一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法和应用与流程

一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型elisa抗体检测试剂盒及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于病原菌检测技术领域，具体涉及一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型elisa抗体检测试剂盒及其制备方法和应用。


背景技术：

2.牛多杀性巴氏杆菌(pasteurella multocida，pm)荚膜b型是引起我国牛出血性败血症的病原菌。牛出血性败血症是以高热、肺炎、急性胃肠炎以及内脏器官广泛出血为特征的传染病，在我国已有几十年的流行历史，目前仍在多地呈散发或地方性流行。2008年，我国牛场出现了以纤维素性肺炎为典型症状的牛呼吸道传染病，并在黑龙江、甘肃、贵州、重庆、四川等数个省市流行。该病的临床表现以精神萎靡、食欲减退、咳嗽、流涕、体温升高和消瘦为特征。主要病理解剖变化在肺组织，呈广泛淤血和散在大小不一的脓肿结节，急性、亚急性或慢性的化脓性纤维素渗出与坏死，以及小叶间隔的水肿与化脓，严重者出现心包膜与胸膜粘连、纤维素性或化脓性胸膜炎。经哈尔滨兽医研究所等单位对数省市病料中的病原菌进行分离鉴定，并进行动物回归试验，确定了其病原菌为牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型。
3.牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型与b型有显著的不同，例如a型菌生长在牛的肺部，在病牛的血液中几乎无法检测出a型菌，因此无法使用pcr方法对采样的血清进行病原检测，elisa抗体检测是首选的方法。可是由于牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型的许多基因与b型有高度同源性，抗原有交叉反应，因此很难找到一个特异性的蛋白抗原进行elisa检测。传统的包被抗原使用a型特异性的荚膜抗原，但荚膜抗原无法使用大肠杆菌等基因工程菌进行大量表达，需要用病原菌培养提取，不但产量低，还容易造成生物安全问题。且多糖的定量和包被都比使用基因工程表达蛋白困难得多。因此使用基因工程表达蛋白，比荚膜抗原更容易制备和生产elisa抗体检测试剂盒。


技术实现要素：

4.本发明意在提供一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型elisa抗体检测试剂盒，以解决现有技术中缺少针对于牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型的且可以大量制备的特异性抗原的技术问题。
5.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型elisa抗体检测试剂盒，包括pma153包被的固相载体；pma153的氨基酸序列如seq id no.2所示。
7.本方案还提供了一种抗原蛋白在制备特异性检测牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型的试剂盒中的应用，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
8.本方案还提供了一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型elisa抗体检测试剂盒的制备方法，包括pma153包被的固相载体的制备步骤：
9.s1抗原蛋白的获取：将序列如seq id no.1所示的基因整合到表达载体上，获得重组质粒；将重组质粒转入宿主菌，诱导宿主菌表达抗原蛋白；再经菌体破碎、离心取上清以及纯化获得pma153。
10.s2包被：配制含pma153的包被液，使包被液于固相载体接触并孵育，再经封闭处理后，获得pma153包被的固相载体。
11.本技术方案的原理以及优点在于：
