修饰的血管紧张素转换酶2（ACE2）及其用途

修饰的血管紧张素转换酶2(ace2)及其用途
1.交叉引用相关申请
2.本技术要求2020年10月9日提交的美国临时申请号63/089,895、2020年6月23日提交的美国临时申请号63/042,907、2020年5月8日提交的美国临时申请号63/022,151以及2020年3月16日提交的美国临时申请号62/989,976的权益，其中每件均通过引用整体并入本文。
技术领域
3.本公开内容涉及修饰的血管紧张素转化酶2(ace2)蛋白，该蛋白具有改善的折叠，并且与使用ace2作为细胞进入受体的sars-cov-2和其他冠状病毒的结合增强。
4.政府支持声明
5.本发明是在美国国立卫生研究院授予的资助号5r01ai129719-03下经政府支持完成的。政府对本发明享有一定的权利。


背景技术：

6.2019年12月，一种与蝙蝠冠状病毒密切相关的新型人畜共患β冠状病毒传播给人类(zhu et al.,n engl j med.2020feb 20；382(8):727
–
733；zhou et al.,nature.2020feb3；579(7798):270
–
273)。该病毒被称为sars-cov-2，因为它与导致近20年前爆发规模较小疫情的严重急性呼吸综合征(sars)冠状病毒相似(peiris et al.,lancet.2003apr19；361(9366):1319
–
1325；coronaviridae study group of the international committee on taxonomy of viruses,nat microbiol.2020mar 2；4(5):3)，此后人传人迅速在世界范围内传播，促使各国政府采取了非常规的遏制措施(patel et al.,mmwr morb mortal wkly rep.2020feb 7；69(5):140
–
146)。股市下跌，旅行受限，公共集会取消，大量人员被隔离。这些事件不同于几代人经历过的任何事件。2019年冠状病毒疾病(covid-19)的症状范围从轻咳到干咳、发烧、肺炎和死亡，sars-cov-2对于老年人和其他弱势群体是毁灭性的(wang et al,j med virol.2020apr；92(4):441
–
447；huang et al.,lancet.2020feb 15；395(10223):497
–
506)。目前没有预防sars-cov-2感染的疫苗，也没有批准的药物来专门治疗这种病毒的感染。因此，需要研发有效的疗法来治疗sars-cov-2感染。


技术实现要素：

7.本文描述了人ace2多肽，其通过改善ace2的折叠和结构稳定性、消除聚糖修饰或提高亲和力，增强了与sars-cov-2s蛋白的结合。所述修饰的多肽可用作诊断剂或治疗剂，用于检测、预防(暴露前预防或暴露后预防)或治疗covid-19或由任何利用ace2作为细胞受体的冠状病毒引起的疾病。
8.本文提供了修饰的ace2多肽，包括ace2或其片段，例如细胞外片段。与野生型ace2相比，所述多肽包括至少一个氨基酸取代，并且由于亲和力变化的直接方式或间接方式(例
如，通过s识别结构的稳定化)结合冠状病毒s的能力增强。在特定实例中，所述ace2是人ace2。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代选自表1、表2和/或表3中所示的任意取代。在一些实例中，所述至少一个氨基酸取代是位于ace2和s界面处的残基。在一些实例中，所述至少一个氨基酸取代是位于n90-糖基化基序中的残基。在一些实例中，所述至少一个氨基酸取代远离所述界面并且增强了s-识别折叠结构的呈递。在一些实例中，所述修饰的ace2多肽是二聚体。在一个实例中，所述二聚体ace2包含t27y、l79t和n330y氨基酸取代。
9.本文还提供了融合蛋白，包括本文公开所修饰的ace2多肽和异源多肽。在一些实施方案中，所述异源多肽是fc蛋白或人血清白蛋白，例如用于募集效应功能和/或增加血清稳定性的蛋白。在一些实施方案中，所述异源多肽是可用作诊断/检测试剂的蛋白质，例如荧光蛋白(例如，gfp)或酶(例如，辣根过氧化物酶(hrp)或碱性磷酸酶)。
10.还提供了一种通过使冠状病毒与本文所公开修饰的ace2多肽或融合蛋白接触来抑制其进入细胞的方法。还提供了抑制冠状病毒在受试者中复制和/或传播的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所公开修饰的ace2多肽或融合蛋白。所述修饰的ace2多肽可以在感染之前(例如在有感染风险的受试者)作为暴露前预防性治疗、在感染后不久作为暴露后预防性治疗或在受试者表现出一种或更多种感染体征或症状之后施用。
11.还提供了通过向受试者施用治疗有效量的本文所公开修饰的ace2多肽或融合蛋白来治疗所述受试者冠状病毒感染(例如covid-19)的方法。所述冠状病毒可以是任何人患病或人畜共患病的冠状病毒，包括利用ace2作为细胞进入受体新出现的冠状病毒株。在一些实例中，所述修饰的ace2多肽通过静脉内、气管内或通过吸入施用。所述治疗方法可以是暴露前预防性治疗方法、暴露后预防性治疗方法或治疗covid-19的方法。
12.还提供了编码本文所公开修饰的ace2多肽或融合蛋白的核酸分子和载体。还提供了通过施用所述核酸分子或载体来抑制在受试者中冠状病毒复制和/或传播(或治疗cov感染)的方法。在一些实例中，所述核酸分子或载体通过静脉内、气管内或通过吸入施用。
13.还提供了检测生物样品中cov的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使所述生物样品与本文所公开修饰的多肽或融合蛋白接触；以及检测所述修饰的多肽或融合蛋白与所述生物样品的结合。
14.还提供了包括本文所公开修饰的多肽或融合蛋白的试剂盒，所述多肽或融合蛋白与固体支持物结合。
15.通过参照附图进行下列详细描述，本公开的前述和其他目的与特征将变得更加明显。
附图说明
16.图1a-1d：对高度结合sars-cov-2s的rbd的ace2变体选择策略。(图1a)收集分泌与sfgfp融合的sars-cov-2s-rbd的expi293f细胞培养基，并在不同稀释度下与expi293f细胞表达myc标记的ace2一起培育。通过流式细胞术测量结合的s-rbd-sfgfp。用于facs选择、含s-rbd-sfgfp培养基的稀释度用箭头表示。(图1b-1c)用过量递体dna稀释的野生型ace2质粒瞬时转染expi293f细胞。在这些条件下，细胞通常获得不超过一个编码质粒，并且大多数细胞是阴性的。细胞与含s-rbd-sfgfp的培养基一起培育，并与荧光抗myc共染色，以通过流
式细胞术检测表面ace2。在分析期间，前67％选自ace2阳性群体(图1b)。随后相对于表面ace2表达测量结合的s-rbd(图1c)。(图1d)用ace2单位点饱和突变文库转染expi293f细胞并如图1b所示进行分析。在facs期间，分别收集相对于ace2表达具有结合s-rbd的靠前15％细胞(ncov-s-high分选)，并收集靠后的20％细胞(ncov-s-low分选)。
17.图2：对于sars-cov-2s rbd高结合信号的ace2的突变图谱。从-3(即耗竭/有害)到中性到+3(即富集)标出ncov-s-high分选的log2富集比。ace2一级结构位于在纵轴上，氨基酸取代位于在横轴上。*为终止密码子。
18.图3a-3f：独立重复的数据显示出高度一致性。(图3a-3b)在两次独立的facs实验之间，ncov-s-high(图3a)和ncov-s-low(图3b)分选的ace2突变log2富集比高度一致。重复1使用了1/40稀释的含s-rbd-sfgfp的培养基，重复2使用了1/20稀释的含s-rbd-sfgfp的培养基。r2值用于非同义突变。(图3c)ncov-s-high和ncov-s-low分选的平均log2富集比往往是反相关的。无义突变和少量非同义突变不在质膜上表达，因此在两个分选群体中均耗竭(即落在对角线以下)。(图3d-3f)重复ncov-s-high分选的残基保守性得分相关图(图3d)和重复ncov-s-low分选的残基保守性得分相关图(图3e)，以及两种ncov-s-high分选平均数据与两种ncov-s-low分选平均数据的残基保守性得分相关图(图3f)。根据每个残基位置上所有氨基酸取代log2富集比的均值计算保守性得分。
