一种抗TROP2抗体的制作方法

no.9。
16.更具体的,根据第一个具体实施方式,所述的抗体或者其功能片段之一或者衍生物包含轻链，所述轻链的序列中，嵌合抗体包含序列seq id no.14，人源化抗体包含序列seq id no.18。
17.根据所述方面，更具体的第二个具体实施方式,本发明所述的抗体或者其功能片段之一或者衍生物包含重链，所述重链包含cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3，其中cdr-h1包含氨基酸序列seq id no.4，cdr-h2包含氨基酸序列seq id no.5,cdr-h3包含氨基酸序列seq id no.6。
18.更具体的,根据第二个具体实施方式,所述的抗体或者其功能片段之一或者衍生物包含重链，所述重链的序列中，嵌合抗体包含序列seq id no.15,人源化抗体包含序列seq id no.19.
19.根据所述方面，更具体的第二个具体实施方式,本发明所述的抗体或者其功能片段之一或者衍生物包含轻链，所述轻链包含cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3，其中cdr-l1包含氨基酸序列seq id no.10,cdr-l2包含氨基酸序列seq id no.11,cdr-l3包含氨基酸序列seq id no.12
20.更具体的,根据第二个具体实施方式,所述的抗体或者其功能片段之一或者衍生物包含轻链，所述轻链的序列中嵌合抗体包含序列seq id no.16,人源化抗体包含序列seq id no.20
21.作为发明的另一方面，本发明涉及分离的dna，其特征包含选自下述dna序列的核酸：其每一条核酸编码的氨基酸序列为上述氨基酸序列seq id no.1至seq id no.20中的一条。
22.更为具体的，包括选自下述的dna序列的核酸：
23.第一个具体实施方式包含序列seq id no.21、seq id no.22、seq id no.23和序列seq id no.27、seq id no.28、seq id no.29的核酸序列。
24.第二个具体实施方式包含序列seq id no.24、seq id no.25、seq id no.26和序列seq id no.30、seq id no.31、seq id no.32的核酸序列。
25.再进一步具体说明
26.第一个具体实施方式嵌合抗体序列包含序列seq id no.33和seq id no.34，人源化抗体序列包含序列seq id no.37和seq id no.38的核酸序列。
27.第二个具体实施方式嵌合抗体序列包含序列seq id no.35和seq id no.36，人源化抗体序列包含序列seq id no.39和seq id no.40的核酸序列。
附图说明
28.图1是4d3轻链、重链可变区序列cdr区识别以及二维结构图；
29.图2是7f11轻链、重链可变区序列cdr区识别以及二维结构图；
30.图3是ch4d3、ch7f11的elisa结合曲线；
31.图4是ch4d3与ch7f11的细胞表面结合活性图；
32.图5是ch4d3与ch7f11抗体在bxpc-3活细胞上的内吞活性图；
33.图6是4d3鼠源抗体的轻重链可变区序列，其在人源化前后的类人分值
(humanness；z-score)变化图；
34.图7是7f11鼠源抗体的轻重链可变区序列，其在人源化前后的类人分值(humanness；z-score)变化图；
35.图8是4d3人源化抗体与嵌合抗体在同等稀释浓度下的结合曲线图；
36.图9是4d3人源化抗体在day7(图a)，day14(图b)，day21(图c)时刻的sec检测结果图；
37.图10是7f11人源化抗体与嵌合抗体在同等稀释浓度下的结合曲线图；
38.图11是7f11人源化抗体在day7(图a)，day14(图b)，day21(图c)时刻的sec检测结果图；
39.图12是4d3-humanized-biotin抗体分别与0.02～50ug/ml的ch4d3与hu4d3抗体结合表位竞争结果；
40.图13是7f11-humanized-biotin抗体分别与0.02～50ug/ml的ch7f11与hu7f11抗体结合表位竞争结果。
41.图14是hu7f11抗体在3种细胞中的结合数据。
42.图15是hu4d3抗体在3种细胞中的结合数据。
43.图16是hu7f11抗体在3种细胞中的内吞数据。
44.图17是hu4d3抗体在3种细胞中的内吞数据。
具体实施方式
45.实施例1 trop2抗原免疫6～8周龄的balb/c小鼠
46.构建trop2胞外区表达载体，用悬浮细胞293f瞬时表达毫克级的trop2蛋白。选择6-8周龄的小鼠，按如下表格中的免疫剂量和时间点进行trop2抗原的皮下免疫，终免选择三免后血浆效价最高的小鼠，免疫流程如表1所示。
