一种TEMPO修饰的交联漆酶聚集体及其制备方法与应用

一种tempo修饰的交联漆酶聚集体及其制备方法与应用
技术领域
1.本技术涉及生物酶工程技术领域，具体涉及一种tempo修饰的交联漆酶聚集体及其制备方法与应用。


背景技术：

2.漆酶是一类以铜为催化中心的多铜氧化酶，具有强的氧化还原能力且作用的底物广泛，唯一副产物是水，对环境十分友好。然而游离漆酶在工业环境中遇到复杂环境，容易造成酶的活性及稳定性降低。固定化酶技术的出现，一定程度上改善部分游离酶催化效率低、难以重复使用、缺乏稳定性等不足。常见的固定化酶技术分为两类，有载体固定化酶技术和无载体固定化酶技术。有载体固定化酶技术，载体的体积一定程度上限制了酶活性，以及载体引入增加了生产成本。无载体固定化酶技术可以改善这个缺点，其中交联酶聚集体(cleas)是最为成熟的一种无载体固定化技术。交联酶聚集体(cleas)包括两步，首先是酶通过沉淀剂使得酶物理聚集，再与交联剂通过化学交联制得交联酶聚集体(journalofmolecular catalysis b:enzymatic,2010,62:48-142)。
3.漆酶在工业领域和合成化学领域有着巨大潜力，天然漆酶对于非酚类底物的氧化通常需要在介质参与下发生反应。其中漆酶对于醇氧化反应，已有研究利用tempo和游离漆酶催化醇的氧化(tetrahedron letters,2001,42:553-7551)。然而，游离漆酶在反应过程中不稳定、不能回收利用，且2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基(tempo)也不能回收利用大大限制了其工业应用。近年，有报道对漆酶和介质在多孔材料中进行共固定化，实现可回收利用。但是，这种固定化方法存在载体对酶和底物的接触阻碍问题，使得酶催化效率受到影响(chemcatchem,2018,10:1542-1546)。目前，利用漆酶和tempo共固定化合成催化材料催化醇氧化的研究尚未开展。


技术实现要素：

4.针对以上问题，本发明目的是提供一种tempo修饰的交联漆酶聚集体及其制备方法，该方法提高了漆酶的环境耐受性及稳定性，同时应用于催化醇氧化，实现漆酶和tempo的可重复使用性，及高效催化。
5.为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.一种tempo修饰的交联漆酶聚集体的制备方法，包括以下步骤：
7.(1)将漆酶分散于去离子水中，过滤去除不溶物，获得粗酶溶液；
8.(2)在搅拌条件下，将粗酶溶液加入到沉淀剂中沉淀，搅拌，然后加入丙烯酸酯类交联剂溶液进行反应，反应结束后离心、洗涤，获得交联漆酶聚集体；
9.(3)将交联漆酶聚集体分散于溶剂中，获得交联漆酶聚集体分散液；在搅拌条件下，向交联漆酶聚集体分散液中加入4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基溶液进行迈克尔加成反应，反应结束后离心、洗涤，获得所述tempo修饰的交联漆酶聚集体。
10.在发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，漆酶与去离子水的质量比为1:10～1:
15。
11.在发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，沉淀剂选自丙酮、异丙醇、乙腈中的一种，粗酶溶液与沉淀剂的体积比为1:3～1:6；搅拌条件为常温下搅拌1min～10min。
12.在发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，丙烯酸酯类交联剂为二丙二醇二丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、双三羟甲基丙烷四丙烯酸酯、聚二季戊四醇六丙烯酸酯化合物中的至少一种；丙烯酸酯类交联剂溶液是将丙烯酸酯类交联剂溶于溶剂中制备得到，所述丙烯酸酯类交联剂溶液的浓度为20～100mmol/l；丙烯酸酯类交联剂溶液与粗酶溶液体积比为1:2～1:5；所述反应条件为25～35℃水浴中恒温反应10～19h。优选地，所述溶剂选自任何可以溶解丙烯酸酯类交联剂的溶剂，包括但不限于异丙醇、乙腈、丙酮、甲苯、二甲苯、三甲苯、醋酸丁酯。