12.发明人通过对vista、ncbi等大量数据库筛选以及结合试验分析，获到一个特异性检测牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型抗体的pma153重组蛋白，构建了pet30a-pma153质粒。并在大肠杆菌中成功表达pma153重组蛋白，使用镍柱进行纯化，获得了较高的蛋白纯度。针对pma153蛋白进行检测，可以特异性地检测出牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型，可根据检测结果采用更有针对性的治疗手段。利用pma153抗原蛋白，可以建立一系列基于免疫反应的、用于特异性检测牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型菌株的检测方法以及检测试剂盒，包括但不限于各种类型的elisa和免疫层析等。例如，基于pma153抗原蛋白，还可以使用胶体金方法测定抗体、乳胶凝集法测定抗体，以及通过对流电泳法和琼脂扩散法测定抗体，这些方法只是具体实施方式不同，但都是以pma153抗原蛋白为基础进行。
13.作为示例，发明人利用pma153重组蛋白建立了牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型elisa抗体检测试剂盒。试剂盒显示出了理想的检测特异性、稳定性和灵敏性。发明人进一步将本方案建立的试剂盒应用于临床检测中，取得了良好的效果。
14.进一步，一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型elisa抗体检测试剂盒还包括标准阳性对照血清和标准阴性对照血清；所述标准阳性对照血清是由使用牛源多杀性巴氏杆菌荚膜a型菌株免疫牛获得；所述标准阴性对照血清为未免疫和未感染多杀性巴氏杆菌荚膜a型的牛血清。
15.进一步，一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型elisa抗体检测试剂盒还包括酶标二抗、显色液、终止液、浓缩洗涤液和样品稀释液。
16.进一步，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗牛igg；所述显色液为双组分tmb显色液；所述终止液为硫酸溶液；所述浓缩洗涤液为pbst洗涤液；所述样品稀释液为含牛血清白蛋白、吐温-20、edta和氯化钠的pbs液。
17.进一步，一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型elisa抗体检测试剂盒，其判定标准为：待检样品的s/p值≥0.161时，判为阳性；待检样品的s/p值＜0.161时，判为阴性；s/p值的计算方法为：(样品od
450
值－标准阴性对照血清od
450
均值)/(标准阳性对照血清od
450
均值－标准阴性对照血清od
450
均值)；od
450
是指在450nm波长下光密度；且标准阳性对照血清od
450
值均≥2.0，标准阴性对照血清od
450
值均＜0.25。
18.进一步，在s1抗原蛋白的获取中，表达载体为pet30a；诱导宿主菌表达抗原蛋白的试剂为异丙基-β-d-硫代半乳糖苷；宿主菌为rosseta de3；纯化的方式为通过ni-nta superflow cartridges his亲和层析柱纯化。
19.进一步，在s2包被中，包被液中pma153的含量为10μg/ml，孵育条件为4℃8-12h；封闭处理为使用无蛋白封闭缓冲液37℃封闭2h。
20.进一步，一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型elisa抗体检测试剂盒的制备方法，还包括标准阳性对照血清的制备步骤：使用牛源多杀性巴氏杆菌a型菌株的灭活疫苗免疫健康
牛，14天后进行一次加强免疫，并于加强免疫后1月采集血清获得标准阳性对照血清。
21.综上所述，本技术方案的有益效果在于：
22.1)本发明提供一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型elisa抗体检测试剂盒制备及应用方法，包被抗原为大肠杆菌基因工程表达pm153重组蛋白抗原，不使用牛多杀性巴氏杆菌作为抗原制备来源，具有良好的生物安全性。
23.2)本发明提供一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型elisa抗体检测试剂盒制备及应用方法，包被抗原为大肠杆菌基因工程表达pm153重组蛋白抗原，不使用牛多杀性巴氏杆菌荚膜抗原进行包被，定量方便且包被方法简单，包被稳定性可靠，重复性好。
24.3)本发明提供一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型elisa抗体检测试剂盒制备及应用方法，包被抗原为大肠杆菌基因工程表达pm153重组蛋白抗原，不使用牛多杀性巴氏杆菌荚膜抗原进行包被，能够获得较高的抗原产量，有利于进行批量生产。
25.4)本发明提供一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型elisa抗体检测试剂盒制备及应用方法，检测方法具有良好的特异性、重复性和稳定性。能够检测出牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型血清，对b型、d型、e型、f型等均不检出。
