可耐受高浓度镉的芽孢杆菌及其应用

1.本发明涉及环境中重金属镉微生物修复技术领域，具体涉及一种可耐受高浓度镉的芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.镉是对环境危害较大的重金属污染物之一，据统计, 我国镉污染土壤面积已达20万km2, 并有进一步扩大的风险。土壤中的镉极易被农作物富集，并通过食物链进入人体，引起慢性中毒，引发各种致命疾病。采矿、冶炼、污泥、污水农用、大气污染、含镉肥料等的应用，易使镉在环境中的含量不断累积，通过暴露、淋洗、沉降、复合夹带等途径，使农田等土壤环境镉污染不断加剧。土壤中镉离子(cd
2+
) 达一定浓度，就无法农用，且会对植物产生毒害作用，使植物细胞损伤，影响植物的正常生理代谢，高浓度镉等重金属的存在还会导致植株死亡。
3.镉污染土壤可以通过物理、化学等方法进行治理，但往往费用昂贵、工艺复杂、实施难度大，对于高浓度镉难以做到彻底修复。相比物理、化学处理方法，生物修复是一种低能耗、高效率和对环境友好的治理方法。芽孢杆菌能够在重金属污染的环境中存活和生长，具有繁殖快速、代谢快、对环境适应性强和耐逆性强等特点。近年来，发展了各种治理镉污染的芽孢杆菌，然而这些微生物菌株只能耐受低浓度的镉，如中国专利cn111925956a公开了一种具有产碱、钝化重金属镉功能的高地芽孢杆菌，其所能处理的镉浓度仅为1.3mg/l。还有一些微生物菌株能够耐受较高浓度的镉，如中国专利cn101525585a公开了一种广州芽孢杆菌，其耐镉的能力为30mg/l；中国专利cn104371956a公开了一种对镉具有阻隔效应的芽孢杆菌及用途，其对镉的最高耐受浓度为40mg/l；中国专利cn112592855a公开了一种高耐镉枯草芽孢杆菌，其对镉的最高耐受浓度也仅为200mg/l。这些芽胞杆菌对镉的耐受承度还远远不能满足矿区等高浓度镉污染土壤处理的需要。
4.因此，发掘可耐受高浓度镉的微生物并将其应用于土壤生物修复具有重大意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种可耐受高浓度镉的菌株，可用于重金属镉污染的治理。
6.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种可耐受高浓度镉的芽孢杆菌，高地芽孢杆菌(bacillus altitudinis) c10-4，该菌株已于2023年4月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：63378，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
7.上述高地芽孢杆菌c10-4的筛选方法，包括如下步骤：（1）称取适量镉污染土壤样品加入到含有玻璃珠的无菌水中，25-30℃，160-180 r/min，震荡混合30-60 min，静置5-10 min；（2）取静置之后的上清液，加入无菌水，依次制备10-2
、10-3
、10-4
梯度稀释的菌悬
液；（3）吸取适量菌悬液涂布于含有3.5 mg/l cd
2+
的pca平板上，每个梯度3个重复，25℃倒置培养5-7 d，待长出菌落后，挑取颜色、大小不同的单菌落划线纯化后斜面保存；（4）将保存的菌株于镉含量为3.5 mg/l的lb液体培养基中，于25℃，160r/min条件下培养48h进行活化。将活化后的菌株依次接种于镉含量为30mg/l、60mg/l、100mg/l、200mg/l、300mg/l、400mg/l、500mg/l、600mg/l、700mg/l、800mg/l、900mg/l、1000mg/l的lb固体培养基中，于25℃培养48-72h，比较菌株的生长状况，从中筛选出目标微生物菌株。
8.所述微生物菌株具有如下形态和生理、生化特性：a.菌体形态特性：透射电镜观察显示细胞为杆状、无鞭毛，且有类似荚膜的结构；b.菌落形态特性：为圆形、表面光滑有光泽、边缘规则、略微凸起、半透明的白色单菌落，菌落直径1-2 mm；大小在(4.06
±
0.75)
×
(0.88
±
0.35)μm；c.生理生化特性：革兰氏染色呈阳性，氧化酶、触酶、甲基红、淀粉水解实验测定结果为阳性，丙二酸利用、柠檬酸盐利用、纤维素解、脲酶、吲哚、v-p实验测定结果为阴性；葡萄糖实验结果为发酵型。