[0047][0048]
表1
[0049]
实施例2 免疫小鼠脾脏细胞体外融合
[0050]
预先培养小鼠骨髓瘤细胞sp2/0于dmem+fbs 10％完全培养基中，融合前使用巴斯德吸管吹取5 x 107个sp2/0细胞，以1000g，5min转速离心并用37℃预热的无血清dmem润洗残留血清，同时采集km鼠腹腔内的饲养细胞，并以5x103个/ 100ul/ 孔的细胞量将饲养细胞铺于96孔板。在终免后第3天眼球采血、并处死终免疫小鼠，75％酒精浸泡消毒后置于无
菌操作台剪取脾脏组织。用预热的无血清dmem吹取脾细胞，取1/2个脾脏的细胞进行计数，以脾细胞:sp2/0细胞数量比例1:1～10:1混合，离心后吸干残留dmem。加入1ml体积的预热peg-1450并均匀混合，3min后加入35ml预热的dmem培养基稀释终止。1000rpm，5min离心细胞，后用hat筛选培养基重悬细胞，铺板于10块96孔板中。
[0051]
实施例3 杂交瘤细胞上清阳性检测
[0052]
融合后7～10天，观察细胞形成克隆的情况。在上清检测前一天用dmem+10％fbs培养基换液一次。同时以2ug/ml 浓度的trop2抗原包被elisa酶标板。在检测当天，在无菌操作台上用多通道电动移液器吸取96孔板中的培养基上清，悬空加入对应的elisa酶标板孔中。将elisa板置于37℃孵育1hr，后pbst洗涤孔板3次，加入1:5000稀释的hrp标记羊抗小鼠抗体。37℃孵育1hr后，pbst洗涤3次。配置tmb底物显色液，每孔添加50ul，于室温条件反应5～10min。随后加入50ul/孔 2m 硫酸溶液终止显色。根据酶标板上的od450读值筛选阳性克隆。
[0053]
实施例4 阳性细胞株亚克隆筛选
[0054]
标记od450值较高的融合细胞板孔，持续培养不超过2天。按照实施例2中方法铺板饲养细胞，并用200ul枪头吹匀阳性细胞，取不超过5ul细胞悬液体积进行亚克隆，将其稀释至100ul，并加入预先含有100ul/孔饲养细胞悬液的96孔板中的第一个空。从a1到h1的方向以100ul体积均匀吹打至最后一排，再用多通道电动移液器吸取100ul从a1～a12的方向均匀吹打至最后一列。将孔板培养7～10天，标记单一克隆形成的板孔，并参照实施例中的方法进行上清阳性检测。
[0055]
实施例5腹水制备单克隆抗体
[0056]
制备腹水前7日，向balb/c小鼠腹腔注射1ml/每只用量的石蜡油。随后挑取第一次亚克隆后阳性率稳定的单克隆细胞，进行扩大培养。在细胞长至至少一个6孔板板孔规模时收取细胞，以1000g，3min离心条件，用磷酸缓冲液润洗细胞3次。按每只小鼠注射1～2x106个/每只的量制备。饲养小鼠7～10天并观察小鼠腹腔。用18号无菌针头采集腹水，并以14000g，5min转速收集腹水上清。所得上清经过proteina/g亲和柱纯化后即得到4d3和7f11细胞株的单克隆抗体。
[0057]
实施例6获取4d3抗体轻重链可变区编码序列
[0058]
培养单克隆细胞株至6孔板，其汇合率达到90～100％时用trizol收集细胞。在无rnase环境中提取总rna，使用oligo dt作为逆转录引物合成cdna文库。此cdna文库经过末端转移酶tdt的5’端加dgtp反应后用作pcr模板，使用上游引物为oligo dc,下游引物对应抗体轻重链的5’端ch1恒定区的引物搭配，借助高保真酶primerstar进行可变区基因5’race扩增。将pcr产物进行dna琼脂糖凝胶电泳分析，回收位于～750bp长度的dna片段，进行下游ta克隆。将菌落pcr鉴定为阳性的菌株实施测序。所得序列由在线imgt数据库进行序列比对鉴定以及可变区序列二维作图。
[0059]
实施例7获取7f11抗体轻重链可变区编码序列
[0060]
参照实施案例6中的操作过程，得到7f11克隆的轻重链可变区序列，如图2所示。
[0061]
实施例8抗体的表达与纯化
[0062]
使用freestyletm 293-f(invitrogen)悬浮细胞表达抗体。转染前一天，以6
×
105个/ml密度将细胞接种于含300ml f17完全培养基(freestyletm f17表达培养基，gibco公
structural query查对抗体结构信息。最终获得4d3-hum版本的轻重链人源化序列。将4d3鼠源序列及人源化序列输入线上网站评估人类抗体相似性分值。
[0073]
图6蓝色线代表鼠源抗体库的z-score分布范围和频率，绿色线代表人抗体库的z-score分布范围和频率。红色直线代表4d3轻链重链所获得的z-score分值。人源化后，4d3的z-score分值明显上升。
[0074]
实施例13 7f11人源化序列改造
[0075]
参照实施案例12中的操作过程，得到7f11鼠抗体的轻重链人源化序列。将7f11鼠源序列，人源化序列输入线上网站评估人类抗体相似性分值。