19.图4a-4c：ace2残基高度结合sars-cov-2s rbd的序列偏好。(图4a)ncov-s-high分选的保守性得分映射到s-rbd结合ace2(表面)的低温em结构(pdb 6m17)。左边视图是底物结合腔的俯视图，为了清楚起见，只显示了单个蛋白酶域。(图4b)平均疏水性加权富集比映射到rbd结合的ace2结构。(图4c)ace2的部分放大图。随附的热图标出了ncov-s-high分选中ace2-t27、ace2-d30和ace2-k31取代从≤-3(耗竭)到≥+3(富集)的log2富集比。
20.图5a-5c：通过深度突变扫描预测ace2中单个氨基酸取代增强rbd结合的影响很小。(图5a)表达全长ace2的expi293f细胞用含rbd-sfgfp的培养基染色并通过流式细胞术进行分析。比较野生型ace2和单个突变体(l79t)的数据。rbd结合增强在表达低水平ace2(较小门)的细胞中最为明显。在本实验中，ace2在残基s19上游有细胞外n-端myc标签，用于检测表面表达。(图5b)测量了ace2中30个氨基酸取代的rbd-sfgfp结合。数据是低表达门中gfp平均荧光的相对变化，减去背景荧光。n的均值＝2，误差线表示范围。(图5c)上图显示了针对总ace2阳性群体(图5a中的较大门)测量的相对rbd-sfgfp结合，而下图绘制了通过检测细胞外myc标签测量的相对ace2表达。rbd-sfgfp与总阳性群体的结合与总ace2表达相关，因此只有在控制表达水平后，突变体之间的结合差异才最明显，如图5b所示。
21.图6a-6b：与s结合增强的工程sace2。(图6a)通过转染细胞培养物的荧光定性评估sace2-sfgfp突变体的表达。(图6b)表达全长s的细胞用含sace2-sfgfp培养基稀释液染色，并通过流式细胞术分析结合。
22.图7a-7d：纯化sace2蛋白的分析尺寸排阻色谱(sec)。(图7a)纯化sace2蛋白(10μg)在4-20％sds-聚丙烯酰胺凝胶上分离并用考马斯染色。(图7b)igg1融合的野生型sace2和sace2.v2的分析sec。标准品的分子量(mw)在峰上方以kd为单位表示。为清楚起见，对mw标准品的吸光度进行了缩放。(图7c)8his标记蛋白的分析sec。主峰对应于单体的预期mw。也观察到二聚体峰，尽管其丰度在独立蛋白质制品之间不同(与图9d相比)。(图7d)可溶性ace2-8h蛋白在37℃下培育40小时并通过sec分析。
23.图8a-8e：对s具有高亲和力的sace2变体。(图8a)将表达全长s的expi293f细胞与纯化的野生型sace2或sace2.v2一起培育，所述野生型sace2或sace2.v2与8his(实线)或igg1-fc(虚线)融合。洗涤后，通过流式细胞术检测结合蛋白。(图8b)100nm野生型sace2-igg1(虚线)的结合与野生型sace2-8h或sace2.v2-8h竞争。将竞争蛋白同时添加到表达全长s的细胞中，并通过流式细胞术检测结合蛋白。(图8c)野生型sace2-8h与固定化rbd-igg1缔合(t＝0至120秒)和解离(t》120秒)的生物层干涉(bli)动力学。(图8d)通过bli测量sace2.v2-8h结合固定化rbd-igg1的动力学。(图8e)在elisa中，康复的covid-19患者血清igg与野生型sace2-8h或sace2.v2-8h竞争结合固定化rbd。测试了三个不同的患者血清(p1至p3为浅色至深色)。
24.图9a-9g：优化高亲和力sace2变体以提高产量。(图9a)将含sace2-sfgfp培养基的稀释液与表达全长s的expi293f细胞一起培育。洗涤后，通过流式细胞术分析结合的sace2-sfgfp。(图9b)考马斯染色的sds-聚丙烯酰胺凝胶比较了用蛋白a树脂从表达培养基中纯化的sace2-igg1变体产量。(图9c)纯化的sace2-8h变体的考马斯染色凝胶(每泳道10μg)。(图9d)通过分析sec，sace2.v2.4-8h与野生型sace2-8h无法区分。为了清楚起见，对mw标准品的吸光度进行缩放，mw以kd为单位表示在洗脱峰上方。(图9e)在37℃下储存60小时后进行分析sec。与sace2.v2.4相比，变异sace2.v2.2的表面更疏水并且部分聚集倾向更高，因此部分储存不稳定性可能与疏水性增强有内在联系。(图9f)通过bli测量野生型sace2-8h与固定化rbd-igg1的缔合(t＝0到120秒)和解离(t》120秒)。数据可与图8c中所示的sace2-8h第二次独立制备数据相比较。(图9g)sace2.v2.4-8h与固定化rbd-igg1缔合和解离的bli动力学。
25.图10a-10d：结合病毒刺突特性改善的二聚体sace2变体。(图10a)野生型sace2
2-8h和sace22.v2.4-8h在37℃培育62小时后的分析sec。(图10b)康复患者血清igg(p1至p3为浅色至深色)与rbd结合的elisa分析。加入二聚体sace22(wt)-8h或sace22.v2.4-8h以与识别受体结合位点的抗体竞争。浓度基于单体亚基。(图10c)通过bli测量rbd-8h与固定化sace22(wt)-igg1的缔合(t＝0至120秒)和解离(t》120秒)。(图10d)rbd-8h与固定化的sace22.v2.4-igg1结合的bli动力学。
26.图11：工程受体增强对sars-cov-2和sars-cov-1的中和作用。在微量中和测定中，单体(实线)或二聚体(虚线)sace2(wt)-8h或sace2.v2.4-8h在加入veroe6细胞之前与病毒预培育。浓度基于单体亚基。数据是n＝4(2次独立实验，2次技术重复)的均值
±
sem。
27.图12a-12c：sace2糖基化突变体与sars-cov-2的rbd的结合。(图12a)携带突变t92q的可溶性ace2蛋白酶域被纯化为8his标记的融合物。在考马斯染色的4-20％sds-聚丙烯酰胺凝胶上分离6μg以评估纯度。(图12b)分析sec显示洗脱为单体的主要峰，在二聚体的预期mw处洗脱的较小级分。(图12c)在生物层干涉(bli)实验中，将rbd-igg1固定到传感器表面并测量sace2-t92q-8h的缔合和解离。所报告的亲和力(80nm)比等效的野生型蛋白质(140-150nm，图8c和图9f)的亲和力更紧密。
28.图13a-13c：流式细胞术测量sace2与质膜上表达myc标记s的结合。(图13a)表达全长s(无论是标记的(图8a)还是带有细胞外myc表位标签)的expi293f细胞，通过主细胞群(门控区域)的前向散射特性进行门控。(图13b)直方图显示，流式细胞术分析与200nm野生型sace2-8h或sace2.v2一起培育的myc-s-表达细胞的代表性原始数据。洗涤后，用荧光抗
his-fitc二抗检测结合蛋白。未经sace2处理的myc-s表达细胞的荧光为黑色。(图13c)与8his(实线)或igg1-fc(虚线)融合的纯化野生型sace2或sace2.v2与表达myc-s细胞的结合。
29.图14a-14d：二聚体sace22与rbd强烈结合。(图14a)纯化的二聚体sace2
2-8h蛋白的sds-page(每泳道10μg，考马斯染色)。(图14b)sace2
2-8h蛋白的制备sec。将ninta亲和层析的洗脱液浓缩并注入凝胶过滤柱。对mw标准品的吸光度进行缩放，kd显示在洗脱峰上方。(图14c)将表达全长s的expi293f细胞与野生型和v2.4 sace2
2-8h一起培育，洗涤并用荧光抗his染色。n的均值＝2，误差线表示范围。结合类似于观察到sace2 igg1融合的结合(图8a和图13c)，表明二聚体sace2
2-8h和三聚体刺突在细胞表面上的强烈相互作用。(图14d)二聚体sace22(wt)-8h和sace22.v2.4-8h与固定在传感器表面上二聚体rbd-igg1强烈结合的bli动力学。
30.图15a-15b：纯化的sace2
2-igg1是二聚体。(图15a)纯化的sace2
2-igg1蛋白的考马斯染色凝胶图像(每泳道10μg)。(图15b)纯化的sace2
2-igg1的分析sec，叠加mw标准品的缩放吸光度(kd在洗脱峰上方表示)。注意不存在高mw峰，其可能对应于不同亚基之间由sace22和igg1二聚体化介导的多联体。