26.5)本发明提供一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型elisa抗体检测试剂盒制备及应用方法，能够精准的为牛多杀性巴氏杆菌a型引起的肺炎提供诊断和治疗。
附图说明
27.图1为实施例1的pet30a-pma153质粒结构示意图。
28.图2为实施例1的pet30a-pma153质粒pcr产物琼脂糖电泳结果图。
29.图3为实施例1的pma153重组蛋白的表达前后sds-page电泳分析结果图。
30.图4为实施例1的pm153重组蛋白纯化的sds-page电泳分析结果图。
31.图5为实施例1的pma153重组蛋白抗原western blot鉴定结果图。
具体实施方式
32.下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
33.实施例1：pet30a-pma153表达载体的构建及表达
34.(1)基因的设计
35.截取牛多杀性巴氏杆菌a型蛋白(genbank：qgv31027.1)的pma153核苷酸片段，根据密码子简并性已经在各种生物中的密码子偏好，对核苷酸片段进行了优化。优化后的核酸序列如seq id no.1所示核苷酸序列，其编码的氨基酸如seq id no.2所示。
36.pma153核苷酸序列(seq id no.1，5
’→3’
)
37.atgaccgaggagaacaagggcaagcgctacttcctgtggtttatcctgttcatcctgtctatctatctgttcattactattcaggaacgtcgtggttactgcttcgataaacgtgcttacatccacgaactgtacaccgaacaggaactgatcgatcgtggcattgaatacgtcgtgagcactatgccgtccggtgtaatcaaaccggatggcacgatcaaggaagtaaaacgttatacttctgttgaagaatttaaacagatgaacccggcatgctgcactctgactacctttatcgatgaaggtggtgatggttacccggatgatgacggttatggctacgtgcgcatcgagtacctgcgtcactacgtt
gaaaacctgaaaccgtatcaccgtgttatctacctggaatacactccgtgcggtgaactgcgtgaagaggctgcattctccaaaaac
38.pma153氨基酸序列(seq id no.2，n
→
c)
39.mteenkgkryflwfilfilsiylfitiqerrgycfdkrayihelyteqelidrgieyvvstmpsgvikpdgtikevkrytsveefkqmnpacctlttfideggdgypdddgygyvrieylrhyvenlkpyhrviyleytpcgelreeaafskn
40.(2)重组质粒的构建
41.pma153基因委托上海生工通过现有技术常规手段合成并连接到pet30a载体上，并转入top10菌种。构建pet30a-pma153重组质粒(质粒结构见附图1)。
42.(3)重组质粒的转化
43.将top10菌种接入100ml含有amp(100μg/ml)的lb培养基，置37℃摇床中振荡培养10小时，提取质粒，转入宿主菌rosseta(de3)，取200μl转化产物涂布含有amp(100μg/ml)的lb琼脂平板，平板置37℃温箱中培养18小时。
44.(4)表达菌的鉴定筛选
45.挑取平板单菌落，分别接种于10ml含有amp(100μg/ml)的lb培养基中，置37℃摇床，震荡培养过夜，作为原始菌液。以pet30a通用引物对菌体进行pcr扩增，核酸电泳目的片段与理论值进行比较，结果见附图2。pcr结果表明，获得798bp目的条带，与理论值相符。pcr产物送上海生工进行序列测定，并进行比对确定。
46.取上述原始菌液1ml，按1％接种量转接100ml含有amp(100μg/ml)的lb液体培养基，置37℃摇床，150r/min震荡培养。当菌液od
600
值达0.6左右时，取1ml置ep管中，3000r/min离心1分钟，获得诱导前菌体。
47.于剩余培养物中加入适量iptg，诱导蛋白表达，置37℃摇床，150r/min震荡培养6小时；取菌液1ml，同上离心，获得诱导后菌体。诱导前后菌体进行sds-page电泳，鉴别蛋白表达情况，进而筛选表达良好的单菌落，并保存菌种。诱导过程中，iptg的终浓度在0.25-0.5mmol/l之间，在本具体的实施例中加入量为0.5mmol/l。(iptg的终浓度为0.5mmol/l)。
