抗原靶向、抗CD16A和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白及其应用的制作方法

抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白及其应用。


背景技术：

2.自然杀伤细胞(nk细胞)是一种天然免疫细胞，能够非常有效地破坏应激细胞，如病毒感染或肿瘤转化细胞。nk细胞具有不受mhc限制的细胞毒性、产生细胞因子和免疫记忆等功能，使其成为免疫反应系统中的关键角色。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)是一种有效的细胞毒性机制，主要通过自然杀伤(nk)细胞介导。通过cd16a的adcc作用是nk细胞抗肿瘤效应的主要机制之一。当特异性抗体结合到靶向肿瘤细胞膜上以后，免疫细胞通过该反应诱导细胞死亡。
3.抗体和免疫细胞的相互作用通过fc受体(fcr)家族发生。在人类中，igg的fcr家族(fcγr)由6个受体组成：fcγri/cd64、fcγriia/cd32a、fcγriib/cd32b、fcγriic/cd32c、fcγriiia/cd16a和fcγriiib/cd16b，其中cd16a主要触发nk细胞介导的adcc。通常情况下，adcc效应主要通过结合fcγriii(cd16)的抗体激活nk细胞。人类nk细胞分为两个主要亚群：cd56 bright和cd56 dim。cd56 bright nk细胞是强有力的细胞因子产生者，但缺乏cd16a；而cd56dim具有高度的细胞毒性，表达cd16a。当通过cd16a识别igg调理的靶点时，nk细胞就会释放不同的细胞毒性分子，从而引发靶细胞的死亡。这种机制依赖于免疫突触的形成和含有穿孔素和颗粒酶的溶解颗粒的脱颗粒。除了脱颗粒外，nk细胞还可以通过将靶死亡受体(如dr4、dr5或fas)与其死亡受体配体(如fasl和trail)结合来清除靶细胞。
4.cd16a是一种跨膜受体，具有短的c-ter胞质尾，并具有两个细胞外ig样结构域。cd16a与igg的ch2以1:1的方式相互作用，其中ch2上的n297位的n-聚糖链在这种相互作用中也起着关键作用。cd16a在其细胞质尾部没有itam结构域，因此需要两条含有itam结构域的细胞内链串联的帮助，cd3ζ和fc∈riγ。cd16a结合后，属于src家族的激酶lck被激活，并磷酸化cd3ζ和/或fc∈riγ的itam结构域。磷酸化的itam允许来自syk家族的激酶招募和磷酸化，例如syk和zap-70，它们反过来负责后续的信号传导。在它们的底物中，pi3k是高度相关的，因为它将pip2转化为pip3，pip3经plc-γ处理后释放ip3和dag。dag激活pkc家族，这有助于触发脱颗粒。ip3诱导钙从内质网释放，这种钙内流是adcc触发的主要信号之一，也导致核内nfat易位，诱导其靶基因的转录。cd16a参与激活的其他途径也有助于adcc，例如erk2 mapk途径。cd16a依赖性nk细胞杀伤后，cd16a迅速下调。cd16a脱落的机制之一是由去整合素和金属蛋白酶17(adam17)介导的，后者在nk细胞上表达。adam17对cd16a的切割发生在顺式结构中，这意味着表达adam17的nk细胞不能在另一个nk细胞上诱导cd16a脱落。激活后cd16a下调的另一个机制是内化，这不仅发生在cd16a上，也发生在其他细胞内信号成分上，如cd3ζ、zap-70和syk。
5.nk细胞作为先天性免疫细胞中的杀伤细胞，可直接杀伤病原体和肿瘤细胞。与t细
胞相比，nk细胞具有更强的肿瘤识别和杀伤能力，以及更强的现货型应用的潜质。如何改造治疗性抗体药物的恒定区(fc端)使其更好地激活先天免疫反应，增强抗体依赖的细胞毒作用(adcc，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)，如何评估能够特异性结合cd16a的双(多)抗药效是药物研发科学家所感兴趣的问题。目前提高adcc作用的策略主要从下面几个方面：
6.(1)细胞因子：提高adcc活性的一个简单方法是用促炎细胞因子刺激nk细胞。nk细胞移植已在多个临床试验中成功进行，例如通过输注细胞因子诱导记忆样(ciml)nk细胞，最常用的细胞因子组合包括il-12、il-15和il-18。ciml nk细胞比传统nk细胞表达更多的ifn-γ，对白血病细胞和原发性急性髓系白血病(aml)母细胞显示出优越的细胞毒性。il-12会增加nk细胞产生ifn-γ和tnf-α，在一项i/ii期临床试验中，西妥昔单抗与il-12联合应用于无法切除或复发的头颈部鳞状细胞癌患者。与无进展生存期(pfs)小于100天的患者相比，pfs大于100天的患者nk细胞在体外具有更高的adcc活性。il-15是nk和cd8+t细胞生存和功能所必需的细胞因子。n-803是一种突变的n72d il-15超激动剂，在临床前模型和临床试验中显示出增强的nk细胞体外和体内活性。此外，它还增加了nk和cd8+t细胞的数量。
7.(2)抑制adam17：adam17是激活后cd16a下调的主要驱动因素。改善nk细胞adcc的一种策略是通过靶向adam17来防止cd16a脱落。研究发现，对nk细胞中使用crispr/cas9技术敲除adam17，显示出更好的ifn-γ生成和体内外adcc活性。然而，也有研究显示，阻断adam17降低了nk细胞的存活率以及cd16a介导的连环杀伤，细胞无法与靶细胞分离，阻碍其运动到另一个靶细胞。总之，adam17抑制的益处尚不清楚，结果也有争议。这一策略是否能够成功，有待于一项正在进行的临床试验(nct04023071)结果，该试验将评估携带不可切割cd16a的ipsc衍生nk细胞在aml和b细胞淋巴瘤中的应用。
8.(3)工程化抗体：抗体的fc部分进行工程化改造，可以增加fc对cd16a的亲和力，并随后改善adcc。一些突变非常流行，例如，所谓的gasdalie，由fc中的4个替换组成：g236a/s239d/a330l/i332e。该突变显示对cd16a的亲和力显著增加，而cd32b亲和力几乎没有增加。另一个突变称为突变体18(f243l/r292p/y300l/v305i/p396l)，adcc显著增加。这些突变现已作为抗her2抗体margetuximab进入临床，并在i期治疗各种her2阳性癌时显示出良好的效果。此外，抗体fc n-聚糖的糖工程化有望增加对cd16a的亲和力。研究最多的糖修饰是去糖基化，例如去岩藻糖修饰。这种修饰导致与cd16a的结合增加，adcc改善。这项技术已被用于抗cd20抗体obinutuzumab。
9.(4)nk细胞接合器：除了工程化抗体之外，还可以研究抗体的形式。基于双特异性t细胞接合器(bite)策略的成功，为nk细胞开发了一种类似的形式，即所谓的双特异性杀伤细胞接合器(bike)。bike由两个scfv通过连接序列组成，一个单链抗体靶向cd16a，另一个靶向肿瘤抗原。此外，还有三特异性杀伤细胞接合器(trike)，有2种肿瘤抗原与cd16a一起被靶向，或者添加il-15代替第三种单链抗体。这种结构的使用允许nk细胞重新定位到肿瘤细胞，并导致针对靶细胞的强大adcc作用。afm13是一种针对cd16a和cd30的双特异性抗体，目前处于临床ⅱ期，用于治疗外周t细胞淋巴瘤、转化型蕈样变性和霍奇金淋巴瘤。在一项治疗复发或难治性霍奇金淋巴瘤的ib临床研究中，afm13与pembrolizumab的联合治疗产生了88％的客观反应率，总反应率为83％。gtb-3550是一种cd16/cd33/il-15的trike形式，目前正在进行多种类型白血病的i/ii期试验研究(nct03214666)。
10.然而，在大多数肿瘤中包括肠癌，肾癌，肝癌，乳腺癌和肺癌发现其肿瘤微环境中nk细胞的数目极少。因此，业内发展一种利用cd16a的活性来治疗癌症的免疫治疗方法，如具有肿瘤表面抗原特异性的抗体以及nk细胞cd16a特异性的抗体形成的双特异性分子，目前已经开发了her2/neu和cd16a的双特异性抗体，比单独的her2抗体具有更强的抗肿瘤活性；afm13，一种特异性结合cd16a和cd30的双特异性抗体，通过结合nk细胞或单核细胞表面的cd16分子，使这些免疫效应细胞靶向表达cd30的肿瘤细胞进行杀伤，该抗体在霍奇金氏瘤的小鼠模型中还是患者中都表现出清除肿瘤的效果。但是传统的cd16a抗体或者抗cd16a抗原结合蛋白暴露一段时间会导致nk细胞衰竭或者nk细胞毒性效力减低，进而影响nk细胞的肿瘤杀伤作用。导致cd16a双抗不能长期给药，影响其效果。
11.白细胞介素-15(interleukin-15，il-15)是一种长14
–