31.图16a-16d：在非人类细胞中表达的未标记sace22.v2.4与s紧密结合。(图16a)对具有8h标签在人expi293f细胞中纯化的sace22.v2.4与非人expicho-s细胞系产生的未标记蛋白质进行sds-page比较。每泳道10μg。(图16b)sace22.v2.4在37℃培育146小时之前和之后的分析sec。mw标准品的吸光度被缩放并标出kd。(图16c)将表达s的expi293f细胞与100nm野生型sace2
2-igg1和浓度渐增的人细胞来源sace22(wt)-8h、人细胞来源sace22.v2.4-8h或expicho-s来源sace22.v2.4共同培育。通过流式细胞术测量结合的his标记蛋白(实线)和sace22(wt)-igg1(虚线)。(图16d)通过bli测量未标记sace22.v2.4与固定化rbd-igg1的强烈结合。
32.图17：工程受体的催化活性降低。针对人细胞来源sace22(wt)-8h(左侧)、人类细胞来源sace22.v2.4-8h(中间)和expicho-s来源sace22.v2.4(右侧)进行肽底物切割释放荧光产物的测量。在产物释放呈线性的初始时间点确定比活性，并排除野生型蛋白质最高浓度(22nm)的数据。时间＝0分钟表示荧光记录开始的时间。
33.图18：sars相关冠状病毒在ace2结合位点具有高度序列多样性。sars-cov-2(pdb 6m17)的rbd因7种sars相关cov毒株之间的差异而颜色不同。
34.图19：sars相关β冠状病毒的ace2结合位点是高度序列多样性的区域。比对使用ace2作为进入受体的2种人β冠状病毒rbd序列和5种蝙蝠β冠状病毒rbd序列(seq id no:3-9)。编号基于sars-cov-2蛋白s。星号表示sars-cov-2rbd的残基，其在pdb 6m17中ace2的范围内。
35.图20a-20c：对ace2具有高或低结合信号的s变体进行facs选择。(图20a)流式细胞术分析expi293f细胞，该细胞表达具有n端c-myc标签的sars-cov-2全长s。myc表位的染色显示在x轴上，而对结合sace2
2-8h(2.5nm)的检测显示在y轴上。s质粒用递体dna按重量稀释1500倍，因此细胞通常表达不超过一种编码变体；在这些条件下，大多数细胞是阴性的。(图20b)用rbd单位点饱和突变(ssm)文库转染细胞进行流式细胞术显示，表达与sace2
2-8h结合降低的s变体的细胞。(图20c)facs的门控策略。对c-myc表位阳性的s表达细胞进行门
控，并收集相对于myc-s表达，sace2
2-8h结合的最高(“ace2-high”)和最低(“ace2-low”)20％的细胞。
36.图21：sars-cov-2全长s的rbd与可溶性ace22结合的突变图谱。深度突变扫描全长s中rbd的log2富集比从≤-3(耗竭/有害)到0(中性)到≥+3(富集)进行绘制。野生型氨基酸显示为黑色。rbd序列在纵轴上并且氨基酸取代在横轴上。*，终止密码子。
37.图22a-22d：深度突变表明sars-cov-2的ace2结合位点可耐受许多突变。(图22a)将表面表达的位置分数映射到sars-cov-2rbd的结构(pdb 6m17，取向如图18所示)。在表面s表达的facs选择中，蛋白质核中的几个残基高度保守(根据ace2-high门和ace2-low门的突变耗竭来判断)，而一些表面残基耐受突变。(图22b)人细胞中对全长s的突变体选择的表达分数(x轴)与酵母展示分离的rbd中突变体选择的保守性得分(残基位置处log2富集比的均值)(y轴)的相关图。标示出明显的异常值。(图22c)将ace2-high门控细胞群的保守性得分映射到rbd结构。(图22d)人细胞中s深度突变(x轴)与酵母表面rbd深度突变(δk
d app
的均值；y轴)的高ace2结合的rbd保守性得分相关图。
38.图23a-23c：丙氨酸取代rbd中二硫键键合的半胱氨酸降低了人细胞中的s表面表达。(图23a)rbd因深度突变(保守或突变耐受)表达分数而颜色不同，与封闭构象的s1亚基其余部分形成连续疏水核(pdb 6vsb链b)。(图23b)基于表面免疫染色和流式细胞术分析，用myc-s半胱氨酸突变体转染的expi293f细胞显示出，myc阳性细胞百分比(门控区域)和阳性群体的平均荧光均降低。为了在单个数字中体现这两种效应，在通过散射首次对活细胞进行门控后，计算了与载体转染的对照细胞相比，整个细胞群平均荧光单位(δmfu)的变化。(图23c)myc-s半胱氨酸突变体相对于野生型myc-s的表面表达。数据是均值
±
范围，n＝2次独立重复。
39.图24a-24g：一种基于竞争的选择，用于识别sars-cov-2s内优先结合野生型或工程ace2受体的rbd突变。(图24a)用野生型myc-s转染expi293f细胞并与竞争性sace22(wt)-igg1(25nm)和sace22.v2.4-8h(20nm)一起培育。在对各个表位标签进行免疫染色后，通过流式细胞术检测结合蛋白。(图24b)如图24a所述，不同之处在于，用rbd ssm文库转染细胞。表达对sace22.v2.4特异性增强的s变体的细胞群显而易见(细胞移到主要群体的左上角)。(图24c)用于对表达rbd ssm文库的细胞进行facs的门。在排除没有结合蛋白的细胞后，收集了针对结合sace22.v2.4-8h(上门)和针对结合sace22(wt)-igg1(下门)前20％的细胞。(图24d-24e)对于表达对sace22(wt)(图24d)或sace22.v2.4(图24e)特异性增强s变体的细胞，两次独立facs选择的log2富集比之间的一致性。计算非同义突变的r2值。(图24f-24g)保守性得分是根据给定残基位置处所有非同义取代log2富集比的均值计算的。相关图显示了，针对sace22(wt)(图24d)或sace22.v2.4(图24e)特异性门内细胞进行两次独立选择，保守性得分的一致性。
40.图25a-25c：rbd内对于野生型ace2具有特异性的突变很少见。(图25a)sars-cov-2rbd因特异性得分(在sace22(wt)和sace22.v2.4特异性门中收集细胞的保守性得分差异)而颜色不同。一些残基是突变的热点，对sace22(wt)或对sace22.v2.4的特异性增强。ace2的接触表面显示为带状，对sace22.v2.4中突变位点标记并显示为球体。(图25b)由sace22(wt)(x轴)和sace22.v2.4(y轴)特异性门中所收集细胞群表达的s中，突变的log2富集比。数据是两个独立分选实验的均值。通过图26中被靶向的突变，测试预期对sace22(wt)特异性增强
的s突变体。通过图27中被靶向的突变，测试预期对sace22.v2.4特异性增强的s突变体。(图25c)野生型myc-s和两种变体(n501w和n501y)在expi293f细胞中表达并通过流式细胞术测试与sace22(wt)-8h(虚线)或sace22.v2.4-8h(实线)的结合。观察到与野生型sace22的特异性结合略有增加。
41.图26a-26b：筛选通过深度突变预测对野生型sace22特异性高于sace22.v2.4的sars-cov-2s的突变。(图26a)如图23中所测定的，myc-s突变体的相对表面表达。数据是均值
±
范围，n＝2次独立重复。(图26b)sace22(wt)-igg1(x轴)和sace22.v2.4-8h(y轴)在表达指定myc标记s蛋白的expi293f细胞上的竞争结合。表达对野生型受体特异性增强s变体的细胞将移至右下方；只观察到微小的移动。表达s变体(表面表达和/或ace2亲和力降低)的细胞，在门控区域中的百分比较低。结果代表2次重复。
42.图27a-27b：筛选通过深度突变预测对sace22.v2.4特异性高于野生型sace22sars-cov-2s的突变。(图27a)通过流式细胞术测量myc-s突变体的相对表面表达。数据是均值
±
范围，n＝2。(图27b)流式细胞术分析表达myc-s变体的细胞，所述变体与竞争性sace22(wt)-igg1(x-轴)和sace22.v2.4-8h(y-轴)结合。表达对sace22.v2.4特异性增强的s的细胞将移至左上角。结果代表2次重复。
43.图28a-28b：静脉施用后sace2肽的血清半衰期。将未融合的sace22.v2.4注射到小鼠的尾静脉中(每个时间点3只雄性小鼠和3只雌性小鼠；0.5mg/kg)。收集血清，通过ace2 elisa(图28a)进行分析，并对荧光底物的蛋白水解活性(图28b)进行分析。数据是均值
±
s.e.