48.(5)蛋白表达及纯化
49.取保存菌种，按1％接种量转接100ml含有amp(100μg/ml)的lb液体培养基，置37℃摇床，150r/min震荡培养8h，按1％接种量转接3000ml含有amp(100μg/ml)的lb液体培养基。当菌液od
600
值达0.6左右时，于培养物中加入终浓度适当iptg，诱导蛋白表达，置37℃摇床，150r/min震荡培养6小时。上述培养液4℃6000rpm离心15min，收集沉淀。
50.上述沉淀用buffer a洗涤一次，离心去上清，沉淀按照重量体积比，加10倍体积的buffer a超声破碎，超声条件：功率300w，工作3s，间歇3s，共120min；4℃12000rpm离心15min，收集上清。buffer a的配方为：取nacl 29.22g、1m ph8.0 tris-hcl 20ml，加去离子水定容至1000ml。sds-page电泳，鉴别蛋白表达情况，结果见附图3。结果表明表达蛋白为可溶性表达。
51.上清蛋白液通过ni-nta superflow cartridges his亲和层析柱(简称ni柱)纯化。以10倍柱体积buffer a平衡镍柱。以上清上样，上样流速为1ml/min。以5倍柱体积的buffer b冲洗杂质，流速1.5ml/min。以buffer c洗脱目的蛋白，流速1.5ml/min。buffer b的配方为：取nacl 29.22g、1m ph8.0 tris-hcl 20ml、咪唑1.7g，加去离子水定容至
1000ml。buffer c的配方为：取nacl 29.22g、1m ph8.0 tris-hcl 20ml、咪唑34g，加去离子水定容至1000ml。
52.取适量纯化样品，以bradford法测定总蛋白含量。sds-page电泳，鉴别蛋白纯化情况，结果见附图4。结果表明该蛋白能够通过ni柱有效纯化，获得25kd的目的蛋白。
53.(6)western blot检测
54.取纯化蛋白进行sds-page凝胶电泳，60v电压电转1h，使蛋白转移到硝酸纤维素膜上。5％脱脂奶粉封闭2h，使用已确认的多杀性巴氏杆菌a型阳性血清(pmcq2株二免血清)作一抗，一抗稀释倍数1:500倍，室温孵育2h。使用兔抗牛igg作二抗，二抗稀释倍数1:500倍，室温孵育2h。dab显色法进行显色，结果见附图5。结果表明该蛋白有较好的免疫原性。
55.实施例2：试剂盒检测方法的建立
56.(1)抗体检测板的包被和封闭
57.用浓度为10μg/ml的纯化pma153重组蛋白抗原包被固相载体于4℃过夜，而后用thermo scientific
tm
pierce无蛋白封闭缓冲液37℃封闭2h。固相载体在本实施例中具体采用96孔聚苯乙烯酶标板，每孔中加入100μl纯化pma153重组蛋白抗原溶液或者无蛋白封闭缓冲液。
58.(2)对照血清的制备
59.用牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型、b型、d型、e型、f型菌株，取菌液培养物制备灭活疫苗(采用现有技术常规的甲醛灭活方式)，各疫苗用体重100kg左右的3-6月健康易感牛免疫一组(4头/组)，各皮下或肌肉注射疫苗4ml(细菌浓度5x10
9 cfu/ml，免疫4ml/头)，1月后采集疫苗组血清作为阳性血清。对pmcq2免疫的牛，14天后进行一次加强免疫，并于加强免疫后1月采集血清作为试剂盒阳性对照血清，并采集未免疫多杀性巴氏杆菌a型牛血清作为阴性对照血清。菌株来源及编号见表1。
60.另获得临床确认的牛溶血性曼氏杆菌、牛异源曼氏杆菌、牛支原体、牛病毒性腹泻、牛口蹄疫阳性血清若干，作为特异性研究用。
61.表2：菌株来源及编号
62.菌株编号宿主荚膜血清型来源pmcq1牛a西南大学分离pmcq2牛a西南大学分离pmcq3牛a西南大学分离pmcq4牛a西南大学分离pmcq5牛a西南大学分离pmcq6牛a西南大学分离pmcq7牛b西南大学分离cvcc390牛b中国兽医药品监察所pmal1牛b重庆澳龙生物制品有限公司分离pmal2牛b重庆澳龙生物制品有限公司分离pmal3牛b重庆澳龙生物制品有限公司分离pmal4牛b重庆澳龙生物制品有限公司分离cvcc391牛b中国兽医药品监察所
cvcc44502牛b中国兽医药品监察所cvcc44702牛b中国兽医药品监察所nctc10323牛bnctc菌种保藏中心cvcc392牛d中国兽医药品监察所cvcc393牛e中国兽医药品监察所cvcc395牛f中国兽医药品监察所
63.(3)pma153试剂盒的组成
64.试剂盒的组分包括用纯化的牛源多杀性巴氏杆菌a型pma153重组蛋白抗原包被的固相载体、标准阳性对照血清、标准阴性对照血清、酶标二抗、显色液、终止液、浓缩洗涤液、样品稀释液和血清稀释板。