9.进一步地，根据天根细菌基因组dna提取试剂盒（tianamp bacteria dna kit）步骤提取该菌株的dna用于菌种鉴定。在比对匹配度最高的结果中，菌种所测得到的16srdna 序列部分（seq id no:1所示）与bacillus（芽孢杆菌属）的16s rdna 序列有100%的同源性，可确定菌属为bacillus（芽孢杆菌属）；与已知菌种的匹配中，与b.altitudinis41kf2b-t(高地芽胞杆菌)的16srdna序列有99.80%的同源性；基因组数据比对结果显示，与bacillus altitudinis41kf2b (高地芽孢杆菌) 的ani值为98.27%，dddh值为84.7%。
10.分子鉴定结果结合形态学及生理生化实验结果，可确定上述菌种为高地芽孢杆菌(bacillus altitudinis)，命名为c10-4。
11.上述微生物菌株在重金属镉污染土壤生物修复中的应用。
12.具体地，所述生物修复方法如下：将高地芽孢杆菌c10-4接种于lb液体培养基中，25℃-28℃，160-180 r
·
min-1
震荡培养16-18 h至对数生长期，离心获得菌体；用去离子水重悬菌体，获得菌悬液，使菌悬液od
600
达到1.0-1.4；按体积质量比(ml/g)10%-15%将菌悬液加入含有重金属镉的污染土壤中混合均匀。
13.作为优选，所述生物修复方法如下：将高地芽孢杆菌c10-4接种于lb液体培养基中，25℃，160 r
·
min-1
震荡培养18 h至对数生长期，离心获得菌体；用去离子水重悬菌体，获得菌悬液，使菌悬液od
600
达到1.2；按体积质量比(ml/g)10%将菌悬液加入含有重金属镉的污染土壤中混合均匀。
14.作为优选，所述lb液体培养基的组成包括：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，ph为 6.8-7.0。
15.所述lb固体培养基的组成包括：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，琼脂粉15-20g/l,ph为6.8-7.0。
16.本发明所提供的高地芽孢杆菌(bacillus altitudinis)c10-4可耐受cd
2+
的浓度高达1600mg/l，是重金属镉污染治理的优秀微生物材料。高地芽孢杆菌c10-4菌株接入土壤后，菌体表面的官能团能将重金属离子快速吸附于菌体表面，降低土壤中的可交换态镉含
量，增加其可还原态、可氧化态及残渣态的含量，在cd
2+
浓度为50mg/kg时，可将土壤中可交换态镉的含量在15d内由66.14%降低到40.01%，在cd
2+
浓度为100mg/kg时，可将土壤中可交换态镉的含量在15d内由65.15%降低到47.12%。并且热干菌体相对于活菌体对cd
2+
有更高的去除率。
17.此外，高地芽孢杆菌c10-4对cu
2+
、zn
2+
、cr
6+
、pb
2+
等重金属也具有较强的抗性，可溶解重金属污染土壤中的无机磷，进一步促进重金属污染修复植物的生长，提高生物修复效率。
附图说明
18.图1为菌株c10-4的平板菌落图（图a）及透射电镜图（图b）。
19.图2 为菌株c10-4在镉离子含量分别为1400mg/l（图a）、1600mg/l（图b）以及1800mg/l（图c）的培养基上生长情况图，其中a代表菌浓度od
600
为0.01；b代表菌浓度od
600
为0.1；c代表菌浓度od
600
为1.0；d代表菌浓度od
600
为10。
20.图3 为菌株c10-4死、活菌体细胞内外对不同浓度镉离子的吸附率占比图。
21.图4为菌株c10-4死、活菌体吸附cd
2+
前后的sem-eds图，其中，图（a）为活菌体吸附cd
2+
前的sem-eds图；图（b）为活菌体吸附cd
2+
后的sem-eds图；图（c）为死菌体吸附cd
2+
前的sem-eds图；图（d）为死菌体吸附cd
2+
后的sem-eds图。
22.图5为菌株c10-4对cd
2+
浓度为50mg/kg的污染土壤修复后土样中cd
2+
存在状态分布图。
23.图6为菌株c10-4对cd
2+
浓度为100mg/kg的污染土壤修复后土样中cd
2+
存在状态分布图。
具体实施方式
24.下面结合实施例对本发明进一步描述，但并不限制本发明的内容。
