一种化学生物法相结合制备高得率半乳糖酸的方法

1.本发明属于生物质降解和生物转化领域，具体涉及一种化学生物法相结合制备高得率半乳糖酸的方法。


背景技术：

2.海藻资源丰富，大型海藻可分为红藻、绿藻和褐藻。红藻组成与陆生植物有很大不同，其碳水化合物含量高达70％以上。红藻中含量最丰富的成分是多糖，包括纤维素、琼胶和卡拉胶；另外，还含有蛋白质、脂类和极微量的木质素。根据红藻所含碳水化合物组成的差异，可以将其分为琼胶类红藻和卡拉胶类红藻。
3.石花菜中含量最高的碳水化合物为琼胶，因此石花菜是一种琼胶类红藻。琼胶也称为琼脂，是石花菜属红藻细胞壁的主要成分，主要由琼脂糖和琼脂胶组成。其中，琼脂糖是由d-半乳糖和3,6-内醚-l-半乳糖通过α-1,3-和β-1,4-糖苷键交替连接组成的线形链状多糖分子，琼脂糖经化学催化或酶催化水解后，可释放d-半乳糖和3,6-内醚-l-半乳糖；琼脂胶主链结构与琼脂糖类似，分子质量小于琼脂糖，结构较为复杂。半乳糖酸是 d-半乳糖醛基氧化产物，是一种与葡萄糖酸结构和化学性质相类似的新型醛糖酸，可以选择性替代柠檬酸作为食品酸味调节剂，可以被用于甜味剂、药物中间体以及分散剂等相关产品的开发。
4.目前关于石花菜的酸水解已有报道，但酸解得率不高。以常见有机酸酸解石花菜并获得高得率d-半乳糖尚未见报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种以自然界产量丰富的可再生生物质石花菜为原料，以微波辅助马来酸催化水解制备d-半乳糖，并利用生物催化剂进一步氧化d-半乳糖制备半乳糖酸的方法。
6.为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
7.一种化学生物法相结合制备高得率半乳糖酸的方法，包括如下步骤：
8.(1)取石花菜与马来酸溶液混合均匀，加热酸解；
9.(2)将步骤(1)反应完毕的酸解液固液分离，上清液即为含有d-半乳糖的水解液，加碱中和，得到生物催化反应的底物；
10.(3)培养恶臭假单胞菌工程菌至对数期，离心收集微生物细胞，得到生物催化剂；
11.(4)将步骤(2)制得的底物与步骤(3)制得的生物催化剂混合，并加入碳酸钙反应，反应结束后，固液分离收集上清液，即为含有半乳糖酸的溶液。
12.步骤(1)中，所述的马来酸溶液质量浓度为1.5％～8％，优选2％～3％；所述石花菜与马来酸溶液的固液比为1:5～1:25g/ml，优选1:10～1:15g/ml。
13.步骤(1)中，优选在微波反应器中加热酸解，微波酸解反应温度为140℃～165℃，优选155℃～160℃，反应时间为20～40min，优选25～35min。
14.步骤(2)中，所述碱为固体氧化钙。
15.步骤(3)中，所述的恶臭假单胞菌工程菌按照如下方法构建得到：提取莓实假单胞菌nl20w的基因组dna，扩增得到seq id no.1所示的目的基因，构建重组质粒电转化至恶臭假单胞菌atcc no.47054。其中，莓实假单胞菌nl20w pseudomonas fragi nl20w已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉.武汉大学，保藏日期为2021年03月17日，保藏编号为cctcc no:m 2021245。
16.步骤(4)中，反应温度为20℃～40℃，优选25℃～35℃；反应ph为5.0～8.0，优选5.3～5.8；反应转速为0～500rpm，优选250～350rpm。
17.步骤(4)中，所述底物和生物催化剂的用量比是：3g底物/g干重细胞～8g底物/g 干重细胞。
18.步骤(4)在生物催化反应容器中进行，生物催化反应容器为广口式，以双层纱布封口，反应时间范围是3～15h。
19.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：(1)与陆生木质纤维生物质资源相比，石花菜生长迅速，资源丰富，木质素含量低，易于水解，水解液成分富含d
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半乳糖。(2)对生物质进行酸水解时通常使用无机酸，例如稀硫酸。通过无机酸水解获得的游离糖在高温处理过程容易被进一步降解。此外，无机酸还有极强的腐蚀作用。本发明使用的马来酸是一种常见的有机酸，价格便宜，在微波辅助条件下，较低酸浓即可获得高浓度、高得率的d-半乳糖，酸解过程绿色环保、工艺简单。(3)本发明中的恶臭假单胞菌工程菌氧化d-半乳糖速度更快，没有副产物产生。(4)以石花菜中半乳聚糖含量为基准，本发明所述技术方案制备的半乳糖酸得率高。
具体实施方式
20.根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