13.在发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中，4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基溶液与交联漆酶聚集体分散液的体积比为1:3～1:9；所述交联漆酶聚集体分散液是将交联漆酶聚集体分散于溶剂中得到，所述交联漆酶聚集体与溶剂的质量体积比为10mg:1ml～50mg:1ml。进一步优选地，所述溶剂选自丙酮、异丙醇、乙腈中的一种；更优选地，所述溶剂选自异丙醇。4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基溶液是将4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基溶于异丙醇中制备得到，所述4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基溶液的浓度为10～40mmol/l；所述迈克尔加成反应的条件为25～35℃水浴中恒温反应5～10h。
14.在发明的一种实施方式中，步骤(2)和步骤(3)中离心条件为5000～10000rpm下离心5～10min，洗涤条件为异丙醇洗涤2～5次。
15.本发明还提供一种采用上述方法制备得到的tempo修饰的交联漆酶聚集体。
16.本发明还提供一种tempo修饰的交联漆酶聚集体的应用，其特征在于，将所述的tempo修饰的交联漆酶聚集体应用于催化醇氧化反应。
17.在发明的一种实施方式中，所述tempo修饰的交联漆酶聚集体的应用，包括以下步骤：将所述的tempo修饰的交联漆酶聚集体分散于去离子水中，获得tempo修饰的交联漆酶聚集体分散液，所述tempo修饰的交联漆酶聚集体与去离子水的质量比为1:30～1:50；直接加入苯甲醇到所述的tempo修饰的交联漆酶聚集体分散液中，在30～60℃水浴中恒温反应10～20h，反应结束后即得苯甲醛。苯甲醛的转化率可利用核磁共振氢谱测定。优选的，所述tempo修饰的交联漆酶聚集体分散液与苯甲醇的体积比为60:1～120:1。
18.本发明的有益效果：
19.(1)本发明所提供一种tempo修饰的交联漆酶聚集体较游离酶相比，采用新型丙烯酸酯类交联剂后，交联漆酶聚集体活性具有较高的酶活性保留，时间稳定性及温度耐受性具有显著提高。该催化材料用于醇氧化的催化过程中突出可重复使用性，可工业化应用。
20.(2)本发明所提供的一种tempo修饰的交联漆酶聚集体制备过程包括交联和与4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基反应两步，无需载体材料，制备方法操作简便，低经济成本，对于醇氧化反应生产效率和经济效益有较大的提升。同时也为可调控型生物酶负载催化材料的研究探索了新的方向。
附图说明
21.附图所示内容仅用于对本发明的解释说明。而不构成本发明任何意义上的限制。
22.图1为本发明实施例的一种tempo修饰的交联漆酶聚集体制备方法流程图；
23.图2为交联漆酶聚集体在不同温度下的酶活性图；
24.图3为交联漆酶聚集体随时间变化的酶活性图；
25.图4为tempo修饰后交联漆酶聚集体的傅立叶变换红外光谱图。
具体实施方式
26.为使本技术实施例的技术方案和优点更加清楚，下面将对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均可从商业途径获得。
27.下面对本技术实施例的tempo修饰的交联漆酶聚集体及其制备方法与应用进行具体说明。
28.实施例1
29.(1)将150mg漆酶(源叶生物，s10189)分散于1.5ml去离子水中，过滤去除不溶物，获得粗酶溶液。
30.(2)在搅拌条件下，按粗酶溶液与沉淀剂异丙醇体积比1:6，将粗酶溶液加入到9ml异丙醇中，常温搅拌2min；按丙烯酸酯类交联剂溶液与粗酶溶液体积比1:2，再加入0.75ml浓度为20mmol/l的三羟甲基丙烷三丙烯酸酯的异丙醇溶液，在30℃水浴中恒温反应19h。反应结束后，将反应体系在5000rpm下离心5min，将离心后得到的固体用异丙醇洗涤2次，获得交联漆酶聚集体。
31.(3)将150mg交联漆酶聚集体分散于13.5ml的异丙醇中，获得交联漆酶聚集体分散液；按4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基溶液与交联漆酶聚集体分散液的体积比为1:9，取1.5ml浓度为40mmol/l的4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基的异丙醇溶液；在搅拌条件下，将4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基溶液加入到交联漆酶聚集体分散液中，在30℃水浴中恒温反应10h，完成迈克尔加成反应。反应结束后体系在5000rpm下离心5min，用异丙醇重复洗涤2次，获得tempo修饰的交联漆酶聚集体。
