历山大藻中肋骨条藻和斯氏异冒藻藻液中；
32.其次：设置添加2216e培养基的对照组，每个组设置3个生物学重复；
33.最后：处理24h后，对培养体系中藻细胞密度进行计数，计算不同处理组的溶藻率。
34.作为本发明的一种优选技术方案，所述假交替单胞菌ld-b6菌剂的制作过程如下：
35.步骤1：木屑经过121℃、20min高温高压灭菌2次后，于烘箱烘干，作为载体；以质量分数15％的比例将载体加入到ld-b6菌液中；
36.步骤2：将吸附充分的木屑过滤，滤去多余未吸附的菌液，将吸附了菌液的木屑置于玻璃培养皿上，进行冷冻干燥，冻干时间24h；冻干完的菌剂，于4℃保存。
37.本发明的有益效果是：本发明所筛选的细菌分离自然水体中，对目标生物特异性高，且菌种容易培养，使用成本低，不会造成二次污染；本发明筛选出的假交替单胞菌ld-b6对夜光藻具有很强的溶藻效果，2％浓度的菌液对夜光藻的溶藻率在12h高达90％左右，且其溶藻物质稳定，在防控夜光藻赤潮方面具有很好的应用前景。
附图说明
38.图1为本发明的流程图；
39.图2为本发明不同菌种对夜光藻的溶藻效果图；
40.图3为本发明高效溶藻菌ld-b6对夜光藻的溶藻效果图；
41.(a)ld-b6处理0h细胞；(b)ld-b6处理12h细胞。
42.a图中标尺为100μm，也适用于b图。
43.图4为本发明不同浓度ld-b6菌液对夜光藻的溶藻效果图；
44.图5为本发明ld-b6不同处理液对夜光藻的溶藻效果图；
45.图6为本发明不同温度处理后的ld-b6溶藻物质对夜光藻的溶藻 效果图；
46.图7为本发明ld-b6对不同赤潮藻的溶藻效果图；
47.图8为本发明溶藻菌剂成品状态图。
具体实施方式
48.下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
49.实施例：请参阅图1-8，本发明提供一种技术方案：具有高效溶藻能力的假交替单胞菌的培养方法，具体步骤如下：
50.s1：溶藻菌的分离和筛选：菌种分离自连云港海域；将采集的水样分别通过梯度稀释涂布的方式接种到2216e固体培养基上，然后进行恒温培养；
51.s11：挑取特征差异明显的单菌落进行分区划线，28℃恒温培养48h，重复以上操作
两次，获得纯化的细菌；
52.s12：将纯化的菌株接种至2216e液体培养基中，28℃、180rpm培养36h后以2％体积比接种到夜光藻藻液中，即在24孔板中每孔分别加入20μl菌液 和1ml藻液；
53.s13：每4h在倒置显微镜下观察记录藻细胞形态变化，并计算其溶藻率；选出溶藻效果最强且最稳定的菌株作后续试验，并将该株细菌代号为ld-b6， 如图2和图3所示；溶藻率(％)＝(1-实验组藻细胞浓度/对照组藻细胞浓度)
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100％；其中夜光藻的藻细胞浓度使用肉眼观察法计数；
54.s2：ld-b6菌株鉴定及保藏：
55.s21：挑取溶藻菌单菌落于50μl无菌水中，100℃温浴10min后快速转移至冰上，取2μl的细菌裂解液用作模板，利用细菌鉴定通用引物16s-27f和16s-1492r进行pcr扩增；
56.s22：对扩增子进行测序；测序结果显示其与pseudoalteromonasflavipulchra同源性为99％，因此鉴定为假交替单胞菌pseudoalteromonasflavipulchra，命名为假交替单胞菌ld-b6，假交替单胞菌(pseudoalteromonas flavipulchra)ld-b6，已于2022年7月18日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：cgmccno：25345，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
57.s3：假交替单胞菌ld-b6的培养方法：
58.s31：将前期纯化的菌株转接到2216e固体斜面培养基上，28℃恒温培养48h后，4℃保存；
59.s32：在无菌条件下从固体斜面培养基上挑取单菌落于10ml 2216e液体培养基中，28℃、180rpm培养至指数生长期(od
600
:0.6-0.7)获得初级培养菌液；
60.s33：将初级培养菌液以1％浓度比接种于100ml液体培养基中，28℃、180rpm培养36h，获得假交替单胞菌ld-b6的菌液。
61.具有高效溶藻能力的假交替单胞菌的应用：