21.石花菜中水分含量的测定方法：称取0.5g粉碎后的石花菜利用水分测定仪测定水分 (the infrared moisture determination balance fd-720)。
22.石花菜中半乳聚糖含量的测定方法：粉碎后的石花菜去除水分，称取0.3g绝干物料加入水解瓶，加入3ml质量浓度为72％硫酸，搅拌至原料充分混合。置于30℃恒温振荡水浴锅中保温1h，每5～10min用涡旋仪振荡一次。之后，向反应液中加入84g水，混匀后于120℃条件下酸解1h。冷却后用g3玻砂过滤，滤液适当稀释，使用0.22μm 过滤膜过滤滤液，并用高效液相色谱法(hplc)分析其中的d-半乳糖含量。
23.半乳聚糖含量(％)＝(cgal
×
0.9
×
v/w)
×
100％
24.(其中，cgal为d-半乳糖的浓度，g/l；0.9为c6单糖和聚糖的转化系数；v为滤液总体积，l；w为样品的绝干重量，g)
25.本发明实施例中所述粉碎后的石花菜的水分含量为9.21％。绝干物料中，半乳聚糖含量为49.16％。
26.以1克粉碎后的石花菜计，所含半乳聚糖为0.446g。
27.d-半乳糖和半乳糖酸检测方法：采用高效液相色谱法(hplc)测定。色谱条件如下：
色谱仪：agillent1260高效液相色谱仪；色谱柱：coregel ion 300；进样量：10μl；流动相：0.5mm硫酸，流速：0.4ml/min；柱温：75℃；检测器：示差折光检测器。
28.微波酸解步骤中，d-半乳糖得率按下述公式(1)计算：
[0029][0030]
生物催化步骤中，以d-半乳糖或富含d-半乳糖的微波酸解液为底物，半乳糖酸得率按下述公式(2)计算：
[0031][0032]
以石花菜为底物，结合化学催化和生物催化，半乳糖酸得率按下述公式(3)计算：
[0033]
半乳糖酸得率(％)＝(1)
×
(2)
×
100
ꢀꢀꢀ
(3)
[0034]
实施例1
[0035]
称取1克粉碎后的石花菜与10ml质量浓度为2％的马来酸溶液混合均匀，加入微波消解管中，置于微波反应器中，密封。升温至160℃并维持30min。反应结束后，待温度降至80℃以下，取出反应液，固液分离，得到含有d-半乳糖的上清液。经hplc 测定，d-半乳糖浓度为46.3g/l。根据公式(1)计算d-半乳糖得率为93.4％。
[0036]
实施例2
[0037]
称取1克粉碎后的石花菜与10ml质量浓度为6％的马来酸溶液混合均匀，加入微波消解管中，置于微波反应器中，密封。升温至160℃并维持30min。反应结束后，待温度降至80℃以下，取出反应液，固液分离，得到含有d-半乳糖的上清液。经hplc 测定，d-半乳糖浓度为45.2g/l。根据公式(1)计算d-半乳糖得率为91.2％。
[0038]
实施例3
[0039]
称取1克粉碎后的石花菜与10ml质量浓度为2％的马来酸溶液混合均匀，加入微波消解管中，置于微波反应器中，密封。升温至155℃并维持25min。反应结束后，待温度降至80℃以下，取出反应液，固液分离，得到含有d-半乳糖的上清液。经hplc 测定，d-半乳糖浓度为46.0g/l。根据公式(1)计算d-半乳糖得率为92.8％。
[0040]
实施例4
[0041]
称取1克粉碎后的石花菜与15ml质量浓度为2％的马来酸溶液混合均匀，加入微波消解管中，置于微波反应器中，密封。升温至155℃并维持33min。反应结束后，待温度降至80℃以下，取出反应液，固液分离，得到含有d-半乳糖的上清液。经hplc 测定，d-半乳糖浓度为31.1g/l。根据公式(1)计算d-半乳糖得率为94.1％。
[0042]
实施例5
[0043]
1、莓实假单胞菌的筛选和保存。
[0044]
从紫金山多处不同生境中采集土样，1g混合土样与9ml无菌生理盐水混合均匀后，取500微升接种至50ml lb培养基中，在30℃、200r/min条件下培养12小时。将培养液以10-8
、10-9
、10-10
三个稀释度涂布在固体筛选培养基上，培养基为含有50g/l乳糖和25g/l轻质碳酸钙的固体lb培养基，30℃培养直至出现微生物菌落。依据菌落周围透明圈的大小，挑取数量足够多的透明圈大的单菌落，接种至50ml液体筛选培养基中，培养基为含有50g/l乳糖和
25g/l碳酸钙的液体lb培养基，培养时间为12小时，中间每隔2小时取样测定乳糖酸产量。挑选其中乳糖酸产量和产率都最优的菌株保存备用。
[0045]