25.实施例1高地芽孢杆菌c10-4的筛选（1）将来自重金属污染区的土壤样品1.0g加入含有玻璃珠的9 ml无菌水，25℃，160 r/min，振荡30 min后静置5 min，取上清液1 ml加入9 ml无菌水，依次制备10-2
、10-3
、10-4
梯度稀释的菌悬液。
26.（2）分别取不同稀释度的菌悬液100μl涂布于含镉量为3.5 mg/l的pca平板上，每个稀释度设置三个平行，25℃倒置培养5-7 d，挑取颜色、大小不同的单菌落划线纯化后斜面保存。
27.（3）将保存的菌株于镉含量为3.5 mg/l的lb液体培养基中，于25℃160r/min培养48h，进行菌株的活化。将活化后的菌株依次接种于镉含量为30、60、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000mg/l的lb固体培养基中，于25℃培养48-72h进行驯化筛选。比较菌株的生长状况，从中筛选出目标微生物菌株。
28.lb液体培养基包括：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，ph 为6.8-7.0。
29.lb固体培养基包括：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，琼脂粉15-20g/l,ph为6.8-7.0。
30.通过上述方法，本发明在稀释浓度为10-3
，含镉1000mg/l的lb固体培养基筛选出一
株微生物菌株，命名为高地芽孢杆菌c10-4，已于2023年4月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：63378。
31.实施例2高地芽孢杆菌c10-4的鉴定1、形态特征如图1所示，菌株c10-4在lb固体培养基上25℃培养18h后形成圆形、表面光滑有光泽、边缘规则、略微凸起、半透明的白色单菌落，菌落直径1-2 mm。透射电镜观察显示细胞为杆状、无鞭毛，且有类似荚膜的结构。大小在(4.06
±
0.75)
×
(0.88
±
0.35)μm。
32.2、生理生化特性参照《伯杰氏系统细菌学手册》对菌株c10-4的生理生化特性进行测定。
33.革兰氏染色呈阳性，氧化酶、触酶、甲基红、淀粉水解实验测定结果为阳性，丙二酸利用、柠檬酸盐利用、纤维素解、脲酶、吲哚、v-p实验测定结果为阴性，葡萄糖实验结果为发酵型。
34.3、分子鉴定根据天根细菌基因组dna提取试剂盒（tianamp bacteria dna kit）步骤提取菌株c10-4的dna用于菌种鉴定。在比对匹配度最高的结果中，菌种所测得到的16srdna 序列部分（seq id no:1所示）与bacillus（芽孢杆菌属）的16s rdna 序列有100%的同源性，可确定菌属为bacillus（芽孢杆菌属）；与已知菌种的匹配中，与b.altitudinis41kf2b-t(高地芽胞杆菌)的16s rdna序列有99.80%的同源性；基因组数据比对结果显示，与bacillus altitudinis41kf2b (高地芽孢杆菌) 的ani值为98.27%，dddh值为84.7%。
35.分子鉴定结果结合形态学及生理生化实验结果，可确定上述菌种为高地芽孢杆菌(bacillus altitudinis) ，命名为c10-4。
36.实施例3高地芽孢杆菌c10-4对镉的耐受性将高地芽孢杆菌c10-4接种于lb液体培养基中，25℃，160 r
·
min-1
震荡培养18 h至对数生长期，离心获得菌体；用去离子水重悬菌体，分别设置od
600
为0.01、0.1、1.0和10的菌悬液。各取5ul菌悬液接种于镉含量分别为0、100、200、1000、1400，1600和1800mg/l的lb固体培养基中，25℃培养48 h，观察并记录cd
2+
所限制菌株生长的最小浓度。如图2所示，菌株c10-4可在镉含量为1600mg/l的培养基上正常生长，而镉含量高于1600mg/l的培养基上无菌落生长。
37.实施例4高地芽孢杆菌c10-4死、活菌体对镉的吸附性能活菌体的制备：将高地芽孢杆菌c10-4接种到lb液体培养基中，25℃，160 r/min震荡培养18h至对数生长期，然后将培养液于10000 r/min离心10 min获得菌体。菌体用无离子水清洗三遍后在室温下通风干燥2h去除多于水分，干燥后的菌体于4℃保存作为活菌体。