44.图29：静脉施用后sace2与人igg1 fc融合的药代动力学。每个时间点对3只雄性小鼠静脉注射2.0mg/kg野生型sace2
2-igg1(空心圆圈)或sace22.v2.4-igg1(实心圆圈)。通过人igg1 elisa对血清中的蛋白质进行量化。数据是均值
±
s.e.
45.图30a-30d：静脉施用后血清中sace22.v2.4-igg1的药代动力学。sace22.v2.4-igg1静脉施用给小鼠(每个时间点3只雄性和3只雌性；2.0mg/kg)。收集血清并通过人igg1 elisa进行分析(图30a)，通过ace2 elisa(图30b)进行分析，并对ace2催化活性进行分析(图30c)。数据是均值
±
s.e.。(图30d)在非还原性sds电泳凝胶上分离代表性雄性小鼠的血清样品，并用抗人igg1探测。标准品为10ng纯化的sace22.v2.4-igg1。预期的分子量(不包括聚糖)为216kd。
46.图31a-31f：直接递送到肺部的ace2蛋白的pk。(图31a和图31b)以1.0mg/kg的剂量在气管内施用野生型sace2
2-igg1(空心圆圈)和sace22.v2.4-igg1(实心圆圈)。收集肺组织，提取蛋白质并通过人igg1 elisa(图31a)和ace2elisa(图31b)进行分析。数据是均值
±
s.e.，n＝每个时间点3只雄性小鼠。(图31c)通过抗人igg1免疫印迹在非还原条件下分析气管内施用sace22.v2.4-igg1代表性小鼠的肺提取物。(图31d和图31e)小鼠吸入雾化的sace22.v2.4-igg1。通过ace2elisa(图31d)和人igg1 elisa(图31e)分析肺组织的提取物。数据是均值
±
s.e.，n＝每个时间点3只雄性小鼠。(图31f)通过抗人igg1免疫印迹分析接受雾化sace22.v2.4-igg1小鼠肺组织的代表性提取物。
47.图32：中和通过sace2
2-igg1进入人肺细胞的假病毒。过表达ace2受体的人a549肺上皮细胞、人a549肺上皮细胞和人肺内皮细胞与vsv-sars-cov-2-萤光素酶-假型病毒和野生型sace2
2-igg1或工程sace22v2.4-igg1在指定浓度下一起培育。每个实验都含有无病毒
对照(每个图中最左侧的条形)，所有其他样品都含有指定moi的病毒剂量。基于荧光素酶活性对病毒进入的程度进行量化。
48.图33：sace2
2-igg1在体内感染模型中抑制假病毒进入肺和肝脏的功效。k18-hace2小鼠在上皮细胞中表达人ace2受体，被静脉注射sace2
2-igg1(野生型，中间条形；工程v2.4，右侧条形)并腹膜内注射vsv-sars-cov-2-萤光素酶假型病毒。在24小时收集肺和肝脏，并根据荧光素酶的表达对病毒进入的程度进行量化。
49.序列表
50.随附序列表中列出的核酸序列和氨基酸序列使用如37c.f.r.1.822定义的核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸三字母代码表示。仅显示了每个核酸序列的一条链，但是互补链被理解为包括在对所示链的任何引用中。序列表以ascii文本文件提交，创建于2021年3月11日，43.7kb，通过引用将其并入本文。在随附的序列表中：
51.seq id no:1是人ace2的氨基酸序列(也称为肽基-二肽酶a；以genbank收录号np_068576.1保藏)：
52.msssswlllslvavtaaqstieeqaktfldkfnheaedlfyqsslaswnyntniteenvqnmnnagdkwsaflkeqstlaqmyplqeiqnltvklqlqalqqngssvlsedkskrlntilntmstiystgkvcnpdnpqeclllepglneimansldynerlwaweswrsevgkqlrplyeeyvvlknemaranhyedygdywrgdyevngvdgydysrgqliedvehtfeeikplyehlhayvraklmnaypsyispigclpahllgdmwgrfwtnlysltvpfgqkpnidvtdamvdqawdaqrifkeaekffvsvglpnmtqgfwensmltdpgnvqkavchptawdlgkgdfrilmctkvtmddfltahhemghiqydmayaaqpfllrnga
53.negfheavgeimslsaatpkhlksigllspdfqedneteinfllkqaltivgtlpftyml
54.ekwrwmvfkgeipkdqwmkkwwemkreivgvvepvphdetycdpaslfhvsndys
55.firyytrtlyqfqfqealcqaakhegplhkcdisnsteagqklfnmlrlgksepwtla
56.lenvvgaknmnvrpllnyfeplftwlkdqnknsfvgwstdwspyadqsikvrislks
57.algdkayewndnemylfrssvayamrqyflkvknqmilfgeedvrvanlkprisfn
58.ffvtapknvsdiiprtevekairmsrsrindafrlndnsleflgiqptlgppnqppvsiwl
59.ivfgvvmgvivvgiviliftgirdrkkknkarsgenpyasidiskgennpgfqntddvqt
60.sf
61.seq id no:2是严重急性呼吸综合征冠状病毒2的表面糖蛋白(蛋白s)的氨基酸序列(以genbank收录号yp_009724390.1保藏)：
62.mfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpff
63.snvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqslli
64.vnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpfl
65.mdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginit
66.rfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdcal
67.dplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyaw
68.nrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiap
69.gqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdist
70.eiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpk
71.kstnlvknkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleildi
72.tpcsfggvsvitpgtntsnqvavlyqdvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqt
73.ragcligaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnsprrarsvasqsiiaytmslgaensv
74.aysnnsiaiptnftisvtteilpvsmtktsvdctmyicgdstecsnlllqygsfctqlnr
75.altgiaveqdkntqevfaqvkqiyktppikdfggfnfsqilpdpskpskrsfiedllfnk
76.vtladagfikqygdclgdiaardlicaqkfngltvlpplltdemiaqytsallagtits
77.gwtfgagaalqipfamqmayrfngigvtqnvlyenqklianqfnsaigkiqdslssta
78.salgklqdvvnqnaqalntlvkqlssnfgaissvlndilsrldkveaevqidrlitgrl
79.qslqtyvtqqliraaeirasanlaatkmsecvlgqskrvdfcgkgyhlmsfpqsaph
80.gvvflhvtyvpaqeknfttapaichdgkahfpregvfvsngthwfvtqrnfyepqiit
81.tdntfvsgncdvvigivnntvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisginas
82.vvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqyikwpwyiwlgfiagliaivmvtiml
83.ccmtsccsclkgccscgscckfdeddsepvlkgvklhyt
84.seq id no:3-9是人和蝙蝠β冠状病毒rbd序列的氨基酸序列(参见图19)。
85.seq id no:10是sace22.v2.4的氨基酸序列，所述sace22.v2.4由相对于人ace2具有三个氨基酸取代(t27y、l79t和n330y)的人ace2(包括蛋白酶域和二聚体化域)残基19-732组成。
86.stieeqakyfldkfnheaedlfyqsslaswnyntniteenvqnmnnagdkwsaflke
87.qsttaqmyplqeiqnltvklqlqalqqngssvlsedkskrlntilntmstiystgkvc
88.npdnpqeclllepglneimansldynerlwaweswrsevgkqlrplyeeyvvlkne
89.maranhyedygdywrgdyevngvdgydysrgqliedvehtfeeikplyehlhayvr
90.aklmnaypsyispigclpahllgdmwgrfwtnlysltvpfgqkpnidvtdamvdqa