通过将其16s rdna序列与ncbi数据库中其他菌株的序列比对可知，该菌株最接近莓实假单胞菌(pseudomonas fragi)，与数据库中多株莓实假单胞菌16s rdna序列的相似度大于99％，系统发育树也表明该菌株与其他莓实假单胞菌处于同一进化分支。该菌株分类命名为莓实假单胞菌nl20w pseudomonas fragi nl20w，该菌已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉.武汉大学，保藏日期为2021年03月17日，保藏编号为cctcc no:m 2021245。其16s rdna序列如下：(seq id no.6)
[0046]
gaactgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaa gtcgagcggtagagagaagcttgcttctcttgagagcggcggacgggtgagtaatacctagga atctgcctgatagtgggggataacgttcggaaacggacgctaataccgcatacgtcctacggga gaaagcaggggaccttcgggccttgcgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtg aggtaatggctcaccaaggctacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactgga actgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaa agcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgg gaggaagggcattaacctaatacgttggtgtcttgacgttaccgacagaataagcaccggctaa ctctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaa agcgcgcgtaggtggtttgttaagttgaatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatc caaaactggcaagctagagtatggtagagggtagtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgt agatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgactacctggactgatactgacactgaggtgc gaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcaact agccgttgggagtcttgaactcttagtggcgcagctaacgcattaagttgaccgcctggggag tacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtg gtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggccttgacatccaatgaactttccagagat ggattggtgccttcgggaacattgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtga gatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcacgtaatggtgg gcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcat ggcccttacggcctgggctacacacgtgctacaatggtcggtacaaagggttgccaagccgcg aggtggagctaatcccataaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtga agtcggaatcgctagtaatcgtgaatcagaatgtcacggtgaatacgttcccgggccttgtaca caccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaccagaagtagctagtctaaccttcgggagga cggttaccacggtgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtaggggaacct gcggctggatcacctcctta。
[0047]
2、采用常规的方法制备莓实假单胞菌nl20w的基因组dna，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备的方法。使用合成的引物从上述基因组dna中pcr扩增得到目的基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0048]