[0076]
图7中蓝色线代表鼠源抗体库的z-score分布范围和频率，绿色线代表人抗体库的z-score分布范围和频率。红色直线代表4d3轻链重链所获得的z-score分值。在人源化以后，7f11的z-score分值明显上升。
[0077]
实施例14 4d3人源化抗体相对亲和力分析
[0078]
将4d3人源化抗体序列克隆至真核表达载体，参照实施例8方案瞬时转染真核细胞293f。纯化后的抗体统一稀释至2ug/ml，与人源化之前的鼠源抗体一同添加至trop2包被的elisa酶标板上的a1～h1孔，再从a1～a12方向进行3倍稀释；37℃孵育1hr后润洗，再加入抗人fc的hrp标记抗体，37℃孵育后进行显色。最终通过ec50和曲线形态来比较ch4d3和hum4d3抗体之间的相对亲和力。
[0079]
图8，ec50(4d3-chimeric)：0.056ug/ml；ec50(4d3-humanized)：0.0502ug/ml。
[0080]
实施例15 4d3人源化抗体热稳定性分析
[0081]
将纯化后的hum4d3抗体透析，以pbs缓冲液透析并标定终浓度为2mg/ml，并按70ul/管分两批，每批3管。将两批样品各放置于4℃和37℃，并按照第0天，第7天，第14天分别取出样品管。将样品用于sec分析以评估抗体的降解及聚集情况。
[0082]
图9：4d3人源化抗体在day7(图a)，day14(图b)，day21(图c)时刻的sec检测结果。4d3-humanized抗体在37℃条件下各时间点的单体和聚集体，以及其所占检测分子的比例(％)显示于图d表格。
[0083]
实施例16 7f11人源化抗体相对亲和力及结合表位一致性分析
[0084]
参照实施例14中的操作过程进行7f11人源化抗体的相对亲和力评估
[0085]
图10：7f11人源化抗体与嵌合抗体在同等稀释浓度下的结合曲线，ec50(7f11-chimeric)：0.061ug/ml；ec50(7f11-humanized)：0.0601ug/ml。
[0086]
实施例17 7f11人源化抗体热稳定性分析
[0087]
参照实施例15中的操作过程进行7f11人源化抗体的热稳定性分析。
[0088]
附图11：7f11人源化抗体在day7(图a)，day14(图b)，day21(图c)时刻的sec检测结果。7f11-humanized抗体在37℃条件下各时间点的单体和聚集体，以及其所占检测分子的比例(％)显示于图d表格。
[0089]
实施例18人源化抗体与亲本抗体的抗原亲和力分析
[0090]
采用pall fortebio octet光学分析技术平台，评估抗体-抗原结合的绝对亲和力。在该方法中，生物素标记的抗原被固定在链霉亲和素生物传感器芯片表面，基线平衡180sec，后与溶液中的浓度梯度稀释之抗体发生30sec的结合，使得芯片的光学厚度增加，导致波长发生漂移(δλ)，随后进入30sec的解离阶段。trop2抗原和相应的抗体相互作用被
实时测定，在各浓度下对结合的特异性、结合速率、解离速率或者样品浓度进行精密准确的检测。汇总至少5个浓度梯度下的k-on和k-off值后，到kd结合常数。
[0091]
ab codekd(m)ka(1/ms)kd(1/s)r2ch4d36.89e-092.35e+051.62e-030.9935hu4d33.07e-081.39e+054.28e-030.9916ch7f116.11e-112.43e+051.45e-050.9925hu7f119.94e-111.86e+051.85e-050.9966
[0092]
实施例19 4d3人源化抗体与嵌合抗体的活性分析及结合表位一致性分析
[0093]
生物素标记4d3-humanized抗体，并通过elisa测定结合曲线的拐点值为0.5ng/ml。配置含0.5ng/ml 4d3生物素标记抗体的elisa封闭液，在此溶液基础上配置50ug/ml的竞争抗体4d3-chimeric与4d3-humanized。添加含生物素标记抗体与竞争抗体的溶液于a1～a12，每孔150ul，后吸出50ul添加至b2～b12中，与预先添加的体积为100ul之生物素抗体溶液充分混合，再依次稀释3倍至h1～h12，37℃孵育1hr，后洗涤并孵育anti-human igg fc二抗，37℃孵育1hr后洗涤3次，进行25min时长的显色并读值。
[0094]
附图12：4d3-humanized-biotin抗体分别与0.02～50ug/ml的ch4d3与hum4d3抗体相竞争。两种竞争抗体表现同等程度竞争活性，结合表位一致。ec50(ch4d3)：0.336ug/ml。ec50(hum4d3)：0.326ug/ml
[0095]
实施例20 7f11人源化抗体与人源化抗体与嵌合抗体的活性分析及结合表位一致性分析
[0096]