65.其中，对试剂盒的各个组成部分的具体情况具体描述如下：
66.固相载体为96孔聚苯乙烯酶标板。
67.牛源多杀性巴氏杆菌pma153重组蛋白抗原为采用实施例1的方法大肠杆菌重组表达后纯化的产物。阳性对照血清为制备的牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型血清，具体地，使用pmcq2菌株免疫健康易感牛，14天后进行一次加强免疫，并于加强免疫后1月采集血清，即为标准阳性对照血清。pmcq2菌株信息参见文献“comparative genomics analysis of two different virulent bovine pasteurella multocida isolates，huihui du et al.，international journal of genomics，2016”,为现有技术中已知的一种牛源多杀性巴氏杆菌荚膜a型菌株。仅仅是为了具体说明试剂盒的组成采用pmcq2菌株为例进行说明，除了该菌株之外，也可以采用其他的牛源多杀性巴氏杆菌荚膜a型菌株对牛进行免疫并获得标准阳性对照血清。采用灭活菌株作为疫苗免疫动物获得含有抗体的血清是现有技术的常规操作手段，本方案的试剂盒可用于检测所有的多杀性巴氏杆菌荚膜a型(后文实验数据可证明)，而不是单独对pmcq2菌株进行检测，所以采用包括pmcq2菌株在内的牛源多杀性巴氏杆菌荚膜a型菌株，对牛进行免疫并获得标准阳性对照血清是可行的。
68.阴性对照血清为未免疫和未感染多杀性巴氏杆菌荚膜a型的牛血清。
69.显色液为tmb显色液(双组份)，为现有技术的常规试剂。tmb是辣根过氧化物酶(hrp)的底物，在辣根过氧化物酶的作用下，与氧化剂过氧化氢反应显色，颜色的强弱与hrp的活性呈正比，从而可以用于检测基于hrp标记物的检测。tmb显色液(双组份)分为a液、b液两部分，a液含有过氧化氢，包装于白色瓶中；b液含有3,3’,5,5
’–
四甲基联苯胺(3,3’,5,5
’‑
tetramethylbenzidine，tmb)，包装于棕色瓶中。更具体地，a液的组分为：醋酸钠13.6g、柠檬酸1.6g、30％双氧水0.3ml，蒸馏水加至500ml；b液的组分为：乙二胺四乙酸二钠0.2g、柠檬酸0.95g、甘油50ml、tmb粉末0.15g(溶于3ml dmso中)，蒸馏水加至500ml。蒸馏水加至500ml过滤除菌后，分别分装于30ml塑料瓶，每瓶10ml。
70.反应终止液为2mol/l的h2so4。
71.浓缩洗涤液为25倍pbst洗涤液，即含吐温-20的磷酸盐缓冲液。
72.样品稀释液是含0.5％bsa、0.05％tween-20、5mmol/l edta、0.5mol/l nacl、ph7.2的pbs液。
73.酶标二抗为辣根过氧化物酶(hrp)标记的兔抗牛igg，可采用现有技术常规手段通过免疫反应、筛选和纯化以及偶联hrp获取。为获得良好生产简易型和重复性，本专利采用
了商业化的hrp anti-bovine serum albumin抗体(abcam公司，商品号：ab7637)。
74.具体地，本实施例设计了如下规格的试剂盒商品(表2)：
75.表2：试剂盒组成
76.试剂盒组分规格数量包被板96孔/块1块/盒血清稀释板96孔/块1块/盒阴性对照血清30μl/支1管/盒阳性对照血清30μl/支1管/盒样品稀释液50ml/瓶1瓶/盒25
×
pbst浓缩洗涤液30ml/瓶1瓶/盒兔抗牛igg酶标抗体hrp50μl/支1瓶/盒底物显色液10ml/瓶1瓶/盒终止液10ml/瓶1瓶/盒说明书双面1份/盒
77.(4)检测方法
78.具体检测操作步骤如下：
79.1)实验开始前，各试剂均应平衡至室温；对待检测的血清样品用样品稀释液按照1:50的体积比进行稀释，以使稀释后的样品检测的吸光度值符合试剂盒的检测范围，阳性对照血清和阴性对照血清也用样品稀释液按照1:50的体积比进行稀释。
80.2)加样：在96孔板固相载体中分别设空白孔、对照孔、待测样品孔。空白孔加100μl样品稀释液，阳性对照孔加100μl稀释后的阳性对照血清，阴性对照孔加100μl稀释后的阴性对照血清，待测样品孔加100μl稀释后的待测样品，加样时注意不要使孔中有气泡，将各溶液加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，于37℃孵育反应30分钟。为保证实验结果有效性，每次实验需要使用新的标准品溶液。
81.3)洗涤：步骤2)孵育结束后，弃去并甩干孔内液体，甩干后的每孔中加洗涤液350μl浸泡4-5分钟，甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)后再进行第二次洗涤，总共洗涤5次。