91.wdaqrifkeaekffvsvglpnmtqgfweysmltdpgnvqkavchptawdlgkgdfr
92.ilmctkvtmddfltahhemghiqydmayaaqpfllrnganegfheavgeimslsaa
93.tpkhlksigllspdfqedneteinfllkqaltivgtlpftymlekwrwmvfkgeipkdq
94.wmkkwwemkreivgvvepvphdetycdpaslfhvsndysfiryytrtlyqfqfqea
95.lcqaakhegplhkcdisnsteagqklfnmlrlgksepwtlalenvvgaknmnvrpl
96.lnyfeplftwlkdqnknsfvgwstdwspyadqsikvrislksalgdkayewndnem
97.ylfrssvayamrqyflkvknqmilfgeedvrvanlkprisfnffvtapknvsdiiprte
98.vekairmsrsrindafrlndnsleflgiqptlg
99.seq id no:11是由sace22.v2.4与人igg1 fc融合组成的sace22.v2.4-igg1的氨基酸序列。
100.stieeqakyfldkfnheaedlfyqsslaswnyntniteenvqnmnnagdkwsaflke
101.qsttaqmyplqeiqnltvklqlqalqqngssvlsedkskrlntilntmstiystgkvc
102.npdnpqeclllepglneimansldynerlwaweswrsevgkqlrplyeeyvvlkne
103.maranhyedygdywrgdyevngvdgydysrgqliedvehtfeeikplyehlhayvr
104.aklmnaypsyispigclpahllgdmwgrfwtnlysltvpfgqkpnidvtdamvdqa
105.wdaqrifkeaekffvsvglpnmtqgfweysmltdpgnvqkavchptawdlgkgdfr
106.ilmctkvtmddfltahhemghiqydmayaaqpfllrnganegfheavgeimslsaa
107.tpkhlksigllspdfqedneteinfllkqaltivgtlpftymlekwrwmvfkgeipkdq
108.wmkkwwemkreivgvvepvphdetycdpaslfhvsndysfiryytrtlyqfqfqea
109.lcqaakhegplhkcdisnsteagqklfnmlrlgksepwtlalenvvgaknmnvrpl
110.lnyfeplftwlkdqnknsfvgwstdwspyadqsikvrislksalgdkayewndnem
111.ylfrssvayamrqyflkvknqmilfgeedvrvanlkprisfnffvtapknvsdiiprte
112.vekairmsrsrindafrlndnsleflgiqptlgsdkthtcppcpapellggpsvflfppk
113.pkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrv
114.vsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtk
115.nqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwq
116.qgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
具体实施方式
[0117]ⅰ.缩略语
[0118]
ace2
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
血管紧张素转化酶2
[0119]
bli
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
生物层干涉技术
[0120]
cov
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
冠状病毒
[0121]
covid-19冠状病毒病2019
[0122]
it
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
气管内
[0123]
iv
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
静脉
[0124]
moi
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
感染复数
[0125]
rbd
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
受体结合域
[0126]
sace2
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
可溶性血管紧张素转化酶2
[0127]
sars
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
严重急性呼吸综合征
[0128]
sars-cov-2sars冠状病毒2
[0129]
sec
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
尺寸排阻色谱
[0130]
sfgfp
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
超折叠绿色荧光蛋白
[0131]ⅱ.术语和方法
[0132]
除非另有说明，否则按照常规用法使用技术术语。分子生物学中常用术语的定义见benjamin lewin,genes x,published by jones&bartlett publishers,2009；和meyers et al.(eds.),the encyclopedia of cell biology and molecular medicine,published by wiley-vch in16volumes,2008；和其他类似的参考文献。
[0133]
如本文所用，单数形式“一个”(a)、“一个”(an)和“所述”既指单数也指复数，除非上下文另有明确指示。例如，术语“一个抗原”包括单个或多个抗原并且可以被认为等同于短语“至少一个抗原”。如本文所用，术语“包含”是指“包括”。还应理解的是，除非另有说明，否则针对核酸或多肽给出的任何和所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子量值都是近似的，并且旨在描述。尽管可以使用与本文所述的方法和材料相似或等效的许多方法和材料，但下文描述了特别合适的方法和材料。如有冲突，以本说明书(包括术语解释)为准。此外，材料、方法和实例仅是说明性的而不是限制性的。为了便于对各种实施方案进行审查，提供以下术语解释：
[0134]
气溶胶：细小的固体颗粒或液滴在气体(如空气)中的悬浮胶体。
[0135]
施用：通过任何有效途径提供或给予受试者以药剂，例如修饰的人ace2多肽。示例性施用途径包括但不限于注射途径(例如皮下、肌内、皮内、腹膜内、瘤内和静脉内)、经皮途径、鼻内途径、气管内途径和吸入途径。
[0136]
生物样品：从受试者(例如人类受试者或动物受试者)获得的样品。生物样品包括例如流体样品、细胞样品和/或组织样品。在本文的一些实施方案中，所述生物样品是流体样品。流体样品包括但不限于血清、血液、血浆、尿液、粪便、唾液、脑脊髓液(csf)、支气管肺泡灌洗液(bal)、鼻拭子或其他体液。生物样品也可以指细胞组织或组织样品，例如活检样品或组织切片。
[0137]
接触：直接进行物理缔合的布置；包括固体和液体两种形式。
[0138]
冠状病毒：一大家族可以感染人类和非人类动物的正义单链rna病毒。冠状病毒得名于其表面的冠状刺突。病毒包膜由含有病毒膜(m)蛋白、包膜(e)蛋白和刺突(s)蛋白的脂质双层组成。大多数冠状病毒会引起轻度至中度的上呼吸道疾病，例如普通感冒。然而，已经出现了三种可导致更严重人类疾病和死亡的冠状病毒：严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、sars-cov-2和中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)。其他感染人的冠状病毒包括人冠状病毒hku1(hku1-cov)、人冠状病毒oc43(oc43-cov)、人冠状病毒229e(229e-cov)、人冠状病毒nl63(nl63-cov)。在本公开的一些实施方案中，“冠状病毒”包括利用ace2作为细胞受体的任何人冠状病毒或人畜共患冠状病毒，包括已知和新出现的冠状病毒株。人畜共患冠状病毒包括但不限于蝙蝠冠状病毒和啮齿动物冠状病毒。
[0139]
融合蛋白：包含两种不同(异源的)蛋白质至少一部分的蛋白质。在一些实施方案中，所述融合蛋白由修饰的ace2多肽和fc蛋白(例如人igg1的fc)组成。
[0140]
异源的：源于单独的遗传来源或物种。
[0141]
分离的：“分离的”生物组分(例如核酸或蛋白质)，已与所述组分天然存在的环境(例如细胞)中的其他生物组分(例如其他染色体和染色体外dna和rna、蛋白质和细胞器)基本分离或纯化。已“分离”的核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸。
[0142]
雾化器：一种将液体形式的治疗剂(如多肽)转化为可吸入呼吸系统(如肺部)的雾或细喷雾(气溶胶)的装置。雾化器也称为“喷雾器”。
[0143]
药学上可接受的递体(carrier)：使用的药学上可接受的递体是常规递体。remington:the science and practice of pharmacy,the university of the sciences in philadelphia,editor,lippincott,williams,&wilkins,philadelphia,pa,21