按照常规分子生物学方法，使用-uni seamless cloning and assembly kit(购自全式金)将pcr扩增所得目的基因克隆至pbbr1mcs-2质粒(购自addgene)中。具体操作如下：
[0049]
1)设计两对引物，分别用于扩增目的基因和质粒。
[0050]
2)扩增目的基因的引物为：
[0051]
上游引物：5
’‑
ttactcagccagtttgaacg-3’(seq id no.2)
[0052]
下游引物：5
’‑
atgagcactgaaggtgcttt-3’(seq id no.3)
[0053]
3)扩增质粒的引物为：
[0054]
上游引物：
[0055]5’‑
aaagcaccttcagtgctcatagctgtttcctgtgtgaaat-3’(seq id no.4)
[0056]
下游引物：
[0057]5’‑
cgttcaaactggctgagtaagcgttaatattttgttaaaa-3’(seq id no.5)
[0058]
4)pcr所得产物用纯化试剂盒纯化，随后按照-uni seamless cloning andassembly kit操作手册将目的片段和质粒连接起来。
[0059]
5)将所得重组质粒电转化至恶臭假单胞菌(atcc no.47054)感受态细胞。其中，感受态制备方法和电转化方法参见专利cn113073072a。电转化后，将电转杯中菌液转移至离心管中，30℃摇床上培养1h进行细胞复苏。复苏后细胞在含有卡那霉素抗性的 lb固体平板上筛选，挑取生长的菌落接种于含有卡那霉素抗性的lb液体培养基中， 30℃培养至对数中期，收集菌体保存于低温冰箱备用。此菌株即为恶臭假单胞菌工程菌株。
[0060]
实施例6
[0061]
从保存恶臭假单胞菌工程菌的琼脂斜面培养基(组分：胰蛋白胨10g/l、酵母浸粉 5g/l，氯化钠10g/l，卡那霉素50mg/l，琼脂粉18g/l)上取一环菌接入液体培养基 (组分：胰蛋白胨10g/l、酵母浸粉5g/l，氯化钠10g/l，卡那霉素50mg/l)，在30℃，200rpm条件下培养12h，以活化菌种；将活化后的菌液按体积百分比1％接入相同的培养基中扩大培养，在30℃，200rpm条件下培养10h后离心收集菌体细胞，用生理盐水洗涤菌体2次，离心分离得到的微生物完整细胞即为生物催化剂。
[0062]
用磷酸盐缓冲液(200mm，ph 7.0)将上述细胞重悬并与d-半乳糖(购自上海国药集团化学试剂有限公司)混合，调整反应体系中各物质浓度，使得生物催化剂的浓度为8g干重/l，d-半乳糖为50g/l，并加入碳酸钙使其浓度为28g/l。在30℃，200rpm 条件下反应6小时，中间每隔2小时取样检测d-半乳糖和半乳糖酸的浓度变化。根据公式(2)计算半乳糖酸得率。数据显示，在反应4小时后，半乳糖酸得率为87％；在反应6小时后，半乳糖酸得率为99％。
[0063]
实施例7
[0064]
按照实施例6中所述方法培养恶臭假单胞菌工程菌制备生物催化剂。
[0065]
用氧化钙调整实施例1中所得酸解液的ph至5.5，与上述细胞混合，调整反应体系中细胞浓度，使得生物催化剂的浓度为8g干重/l，并加入碳酸钙使其浓度为25g/l。在35℃，300rpm条件下反应，中间每隔2小时取样检测d-半乳糖和半乳糖酸的浓度变化。根据公式(2)计算半乳糖酸得率。数据显示，在反应6小时后，半乳糖酸得率为 95％；在反应8小时后，半乳糖酸得率为100％。因此，以石花菜为底物，结合化学催化和生物催化，根据公式(3)可知，总体半乳糖酸得率为93.4％。
[0066]
实施例8
[0067]
按照实施例6中所述方法培养恶臭假单胞菌工程菌制备生物催化剂。
[0068]
用氧化钙调整实施例4中所得酸解液的ph至6.0，与上述细胞混合，调整反应体系中细胞浓度，使得生物催化剂的浓度为8g干重/l，并加入碳酸钙使其浓度为17g/l。在30℃，350rpm条件下反应，中间每隔2小时取样检测d-半乳糖和半乳糖酸的浓度变化。根据公式(2)计算半乳糖酸得率。数据显示，在反应4小时后，半乳糖酸得率为 100％。因此，以石花菜
为底物，结合化学催化和生物催化，根据公式(3)可知，总体半乳糖酸得率为94.1％。
[0069]
对比例1
[0070]
称取1克粉碎后的石花菜与10ml质量浓度为2％的马来酸溶液混合均匀，加入耐压管中，密封，于160℃油浴中保温30min。反应结束后将耐压管取出并冷却至常温。倒出反应液，固液分离，得到含有d-半乳糖的上清液。经hplc测定，d-半乳糖浓度为39.8g/l。根据公式(1)计算d-半乳糖得率为80.3％。