82.4)向步骤3)洗涤后的每孔中加稀释过的酶标二抗(酶标二抗与样品稀释液按照1:100的体积比稀释，在使用前十分钟内稀释)100μl，37℃孵育30分钟。
83.5)洗涤：步骤4)孵育后弃去并甩干孔内液体，同步骤3)方法洗涤孔5次。
84.6)显色：依序向每孔中加入显色液100μl，37℃避光反应10分钟。
85.7)终止反应：依序每孔加终止液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。
86.8)测定：加终止液后立即进行检测，用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(od
450
值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
87.9)结果判定：s/p值计算按照以下计算公式，计算s/p值。
[0088][0089]
阳性对照血清od
450
值均≥2.0，阴性对照血清od
450
值均＜0.25，则判为试验成立。
[0090]
待检样品s/p值≥0.161时，判为阳性；待检样品s/p值＜0.161时，判为阴性。
[0091]
对本发明试剂盒和检测方法的特异性、稳定性和灵敏度进行检测验证：
[0092]
特异性试验表明，包被pm153重组蛋白抗原与牛多杀性巴氏杆菌a型血清发生阳性反应，而与b型、d型、e型、f型牛源多杀性巴氏杆菌阳性血清均呈阴性反应。包被pm153重组蛋白抗原与牛溶血性曼氏杆菌、牛异源曼氏杆菌、牛支原体、牛病毒性腹泻、牛口蹄疫阳性血清均呈阴性反应，以pm153重组蛋白抗原构建的间接elisa方法有较好的特异性(表3)。
[0093]
表3：特异性检测结果
[0094][0095][0096]
稳定性试验表明，同批次包被板检测10份血清od
450
值变异系数介于2.03％-5.22％之间，不同批次包被板检测10份血清od
450
值变异系数介于5.03％-9.15％之间，说明该方法重复性良好。
[0097]
随机选取阳性样本，对阳性样本进行倍比稀释后，用建立的elisa方法检测，结果
显示，当血清以1:2560倍的体积比稀释后，仍可以检测到阳性，说明此该方法具有良好的灵敏性(表4)。
[0098]
表4：灵敏性检测结果
[0099]
稀释倍数204080160320640128025605120样本od
450
1.6891.4861.2781.0910.8790.7640.6820.4630.32阳性对照1.81.81.81.81.81.81.81.81.8阴性对照0.1850.1850.1850.1850.1850.1850.1850.1850.185s/p0.9310.8060.6770.5610.4300.3590.3080.1720.084检测结果++++++++-[0100]
实施例3：试剂盒检测的临床应用
[0101]
另采集临床确定的牛a型阳性血清250份，阴性血清240份。计算阴性和阳性符合率。
[0102]
250份阳性样品测得阳性样本数为238份，符合率95.2％，240份阴性样本测得阴性样本数为220份，符合率为91.7％，具有良好的符合率。
[0103]
实施例4：牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型特异性基因pma153的筛选过程
[0104]
在ncbi数据库里，调用全基因组数据pmcq2株(a型)(genbank:nz_cp033599.1)，nctc 10323株(b型)(genbank:lr134532.1)作为典型代表进行对比。由于基因组比较大，难以使用普通程序完成，所以使用了强有力的工具：mvista(https://genome.lbl.gov/vista/mvista/submit.shtml)。通过mvista结果进行比对，得到pmcq2株基因组在1040k附近有一段区域，nctc 10323株完全缺失。将缺失区段的基因命名为pma153基因：
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atgacagaagaaaataaaggaaagagatattttttatggttcatattgtttatcctttcaatctatttatttattaccatacaagaaagacgaggttattgttttgacaaacgtgcatatattcatgagctttatactgagcaagagttaattgatcgggggattgaatatgtggtatccaccatgccgtcaggtgttattaaaccagatggcacaataaaagaagtaaagcgttacacgagtgtcgaggagtttaaacagatgaacccagcttgttgtacattaaccacctttattgatgaaggaggcgatggctatccagatgatgatggatatggttatgtcagaattgaatatttaagacattatgttgagaatctaaaaccttatcatagagtgatttatcttgaatatacgccctgtggagagttaagggaagaggcggctttttcaaaaaattaa。