38.死菌体（热干菌体）的制备：将干燥后的菌体放入60℃烘箱内过夜至恒重，取出后充分研磨粉碎，作为死菌体（热干菌体）。
39.6g活菌体经热干处理后可获得1 g的热干菌体，吸附特性分析时所用活菌体质量为热干菌体的6倍。
40.在cd
2+
含量为40mg/l的水溶液中分别接入菌株c10-4的活菌体和热干菌体，使活菌体终浓度为6 mg/l，热干菌体终浓度为1 mg/l，于25℃，180r/min条件下进行吸附处理1 h，然后离心获得铬钝化之后的菌体。将菌体用20 ml 100 mmol
·
l-1
edta-pbs重悬后，在30℃
160 r/min条件下振荡 30 min，离心分别收集上清液和菌体，上清液中cd
2+
含量即为胞外吸附量。将菌体重悬浮在20 ml 5% hno3和0.1% triton x-100的混合消化液中，95℃下水浴 30 min；待细胞裂解完全溶液澄清后，12000r/min离心10 min取上清；胞内cd
2+
已全部呈自由态的形式存在于溶液中，此时上清液中的cd
2+
含量即为重金属在细菌胞内的吸附量。将上清液稀释适宜倍数后最后用原子吸收分光光度计测定重金属浓度。
41.如图3所示，菌株c10-4活菌体与热干菌体的细胞外cd
2+
吸附量都明显多于细胞内cd
2+
吸附量。且热干菌体细胞外cd
2+
吸附量大于活菌体细胞外cd
2+
吸附量。
42.进一步对吸附cd
2+
前后的菌体进行sem-eds分析。将菌体用pbs溶液（0.1m，不含nacl）漂洗数次，离心去上清，向沉淀菌体中加入4℃预冷的3%戊二醛，在4℃固定4 h或过夜，之后用系列梯度酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）脱水，每种浓度酒精脱水1次，每次10-20 min，再用 100%酒精彻底脱水1-2次。干燥后用真空喷镀法喷镀，使用扫描电子显微镜和x射线能量色散仪分析菌体吸附cd
2+
前后的形态结构和元素组成。
43.如图4所示，从sem图谱可以看出，形状规则的菌株c10-4活菌体在吸附cd
2+
后表面变得粗糙。经热干处理后的死菌体表面发生了皱缩，但是杆状结构没有被破坏，在吸附cd
2+
后表面也变得更粗糙，褶皱变多。从eds图谱可以看出，两种菌体处理前表面没有cd
2+
存在，处理后两种菌体表面存在大量cd
2+
，活菌体表面存在的cd
2+
的质量百分比为(3.76
±
0.73)%，热干菌体表面存在的cd
2+
的质量百分比为(5.8
±
0.38)%。
44.由此可见，菌株c10-4主要通过菌体表面的官能团快速将cd2吸附于菌体表面，对镉产生抗性，溶液中绝大部分的cd
2+
都被菌株c10-4表面官能团结合吸附，只有很少的一部分进入菌体内。并且热干菌体对cd
2+
的吸附要强于活菌体。
45.实施例5 菌株c10-4对土壤中镉的钝化性能将菌株c10-4接种于微生物菌株培养基中，培养18h至对数生长期，离心并用去离子水重悬菌体，获得菌悬液，使菌悬液od
600
达到1.2。按10%(v/g)的接种量将菌悬液接种到cd
2+
污染的土壤中。同时设置空白对照组，在cd
2+
污染的土壤中接入等量的去离子水。每组三个平行，每个平行500 g土壤。在接入菌体后的0、5、10、15、20、25、30天采集土壤，采用改进bcr法测定土样中cd
2+
的存在状态。
46.步骤如下：1.可交换态：准确称取通过100目筛的风干土壤样品1g，加40ml 0.1mol/l 的hac，放在恒温振荡器中24
±
1℃下连续振荡16h，然后3000-5000rpm下离心15-20min。取上清液，用icp-aes测定cd
2+
含量。加入无菌水清洗残余物，振荡20-30min，离心，弃去清洗液。
47.2.可还原态：向1的残渣中加入40ml 0.5mol/l的盐酸羟胺，放在恒温振荡器中22-24℃下连续振荡15-16h，然后3000-5000rpm下离心15-20min。其余步骤同1。
48.3.可氧化态：向2的残渣中加入10ml h2o2，搅拌均匀，室温下静置 1h左右后用水浴加热保持80-85℃ 1h左右，再加入10ml h2o2，在恒温水浴箱中加热保持80-85℃1h左右。冷却后，加入50ml 1mol/l的nh4ac，放在恒温振动器中22-24℃下连续震荡16h，然后3000-5000rpm下离心15-20min。其余步骤同1。