32.实施例2
33.(1)将100mg漆酶(源叶生物，s10189)分散于1ml去离子水中，过滤去除不溶物，获得粗酶溶液。
34.(2)在搅拌条件下，按粗酶溶液与沉淀剂异丙醇体积比1:4，将粗酶溶液加入到4ml异丙醇中，常温搅拌1min；按丙烯酸酯类交联剂溶液与粗酶溶液体积比1:2，再加入0.5ml浓度为20mmol/l的三羟甲基丙烷三丙烯酸酯的异丙醇溶液，在25℃水浴中恒温反应10h。反应结束后，将反应体系在8000rpm下离心8min，将离心后得到的固体用异丙醇重复洗涤3次，获得交联漆酶聚集体。
35.(3)将100mg交联漆酶聚集体分散于3ml的异丙醇中，获得交联漆酶聚集体分散液；按4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基溶液与交联漆酶聚集体分散液的体积比为1:3，取1ml浓度为10mmol/l的4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基的异丙醇溶液；在搅拌条件下，将4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基溶液加入到交联漆酶聚集体分散液
中，在25℃水浴中恒温反应5h，完成迈克尔加成反应。反应结束后体系在8000rpm下离心8min，用异丙醇重复洗涤3次，获得tempo修饰的交联漆酶聚集体。
36.实施例3
37.(1)将100mg漆酶(源叶生物，s10189)分散于1.5ml去离子水中，过滤去除不溶物，获得粗酶溶液。
38.(2)在搅拌条件下，按粗酶溶液与沉淀剂乙腈体积比1:3，将粗酶溶液加入到4.5ml乙腈中，常温搅拌5min；按丙烯酸酯类交联剂溶液与粗酶溶液体积比1:3，再加入0.5ml浓度为40mmol/l的二丙二醇二丙烯酸酯的乙腈溶液，在35℃水浴中恒温反应15h。反应结束后，将反应体系在5000rpm下离心10min，将离心后得到的固体用异丙醇重复洗涤5次，获得交联漆酶聚集体。
39.(3)将100mg交联漆酶聚集体分散于6ml的异丙醇中，获得交联漆酶聚集体分散液；按4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基溶液与交联漆酶聚集体分散液的体积比为1:6，取1ml浓度为20mmol/l的4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基的异丙醇溶液；在搅拌条件下，将4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基溶液加入到交联漆酶聚集体分散液中，在35℃水浴中恒温反应8h，完成迈克尔加成反应。反应结束后体系在5000rpm下离心10min，用异丙醇重复洗涤5次，获得tempo修饰的交联漆酶聚集体。
40.实施例4
41.(1)将150mg漆酶(源叶生物，s10189)分散于1.25ml去离子水中，过滤去除不溶物，获得粗酶溶液。
42.(2)在搅拌条件下，按粗酶溶液与沉淀剂丙酮体积比1:4，将粗酶溶液加入到5ml丙酮中，常温搅拌10min；按丙烯酸酯类交联剂溶液与粗酶溶液体积比1:5，再加入0.25ml浓度为60mmol/l的季戊四醇三丙烯酸酯的丙酮溶液，在30℃水浴中恒温反应19h。反应结束后，将反应体系在5000rpm下离心5min，将离心后得到的固体用异丙醇重复洗涤2次，获得交联漆酶聚集体。
43.(3)将150mg交联漆酶聚集体分散于4.5ml的异丙醇中，获得交联漆酶聚集体分散液；按4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基溶液与交联漆酶聚集体分散液的体积比为1:3，取1.5ml浓度为30mmol/l的4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基的异丙醇溶液；在搅拌条件下，将4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基溶液加入到交联漆酶聚集体分散液中，在30℃水浴中恒温反应10h，完成迈克尔加成反应。反应结束后体系在5000rpm下离心5min，用异丙醇重复洗涤2次，获得tempo修饰的交联漆酶聚集体。