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使用pma153基因进行blast分析，发现在所有a型毒株中，pma153基因均存在，不仅仅是存在于pmcq2株中(以牛多杀性氏杆菌a型特异性基因片段(hyad基因)调出数据库a型毒株进行比对，例如：pmcq2、pm1bs168、eb168、tb168和pm8-1等a型毒株)。再将b型毒株、d、e、f型等毒株调出，进行分析，发现pma153基因均不存在于除了a型毒株外的其他毒株中，得到pma153是a型独有的基因片段。本技术方案发现了a型毒株特有的基因片段，进而将其用于致病微生物的检测中。
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但是，虽然有该基因片段是a型特有，却不能使用pcr对病牛进行检出。牛多杀性巴氏杆菌a型，生长在牛的肺部，而血液中无法分离得到该菌株，且鼻拭子和咽拭子也不能采集到该病原微生物。因此，在不杀牛取肺部组织的前提下，是无法实现对该病原微生物的检测的。因此虽然有此基因，但限于样本，pcr方法是对活牛无效。而采集外周血进行elisa较为方便，克服了上述难题。如果要通过抗原物质在血清中产生的抗体进行动物是否被感染的判断，需要该抗原物质具备产生大量抗体的能力。即，不但需要pma153基因相对于其他类
型是特有的，还需要pma153基因能够翻译产生大量抗原蛋白，且这些抗原蛋白具有较好的免疫原性，能够产生大量的存在于血液循环中的抗体。满足上述条件，才能将该基因应用到elisa抗体检测试剂盒的制备中。
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通过序列比对，发明人发现4个a型特异性基因(例如：pma181、pma153等)，再通过试验分析发现这些特异性基因表达的蛋白(抗原)，免疫原性不理想，在生物体中难以产生可供检测的抗体，无法用于诊断生物体是否被a型所感染，所以最后选定使用pma153抗原蛋白进行elisa检测试剂盒的制作。
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另外，现有技术中用于a型以及b型毒株检测的主要是a型菌荚膜抗原和b型菌荚膜抗原。pma153抗原相对于a型菌荚膜抗原对a型血清型特异性好，交叉反应弱。将使用pma153抗原进行elisa检测的结果与使用a型菌荚膜抗原和b型菌荚膜抗原进行elisa检测的结果进行对比，详见表5。
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表5：pma153抗原与荚膜抗原包被的比较
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由此可见，a型菌提取的荚膜抗原和b型菌提取的荚膜抗原，并不能直接用于elisa区分a型和b型血清，在elisa上就有交叉反应，且数值很大。而蛋白抗原无此问题，因此优于使用荚膜抗原。
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以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前
提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

技术特征：
1.一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，包括pma153包被的固相载体；pma153的氨基酸序列如seq id no.2所示。2.根据权利要求1所述的一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，还包括标准阳性对照血清和标准阴性对照血清；所述标准阳性对照血清是由使用牛源多杀性巴氏杆菌荚膜a型菌株免疫牛获得；所述标准阴性对照血清为未免疫和未感染多杀性巴氏杆菌荚膜a型的牛血清。3.根据权利要求2所述的一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，还包括酶标二抗、显色液、终止液、浓缩洗涤液和样品稀释液。4.根据权利要求3所述的一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗牛igg；所述显色液为双组分tmb显色液；所述终止液为硫酸溶液；所述浓缩洗涤液为pbst洗涤液；所述样品稀释液为含牛血清白蛋白、吐温-20、edta和氯化钠的pbs液。5.根据权利要求4所述的一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，其判定标准为：待检样品的s/p值≥0.161时，判为阳性；待检样品的s/p值＜0.161时，判为阴性；s/p值的计算方法为：(样品od