[0071]
对比例2
[0072]
称取1克粉碎后的石花菜与10ml质量浓度为5％的乙酸溶液混合均匀，加入微波消解管中，置于微波反应器中，密封。升温至160℃并维持30min。反应结束后，待温度降至80℃以下，取出反应液，固液分离，得到含有d-半乳糖的上清液。经hplc测定，d-半乳糖浓度为39.6g/l。根据公式(1)计算d-半乳糖得率为79.9％。
[0073]
对比例3
[0074]
以恶臭假单胞菌(atcc no.47054)为生物催化剂。
[0075]
生物催化剂制备方法与实施例6相同，但培养基中不含有卡那霉素。
[0076]
用磷酸盐缓冲液(200mm，ph 7.0)将上述细胞重悬并与d-半乳糖(购自上海国药集团化学试剂有限公司)混合，调整反应体系中各物质浓度，使得生物催化剂的浓度为8g干重/l，d-半乳糖为50g/l，并加入碳酸钙使其浓度为28g/l。在30℃，200rpm 条件下反应6小时，中间每隔2小时取样检测d-半乳糖和半乳糖酸的浓度变化。根据公式(2)计算半乳糖酸得率。数据显示，在反应4小时后，半乳糖酸得率为69％；在反应6小时后，半乳糖酸得率为89％。

技术特征：
1.一种化学生物法相结合制备高得率半乳糖酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取石花菜与马来酸溶液混合均匀，加热酸解；(2)将步骤(1)反应完毕的酸解液固液分离，上清液即为含有d-半乳糖的水解液，加碱中和，得到生物催化反应的底物；(3)培养恶臭假单胞菌工程菌至对数期，离心收集微生物细胞，作为生物催化剂；(4)将步骤(2)制得的底物与步骤(3)制得的生物催化剂混合，并加入碳酸钙反应，反应结束后，固液分离收集上清液，即为含有半乳糖酸的溶液。2.根据权利要求1所述的一种化学生物法相结合制备高得率半乳糖酸的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的马来酸溶液质量浓度为1.5％～8％；所述石花菜与马来酸溶液的固液比为1:5～1:25g/ml。3.根据权利要求1所述的一种化学生物法相结合制备高得率半乳糖酸的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的马来酸溶液质量浓度为2％～3％；所述石花菜与马来酸溶液的固液比为1:10～1:15g/ml。4.根据权利要求1所述的一种化学生物法相结合制备高得率半乳糖酸的方法，其特征在于，步骤(1)中，酸解反应温度为140℃～165℃，反应时间为20～40min。5.根据权利要求1所述的一种化学生物法相结合制备高得率半乳糖酸的方法，其特征在于，步骤(1)中，酸解反应温度为155℃～160℃，反应时间为25～35min。6.根据权利要求1所述的一种化学生物法相结合制备高得率半乳糖酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述碱为固体氧化钙。7.根据权利要求1所述的一种化学生物法相结合制备高得率半乳糖酸的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的恶臭假单胞菌工程菌按照如下方法构建得到：提取莓实假单胞菌nl20w的基因组dna，扩增得到seq id no.1所示的目的基因，构建重组质粒电转化至恶臭假单胞菌atcc no.47054。8.根据权利要求1所述的一种化学生物法相结合制备高得率半乳糖酸的方法，其特征在于，步骤(4)中，反应温度为20℃～40℃；反应ph为5.0～8.0；反应转速为0～500rpm。9.根据权利要求1所述的一种化学生物法相结合制备高得率半乳糖酸的方法，其特征在于，步骤(4)中，反应温度为25℃～35℃；反应ph为5.3～5.8；反应转速为250～350rpm。10.根据权利要求1所述的一种化学生物法相结合制备高得率半乳糖酸的方法，其特征在于，步骤(4)中，每克生物催化剂干重细胞对应3g～8g底物。

技术总结
本发明公开了一种化学生物法相结合制备高得率半乳糖酸的方法，首先将石花菜与马来酸溶液混合，微波加热酸解以获取D-半乳糖，之后以工程恶臭假单胞菌为生物催化剂，高效氧化D-半乳糖为半乳糖酸。本发明中，微波加热酸解步骤中获得的D-半乳糖浓度高、得率高，后续生物催化步骤中可将D-半乳糖全部氧化为半乳糖酸。本方法无需强酸或特殊催化剂、绿色环保，原料成本低、工艺简单，半乳糖酸得率高，实现了生物质石花菜的高值化开发利用。质石花菜的高值化开发利用。


技术研发人员：郑兆娟 金小虎 刘鹏 周凤 欧阳嘉
受保护的技术使用者：南京林业大学
技术研发日：2022.05.17
技术公布日：2023/8/16