st edition(2005)，描述了适用于对本文所公开多肽和其他组合物进行药物递送的组合物和制剂。一般而言，递体的性质将取决于所采用的特定施用方式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射流体，其包括作为媒介物的药学和生理学可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。对于固体组合物(例如粉剂、丸剂、片剂或胶囊剂)，常规的无毒固体递体可以包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性递体之外，待施用的药物组合物可以含有少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和ph缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
[0144]
多肽、肽和蛋白质：指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸打断。该术语还包括已修饰的氨基酸
聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他处理，例如与标记组分的缀合。如本文所用，术语“氨基酸”包括天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸和d或l旋光异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。
[0145]
预防、治疗或改善疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的全面发展。“治疗”是指在疾病或病理状况开始发展后改善其体征或症状的治疗干预。“改善”是指减轻疾病体征或症状的数量或严重程度。“预防性”治疗是对未表现出疾病迹象或仅表现出早期迹象的受试者进行的治疗，目的是降低发生病状的风险。预防性治疗可以是暴露前或暴露后进行。
[0146]
预防：使用医学治疗来预防(或降低发展风险)疾病或感染，例如cov感染或covid-19。在病毒感染的情况下，暴露前预防是指在受试者暴露于病毒之前进行的治疗，而暴露后预防是指在暴露于病毒后马上或不久，但在出现感染迹象或症状之前进行的治疗。
[0147]
纯化的：术语“纯化的”不要求绝对纯度；相反，它是一个相对术语。因此，例如，纯化的多肽制品是其中多肽比在其自然环境中(例如在细胞内)更富集的制品。在一个实施方案中，纯化制品使得所述多肽为所述制品总肽或蛋白质含量的至少50％。基本上纯化是指从其他蛋白质或细胞组分中纯化。基本上纯化蛋白质的纯度为至少60％、70％、80％、90％、95％或98％。因此，在一个具体的非限制性实例中，基本上纯化的蛋白质90％不含其他蛋白质或细胞组分。
[0148]
序列同一性：氨基酸或核酸序列之间的相似性以序列之间的相似性来表示，也称为序列同一性。序列同一性通常以同一性百分比(或相似性或同源性)来衡量；百分比越高，两个序列越相似。当使用标准方法比对时，多肽或核酸分子的同源物或变体将具有较高程度的序列同一性。
[0149]
用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。各种程序和比对算法在以下文献中进行说明：smith and waterman,adv.appl.math.2:482,1981；needleman and wunsch,j.mol.biol.48:443,1970；pearson and lipman,proc.natl.acad.sci.u.s.a.85:2444,1988；higgins and sharp,gene 73:237,1988；higgins and sharp,cabios 5:151,1989；corpet et al.,nucleic acids research 16:10881,1988；和pearson and lipman,proc.natl.acad.sci.u.s.a.85:2444,1988.altschul et al.,nature genet.6:119,1994，详细考虑了序列比对方法和同源性计算。
[0150]
ncbi基本局部比对搜索工具(blast)(altschul et al.,j.mol.biol.215:403,1990)可从多个来源获得，包括美国国家生物技术信息中心(ncbi,bethesda,md)和互联网，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。如何使用该程序确定序列同一性的说明可在互联网上的ncbi网站获得。
[0151]
多肽的同源物和变体，例如修饰的人ace2多肽，通常特征在于拥有至少约75％，例如至少约80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，使用ncbi blast 2.0在与抗体氨基酸序列的全长比对中计数，将空位的blastp设置为默认参数。对于比较大于约30个氨基酸的氨基酸序列，采用blast 2序列函数，使用设置为默认参数的默认blosum62矩阵(空位存在成本为11，每个残基空位成本为1)。当比对短肽(少于约30个氨基酸)时，应使用blast 2序列函数进行比对，采用pam30矩阵，设置为默认参数(产生空位罚分9，延伸空位罚分1)。当通过该方法评估时，与参考序列相似性更高的蛋白质将显示出百分比同一性增加，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％，或至少99％的序列同一性。当
比较少于整个序列的序列同一性时，同源物和变体通常在10-20个氨基酸的短窗口内具有至少80％的序列同一性，并且可能具有至少85％或至少90％或95％的序列同一性，取决于它们与参考序列的相似性。在这样的短窗口上确定序列同一性的方法可在互联网上ncbi网站获得。本领域技术人员将理解，提供这些序列同一性范围仅用于指导；完全有可能获得超出所提供范围的高度显著的同源物。
[0152]
受试者：活体多细胞脊椎动物有机体，即包括人类和动物受试者的类别，包括人类和非人类哺乳动物。
[0153]
治疗有效量：足以使接受治疗的受试者实现所需效果的特定物质(例如修饰的人ace2多肽)的量。例如，这可能是抑制受试者cov复制或降低cov滴度所必需的量。在一个实施方案中，治疗有效量是抑制cov复制至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％(与未治疗的情况相比)所需的量。在另一个实施方案中，治疗有效量是使受试者的cov滴度降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％(与未治疗的情况相比)所需的量。治疗有效量也可以是减少或消除一种或更多种cov感染症状所必需的量，例如减少或消除发烧、咳嗽或呼吸急促所必需的量。类似地，在一些实施方案中，预防有效量是使感染cov或患病(例如covid-19)的风险降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％(与未治疗的情况相比)所必需的量。
[0154]
载体(vector)：引入宿主细胞中的核酸分子，从而产生转化的宿主细胞。载体可以包括使其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包括一个或更多个可选择的标记基因和本领域已知的其他遗传元件。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体，例如慢病毒载体。
[0155]ⅲ.修饰的ace2多肽和使用方法
[0156]
sars-cov-2的刺突(s)糖蛋白与宿主细胞上的血管紧张素转化酶2(ace2)结合。s是一种三聚体i类病毒融合蛋白，经蛋白水解加工成s1和s2亚基，在融合前状态下保持非共价缔合(walls et al.,cell.2020mar 6；181(2):281-292.e6；hoffmann et al.,cell.2020mar 4；181(2)271-280.e8；tortorici and veesler,adv virus res.elsevier；2019；105:93
–
116)。在s1中的受体结合域(rbd)与ace2结合后(wong et al.,j biol chem；2004jan 30；279(5):3197
–
3201)，会发生构象重排，导致s1脱落，s2通过宿主蛋白酶切割，并且暴露与s2'蛋白水解位点相邻的融合肽(tortorici and veesler,adv virus res.elsevier；2019；105:93
–
116；madu et al.,j virol；2009aug；83(15):7411
–
7421；walls et al.,proc natl acad sci usa；2017oct 17；114(42):11157
–
11162；millet and whittaker,proc natl acad sci usa；2014oct 21；111(42):15214
–
15219)。s向融合后构象的有利折叠与宿主细胞/病毒膜融合和病毒rna的胞质释放有关。与rbd的原子接触仅限于ace2的蛋白酶域(yan et al.,science.2020mar 4；:eabb2762；li et al.,science.2005sep16；309(5742):1864
–
1868)，并且去除颈部域和跨膜域的可溶性ace2(sace2)足以结合s和中和感染(li et al.,nature.2003nov 27；426(6965):450
–
454；hofmann et al.,biochem biophys res commun.2004jul 9；319(4):1216
–