15kda的细胞因子，对于nk细胞、nkt细胞和memory cd8+t细胞功能非常重要。il-15通过与其受体il-15rα结合产生具有极高生物效价的复合物il-15超激动剂(il-15sa)后一起被转导转运至靶细胞。il-15sa强烈激活响应表达il-15r的细胞，特别是nk细胞/t细胞，从而促进抗肿瘤和抗病毒功能。il-15具有广泛的免疫调节作用，能够参与调节t细胞，特别是nk细胞、记忆性cd8+t细胞的存活、增殖与功能。il-15与il-2结构十分相似，同属于螺旋型细胞因子家族。il-15的异三聚体受体与il-2受体共用il-2r/il-15rβ(cd122)和共同γc链(cd 132)，由于这些共同的受体成分和共用jak 1/jak 3/stat 5信号通路，il-15与il-2具有相同的功能，包括刺激t细胞增殖、产生细胞毒性t淋巴细胞、刺激b细胞合成免疫球蛋白以及nk细胞的产生和持续存活。在许多适应性免疫应答中，il-2和il-15具有独特且常为竞争性的作用。主要有以下四点：1、il-2可以调节tregs细胞的激活，而il-15则不能调节。2、il-2可以通过激活诱导的cd8+效应t细胞的细胞死亡从而抑制t细胞反应。3、il-15对nk、效应细胞cd8+和记忆表型cd8+t细胞的分化起着必不可少的作用。4、临床前研究标明，il-15与il-2的毒性不同，与il-2相比，il-15几乎观察不到血管毛细血管渗漏。这些因素使得il-15成为肿瘤免疫策略中更具潜力的细胞因子。目前有多个il-15靶点产品仍处于临床试验阶段，其中最值得关注的是il-15超级激动剂n-803，为il-15蛋白n72d突变后结合il-15ra及igg1fc共同表达的融合蛋白，2022年5月23日，immunitybio向fda递交il-15超级激动剂n-803的上市申请，用于与卡介苗(bcg)联合治疗卡介苗不响应的非肌肉浸润性膀胱癌(nmibc)。2021年公布的临床数据，n-803+bcg联合治疗效果显著，cr率达到71％(59/83)，平均cr维持时间为24.1个月。一项1期临床实验显示，nivolumab(pd-1抗体，opdivo)联合n-803治疗转移性非小细胞肺癌的能够明显延长患者长期生存。基因泰克与xencor公司合作开发il-15细胞因子目前正在进行联用tecentriq临床研究。恒瑞医药的shr-1501(il-15融合蛋白)于2019年5月14日获批开展shr-1501临床试验。此外，shr-1316(pd-l1单抗药物)将联合shr-1501用于治疗失败的晚期恶性肿瘤患者。然而，细胞因子在临床上的使用存在着单药给药靶向性差的缺点，只有高浓度给药才可以达到抗肿瘤作用，而高浓度给药会产生免疫抑制作用和高毒性。并且，非靶向性细胞因子对于免疫系统的激活是系统性的，免疫系统被广泛的激活，具有致命的副作用。此外，由于细胞因子属于小分子量蛋白，不具备抗体的体内循环保护机制，单纯的细胞因子往往半衰期较短，需要短时间重复高剂量给药。目前临床研究药物多采用peg化或者fc融合来提高细胞因子的半衰期，虽然半衰期得以延长，但仍无法解决细胞因子的靶向性差的问题。


技术实现要素：

12.本发明的第一目的是提供一种新型的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，以解决背景技术中的问题。
13.本发明提供的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白包括：特异性结合cd16a的cd16a结合区、特异性结合肿瘤相关抗原(taa)的taa结合区、il-15和il-15rα结合形成的il-15/il-15rα复合物、以及fc结构域。本发明提供的三功能融合蛋白不仅同时靶向cd16a和taa，还融合了il-15/il-15rα复合物以及fc结构域，其具有独特的组分并形成了独特的构型。此外，本发明的三功能融合蛋白利用il-15及il-15rα分别替代双特异抗体的其中一个抗体结构中的cl及ch1结构域，通过il-15与il-15rα之间的超高的亲和力(kd约30-100pm)形成的il-15/il-15rα结构，确保双特异抗体轻重链之间正确配对，进而解决双特异抗体轻链错配问题。同时，三功能融合蛋白cd16a抗体靶向nk细胞到肿瘤部位，并在肿瘤细胞附近激活nk细胞。传统的cd16a抗体或者抗cd16a抗原结合蛋白暴露一段时间会导致nk细胞衰竭或者nk细胞毒性效力减低，导致cd16a抗体不能长期给药，影响肿瘤治疗其效果，但受损的nk细胞毒性可以通过本发明三功能融合蛋白结构当中的细胞因子il-15和il-15rα刺激而恢复，进而增强nk细胞的肿瘤细胞杀伤作用，解决了cd16a抗体导致的nk细胞耗竭和肿瘤细胞毒性减弱问题。il-15和il-15rα刺激nk细胞和t细胞等免疫效应细胞的增殖和激活，大大增强机体对肿瘤的免疫抑制活性。
14.可选的，所述cd16a结合区包括抗cd16a抗体或其抗原结合片段。
15.可选的，所述cd16a结合区为靶向cd16a的fab片段或fv片段。
16.可选的，所述taa结合区包括抗taa抗体或其抗原结合片段。
17.可选的，所述taa结合区为靶向taa的fab片段或fv片段。
18.可选的，所述的融合蛋白还包括连接片段；所述连接片段的氨基酸序列优选为若干个gs重复序列。
19.可选的，所述融合蛋白包含若干条肽链，所述il-15和所述il-15rα分别位于不同肽链上。
20.可选的，所述的融合蛋白包括：第一单体和第二单体；所述第一单体包括：所述的taa结合区和第一fc链；所述第二单体包括：所述的cd16a结合区、所述的il-15/il-15rα复合物和第二fc链；所述第一fc链和所述第二fc链聚合形成所述的fc结构域。
21.可选的，所述taa结合区为靶向taa的fab片段；所述cd16a结合区为靶向cd16a的fv片段。
22.可选的，所述的融合蛋白包括：第一单体和第二单体；所述第一单体包括：所述的cd16a结合区和第一fc链；所述第二单体包括：所述的taa结合区、所述的il-15/il-15rα复合物和第二fc链；所述第一fc链和所述第二fc链聚合形成所述的fc结构域。
23.可选的，所述cd16a结合区为靶向cd16a的fab片段；所述taa结合区为靶向taa的fv片段。
24.可选的，所述第一单体包括第一肽链和第二肽链，所述第二单体包括第三肽链和第四肽链；所述第一肽链包括：由vl结构域和cl结构域融合形成的轻链；所述第二肽链包括：由vh结构域、ch1结构域和第一fc链融合形成的重链；所述第三肽链包括：抗体可变区、细胞因子和第二fc链；所述第四肽链包括：抗体可变区、细胞因子；所述第一肽链的vl结构
域、cl结构域，以及所述第二肽链的vh结构域、ch1结构域配对形成fab片段；所述第三肽链的抗体可变区和所述第四肽链的抗体可变区配对形成fv片段；所述第三肽链的细胞因子和所述第四肽链的细胞因子结合形成所述的il-15/il-15rα复合物；其中，所述的fab片段靶向taa，所述的fv片段靶向cd16a；或者，所述的fab片段靶向cd16a，所述的fv片段靶向taa。
25.可选的，配对形成所述fv片段的抗体可变区选自vh结构域和vl结构域；所述的细胞因子选自il-15和il-15rα。
26.可选的，配对形成所述fv片段的vh结构域和vl结构域之间具有一对或多对二硫键，并且包含以下突变组合形式的任意一种以上，根据eu计数：
[0027][0028]
可选的，自肽链的n端到c端，所述第三肽链的融合顺序为：抗体可变区～细胞因子～第二fc链，或为：细胞因子～抗体可变区～第二fc链；自肽链的n端到c端，所述第四肽链的融合顺序为：抗体可变区～细胞因子；或为：细胞因子～抗体可变区；“～”表示连接片段。
[0029]
可选的，所述il-15包括：il-15及其能结合il-15ra的突变，截短及各种衍生物；所述il-15ra包括：il-15ra及其能结合il-15的突变，截短及各种衍生物；优选地，所述il-15包括但不限于以下任意一组合所示的突变方式，计数方式根据il-15的氨基酸序列的第一个氨基酸开始算为第1位；
[0030]
[0031][0032]
或者，所述il-15/il-15ra复合物包括但不限于以下任意一组合所示的突变方式，计数方式根据il-15或il-15ra的氨基酸序列的第一个氨基酸开始算为第1位；
[0033]
组合il15il15ra1wtd962wtd96/p973wtd96/p97/a984e87cd96/c975e87cd96/p97/c986e87cd96/c97/a987v49cs40c8l52cs40c9e89ck34c10q48cg38c11e53cl42c12c42sa37c13l45cg38c14l45ca37c。
[0034]
可选的，所述taa选自cd20、cd19、cd30、cd33、cd38、cd40、cd52、slamf7、gd2、cd24、cd47、cd133、cd217、cd239、cd274、cd276、cea、epcam、trop2、tag72、muc1、muc16、mesothelin、folr1、cldn18.2、egfr、egfr viii、c-met、her2、fgfr2、fgfr3、psma、psca、epha2、adam17、17-a1、nkg2d ligands、mcsp、lgr5、ssea3、slc34a2、bcma、gpnmb、ccr4、vegfr-2、cd6、整合素α4、pdgfrα、neugcgm3、整合素αvβ3、cd51、ctaa16.88、cd22、ror1、cspg4、ss1或igfr1。
[0035]
可选的，所述fc结构域选自human igg1 fc、human igg2 fc、human igg3 fc、human igg4 fc或其变异体，优选自igg1 fc、或human igg4 fc或其变异体；所述fc结构域