44.实施例5
45.(1)将100mg漆酶(源叶生物，s10189)分散于1.5ml去离子水中，过滤去除不溶物，获得粗酶溶液。
46.(2)在搅拌条件下，按粗酶溶液与沉淀剂异丙醇体积比1:6，将粗酶溶液加入到9ml异丙醇中，常温搅拌8min；按丙烯酸酯类交联剂溶液与粗酶溶液体积比1:3，再加入0.5ml浓度为80mmol/l的双三羟甲基丙烷四丙烯酸酯的异丙醇溶液，在35℃水浴中恒温反应10h。反应结束后，将反应体系在8000rpm下离心8min，将离心后得到的固体用异丙醇重复洗涤4次，获得交联漆酶聚集体。
47.(3)将100mg交联漆酶聚集体分散于9ml的异丙醇中，获得交联漆酶聚集体分散液；
按4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基溶液与交联漆酶聚集体分散液的体积比为1:9，取1ml浓度为40mmol/l的4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基的异丙醇溶液；在搅拌条件下，将4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基溶液加入到交联漆酶聚集体分散液中，在35℃水浴中恒温反应5h，完成迈克尔加成反应。反应结束后体系在8000rpm下离心8min，用异丙醇重复洗涤4次，获得tempo修饰的交联漆酶聚集体。
48.实施例6
49.(1)将150mg漆酶(源叶生物，s10189)分散于1.25ml去离子水中，过滤去除不溶物，获得粗酶溶液。
50.(2)在搅拌条件下，按粗酶溶液与沉淀剂异丙醇体积比1:6，将粗酶溶液加入到7.5ml异丙醇中，常温搅拌8min；按丙烯酸酯类交联剂溶液与粗酶溶液体积比1:5，再加入0.25ml浓度为100mmol/l的聚二季戊四醇六丙烯酸酯的异丙醇溶液，在25℃水浴中恒温反应15h。反应结束后，将反应体系在8000rpm下离心8min，将离心后得到的固体用异丙醇重复洗涤5次，获得交联漆酶聚集体。
51.(3)将150mg交联漆酶聚集体分散于9ml的异丙醇中，获得交联漆酶聚集体分散液；按4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基溶液与交联漆酶聚集体分散液的体积比为1:6，取1.5ml浓度为40mmol/l的4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基的异丙醇溶液；在搅拌条件下，将4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基溶液加入到交联漆酶聚集体分散液中，在25℃水浴中恒温反应8h，完成迈克尔加成反应。反应结束后体系在8000rpm下离心8min，用异丙醇重复洗涤5次，获得tempo修饰的交联漆酶聚集体。
52.应用例1:
53.将100mg实施例1制备得到的tempo修饰的交联漆酶聚集体分散于5ml去离子水中，得到tempo修饰的交联漆酶聚集体分散液。直接加入50μl的苯甲醇混合，在30℃水浴中恒温反应10h。反应结束后，加入3ml的石油醚进行萃取并重复三次，将有机相旋转蒸发得到苯甲醇氧化后的产物。经核磁共振氢谱证实tempo修饰的交联漆酶聚集体催化苯甲醇氧化的转化率为90％。
54.应用例2:
55.将100mg实施例3制备得到的tempo修饰的交联漆酶聚集体分散于4ml去离子水中，得到tempo修饰的交联漆酶聚集体分散液。直接加入50μl的苯甲醇混合，在40℃水浴中恒温反应20h。反应结束后，加入3ml的石油醚进行萃取并重复三次，将有机相旋转蒸发得到苯甲醇氧化后的产物。经核磁共振氢谱证实tempo修饰的交联漆酶聚集体催化苯甲醇氧化的转化率为95％。
56.应用例3:
57.将150mg实施例4制备得到的tempo修饰的交联漆酶聚集体分散于6ml去离子水中，得到tempo修饰的交联漆酶聚集体分散液。直接加入50μl的苯甲醇混合，在30℃水浴中恒温反应15h。反应结束后，加入3ml的石油醚进行萃取并重复三次，将有机相旋转蒸发得到苯甲醇氧化后的产物。经核磁共振氢谱证实tempo修饰的交联漆酶聚集体催化苯甲醇氧化的转化率为92％。
58.应用例4:
59.将100mg实施例5制备得到的tempo修饰的交联漆酶聚集体分散于3ml去离子水中，