62.1：不同浓度溶藻菌对夜光藻的溶藻效果：将ld-b6的菌液与经过抗生素处理的夜光藻以0.5％、1％、2％和5％等不同体积比进行共培养；设置空白对照，对照组加入相同体积的2216e液体培养基。实验组与对照组均设置3个重复。每4h进行藻细胞浓度计数，并进一步计算溶藻率(图4)；
63.结果显示，以0.5％初始菌浓度将菌株ld-b6菌液加入夜光藻中，12h溶藻率为6.32％；以1％初始菌浓度添加时，12h溶藻效果为37.89％；以2％浓度添加时，12h溶藻率可达90.53％；而5％菌浓度在4h时对夜光藻溶藻率已高达100％。可见假交替单胞菌ld-b6对夜光藻具有较高的溶藻效率。
64.2：假交替单胞菌ld-b6溶藻方式的研究：取培养至稳定生长期(36h)的菌液分别作不同方式的处理：
①
为原菌液，即不经任何处理；
②
为菌液经12000rpm离心10min，取上清经0.22μm滤膜过滤后所得无菌滤液(平板菌落计数法证明无菌)；
③
为菌液经12000rpm离心10min后弃去上清，菌体经无菌ddh2o清洗3次，重悬于与菌液相同体积的无菌ddh2o中，即菌悬液；将以上三种不同方式处理得到的菌液，无菌滤液和菌悬液，按最佳体积比(2％)与经过抗生素处理的夜光藻共培养；以相同体积的2216e液体培养基为对照，实验组和对照组均设置三组平行；在光学显微镜下观测溶藻效果，并计算各处理组溶藻率 (图5)；
65.结果显示，ld-b6菌体本身没有溶藻活性，原菌液和无菌滤液的溶藻效果都很强，
表明该菌是通过分泌溶藻活性物质来溶解夜光藻，其溶藻方式为间接溶藻。
66.3：假交替单胞菌ld-b6溶藻物质稳定性研究：将制备的无菌滤液分别在-80、-20、0、15、30、80和100℃下静置2h，然后在室温下解冻或冷却；将滤液接种到藻液中，每个处理组设置三个平行；12h时计算各处理组溶藻率来检测溶藻物质的热稳定性。
67.结果显示不同温度处理组溶藻率无显著差异，表明其溶藻物质具有一定的稳定性，该菌种可用于制作溶藻菌粉。
68.4：假交替单胞菌ld-b6对典型有害藻种的作用：将溶藻细菌ld-b6菌液以2％的体积浓度接种于无菌的对数生长期赤潮异弯藻(heterosigmaakashiwo)、海洋原甲藻(prorocentrummicans)、伊姆裸甲藻(gymnodiniumimpudicum)、亚历山大藻中肋骨条藻(skeletonemacostatum)和斯氏异冒藻(heterocapsasteinii)藻液中，并设置添加2216e培养基的对照组，每个组设置3个生物学重复；处理24h后，对培养体系中藻细胞密度进行计数，计算不同处理组的溶藻率(图7)；
69.由图可知假交替单胞菌ld-b6对赤潮异弯藻、伊姆裸甲藻和斯氏异冒藻具有不同程度的溶藻作用，而对于海洋原甲藻和中肋骨条藻的溶藻效果较弱。
70.5：假交替单胞菌ld-b6菌剂的制作：木屑经过121℃、20min高温高压灭菌2次后，于烘箱烘干，作为载体；以质量分数15％的比例将载体加入到ld-b6菌液中。将吸附充分的木屑过滤，滤去多余未吸附的菌液，将吸附了菌液的木屑置于玻璃培养皿上，进行冷冻干燥，冻干时间24h；冻干完的菌剂，于4℃保存(图8)；
71.实验室评估结果表明，0.2％(质量/体积)的冻干的菌剂添加量可在12h实现100％的溶藻率。
72.以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.具有高效溶藻能力的假交替单胞菌的培养方法，其特征在于：具体步骤如下：s1：溶藻菌的分离和筛选：菌种分离自沿海城市海域；将采集的水样分别通过梯度稀释涂布的方式接种到2216e固体培养基上，然后进行恒温培养；s11：挑取特征差异明显的单菌落进行分区划线，28℃恒温培养48h，重复以上操作两次，获得纯化的细菌；s12：将纯化的菌株接种至2216e液体培养基中，28℃、180rpm培养36h后以2％体积比接种到夜光藻藻液中，即在24孔板中每孔分别加入20μl菌液和1ml藻液；s13：每4h在倒置显微镜下观察记录藻细胞形态变化，并计算其溶藻率；选出溶藻效果最强且最稳定的菌株作后续试验，并将该株细菌代号为ld-b6；s2：ld-b6菌株鉴定及保藏：s21：挑取溶藻菌单菌落于50μl无菌水中，100℃温浴10min后快速转移至冰上，取2μl的细菌裂解液用作模板，利用细菌鉴定通用引物16s-27f和16s-1492r进行pcr扩增；s22：对扩增子进行测序；测序结果显示其与pseudoalteromonasflavipulchra同源性为99％，因此鉴定为假交替单胞菌pseudoalteromonasflavipulchra，命名为假交替单胞菌ld-b6；s3：假交替单胞菌ld-b6的培养方法：s31：将前期纯化的菌株转接到2216e固体斜面培养基上，28℃恒温培养48h后，4℃保存；s32：在无菌条件下从固体斜面培养基上挑取单菌落于10ml2216e液体培养基中，28℃、180rpm培养至指数生长期(od