为fc异源二聚体形式；优选地，所述fc异源二聚体包含但不限于以下突变的组合，以下突变为根据eu计数：
[0036][0037]
可选的，所述fc结构域选择消除免疫效应功能，优选包含以下任一突变方式，以下突变为根据eu计数：
[0038][0039]
可选的，所述第一fc链不结合protein a，优选包括突变h435r或h435r/y436f，根据eu计数；所述第二fc链能够结合protein a。
[0040]
可选的，所述cd16a结合区包括序列如seq id no:39所示的vh结构域和seq id no:38所示的vl结构域；或者，所述il-15的序列如seq id no:46或47所示；或者，所述il-15ra的序列如seq id no:48至54中任意一项所示；优选的，所述cd16a结合区的vh和vl之间，和/或所述il-15与il-15ra之间，至少具有一对以上二硫键。
[0041]
可选的，所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白由以下任意一组序列所示或与其具有90％以上同一性的氨基酸片段融合得到：
[0042]
(1)seq id no:01、02、03、04；
[0043]
(2)seq id no:01、05、03、06；
[0044]
(3)seq id no:07、08、09、10；
[0045]
(4)seq id no:01、02、11、12；
[0046]
(5)seq id no:01、02、13、14；
[0047]
(6)seq id no:01、05、11、15；
[0048]
(7)seq id no:01、05、13、16。
[0049]
可选的，所述抗原还包括：传染性疾病相关抗原、病原体、免疫功能相关抗原。
[0050]
本发明还提供了一种核酸分子，其编码上述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白。
[0051]
本发明还提供了一种药物组合物，其含有上述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，以及药学上可接受的载体。
[0052]
本发明还提供了上述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白在制备用于抑制或治疗癌症、感染和免疫调节疾病的药物中的应用。
[0053]
所述癌症包括前列腺癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、黑色素瘤、肾癌、口腔癌、咽癌、胰腺癌、子宫癌、甲状腺癌、皮肤癌、头颈癌、宫颈癌、卵巢癌或血液系统癌症。
[0054]
本发明另提供一种蛋白的复合单元，所述复合单元包括：第一可变区、第二可变区、第一细胞因子、第二细胞因子、若干连接片段；所述第一可变区通过连接片段与所述第一细胞因子融合；所述第二可变区通过连接片段与所述第二细胞因子融合；所述第一可变区和第二可变区选自vh结构域或vl结构域，并且所述第一可变区和第二可变区配对形成特异性结合cd16a的fv片段；所述第一细胞因子和第二细胞因子选自il15或il15rα，所述il-15和所述il-15rα分别位于不同肽链上，并且所述第一细胞因子和第二细胞因子结合形成il15/il15rα复合物；优选的，所述vh结构域和所述vl结构域之间，和/或所述il15和il15rα之间，具有一对以上的二硫键。
[0055]
发明的有益效果：
[0056]
(1)本发明提供的三功能融合蛋白包括特异性结合cd16a的cd16a结合区、特异性结合肿瘤相关抗原(taa)的taa结合区、il-15和il-15rα结合形成的il-15/il-15rα复合物、以及fc结构域，不仅能够同时靶向cd16a和taa，还融合了il-15/il-15rα复合物以及fc结构域，其具有独特的组分并形成了独特的构型。
[0057]
(2)本发明设计的taa/cd16a/il15三功能融合蛋白通过同时结合肿瘤细胞上的肿瘤相关抗原(taa)和nk细胞上的cd16a，将nk细胞靶向肿瘤，nk细胞释放穿孔素、颗粒酶，引发细胞凋亡并导致肿瘤细胞死亡。细胞因子il15扩增并维持nk细胞功能，刺激免疫细胞增殖，改变肿瘤的免疫微环境。
[0058]
(3)本发明构建的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，具有il-15/il-15rα活性，能够将细胞因子靶向到肿瘤部位，可以特异的在肿瘤部位扩增和活化免疫效应细胞(nk细胞及t细胞)，使免疫细胞数目以及杀伤性细胞因子的释放增加，更加有效地激活免疫反应杀伤肿瘤细胞。
[0059]
(4)将il-15和il-15rα替换抗体结构中的cl和ch1结构域，利用il-15和il-15rα的高亲和力形成il-15/il-15rα复合物，从而实现双特异抗体轻链的正确配对，解决双特异性抗体轻链错配问题。另外，可通过氨基酸序列突变，在vh和vl之间，以及il-15和il-15rα之间添加一对或多对二硫键，进一步地增强轻链/重链间的结合活性，结合fc异源二聚体技术解决双特抗体重链错配问题，更有效克服双特异性抗体制备过程中轻链、重链错配、副产物高、稳定性差等挑战，制备得到正确配对的多功能融合蛋白，同时，缩短多功能融合蛋白开发周期，降低生产成本。
[0060]
(5)可保留fc结构域的效应功能，或采用消除免疫效应形式的fc结构域。采用消除免疫效应形式的fc结构域使fc不能结合fcrγiii(cd16a)。本发明的融合蛋白若保留fc结构域的效应功能，也观察到免疫细胞相对应的激活效果。
附图说明
[0061]
图1至图9分别为本发明的不同实施例中的三功能融合蛋白的结构形式示意图。
[0062]
图10为facs检测三功能蛋白结合hl60细胞的结果图。
[0063]
图11为facs检测cd38/cd16a/il-15三功能融合蛋白结合daudi细胞的结果图。
[0064]
图12为elisa检测三功能分子结合cs1蛋白的结果图。
[0065]
图13为cck8检测taa/cd16a/il-15三功能融合蛋白对mo7e细胞增殖实验的结果图。
[0066]
图14为cck8检测taa/cd16a/il-15三功能融合蛋白对mo7e细胞增殖实验的结果图。
[0067]
图15为cck8检测taa/cd16a/il-15三功能融合蛋白对mo7e细胞增殖实验的结果图。
[0068]
图16为效靶比10:1的cd33/cd16a/il-15三功能融合蛋白介导的adcc作用的结果图。
[0069]
图17为效靶比10:1的cd33/cd16a/il-15三功能融合蛋白介导的adcc作用的结果图。
[0070]
图18为效靶比20:1的cd33/cd16a/il-15三功能融合蛋白介导的adcc作用的结果图。
[0071]
图19为效靶比10:1的cd38/cd16a/il-15三功能融合蛋白介导的adcc作用的结果图。
[0072]
图20为效靶比5:1的cd33/cd16a/il-15三功能融合蛋白介导的adcp的结果图。
[0073]
图21为cd33/cd16a/il-15三功能融合蛋白介导的adcp的结果图。
具体实施方式
[0074]
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其他技术和科学术语都具有本领域技术人员通常理解的含义。
[0075]
术语
[0076]
术语“融合”指由肽键直接连接或借助连接片段连接组分，或通过分子间相互作用非共价融合或通过一个或多个二硫键或化学交联共价融合。在单条肽链中，融合是指由肽键直接连接或借助连接片段连接。“多功能融合蛋白”是指包含两个或更多个抗原结合结构域的蛋白，能够结合两个或更多个不同的表位(例如，两个、三个或更多个不同的表位)，多功能融合蛋白还可以包含细胞因子(例如il-15、il-15ra)等。“融合位置”是指功能区或者结构域在肽链中的位置，指示该肽链上各功能片段的连接顺序。
[0077]
术语“多肽”是指任何长度的氨基酸链，包括蛋白质及其片段。本发明将多肽公开为氨基酸残基序列。那些序列按氨基末端到羧基末端的方向从左到右书写。根据标准命名法，氨基酸残基序列以三字母或单字母代码命名，如下所示：丙氨酸(ala,a)、精氨酸(arg,r)、天冬酞胺((asn,n)、天冬氨酸(asp，d)、半肌氨酸(cys,c)、谷氨酞胺(gln,q)、谷氨酸(glu,e)、甘氨酸(gly,g)、组氨酸(his,h)、异亮氨酸(i1e，i)、亮氨酸(leu,l)、赖氨酸(lys,k)、甲硫氨酸(met,m)、苯丙氨酸(phe，f)、脯氨酸(pro,p)、丝氨酸(ser,s)、苏氨酸(thr,t)、
色氨酸(trp,w)、酪氨酸(tyr,y)和缬氨酸(val,v)。
[0078]
术语“肽链”指由肽键线性连接氨基酸的分子。
[0079]
术语“变异体”或“突变体”是指与包含的氨基酸或核苷酸有所不同但保持基本特性的多肽或多核苷酸。通常变异体之间或者变异体与母本抗体之间的差异是有限的，氨基酸序列总体上非常相似。本说明书中，将变异前的抗体或抗体片段称为母本抗体，变异后的抗体或抗体片段称为变异体。变异体仍具有抗原结合活性。
[0080]