450
值－标准阴性对照血清od
450
均值)/(标准阳性对照血清od
450
均值－标准阴性对照血清od
450
均值)；od
450
是指在450nm波长下光密度；且标准阳性对照血清od
450
值均≥2.0，标准阴性对照血清od
450
值均＜0.25。6.一种抗原蛋白在制备特异性检测牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型的试剂盒中的应用，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.2所示。7.一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型elisa抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括pma153包被的固相载体的制备步骤：s1抗原蛋白的获取：将序列如seq id no.1所示的基因整合到表达载体上，获得重组质粒；将重组质粒转入宿主菌，诱导宿主菌表达抗原蛋白；再经菌体破碎、离心取上清以及纯化获得pma153。s2包被：配制含pma153的包被液，使包被液于固相载体接触并孵育，再经封闭处理后，获得pma153包被的固相载体。8.根据权利要求7所述的一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型elisa抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，在s1抗原蛋白的获取中，表达载体为pet30a；诱导宿主菌表达抗原蛋白的试剂为异丙基-β-d-硫代半乳糖苷；宿主菌为rosseta de3；纯化的方式为通过ni-nta superflow cartridges his亲和层析柱纯化。9.根据权利要求8所述的一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型elisa抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，在s2包被中，包被液中pma153的含量为10μg/ml，孵育条件为4℃8-12h；封闭处理为使用无蛋白封闭缓冲液37℃封闭2h。10.根据权利要求8所述的一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型elisa抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，还包括标准阳性对照血清的制备步骤：使用牛源多杀性巴氏杆菌a型菌株的灭活疫苗免疫健康牛，14天后进行一次加强免疫，并于加强免疫后1月采集血清获得标准阳性对照血清。

技术总结
本发明属于病原菌检测技术领域，具体涉及一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法和应用。将序列如SEQ ID NO.1所示的基因整合到表达载体上并转入宿主菌；诱导宿主菌表达并纯化后获得序列如SEQ ID NO.2所示的PmA153重组抗原蛋白；将PmA153包被在固相载体上，即可通过酶联免疫吸附的检测方法实现对样品中的牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型的抗体的检测，实现诊断目的。本发明提供的试剂盒，不使用多杀性巴氏杆菌作为抗原来源，具有良好的生物安全性及生产便宜性，对牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型抗体检测具有良好的特异性，能够精准诊断牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型肺炎，具有重要的临床应用价值。有重要的临床应用价值。有重要的临床应用价值。


技术研发人员：高洋 赖茂林 杨元礼 冉智光 赵扬扬 秦世荣 杨婕 伏刚 赵宗玲 吕逢波 王为民 李朝阳
受保护的技术使用者：重庆澳龙生物制品有限公司
技术研发日：2022.12.29
技术公布日：2023/8/16