参照实施例18中的操作流程，分析7f11的表位竞争活性及结合表位一致性。
[0097]
附图13：7f11-humanized-biotin抗体分别与0.02～50ug/ml的ch7f11与hum7f11抗体相竞争。两种竞争抗体表现同等程度竞争活性，结合表位一致。ec50(ch7f11)：0.732ug/ml。ec50(hum7f11)：0.856ug/ml。
[0098]
实施例21人源化抗体hu7f11&hu4d3的细胞结合和内吞实验
[0099]
使用hek293细胞作为阴性细胞，bxpc-3和mcf-7细胞作为阳性细胞，测试梯度浓度下的各个抗体结合与内吞情况。细胞结合测试在4℃下结合1hr，后添加常规fitc标记的荧光二抗，流式收集数据。
[0100]
内吞测试使用标记有酸敏感型的小分子染料phrodo-red羊抗人二抗，先与各个浓度的一抗共孵育形成复合物后，再与各细胞系共孵育16hr。后取样，每个96孔板的细胞孔铺设至少10000个细胞，采用流式细胞仪收集并分析数据。统计各个浓度下的细胞在远红光通道中的平均荧光强度值，以抗体浓度为横坐标描绘内吞程度曲线。
[0101]
hu7f11和hu4d3抗体在3种细胞中的结合程度比较，bxpc-3细胞结合程度最大。hu7f11和hu4d3抗体在3种细胞中的内吞程度比较。bxpc-3细胞内吞程度最大。

技术特征：
1.一种抗trop2的抗体或者其fv、scfv、fab、f(ab’)2、fab’、scfv-fc片段之一，其特征在于，所述抗体包括重链可变区氨基酸序列seq id no.15和轻链可变区氨基酸序列seq id no.16。2.如权利要求1所述抗trop2的抗体或者其fv、scfv、fab、f(ab’)2、fab’、scfv-fc片段之一，其特征在于，所述抗体的人源化重链可变区氨基酸序列seq id no.19，人源化轻链可变区氨基酸序列seq id no.20。3.如权利要求1所述抗trop2的抗体或者其fv、scfv、fab、f(ab’)2、fab’、scfv-fc片段之一，其特征在于，所述的重链可变区氨基酸序列包括seq id no.4、5和6的cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述的轻链可变区氨基酸序列包括seq id no.10、11和12的cdrl1、cdrl2和cdrl3。4.如权利要求1-3任一所述抗trop2的抗体或者其fv、scfv、fab、f(ab’)2、fab’、scfv-fc片段之一，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体。5.一种包括如权利要求1-3任一所述抗trop2的抗体或者其fv、scfv、fab、f(ab’)2、fab’、scfv-fc片段之一的核酸。6.根据权利要求5所述的核酸，其特征在于，所述核酸包含重链cdr的序列seq id no.24、25、26，轻链cdr的序列seq id no.30、31、32。7.根据权利要求5所述的核酸，其特征在于，所述核酸包含seq id no.35和seq id no.36。8.根据权利要求5所述的核酸，其特征在于，所述核酸包含seq id no.39和seq id no.40。9.一种包括权利要求5-8中任一所述核酸的rna序列。10.一种包括权利要求5-8中任一所述核酸的互补核酸。11.一种包含权利要求5-8中任一项所述核酸的表达载体。12.一种包括权利要求1-3任一所述抗trop2的抗体或者其fv、scfv、fab、f(ab’)2、fab’、scfv-fc片段之一用于制备治疗trop2靶点恶性肿瘤药物中的应用。13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述抗体或者其fv、scfv、fab、f(ab’)2、fab’、scfv-fc片段之一偶联细胞毒性化合物或者放射性元素。14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述细胞毒性化合物选自烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤药物、有丝分裂抑制剂、染色质功能抑制剂、抗血管生成剂、抗雄激素、抗雌激素或者免疫调节剂。

技术总结
本发明涉及单价和多价的抗TROP2抗体，该类抗体与TROP2蛋白特异性结合，相对亲和力强，内吞效率高，该特性抗体在ADC药物开发中具有广阔的应用前景。本发明还涉及鼠单克隆抗体，人鼠嵌合抗体，人源化抗体以及该类抗体在肿瘤诊断和治疗中的用途。诊断和治疗中的用途。诊断和治疗中的用途。


技术研发人员：朱义 张勇 卓识 丁沐然 王尊
受保护的技术使用者：成都百利多特生物药业有限责任公司
技术研发日：2021.06.18
技术公布日：2023/8/16