术语“抗体”(antibody，ab)指包含至少一个抗原结合位点并能特异性结合抗原的免疫球蛋白分子(immunoglobulin，ig)。
[0081]
术语“抗原”是在机体内能诱发免疫应答且与抗体特异性结合的物质。抗体与抗原的结合依靠二者间形成的相互作用来介导，包括氢键、范德华力、离子键以及疏水键。抗原表面与抗体结合的区域为“抗原决定簇”或“表位”，一般来说，每个抗原有多个决定簇。
[0082]
本发明所提及的术语“抗体”以其最广泛的含义理解，并包含单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、抗体片段、包含至少两个不同的抗原结合结构域的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。抗体还包括鼠源抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体以及其它来源的抗体。本发明的抗体可以来源于任何动物，包括但不限于人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、牛、马、鸡、骆驼、羊驼的免疫球蛋白分子等。抗体可以含有另外的改变，如非天然氨基酸，fc效应子功能突变和糖基化位点突变。抗体还包括翻译后修饰的抗体、包含抗体的抗原决定簇的融合蛋白，以及包含对抗原识别位点的任何其它修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体展现出所期望的生物活性。换句话说，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即至少含有一个抗原结合结构域的分子。
[0083]
抗体的基本结构是由两条完全相同的重链(heavy chain，h)和两条完全相同的轻链(light chain，l)通过二硫键连接的呈y形的单体。每条链分别由2～5个约含110个氨基酸，序列相似但功能不同的结构域(又称功能区)组成。抗体分子中轻链和重链靠近n端的氨基酸序列变化较大，形成的结构域称为可变区(variable region，v区)；靠近c端的氨基酸序列相对恒定的区域称为恒定区(constant region，c区)。
[0084]
重链和轻链的v区分别称为vh和vl，vh和vl各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序高度可变，称为高变区(hypervariable region，hvr)；该区域形成与抗原表位互补的空间构象，又被称为互补决定区(complementarity determining region，cdr)。vh的3个cdr分别用vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3表示，vl的3个cdr分别用vlcdr1、vlcdr2、vlcdr3表示。vh和vl共6个cdr共同组成抗原结合部位(antigen-binding site)。cdr区氨基酸的多样性是抗体与数量庞大的不同抗原特异性结合的分子基础。v区中cdr之外的氨基酸组成和排列顺序相对变化不大，称为骨架区(framework region，fr)。vh和vl各有4个骨架区(或称框架区)，分别用fr1、fr2、fr3、fr4表示。每个vh和vl有三个cdr和四个fr组成，从氨基端到羧基端排列顺序为：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。
[0085]
根据抗体重链恒定区的氨基酸序列，可以将人免疫球蛋白分为5类：igm、igg、iga、igd、ige。其还可以进一步分成不同的亚类(同种型)，如人igg可以分为igg1、igg2、igg3、igg4；iga可分为iga1和iga2。igm、igd、ige尚未发现有亚类。根据轻链氨基酸序列，可将轻链分类为κ链和λ链。本发明的抗体可以是任何种类(如igm、igg、iga、igd、ige)或亚类(如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2)。
[0086]
重链和轻链的恒定区分别称为ch和cl。igg、iga、igd的重链恒定区有ch1、ch2、ch3三个结构域，igm、ige的重链恒定区有ch1、ch2、ch3、ch4四个结构域。
[0087]
铰链区(hinge region)位于ch1和ch2之间，含有丰富的脯氨酸，因此易伸展弯曲，能改变y形两个臂之间的距离，有利于两臂同时结合抗原表位。
[0088]
术语“fab片段”为抗原结合片段(fragment of antigen binding,fab)，意指由vl、vh、cl和ch1结构域组成的抗体片段，与单个抗原表位结合(单价)。本领域技术人员可知，在一定条件下，抗体分子链的某些部分易被蛋白水解酶水解为各种片段。木瓜蛋白酶从铰链区的近n端，将抗体分子水解为2个完全相同的抗原结合片段(fab)和一个可结晶片段(fc)。
[0089]
术语“fv片段”是由l链和h链的v区(vh+vl)组成的单价小分子，是与抗原结合的最小功能片段。
[0090]
术语“fc”、“fc段”、“fc片段”“fc结构域”，是指可结晶片段(fragment crystallizable)，无抗原结合活性，是抗体与效应分子或细胞表面fc受体(fcr)相互作用的部位。fc片段与表面具有相应fc受体的细胞结合，产生不同的生物学作用。在adcc效应中(抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)，抗体的fab段结合病毒感染的细胞或肿瘤细胞的抗原表位，其fc段与杀伤细胞(nk细胞、巨噬细胞等)表面的fcr结合，介导杀伤细胞直接杀伤靶细胞。fc片段包含抗体除重链恒定区ch1之外的恒定区多肽，即人免疫球蛋白iga、igd、igg重链恒定区羧基端的两个恒定区结构域ch2及ch3，以及人免疫球蛋白ige和igm重链恒定区羧基端的三个恒定区结构域ch2，ch3及ch4。fc片段常选自human igg1 fc、human igg2 fc、human igg3 fc、human igg4 fc或其变异体，优选自igg1 fc、或human igg4 fc或其变异体
[0091]
fc可由两条链组成，本文中将fc片段的两条链描述为第一fc链和第二fc链，第一fc链和第二fc链可以分别进行突变，本发明并不做特别限定。fc片段也可指fc结构域中的单条多肽链。抗体的fc段可选择消除免疫效应功能，包含但不限于以下突变的组合(根据eu计数)
[0092][0093]
经突变设计的fc变体之间可以形成空间填充效应、静电转向、氢键作用、疏水作用等。fc变体间相互作用有助于形成稳定的异源二聚体。优选的突变设计为“knob-in-hole"形式的突变设计。
[0094]“连接片段”是指插入免疫球蛋白结构域中并提供足够的可动性的一个或多个氨基酸残基，需保证蛋白质的正确折叠和肽稳定性。“连接片段”优选为(ggggs)n，其中n可以为0、1、2、3、4、5或者更多。如果连接片段序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果连接肽序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为连接肽序列本身就是新的抗原。
[0095]
肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，taa)，是指在肿瘤细胞或正常细胞上存在的抗原分子，包括：胚胎性蛋白、糖蛋白抗原、鳞状细胞抗原等，常用于临床肿瘤的诊断。肿瘤相关抗原并非肿瘤细胞所特有，正常细胞可微量合成，而在肿瘤细胞增殖时高度表达，因此称为“相关抗原”。肿瘤相关抗原例如可以是cd20、cd19、cd30、cd33、cd38、cd40、cd52、slamf7、gd2、cd24、cd47、cd133、cd239、cd276、pd-1、cea、epcam、trop2、tag72、muc1、muc16、mesothelin、folr1、cldn18.2、pdl1、egfr、egfr viii、c-met、her2、fgfr2、fgfr3、
psma、psca、epha2、adam17、17-a1、nkg2d ligands、mcsp、lgr5、ssea3、slc34a2、bcma、gpnmb或glypican-3。
[0096]
术语“载体”意指能够转运与其连接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链dna环，其中可以连接附加的dna区段。另一种类型的载体是病毒载体，其中附加的dna区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。通常，在重组dna技术中有用的表达载体通常呈质粒的形式。本发明可提供包含有能够编码三功能融合蛋白的核酸片段的载体。
[0097]
术语“il-15”、“il-15ra”可以是其突变体或片段。本发明所述的“il-15”可以是任何il-15或能结合il-15rα的突变体，如人il-15或非人哺乳动物或非哺乳动物的il-15。示例性非人哺乳动物如猪、兔、猴、猩猩、鼠等，非哺乳动物如鸡等；优选人的il-15。术语“能结合il-15rα的突变体”指通过一个或多个氨基酸替换、增加或者缺失突变获得的对il-15与其受体间亲和力提高或者降低，或其刺激t细胞或者nk细胞活性增加或者降低的突变体分子。