49.4.残渣态：向3的残渣中加入10ml hno3，使酸和样品充分混合均匀。进行微波消解。
50.各形态镉的含量变化如图5和图6所示，通过接种菌株c10-4的土样经30天菌种的
繁殖，土壤中可交换态镉含量显著降低，且在0-5天内可交换态的cd
2+
减少速度最快，此后减少速度逐渐变慢，在15天时达到稳定。达到稳定时，与未接种土样相比，在cd
2+
浓度为50 mg/kg的接种菌株c10-4的土样中可交换态cd
2+
含量从66.14%下降到了40.01%，共减少了26.13%；在cd
2+
浓度为100 mg/kg的接种菌株c10-4的土样中可交换态cd
2+
从65.15%下降到了47.12%，共减少了17.98%，经方差分析，两组实验结果差异极显著（p《0.01）。在cd
2+
浓度为50mg/kg的土壤中，可还原态cd
2+
增加了20.24%，可氧化态cd
2+
增加了3.62%，残渣态cd
2+
增加了2.26%。在cd
2+
浓度为100mg/kg的土壤中，可还原态cd
2+
增加了12.83%，可氧化态cd
2+
增加了2.27%，残渣态cd
2+
增加了2.35%，经方差分析，两组实验结果差异极显著（p《0.01）。
51.cd
2+
的可交换态是cd
2+
最不稳定的状态，被认为是最易被植物等生物吸收的形态，而还原态、氧化态和残渣态是相对稳定的状态，如果可交换态减少而稳定态增加，则污染土壤得到修复。cd
2+
污染土壤中接入菌株c10-4后可交换态显著下降（p《0.01），还原态、氧化态与残渣态总和显著增加（p《0.01）表明菌体c10-4能有效降低土壤中可交换态等有效态镉的含量，对镉污土壤染具有明显的修复能力。
52.实施例6 菌株c10-4对其他重金属的抗性将处于对数生长期的菌株c10-4制成od
600
为1的菌悬液，然后将其按1%的接种量分别接种到含有不同浓度梯度的cu
2+
、zn
2+
、cr
6+
、cd
2+
的lb固体培养基中，培养48 h，观察并记录重金属离子所限制菌株生长的最小浓度。
53.结果显示，菌株c10-4可在含cu
2+
、zn
2+
、cr
6+
、pb
2+
等重金属的培养基中生长，这些重金属对菌株c10-4的最小限制生长浓度分别为50、25、50、200 mg/l。

技术特征：
1.可耐受高浓度镉的芽孢杆菌，其特征在于，所述芽孢杆菌为高地芽孢杆菌(bacillus altitudinis) c10-4，保藏编号为gdmcc no:63378。2.一种权利要求1所述的芽孢杆菌在镉污染治理中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，用于含镉土壤生物修复。4.一种修复镉污染土壤的方法，其特征在于，将权利要求1所述的高地芽孢杆菌(bacillus altitudinis) c10-4接种于lb液体培养基中，培养至对数生长期，离心获得菌体；用去离子水重悬菌体，获得菌悬液；将菌悬液与镉污染土壤混合均匀。5.根据权利要求4所述的修复镉污染土壤的方法，其特征在于，所述lb液体培养基的组成包括胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，ph为6.8-7.0。6.根据权利要求4所述的修复镉污染土壤的方法，其特征在于，所述高地芽孢杆菌(bacillus altitudinis) c10-4的培养条件为：25℃-28℃，160-180 r
·
min-1
震荡培养16-18 h。

技术总结
本发明涉及环境中重金属镉微生物修复技术领域，具体涉及一种可耐受高浓度镉的芽孢杆菌及其应用。本发明公开了一株可耐受高浓度镉的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)C10-4，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号是GDMCC No:63378。该菌株能够将土壤中的可交换态镉钝化，显著降低其含量，对Cu


技术研发人员：孙磊 高天宇 吕志堂
受保护的技术使用者：河北大学
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/8/14