得到tempo修饰的交联漆酶聚集体分散液。直接加入50μl的苯甲醇混合，在60℃水浴中恒温反应20h。反应结束后，加入3ml的石油醚进行萃取并重复三次，将有机相旋转蒸发得到苯甲醇氧化后的产物。经核磁共振氢谱证实tempo修饰的交联漆酶聚集体催化苯甲醇氧化的转化率为95％。
60.测试例1:
61.(1)将150mg实施例1中的交联漆酶聚集体分散于10.5ml去离子水中，得到交联漆酶聚集体分散液。取1.5ml实施例1中的粗酶溶液分散于9ml的去离子水中，得游离酶溶液。将游离酶溶液和交联漆聚集体分散液各均分2ml的5等份分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴锅中水浴加热3h后冷却至室温；
62.(2)在5ml的乙酸-乙酸钠缓冲溶液(50mmol/l，ph＝4.4)中，用移液枪依次取200μl的上述交联漆酶聚集体分散液和游离酶溶液，分别与500μl的2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液(浓度为11mmol/l，溶剂为水)充分混合，在30℃水浴中恒温反应。利用紫外-可见分光光度计，2min后开始依次测定在420nm处的紫外吸光度值，计算酶活性值。
63.该反应体系酶活性定义为：
64.酶活性＝
△
abs/(ε*
△
t)；
65.式中
△
abs为420nm处吸光度增加值；
△
t为反应时间；ε为摩尔吸光系数(3.6
×
104m-1
cm-1
)；
66.相对酶活性(％)＝(实验组酶活性/对照组酶活性)
×
100％。
67.测试结果如图2所示，较游离酶相比，交联漆酶聚集体比游离酶温度耐受性显著提高，在50℃、60℃的较高温下酶活性保留率仍在80％以上。
68.测试例2:
69.将150mg实施例1中的交联漆酶聚集体分散于10.5ml去离子水中，得到交联漆酶聚集体分散液。取1.5ml实施例1中的粗酶溶液分散于9ml的去离子水中，得游离酶溶液。将游离酶溶液与交联漆酶聚集体分散液置于0～4℃下保存，并随时间推移，同测试例1相同方法，利用紫外-可见分光光度计分别测定第1天、第3天、第5天、第10天、第21天、第29天、第40天的酶活性。测试结果如图3所示，游离酶在40天后活性极低只剩下5％左右，交联漆酶聚集体稳定在80％左右，交联漆酶聚集体活性比游离酶时间稳定性有显著提高。
70.测试例3:
71.将实施例1中步骤(2)得到的交联漆酶聚集体和步骤(3)得到的tempo修饰的交联漆酶聚集体放置于烘箱中进行烘干处理，烘箱温度为35℃，24h后取出。取出烘干后的样品，测试傅立叶转换红外光谱，结果如图4所示。从图4可以看出，对比4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基红外谱图，找到tempo官能团的特征峰。其中2935cm-1
吸收峰归属于-ch2反对称伸缩振动，2973cm-1
有吸收峰归属于-ch3不对称伸缩振动，1361cm-1
吸收峰归属于n-o键伸缩振动，1241cm-1
吸收峰归属于c-n键伸缩振动。tempo修饰的交联漆酶聚集体，四个对应位置特征峰强度都有增加，尤其是1241cm-1
的c-n键伸缩振动，以上特征峰的出现证实了tempo对交联酶聚集体的成功修饰。
72.对比例1：
73.将100mg实施例5制备得到的tempo修饰的交联漆酶聚集体分散于3ml去离子水中，得到tempo修饰的交联漆酶聚集体分散液。直接加入50μl的苯甲醇混合，在70℃水浴中恒温
反应20h。反应结束后，加入3ml的石油醚进行萃取并重复三次，将有机相旋转蒸发得到苯甲醇氧化后的产物。经核磁共振氢谱证实tempo修饰的交联漆酶聚集体催化苯甲醇氧化的转化率为2％，在较高温度下tempo修饰的交联漆酶聚集体对催化苯甲醇氧化效果较差。
74.以上所述仅为本技术的实施例而已，并不用于限制本技术的保护范围，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.一种tempo修饰的交联漆酶聚集体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将漆酶分散于去离子水中，过滤去除不溶物，获得粗酶溶液；(2)在搅拌条件下，将粗酶溶液加入到沉淀剂中沉淀，搅拌，然后加入丙烯酸酯类交联剂溶液进行反应，反应结束后离心、洗涤，获得交联漆酶聚集体；(3)将交联漆酶聚集体分散于溶剂中，获得交联漆酶聚集体分散液；在搅拌条件下，向交联漆酶聚集体分散液中加入4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基溶液进行迈克尔加成反应，反应结束后离心、洗涤，获得所述tempo修饰的交联漆酶聚集体。