[0098]
本发明中所述的“il-15rα”可以是任何物种的il-15rα或者能结合il-15rα的突变体，如人il-15rα或非人哺乳动物il-15rα或非哺乳动物il-15rα。示例性非人哺乳动物如猪、兔、猴、猩猩、鼠等，非哺乳动物如鸡等。优选人的il-15rα，更优选人il-15rα胞外域片段，简称il-15rαecd(见数据库uniprotkb，登录号q13261，31-205aa)。术语“能结合il-15rα的突变体”指在il-15rα上通过一个或者多个氨基酸缺失、插入或替换突变形成的具有与其配体分子如il-15结合能力的功能性突变体，优选人的il-15rα分子更优选人的il-15rα胞外域片段的缩短形式，即从胞外域片段c端开始通过一个或多个氨基酸缺失突变所得的具有人il-15受体α活性的分子，优选保留65-178个氨基酸的缺失突变形式，比如il-15rα。il-15蛋白本身不如与il-15rα蛋白复合时稳定。如本领域已知的，il-15rα蛋白含有“sushi结构域”，其是保留il-15结合活性的受体的最短区域，或胞外区中能够保持90％以上结合活性的一个结构域。
[0099]
cs1(也称cd319，slamf7)为信号淋巴细胞活化分子家族成员7，是调节nk细胞免疫功能的表面受体蛋白。cs1在多发性骨髓瘤(mm)细胞系中高度表达，但在健康组织，原发性肿瘤组织或血液学和非血液学癌症细胞系未发现，使其成为治疗该疾病的诱人靶标。
[0100]
cd33是67kd的单通跨膜糖蛋白并且是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(siglecs)家族的成员。虽然其确切的生物学功能尚不清楚，但在正常个体中，其主要被认为是髓细胞样分化抗原，在髓细胞样祖细胞、中性粒细胞和巨噬细胞中表达较低，而在循环的单核细胞和树突状细胞中高度表达。重要的是，已在85％至90％的患有急性髓性白血病(aml)的患者的母细胞和白血病干细胞中检测到cd33。有趣的是，cd33的表达仅限于造血细胞(paul、taylor、stansbury和mcvicar，2000年；ulyanova、blasioli、woodford-thomas和thomas，1999年)，但是在正常造血干细胞上却不存在(andrews、torok-storb和bernstein，1983年griffin、linch、sabbath、larcom和schlossman，1984；jilani等人，2002年)。这些发现表明cd33是aml中基于抗体的疗法的合适靶标。
[0101]
cd38抗原于1980年被发现，是一种大小为46kda的ii型跨膜糖蛋白。cd38的配体为cd31，也称为pecam-1，它是ig基因超家族的成员。cd31除了在内皮细胞上表达外，还在淋巴样细胞(卵泡膜b细胞和浆细胞)、肺(肺泡管、肺泡和淋巴管)和肾脏(肾小球细胞)中表达。cd38与配体cd31相互作用，在调节细胞迁移、受体介导的粘附以及信号传导中扮演着重要角色。此外，cd38蛋白质还是一种双功能胞外酶，兼具环化酶和水解酶的活性，参与核苷酸代谢。cd38使用nad+作为底物来形成环状adp核糖(cadpr)和adpr，这些核苷酸代谢产物是有效的第二信使，可调节细胞质中钙离子的动员，激活控制各种生物学过程的信号通路，例如淋巴细胞增殖、胰腺b细胞分泌胰岛素等等。还有研究表明，cd38依赖性腺苷的产生在由自然杀伤(nk)细胞介导的免疫抑制中也起着关键作用。通常，cd38在正常淋巴样细胞和髓样细胞以及非造血组织上低水平表达，而在造血起源的细胞(包括定型干细胞)上广泛表达。cd38在b细胞中表达，而浆细胞(也称效应b细胞)中的cd38表达水平特别高。cd38的表达与多种疾病有关，包括艾滋病、自身免疫性疾病(例如系统性红斑狼疮)、2型糖尿病、骨质疏松症和癌症。研究发现，cd38在大量恶性血液癌症中高度表达，特别是在多发性骨髓瘤等癌症中，这使cd38成为多发性骨髓瘤治疗性抗体药物的开发靶点。
[0102]“效应子功能”意指由抗体fc区与fc受体或配体的相互作用产生的生物化学事件。效应子功能包括但不限于adcc、adcp和cdc。“adcc”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”意指细胞介导的反应，其中表达fcγr的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体，并且随后引起靶细胞的裂解。adcc与fcγriiia的结合相关联；与fcγriiia的结合增加导致adcc活性中的增加。如本文讨论的，本发明的许多实施例完全消除了adcc活性。“adcp”或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用意指细胞介导的反应，其中表达fcγr的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体，并且随后引起靶细胞的吞噬作用。
[0103]
就蛋白质序列而言的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为，在比对序列且必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的部分，候选序列中与特定(亲本)序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。在一些实施例中，两个或更多个氨基酸序列是至少80％、85％或90％相同的。在一些实施例中，两个或更多个氨基酸序列是至少95％、97％、98％、99％或甚至100％相同的。
[0104]
术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，并不指示或暗示其重要性程度。
[0105]
本发明的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白包括：特异性结合cd16a的cd16a结合区、特异性结合肿瘤相关抗原(taa)的taa结合区、il-15和il-15rα结合形成的il-15/il-15rα复合物、以及fc结构域。本发明的taa/cd16a/il-15三功能融合蛋白发挥治疗作用，主要是通过同时结合肿瘤细胞上表达的肿瘤相关抗原(taa)和nk细胞上的cd16a，将这两种细胞交联形成免疫突触，促进nk细胞杀死肿瘤细胞，同时il-15扩增并维持nk细胞功能。
[0106]
本发明的三功能融合蛋白的结构形式可参阅图1至图9。融合蛋白由四条肽链融合形成，第一肽链和第二肽链形成第一单体(图中左侧部分)，第三肽链和第四肽链形成第二单体(图中右侧部分)。第一肽链包括：由vl结构域和cl结构域融合形成的轻链，第二肽链包括：由vh结构域、ch1结构域和第一fc链融合形成的重链；第一肽链的vl结构域、cl结构域，以及所述第二肽链的vh结构域、ch1结构域配对形成fab片段。第三肽链包括：抗体可变区、细胞因子和第二fc链；第四肽链包括：抗体可变区、细胞因子。第三肽链的抗体可变区和所
述第四肽链的抗体可变区配对形成fv片段，第三肽链的细胞因子和所述第四肽链的细胞因子结合形成所述的il-15/il-15rα复合物。
[0107]
在图1至图8所示的融合蛋白中，第一单体中的fab片段靶向taa，实现图中taa antibody的功能。在第二单体中，配对形成fv片段的抗体可变区选自vh结构域和vl结构域，例如，第三肽链中的抗体可变区选择靶向cd16a的vh结构域，第四肽链的抗体可变区选择靶向cd16a的vl结构域，vh和vl配对形成靶向cd16a的fv片段，实现图中anti-cd16a antibody的功能。另一些实施例中，第三肽链中的抗体可变区选择靶向cd16a的vl结构域，第四肽链的抗体可变区选择靶向cd16a的vh结构域。图中的vh(l)表示选择vh或vl。图中“vh(l)1”、“vl(h)1”、“vh2”、“vl2”中的数字仅用于描述目的，表示靶向不同抗原的抗体可变区。vh(l)1表示可以选择vh1也可以选择vl1，若第三肽链的抗体可变区选择vh1，则第四肽链的抗体可变区应选择vl1，从而能够配对形成fv片段。第三肽链和第四肽链中的细胞因子选自il-15和il-15rα，形成il-15/il-15rα复合物(il-15/il-15rαcomplex)。一些实施例中，第三肽链中的细胞因子选择il-15，第四肽链中的细胞因子选择il-15rα。一些实施例则相反，第三肽链选择il-15rα，第四肽链选择il-15。
[0108]
在第三肽链和第四肽链中，并不限定抗体可变区(vh或vl)与细胞因子的融合顺序。例如，图1所示的融合蛋白中，自肽链的n端到c端，所述第三肽链的融合顺序为：抗体可变区～细胞因子～第二fc链，第四肽链的融合顺序为：抗体可变区～细胞因子，“～”表示连接片段。图2所示的融合蛋白与图1的区别在于，自肽链的n端到c端，第四肽链的融合顺序为：细胞因子～抗体可变区。图1至图8中的圆球形和月牙形代表不同的细胞因子，以下假设圆球形代表il-15，则月牙形则代表il-15ra。自肽链的n端到c端，图1至图8所示的融合蛋白，其第三肽链和第四肽链的可能组合形式列示如下：