1221；lei et al.,biorxiv.2020jan1；:2020.02.01.929976；moore et al.,j virol；2004oct；78(19):10628
–
10635)。原则上，该病毒在不同时降低对天然ace2受体亲和力的情况下，逃逸sace2
介导的中和作用的潜力有限，从而减弱毒力。此外，sace2与人免疫球蛋白fc区的融合可以在募集免疫效应功能和增强血清稳定性的同时使亲和力增强，如果用于预防，这是一种特别理想的优势(moore et al.,j virol；2004oct；78(19):10628
–
10635；liu et al.,kidney int.2018jul；94(1):114
–
125)，并且重组sace2已被证明对于健康人类受试者(haschke et al.,clin pharmacokinet.2013sep；52(9):783
–
792)和肺病患者(khan et al.,crit care.2017sep7；21(1):234)是安全的。
[0157]
sars冠状病毒2(sars-cov-2)的快速传播及不断升级造成了突发公共卫生事件，目前尚无批准的治疗方法或疫苗。病毒刺突蛋白s与肺部宿主细胞上的膜锚定ace2结合，引发分子事件，最终在细胞内释放病毒基因组。ace2的细胞外蛋白酶域通过充当s上受体结合位点的可溶性诱饵来抑制sars和sars-2冠状病毒进入细胞，是治疗和预防研发最好的选择。ace2的功效和可制造性可以通过增加折叠功能蛋白的亲和力和表达的突变来改善。本公开使用深度突变和体外选择解决了这一难题，由此确定了ace2的变体在细胞表面上与s受体结合域的结合增强。突变存在于整个蛋白质-蛋白质界面，以及它们可增强折叠和呈递相互作用表位的掩埋位点。在一些本文的实施方案中，ace2上的n90-聚糖被去除，因为它阻碍了与s的缔合。突变图谱为工程化高亲和力ace2受体以应对这一前所未有的挑战绘制了蓝图。所公开的ace2多肽具有优势，因为sars-cov-2或任何其他结合ace2的冠状病毒对这些受体诱饵产生抗性的风险非常小。
[0158]
本文所述的是ace2多肽(例如人ace2多肽)，改善了它们结合cov s蛋白的特性。具体而言，本文提供了修饰的ace2多肽，包括人ace2或其片段，例如其细胞外片段。相对于野生型人ace2(seq id no:1)，所述多肽包括至少一个氨基酸取代。
[0159]
在一些实施方案中，所述至少一个(例如，至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或更多个)氨基酸取代选自表1中所示的任何取代。
[0160]
在一些实施方案中，所述至少一个(例如，至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或更多个)氨基酸取代选自表2中所示的任何取代。
[0161]
在一些实施方案中，所述至少一个(例如，至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或更多个)氨基酸取代选自表3中所示的任何取代。
[0162]
在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代位于seq id no:1的人ace2的残基19、23、24、25、26、27、29、30、31、33、34、35、39、40、41、42、65、69、72、75、76、79、82、89、90、91、92、324、325、330、351、386、389、393和/或518处。
[0163]
在一些实施方案中，所述修饰的多肽相对于野生型人ace2(seq id no:1)仅含有单个氨基酸取代，例如表1中列出的一个氨基酸取代。在其他实例中，所述修饰的多肽包括两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代，例如表1中列出的两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代。在具体实例中，所述修饰的多肽仅包括在seq id no:1的人ace2的残基19、23、24、25、26、27、29、30、31、33、34、35、39、40、41、42、65、69、72、75、76、79、82、89、90、91、92、324、325、330、351、386、389、393或518处的单个取代。在其他具体实例中，所述修饰的多肽包括在选自由以下组成的组的残基处两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代：seq id no:1的人ace2的残基19、23、24、25、26、27、29、30、31、33、34、35、39、40、41、42、65、69、72、75、76、79、82、89、90、91、92、324、325、330、351、386、389、393或518。在其他实例中，所述修饰的多肽包括表4中列出取代的组合。
[0164]
在一些实施方案中，所述修饰的多肽是全长人ace2多肽。在一些实例中，所述多肽的氨基酸序列与seq id no:1至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％相同，并且包括至少一个本文公开的氨基酸取代。
[0165]
在其他实施方案中，所述修饰的多肽由人ace2的细胞外片段组成。例如，所述修饰的多肽可以由人ace2的完整细胞外蛋白酶域组成，例如seq id no:1的氨基酸残基19-615，或者所述修饰的多肽可以由所述细胞外域的一部分组成，例如所述细胞外域约50个氨基酸、约75个氨基酸、约100个氨基酸、约150个氨基酸、约200个氨基酸、约250个氨基酸、约300个氨基酸、约350个氨基酸、约400个氨基酸、约450个氨基酸、约500个氨基酸、约550个氨基酸或约590个氨基酸。在一些实例中，所述细胞外片段的氨基酸序列与seq id no:1残基19至615至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％相同，并且包括本文所公开至少一个氨基酸取代。
[0166]
在一些实施方案中，所述修饰的多肽由人ace2的片段组成。在一些实例中，所述修饰的多肽是seq id no:1约50个氨基酸、约75个氨基酸、约100个氨基酸、约150个氨基酸、约200个氨基酸、约250个氨基酸、约300个氨基酸、约350个氨基酸、约400个氨基酸、约450个氨基酸、约500个氨基酸、约550个氨基酸、约590个氨基酸、约596个氨基酸、约600个氨基酸、约650个氨基酸、约700个氨基酸、约714氨基酸、约722个氨基酸、约732个氨基酸、约740个氨基酸、约750个氨基酸或约800个氨基酸，并且包括本文公开的至少一个氨基酸取代。在具体的非限制性实例中，所述多肽的氨基酸序列与人ace2的片段(例如seq id no:1的残基1-732、19-732或19-740)至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％相同，并且包括本文公开的至少一个氨基酸取代。在具体实例中，所述修饰的多肽由seq id no:1氨基酸残基1-732、19-732或19-740组成并且包括本文公开的至少一个氨基酸取代。
[0167]
在一些实例中，所述修饰的多肽包含：t27y、l79t和n330y氨基酸取代；h34a、t92q、q325p和a386l氨基酸取代；t27y、l79t、n330y和a386l氨基酸取代；l79t、n330y和a386l氨基酸取代；t27y、n330y和a386l氨基酸取代；t27y、l79t和a386l氨基酸取代；a25v、t27y、t92q、q325p和a386l氨基酸取代；h34a、l79t、n330y和a386l氨基酸取代；a25v、t92q和a386l氨基酸取代；或t27y、q42l、l79t、t92q、q325p、n330y和a386l氨基酸取代，其中所述氨基酸取代参照seq id no:1。
[0168]
还提供了本文所公开修饰的多肽的二聚体。在一些实施方案中，所述二聚体多肽包括seq id no:1的残基1-732或19-732，以及本文公开的至少一个氨基酸取代，例如1、2、3、4或5个氨基酸取代。在一些实例中，所述二聚体是具有seq id no:10氨基酸序列的sace2v.2.4变体的二聚体。
[0169]
还提供了包括本文所公开修饰的ace2多肽和异源多肽的融合蛋白。在一些实施方案中，所述异源多肽是fc蛋白，例如人fc蛋白，例如人igg1的fc。在特定的非限制性实例中，所述融合蛋白包含seq id no:11的氨基酸序列或由其组成。在其他实施方案中，所述异源
多肽是可用作诊断/检测试剂的蛋白质，例如荧光蛋白质(例如，gfp)或酶(例如，碱性磷酸酶、hrp或萤光素酶)。在一些实施方案中，所述异源多肽是抗体或抗原结合蛋白，用于与第二cov抗原强烈结合。在一些实施方案中，所述异源多肽是用于锚定至细胞或细胞周边(例如，用于募集免疫细胞)的抗体或抗原结合蛋白。在一些实施方案中，所述异源多肽是用于引发生物反应的细胞因子、配体或受体。在一些实施方案中，所述异源多肽是延长血清半衰期的蛋白质(例如，抗体fc或血清白蛋白)。
[0170]
还提供了组合物，包含修饰的ace2多肽或其融合蛋白和药学上可接受的递体。在一些实施方案中，所述修饰的ace2多肽或融合蛋白被配制用于气管内或吸入施用。气管内或吸入制品可以是液体(例如溶液或悬浮液)并且包括雾剂、喷雾剂、气雾剂等。在具体实例中，所述组合物被配制用于使用雾化器施用。在其他实施方案中，所述修饰的ace2多肽或融合蛋白被配制用于静脉施用。
[0171]
还提供了通过使cov与本文所公开修饰的ace2多肽或融合蛋白接触来抑制cov复制的体外方法。在一些实例中，将cov感染的细胞(例如培养的细胞系或原代细胞)与所述修饰的ace2多肽接触，以测试所述修饰的多肽对cov复制的影响。
[0172]