2.根据权利要求1所述的tempo修饰的交联漆酶聚集体的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，漆酶与去离子水的质量比为1:10～1:15。3.根据权利要求1所述的tempo修饰的交联漆酶聚集体的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，沉淀剂选自丙酮、异丙醇、乙腈中的一种，粗酶溶液与沉淀剂的体积比为1:3～1:6；搅拌条件为常温下搅拌1～10min。4.根据权利要求1所述的tempo修饰的交联漆酶聚集体的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，丙烯酸酯类交联剂为二丙二醇二丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、双三羟甲基丙烷四丙烯酸酯、聚二季戊四醇六丙烯酸酯化合物中的一种；丙烯酸酯类交联剂溶液是将丙烯酸酯类交联剂溶于溶剂中制备得到，所述丙烯酸酯类交联剂溶液浓度为20～100mmol/l；丙烯酸酯类交联剂溶液与粗酶溶液体积比为1:2～1:5；所述反应的条件为25～35℃水浴中恒温反应10～19h。5.根据权利要求1所述的tempo修饰的交联漆酶聚集体的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基溶液与交联漆酶聚集体分散液的体积比为1:3～1:9；所述迈克尔加成的反应条件为25～35℃水浴中恒温反应5～10h。6.根据权利要求5所述的tempo修饰的交联漆酶聚集体的制备方法，其特征在于：所述交联漆酶聚集体分散液是将交联漆酶聚集体分散于溶剂中得到，所述交联漆酶聚集体与溶剂的质量体积比为10mg:1ml～50mg:1ml；所述4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基溶液是将4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基溶于异丙醇中制备得到，所述4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基溶液的浓度为10～40mmol/l。7.根据权利要求2～6中任意一项所述的tempo修饰的交联漆酶聚集体的制备方法，其特征在于：步骤(2)和步骤(3)中离心条件为5000～10000rpm下离心5～10min，洗涤条件为异丙醇洗涤2～5次。8.一种tempo修饰的交联漆酶聚集体，其特征在于，采用权利要求1～7中任意一项所述的tempo修饰的交联漆酶聚集体的制备方法制备得到。9.根据权利要求8所述的tempo修饰的交联漆酶聚集体在催化醇氧化反应中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，用于催化苯甲醇氧化成苯甲醛，包括以下步骤：将所述的tempo修饰的交联漆酶聚集体分散于去离子水中，获得tempo修饰的交联漆酶聚集体分散液，所述tempo修饰的交联漆酶聚集体与去离子水的质量比为1:30～1:50；直接加入苯甲醇到所述的tempo修饰的交联漆酶聚集体分散液中，在30～60℃水浴中恒温反应10～20h，反应结束后即得苯甲醛；优选的，所述tempo修饰的交联漆酶聚集体分散液与苯甲醇的体积比为60:1～120:1。

技术总结
本发明提供一种TEMPO修饰的交联漆酶聚集体及其制备方法与应用，涉及生物酶工程技术领域。本发明具体主要是选用漆酶、丙烯酸酯类交联剂、4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基(4-氨基-TEMPO)，通过迈克尔加成反应制备得到。此法制备的交联漆酶聚集体的温度耐受性以及贮藏稳定性都有显著的提高。且此法制备TEMPO修饰的交联漆酶聚集体可应用于醇氧化，实现了漆酶和TEMPO的重复利用，极大降低生产成本。同时催化条件温和，以水为溶剂，可实现绿色反应，对于可持续化生产具有实现意义。对于可持续化生产具有实现意义。对于可持续化生产具有实现意义。


技术研发人员：陈天有 彭燕 丘美爽 徐祖顺
受保护的技术使用者：湖北大学
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/8/14