[0109]
表1融合蛋白第三肽链和第四肽链的组合形式
[0110][0111]
图9所示的融合蛋白，其第一单体中(图中左侧部分)的fab片段靶向cd16a，实现图中anti-cd16a antibody的功能。fv片段靶向taa，实现图中anti-taa antibody的功能。类似于图1至图8所示的融合蛋白，图9所示的融合蛋白也可具有表1所列的第三肽链和第四肽链的多种可能组合形式。
[0112]
本发明提供的具有创新结构蛋白的复合单元，可参阅图1所示融合蛋白的第二单体的上部，即抗cd16a的fv片段与il-15/il-15rα复合物融合的区域。复合单元包括：两个抗体可变区(抗cd16a的vh和vl)、两个细胞因子(il-15、il-15ra)、若干连接片段。一个抗体可变区通过连接片段与一个细胞因子融合。两个抗体可变区配对形成fv片段，两个细胞因子
结合形成il-15/il-15r复合物。抗cd16a的vh结构域和vl结构域之间，和/或il15和il15rα之间，优选具有一对以上的二硫键，从而形成更稳定的结构。可以在vh和vl之间设二硫键，il15和il15rα之间不设二硫键；也可以在il15和il15rα之间设二硫键，vh和vl之间不设二硫键；或者，在vh和vl之间，以及il15和il15rα之间均设二硫键。利用本发明提供的复合单元，本领域技术人员可用于构建其他目的蛋白，而不限于本发明实施例所举例说明的融合蛋白的形式。
[0113]
细胞因子il-15与il-15ra之间有超高的亲和力(kd约30-100pm)，本发明可用il-15及il-15ra分别替代其中一个抗体结构中的cl及ch1结构域，解决双特异抗体轻链错配问题，通过fc异源二聚体形式解决重链错配。一些实施例中，将有fab的fc端进行突变，使其不能结合protein a。纯化通过结合fc端的protein a亲和层析及结合ch1结构域ch1-xl亲和层析的2步纯化出双特异靶向抗体。
[0114]
实施例1：taa/cd16a/il-15三功能融合蛋白获得，分子克隆，瞬转表达，及蛋白纯化
[0115]
分子克隆：本实施例根据下表构建多个融合蛋白，taa分别选择cd33、cd38、cs1。蛋白表达及序列号如下表所示。
[0116]
表2：克隆设计构建
[0117]
[0118][0119]
seq id no:01序列如下：
[0120][0120]
其中，虚线所指序列为anticd16a的vl，波浪线所指序列为il-15。
[0121]
seq id no:02序列如下：
[0122][0123]
其中，虚线所指序列为anticd16a的vh，波浪线所指序列为il-15ra，双下划线为fc(knob突变)。
[0124]
seq id no:03序列如下：
[0125][0126][0127]
其中，下划线以外的部分
为anticd33的轻链序列，虚线所指序列为vl。
[0128]
seq id no:04序列如下：
[0129][0130]
其中，下划线以外的部分为anticd33的重链序列，虚线所指序列为vh。
[0131]
另提供以下序列：
[0132]
[0133][0134][0135]
上述il-15或il-15ra的序列均可用于构建本发明的融合蛋白。
[0136]
如表3所示，设计构建对照抗体anticd16a antibody、anticd33 antibody、elotuzumab、daratumumab、taa/cd16a双抗，及根据专利文献us20200148737a1构建cd33/cd16a/il-15对照分子gtb-3550等分子。
[0137]
表3对照抗体克隆设计构建
[0138]
[0139][0140]
瞬转表达目标分子：
[0141]
接种expicho-s细胞到forticho培养基中(gibco,a1148301)额外加入8mm glutamax，37℃，120rpm，8％ co2培养。转染前一天，将expicho-s细胞密度调整为3*10e6/ml，置于摇床中，37℃，120rpm，8％co2培养；转染当天，取样，计数，将细胞密度稀释为6*10e6/ml，每瓶40ml，置于125ml的摇瓶中；共转染质粒各20μg与4.8ml opti mem混合，加入120μl polyplus-fectopro转染试剂，将dna和转染试剂混合均匀后，置于室温10min，将混合物缓慢置于细胞中，混合均匀后，置于摇床培养。培养过程中，分别在第1，4，6，8天每瓶补加2ml feed pff05(opm,f81279-001)及1ml的30％葡萄糖溶液。转染第一天，将温度降为32℃，co2浓度降为5％。13天收样，8000rpm离心20min,取上清，待纯化；
[0142]
融合蛋白的纯化：
[0143]
protein a亲和层析纯化
[0144]
用平衡液过柱，至少3cv，实际体积20ml，确保最终仪器中流出的溶液ph和电导与平衡液一致，流速1ml/min；将离心后培养液上清过柱，上样40ml，流速0.33ml/min；用平衡液过柱，至少3cv，实际体积20ml，确保最终仪器中流出的溶液ph和电导与平衡液一致，流速0.33ml/min；用洗脱液过柱，uv280上升至15mau时开始收集洗脱峰(pac-ep)，uv280下降至15mau时停止收集，流速1ml/min。样品收集完成后，用ph调节液将pac-ep调至中性。
[0145]
ch1-xl亲和层析
[0146]
将protein a处理后样品8000rpm
×
15min离心，取上清；用平衡液过柱，至少3cv，实际体积20ml，确保最终仪器中流出的溶液ph和电导与平衡液一致，流速1ml/min；将离心
后上清经上样环过柱，流速0.33ml/min；用平衡液过柱，至少3cv，实际体积20ml，确保最终仪器中流出的溶液ph和电导与平衡液一致，流速0.33ml/min；用洗脱液过柱，uv280上升至10mau时开始收集洗脱峰(pac-ep)，uv280下降至10mau时停止收集，流速1ml/min。样品收集完成后，用ph调节液将ch1-ep调至中性。
[0147]
实施例2：facs检测cd33/cd16a/il-15三功能融合蛋白结合天然表达cd33的hl60细胞
[0148]
实验目的：人早幼粒白血病细胞株hl60细胞天然表达cd33，本发明通过facs检测cd33/cd16a/il-15三功能融合蛋白结合天然表达cd33的hl60细胞
[0149]
实验方法：hl60细胞于37℃5％co2培养箱中培养，胰酶消化收集细胞，按100000个细胞每孔接种于96孔板中，2％fbs/pbs冰上封闭1h，孵育不同浓度三功能蛋白及对照蛋白，冰上1h，pbs洗3遍，孵育pe-anti human fc(1：200)稀释，pbs洗3遍，200微升pbs重悬，facs读取平均荧光值，使用graphpad prism软件分析结果。结果如图10所示，cd33抗体igg1wt亚型qp41154116、cd33/cd16a/il-15三功能融合蛋白qp743745(fc野生型)、qp43394340(fc进行l234a/l235a突变消除功能)、qp42914285(fc进行l234a/l235a突变消除功能)、cd33/cd16a双特异抗体qp4115777778(fc野生型)、cd33/cd16a双特异抗体qp411543674368(fc进行l234a/l235a突变消除功能)及cd33抗体igg1wt亚型qp41154116均结合天然表达cd33的hl60细胞。
[0150]
实施例3：facs检测cd38/cd16a/il-15三功能融合蛋白结合天然表达cd38的daudi细胞
[0151]
实验目的：人burkitt
′
s淋巴瘤细胞daudi细胞天然表达cd38，本发明通过facs检测cd38/cd16a/il-15三功能融合蛋白结合天然表达cd38的daudi细胞
[0152]
实验方法：daudi细胞于37℃5％co2培养箱中培养，胰酶消化收集细胞，按100000个细胞每孔接种于96孔板中，2％fbs/pbs冰上封闭1h，孵育不同浓度三功能蛋白及对照蛋白，冰上1h，pbs洗3遍，孵育pe-anti human fc(1：200)稀释，pbs洗3遍，200微升pbs重悬，facs读取平均荧光值，使用graphpad prism软件分析结果。结果如图11所示，cd38抗体igg1wt亚型qp34503451、cd38/cd16a/il-15三功能融合蛋白qp43394341(fc进行l234a/l235a突变消除功能)均呈浓度依赖结合天然表达cd38的daudi细胞。
[0153]
实施例4：elisa检测cs1/cd16a/il-15三功能融合蛋白结合cs1活性
[0154]
检测试剂：milk(bd,232100),pbs(生工，b548117-0500)；hrp-anti human igg(h+l)(jackson，109-035-088)；tmb(洛阳佰奥通实验材料中心，c060201)；elisa板(costa,9018)1
×
pbs缓冲液：称取nacl 8.00g、kcl 0.20g、na2hpo4
·