600
:0.6-0.7)获得初级培养菌液；s33：将初级培养菌液以1％浓度比接种于100ml液体培养基中，28℃、180rpm培养36h，获得假交替单胞菌ld-b6的菌液。2.根据权利要求1所述的具有高效溶藻能力的假交替单胞菌的培养方法，其特征在于：所述s13中的溶藻率(％)＝(1-实验组藻细胞浓度/对照组藻细胞浓度)
×
100％；其中夜光藻的藻细胞浓度使用肉眼观察法计数。3.具有高效溶藻能力的假交替单胞菌的应用，其特征在于：包括不同浓度溶藻菌对夜光藻的溶藻效果；假交替单胞菌ld-b6的溶藻方式；假交替单胞菌ld-b6溶藻物质的稳定性；假交替单胞菌ld-b6对典型有害藻种的作用和假交替单胞菌ld-b6菌剂的制作。4.根据权利要求3所述的具有高效溶藻能力的假交替单胞菌的应用，其特征在于：所述不同浓度溶藻菌对夜光藻的溶藻效果的实验方法如下：将假交替单胞菌ld-b6的菌液与经过抗生素处理的夜光藻以0.5％、1％、2％和5％不同体积比进行共培养，设置空白对照，对照组加入相同体积的2216e液体培养基；实验组与对照组均设置3个重复；每4h进行藻细胞浓度计数，并进一步计算溶藻率。5.根据权利要求3所述的具有高效溶藻能力的假交替单胞菌的应用，其特征在于：所述假交替单胞菌ld-b6溶藻方式的具体过程如下：步骤1：取培养至稳定生长期(36h)的菌液分别作不同方式的处理：
①
为原菌液，即不经任何处理；
②
为菌液经12000rpm离心10min，取上清经0.22μm滤膜过滤后所得无菌滤液(平板菌落计数法证明无菌)；
③
为菌液经12000rpm离心10min后弃去上清，菌体经无菌ddh2o清洗3次，重悬于与菌液相同体积的无菌ddh2o中，即菌悬液；
步骤2：将以上三种不同方式处理得到的菌液，无菌滤液和菌悬液，按体积比(2％)与经过抗生素处理的夜光藻共培养；以相同体积的2216e液体培养基为对照，实验组和对照组均设置三组平行；步骤3：在光学显微镜下观测溶藻效果，并计算各处理组溶藻率。6.根据权利要求3所述的具有高效溶藻能力的假交替单胞菌的应用，其特征在于：所述假交替单胞菌ld-b6溶藻物质稳定性的探究实验步骤如下：步骤1：将制备的无菌滤液分别在-80、-20、0、15、30、80和100℃下静置2h，然后在室温下解冻或冷却；步骤2：将滤液接种到藻液中，每个处理组设置三个平行；步骤3：12h时计算各处理组溶藻率来检测溶藻物质的热稳定性。7.根据权利要求3所述的具有高效溶藻能力的假交替单胞菌的应用，其特征在于：所述假交替单胞菌ld-b6对典型有害藻种的作用：首先：将溶藻细菌ld-b6菌液以2％的体积浓度接种于无菌的对数生长期赤潮异弯藻、海洋原甲藻、伊姆裸甲藻、亚历山大藻中肋骨条藻和斯氏异冒藻藻液中；其次：设置添加2216e培养基的对照组，每个组设置3个生物学重复；最后：处理24h后，对培养体系中藻细胞密度进行计数，计算不同处理组的溶藻率。8.根据权利要求3所述的具有高效溶藻能力的假交替单胞菌的应用，其特征在于：所述假交替单胞菌ld-b6菌剂的制作过程如下：步骤1：木屑经过121℃、20min高温高压灭菌2次后，于烘箱烘干，作为载体；以质量分数15％的比例将载体加入到ld-b6菌液中；步骤2：将吸附充分的木屑过滤，滤去多余未吸附的菌液，将吸附了菌液的木屑置于玻璃培养皿上，进行冷冻干燥，冻干时间24h；冻干完的菌剂，于4℃保存。

技术总结
本发明公开了具有高效溶藻能力的假交替单胞菌的培养方法及其应用，培养方法步骤如下：溶藻菌的分离和筛选：菌种分离自沿海城市海域；将采集的水样分别通过梯度稀释涂布的方式接种到2216E固体培养基上，然后进行恒温培养；LD-B6菌株鉴定及保藏和假交替单胞菌LD-B6的培养方法；本发明所筛选的细菌分离自然水体中，对目标生物特异性高，且菌种容易培养，使用成本低，不会造成二次污染；本发明筛选出的假交替单胞菌LD-B6对夜光藻具有很强的溶藻效果，2％浓度的菌液对夜光藻的溶藻率在12h高达90％左右，且其溶藻物质稳定，在防控夜光藻赤潮方面具有很好的应用前景。潮方面具有很好的应用前景。潮方面具有很好的应用前景。


技术研发人员：姬南京 王君玥 李俊佳 毛宁 黄文聪 徐名杨 申欣
受保护的技术使用者：江苏海洋大学
技术研发日：2022.08.23
技术公布日：2023/8/14