12h20 2.9g、kh2po4 0.2g至800ml ddh2o中溶解，充分溶解后定容至1l，调节ph至7.4，高温灭菌备用。或购买商品化10
×
、20
×
的pbs溶液稀释至1
×
pbs缓冲液使用。封闭液：称取5g的milk至pbs中，封闭液需现配现用。终止液(1mol/lh2so4)：取109ml 98％的浓h2so4缓慢滴加至2000ml ddh2o中。tmb 37℃显色10min，置于摇床中(120rpm)，100μl/well。
[0155]
实验步骤：cs1-fc融合蛋白包板，1μg/ml，4度过夜；pbs洗3遍。按200μl/孔加入封闭液5％milk，37度孵育1h。封闭结束后，pbs洗3遍，孵育样品，按照20μg/ml 5倍稀释，共稀释7个梯度最后一孔稀释100倍，100μl/well充分混匀后，孵育1h，pbst洗3遍；加酶标抗体：孵育hrp-anti human fab抗体，按照1:5000稀释比例，100μl/孔，充分混匀后，孵育1h，pbst
solution后1h内完成读数)。计算：杀伤百分比＝(样品释放-靶细胞自发-效应细胞自发释放)/(靶细胞最大释放-靶细胞自发释放)*100。将自发释放(对应于在没有抗体的情况下与效应细胞一起温育的靶细胞)定义为0％细胞毒性，并将最大释放(用1％triton x-100裂解的靶细胞)定义为100％细胞毒性。
[0165]
图16、图17显示为效靶比10:1的结果，图18为效靶比20:1的结果。结果显示：cd33抗体igg1wt亚型qp41154116呈浓度依赖引起nk细胞杀伤细胞天然表达cd33的hl60细胞，cd33/cd16a/il-15三功能融合蛋白qp743745(fc野生型)、qp43394340(fc进行l234a/l235a突变消除功能)、qp42914285(fc进行l234a/l235a突变消除功能)、cd33/cd16a双特异抗体qp4115777778(fc野生型)、cd33/cd16a双特异抗体qp411543674368(fc进行l234a/l235a突变消除功能)引起nk细胞杀伤hl60细胞均优于cd33/cd16a/il-15三功能融合蛋白对照分子gt-3550(qp877)及cd33抗体igg1wt亚型qp41154116。cd16a单抗qp43354336及il-15/il-15ra-fc融合蛋白qp33123313均无adcc效应。
[0166]
实施例7：cd38/cd16a/il-15三功能融合蛋白介导的adcc作用
[0167]
实验目的：通过adcc实验检测cd38/cd16a/il-15三功能融合蛋白。
[0168]
实验材料：pbmc购买自上海赛笠生物科技有限公司，daudi细胞购买自中国科学院细胞库，cytotox96 non-radioactive cytotoxicity assay检测试剂盒购自promega(g1780)。
[0169]
实验步骤：复苏pbmc，收集细胞待第二天备用。准备靶细胞：daudi细胞用胰酶消化，1000rpm5min。pbs清洗2次后，铺96孔板，20000个每孔，50μl每孔，37度5％co2孵育2h。准备抗体：用培养基(rpmi1640含10％low-igg fbs)梯度稀释抗体8个浓度。加入上面稀释各浓度的抗体50μl每孔，37度孵育15min。准备pbmc：将第一天复苏的pbmc离心，用培养基(rpmi1640含10％low-igg fbs)重悬，计数。按pbmc:target cell＝10:1，或5:1，加入上面的孔板中50μl每孔，37度孵育4小时。ldh检测：对于最大释放组和体积矫正组，提前45min加入10μl裂解液,继续放置培养箱培养。培养4h后，吸取50μl上清至酶标板中,按照cytotox96 non-radioactive cytotoxicity assay检测试剂盒(promega，g1780)说明书，加入50μl reagent。室温，避光反应30min后，加入50μl stop solution.490nm吸光值读数(加入stop solution后1h内完成读数)。计算：杀伤百分比＝(样品释放-靶细胞自发-效应细胞自发释放)/(靶细胞最大释放-靶细胞自发释放)*100。将自发释放(对应于在没有抗体的情况下与效应细胞一起温育的靶细胞)定义为0％细胞毒性，并将最大释放(用1％triton x-100裂解的靶细胞)定义为100％细胞毒性。
[0170]
图19显示为效靶比10:1的结果，图20为效靶比5:1的结果，如图所示：在不同效靶比下，cd38抗体igg1wt亚型qp34503451呈浓度依赖引起nk细胞杀伤细胞天然表达cd38的daudi细胞，cd38/cd16a/il-15三功能融合蛋白qp43394341(fc进行l234a/l235a突变消除功能)引起nk细胞杀伤daudi细胞均优于cd38抗体igg1wt亚型qp34503451。cd16a单抗qp43354336及il-15/il-15ra-fc融合蛋白qp33123313均无adcc效应。
[0171]
实施例8：cd33/cd16a/il-15三功能融合蛋白介导的adcp
[0172]
取健康人外周血单个核细胞(pbmc)分离单核细胞，加入50ng/ml human recombinant m-csf，诱导分化为巨噬细胞。将hl60细胞标记绿色荧光cfse，将hl60细胞与巨噬细胞按照2:1的比例种96孔板，再加入不同浓度的待检测蛋白。37℃孵育2h后终止反
应，再孵育apc anti-human cd11b抗体，通过facs读数，得到各浓度抗体下apc/fitc双阳性细胞的百分比即为发生吞噬行为的巨噬细胞百分比。
[0173]
结果如图21所示，cd33/cd16a/il-15三功能融合蛋白qp743745(fc野生型)及qp43394340(fc进行l234a/l235a突变消除功能)均浓度依赖引起巨噬细胞吞噬hl60细胞。cd33/cd16a/il-15三功能融合蛋白对照分子gt-3550(qp877)无adcp效应。
[0174]
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

技术特征：
1.抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述抗原包括肿瘤相关抗原(taa)；所述三功能融合蛋白包括：特异性结合cd16a的cd16a结合区、特异性结合肿瘤相关抗原(taa)的taa结合区、il-15和il-15rα结合形成的il-15/il-15rα复合物、以及fc结构域。2.根据权利要求1所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述cd16a结合区包括抗cd16a抗体或其抗原结合片段，优选的，所述cd16a结合区为靶向cd16a的fab片段或fv片段。3.根据权利要求1所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述taa结合区包括抗taa抗体或其抗原结合片段，优选的，所述taa结合区为靶向taa的fab片段或fv片段。4.根据权利要求1所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白还包括连接片段；所述连接片段的氨基酸序列优选为若干个gs重复序列。5.根据权利要求1所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含若干条肽链，所述il-15和所述il-15rα分别位于不同肽链上。6.根据权利要求1所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包括：第一单体和第二单体；所述第一单体包括：所述的taa结合区和第一fc链；所述第二单体包括：所述的cd16a结合区、所述的il-15/il-15rα复合物和第二fc链；所述第一fc链和所述第二fc链聚合形成所述的fc结构域。7.根据权利要求6所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述taa结合区为靶向taa的fab片段；所述cd16a结合区为靶向cd16a的fv片段。8.根据权利要求1所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包括：第一单体和第二单体；所述第一单体包括：所述的cd16a结合区和第一fc链；所述第二单体包括：所述的taa结合区、所述的il-15/il-15rα复合物和第二fc链；所述第一fc链和所述第二fc链聚合形成所述的fc结构域。9.根据权利要求8所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述cd16a结合区为靶向cd16a的fab片段；所述taa结合区为靶向taa的fv片段。10.根据权利要求6或8所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述第一单体包括第一肽链和第二肽链，所述第二单体包括第三肽链和第四肽链；所述第一肽链包括：由vl结构域和cl结构域融合形成的轻链；所述第二肽链包括：由vh结构域、ch1结构域和第一fc链融合形成的重链；所述第三肽链包括：抗体可变区、细胞因子和第二fc链；所述第四肽链包括：抗体可变区、细胞因子；所述第一肽链的vl结构域、cl结构域，以及所述第二肽链的vh结构域、ch1结构域配对形成fab片段；所述第三肽链的抗体可变区和所述第四肽链的抗体可变区配对形成fv片段；
所述第三肽链的细胞因子和所述第四肽链的细胞因子结合形成所述的il-15/il-15rα复合物；其中，所述的fab片段靶向taa，所述的fv片段靶向cd16a；或者，所述的fab片段靶向cd16a，所述的fv片段靶向taa。11.根据权利要求10所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，配对形成所述fv片段的抗体可变区选自vh结构域和vl结构域；所述的细胞因子选自il-15和il-15rα。12.根据权利要求11所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，配对形成所述fv片段的vh结构域和vl结构域之间具有一对或多对二硫键，并且包含以下突变组合形式的任意一种以上，根据eu计数：且包含以下突变组合形式的任意一种以上，根据eu计数：13.根据权利要求10所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，自肽链的n端到c端，所述第三肽链的融合顺序为：抗体可变区～细胞因子～第二fc链，或为：细胞因子～抗体可变区～第二fc链；自肽链的n端到c端，所述第四肽链的融合顺序为：抗体可变区～细胞因子；或为：细胞因子～抗体可变区；“～”表示连接片段。14.根据权利要求1所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述il-15包括：il-15及其能结合il-15ra的突变，截短及各种衍生物；所述il-15ra包括：il-15ra及其能结合il-15的突变，截短及各种衍生物；优选地，所述il-15包括但不限于以下任意一组合所示的突变方式，计数方式根据il-15的氨基酸序列的第一个氨基酸开始算为第1位；
或者，所述il-15/il-15ra复合物包括但不限于以下任意一组合所示的突变方式，计数方式根据il-15或il-15ra的氨基酸序列的第一个氨基酸开始算为第1位；组合il15il15ra1wtd962wtd96/p973wtd96/p97/a984e87cd96/c975e87cd96/p97/c986e87cd96/c97/a987v49cs40c8l52cs40c9e89ck34c10q48cg38c11e53cl42c12c42sa37c
13l45cg38c14l45ca37c。15.根据权利要求1所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述taa选自cd20、cd19、cd30、cd33、cd38、cd40、cd52、slamf7、gd2、cd24、cd47、cd133、cd217、cd239、cd274、cd276、cea、epcam、trop2、tag72、muc1、muc16、mesothelin、folr1、cldn18.2、egfr、egfr viii、c-met、her2、fgfr2、fgfr3、psma、psca、epha2、adam17、17-a1、nkg2dligands、mcsp、lgr5、ssea3、slc34a2、bcma、gpnmb、ccr4、vegfr-2、cd6、整合素α4、pdgfrα、neugcgm3、整合素αvβ3、cd51、ctaa16.88、cd22、ror1、cspg4、ss1或igfr1。16.根据权利要求1所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述fc结构域选自human igg1 fc、human igg2 fc、human igg3 fc、human igg4 fc或其变异体，优选自igg1 fc、或human igg4 fc或其变异体；所述fc结构域为fc异源二聚体形式；优选地，所述fc异源二聚体包含但不限于以下突变的组合，以下突变为根据eu计数：
17.根据权利要求1所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述fc结构域选择消除免疫效应功能，优选包含以下任一突变方式，以下突变为根据eu计数：
18.根据权利要求10所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述第一fc链不结合protein a，优选包括突变h435r或h435r/y436f，根据eu计数；所述第二fc链能够结合protein a。19.根据权利要求1所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述cd16a结合区包括序列如seq id no:39所示的vh结构域和seq id no:38所示的vl结构域；或者，所述il-15的序列如seq id no:46或47所示；或者，所述il-15ra的序列如seq id no:48至54中任意一项所示；优选的，所述cd16a结合区的vh和vl之间，和/或所述il-15与il-15ra之间，至少具有一对以上二硫键。20.根据权利要求1所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，由以下任意一组序列所示或与其具有90％以上同一性的氨基酸片段融合得到：(1)seq id no:01、02、03、04；(2)seq id no:01、05、03、06；(3)seq id no:07、08、09、10；(4)seq id no:01、02、11、12；(5)seq id no:01、02、13、14；(6)seq id no:01、05、11、15；
(7)seq id no:01、05、13、16。21.根据权利要求1所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述抗原还包括：传染性疾病相关抗原、病原体、免疫功能相关抗原。22.一种核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1至21中任意一项所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白。23.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1至21中任意一项所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，以及药学上可接受的载体。24.权利要求1至21中任意一项所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白在制备用于抑制或治疗癌症、感染和免疫调节疾病的药物中的应用。25.根据权利要求24所述的应用，其特征在于，所述癌症包括前列腺癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、黑色素瘤、肾癌、口腔癌、咽癌、胰腺癌、子宫癌、甲状腺癌、皮肤癌、头颈癌、宫颈癌、卵巢癌或血液系统癌症。26.一种蛋白的复合单元，其特征在于，所述复合单元包括：权利要求10所述的抗原靶向、抗cd16a和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白中的第三肽链的抗体可变区和细胞因子、第四肽链的抗体可变区和细胞因子，以及若干连接片段；所述第三肽链的抗体可变区通过连接片段与所述第三肽链的细胞因子融合；所述第四肽链的抗体可变区通过连接片段与所述第四肽链的细胞因子融合；所述第三肽链的抗体可变区和所述第四肽链的抗体可变区选自靶向cd16a的vh结构域或vl结构域，并配对形成fv片段；所述第三肽链的细胞因子和所述第四肽链的细胞因子选自il15或il15rα，并结合形成il-15/il-15r复合物；优选的，所述配对形成fv片段的vh结构域和vl结构域之间，和/或所述il15和il15rα之间，具有一对以上的二硫键。27.一种核酸分子，其特征在于，其编码权利要求26所述的蛋白的复合单元。

技术总结
本发明公开了抗原靶向、抗CD16A和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其包括：特异性结合CD16A的CD16A结合区、特异性结合肿瘤相关抗原(TAA)的TAA结合区、IL-15和IL-15Rα结合形成的IL-15/IL-15Rα复合物、以及Fc结构域。本发明设计的肿瘤靶向先天免疫细胞激活分子，即抗TAA、抗CD16A和细胞因子IL15的三功能融合蛋白，通过同时结合肿瘤细胞上的肿瘤相关抗原(TAA)和NK细胞上的CD16A，将NK细胞靶向肿瘤，NK细胞释放穿孔素、颗粒酶，引发细胞凋亡并导致肿瘤细胞死亡。细胞因子IL15扩增并维持NK细胞功能，刺激免疫细胞增殖，改变肿瘤的免疫微环境。环境。环境。


技术研发人员：屈向东 潘琴
受保护的技术使用者：启愈生物技术（上海）有限公司
技术研发日：2022.07.29
技术公布日：2023/8/14