还提供了抑制cov在受试者中复制和/或传播的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所公开修饰的ace2多肽、融合蛋白或组合物。还提供了一种治疗受试者的cov感染(例如covid-19或sars)的方法，包含向所述受试者施用治疗有效量本文所公开的修饰的ace2多肽、融合蛋白或组合物。在一些实例中，所述受试者是老年人或患有潜在的医学病症(例如心脏病、肺病、肥胖症或糖尿病)的病人。在一些实例中，所述受试者患有covid-19。在一些实例中，所述受试者是医护人员。在一些实例中，所述修饰的ace多肽经静脉施用。在其他实例中，气管内(it)或通过吸入(例如通过使用雾化器)施用所述修饰的ace多肽。在特定的非限制性实例中，所述修饰的ace2多肽、融合蛋白或组合物通过至少两种途径施用，例如iv和it，或iv和吸入。肺或呼吸道的其他施用途径包括支气管、鼻内或其他吸入途径，例如在插管患者的鼻气管或气管插管中直接滴注。在特定的非限制性实例中，所述修饰的ace2多肽的氨基酸序列包含seq id no:10或由其组成，或者所述融合蛋白的氨基酸序列包含seq id no:11或由其组成。
[0173]
还提供了一种预防性治疗(例如预防)受试者cov感染的方法，包含向所述受试者施用预防有效量本文所公开的修饰的ace2多肽、融合蛋白或组合物。预防性治疗包括暴露前预防和暴露后预防。在一些实例中，所述受试者是老年人或患有潜在的医学病症的病人。在一些实例中，所述潜在病症是心脏病、肺病、肥胖症或糖尿病。在一些实例中，所述受试者曾接触过covid-19患者。在一些实例中，所述受试者是医护人员。在一些实例中，所述修饰的ace多肽通过静脉施用。在其他实例中，气管内或通过吸入(例如通过使用雾化器)施用所述修饰的ace多肽。肺或呼吸道的其他施用途径包括支气管、鼻内或其他吸入途径，例如在插管患者的鼻气管或气管插管中直接滴注。在特定的非限制性实例中，所述修饰的ace2多肽的氨基酸序列包含seq id no:10或由其组成，或者所述融合蛋白的氨基酸序列包含seq id no:11或由其组成。
[0174]
在一些预防性治疗的实例中，所述治疗包括暴露前预防。例如，暴露于高风险环境的受试者(例如卫生保健工作者或基本工作人员)，可以施用修饰的ace多肽、融合蛋白或其组合物，以降低其感染sars-cov-2和/或covid-19发展的风险。在特定的非限制性实例中，
所述暴露前预防性治疗包含气管内或通过吸入(例如通过使用雾化器)施用所述多肽、融合蛋白或组合物。
[0175]
在一些预防性治疗的实例中，所述治疗包括暴露后预防。在这种类型的方法中，在暴露于sars-cov-2后马上或更短时间，例如在2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时或24小时内，向所述受试者施用所述修饰的ace多肽、融合蛋白或其组合物。在特定的非限制性实例中，所述暴露后预防性治疗包含气管内或通过吸入(例如通过使用雾化器)施用所述多肽、融合蛋白或组合物。
[0176]
还提供了编码本文所公开修饰的ace2多肽或融合蛋白的核酸分子和载体。在一些实例中，所述核酸分子和载体具有不同的密码子用途或可以针对在特定细胞类型(例如哺乳动物细胞)中的表达进行密码子优化。在一些实例中，所述核酸分子和载体带有天然人类多态性。
[0177]
还提供了组合物，包括本文所公开核酸分子或载体和药学上可接受的递体。
[0178]
还提供了通过施用治疗有效量(或暴露前或暴露后预防方法的预防有效量)的本文所公开核酸分子、载体或组合物来抑制受试者cov复制和/或传播的方法。还提供了治疗受试者cov感染的方法，包含向所述受试者施用治疗有效量的本文所公开核酸分子、载体或组合物。在一些实例中，所述核酸或载体是经静脉施用的。在其他实例中，所述核酸或载体通过气管内或通过吸入(例如通过使用雾化器)施用。在特定的非限制性实施方案中，所述核酸或载体使用至少两种途径施用，例如iv和it，或iv和吸入。肺或呼吸道的其他施用途径包括支气管、鼻内或其他吸入途径，例如在插管患者的鼻气管或气管插管中直接滴注。在一些实例中，所述受试者是老年人或患有潜在的医学病症(例如心脏病、肺病、肥胖症或糖尿病)的病人。在一些实例中，所述受试者患有covid-19。在一些实例中，所述受试者是医护人员。
[0179]
在一些实施方案中，向所述受试者施用一剂或更多剂本文所公开修饰的ace2多肽、融合蛋白、核酸或组合物。例如，可以向所述受试者施用一剂或更多剂、两剂或更多剂、三剂或更多剂、四剂或更多剂，或五剂或更多剂，例如每天两次、每天一次、每隔一天一次、每周两次、每周一次，或每月一次。本领域普通技术人员可以基于诸如被治疗的受试者、受试者的病症和潜在病症等因素来选择适当数量的剂量和施用时间。
[0180]
本文还提供了检测生物样品中cov的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使所述生物样品与本文所公开修饰的多肽或融合蛋白接触；以及检测所述修饰的多肽或融合蛋白与所述生物样品的结合。在一些实例中，所述生物样品是血液、唾液、痰液、鼻拭子或支气管肺泡灌洗液样品。
[0181]
在本文公开方法的一些实施方案中，所述冠状病毒是利用ace2作为进入受体的任何人或动物冠状病毒，包括新出现的冠状病毒株。在一些实例中，所述冠状病毒是人冠状病毒。在具体的实例中，人冠状病毒是sars-cov、sars-cov-2、mers-cov、人冠状病毒hku1(hku1-cov)、人冠状病毒oc43(oc43-cov)、人冠状病毒229e(229e-cov)或人冠状病毒nl63(nl63-cov)。在其他实例中，所述冠状病毒是人畜共患冠状病毒，例如有可能交叉感染人的人畜共患冠状病毒。在具体实例中，所述冠状病毒是蝙蝠冠状病毒或啮齿动物冠状病毒。在特定的非限制性实例中，蝙蝠冠状病毒是lyra11、rs4231、rs7327、rs4084或rsshc014。
[0182]
还提供了试剂盒，包括结合固体支持物的本文所公开修饰的多肽或融合蛋白。
[0183]
提供以下实施例用于说明某些特定特征和/或实施方案。这些实施例不应被解释为将本公开限制于所描述的特定特征或实施方案。
[0184]
实施例
[0185]
实施例1
[0186]
由于人ace2尚未进化至识别sars-cov-2s，因此假设可能会发现一些突变，其增强用于治疗和诊断应用的亲和力。通过引入简并密码子，使具有n端c-myc表位标签的全长ace2的编码序列多样化，以创建一个含有117个位点上所有可能的单氨基酸取代的文库，该文库跨越与s的整个界面，并排列在底物结合腔内。s结合不依赖于ace2催化活性(moore et al.,j virol；2004oct；78(19):10628
–
10635)并且发生在ace2的外表面(yan et al.,science.2020mar 4；:eabb2762；li et al.,science.2005sep16；309(5742):1864
–
1868)，而血管紧张素底物结合在容纳活性位点的深裂隙内(towler et al.,j biol chem；2004apr 23；279(17):17996
–
18007)。因此，ace2的底物结合裂隙内的取代作为对照，预期对s相互作用的影响最小，但可能有助于工程化底物亲和力以提高体内安全性。然而，用催化失活的sace2治疗covid-19的优势受到质疑(kruse,f1000res；2020；9(72):72)。
[0187]
在通常每个细胞产生不超过一个编码变体的情况下，ace2文库在人expi293f细胞中瞬时表达，从而将基因型和表型紧密联系(heredia et al.,j immunol；2018apr20；200(11):ji1800343
–
3839；park et al.,j biol chem；2019；294(13):4759
–
4774)。然后将细胞与含有sars-cov-2的rbd(seq id no:2的氨基酸333-529)培养基的亚饱和稀释液一起培育，该rbd在c端与超折叠gfp((sfgfp:(p
é
delacq et al.,nat biotechnol.2006jan；24(1):79
–
88))融合(图1a)。结合的s-rbd-sfgfp水平与通过双色流式细胞术测量的myc标记ace2的表面表达水平相关。与表达野生型ace2的细胞(图1c)相比，ace2文库中的许多变体未能结合s-rbd，而结合信号较高的ace2变体似乎数量较少(图1d)。通过荧光激活细胞分选(facs)收集表达与s-rbd高或低结合ace2变体的细胞，分别称为“ncov-s-high”和“ncov-s-low”分选群体。在facs期间，结合s-rbd-sfgfp的荧光信号持续下降，需要定期更新收集门以“追逐”相关群体。这与实验期间s-rbd解离数小时一致。所报道s-rbd对ace2的亲和力范围为1至15nm(walls et al.,cell.2020mar 6；181(2):281-292.e6；wrapp et al.,science.2020feb19；:eabb2507)。
[0188]
对分选群体中的转录本进行深度测序，并将变体的频率与天然质粒文库进行比较，以计算文库中所有2,340个编码突变的富集或耗竭情况(图2)。这种通过深度测序跟踪体外选择或进化的方法被称为深度突变(fowler and fields,nat methods.2014aug；11(8):801
–
807)。两个独立分选实验之间的富集比(图3a和3b)和残基保守性得分(图3d和3e)非常一致，从而给出了数据的置信度。在大多数情况下，ncov-s-high分选中的富集比(图3c)和保守性得分(图3f)与ncov-s-low分选是反相关的，除了从两个门适当耗竭的无义突变。这表明ace2中大多数(但不是全部)非同义突变并没有消除表面表达。该文库偏向于溶剂暴露的残基，并且几乎没有掩埋疏水残基的取代，这些疏水残基可能对质膜运输产生更大影响(park et al.,j biol chem；2019；294(13):4759
–
4774)。
[0189]
将ncov-s-high分选的实验保守性得分映射到s-rbd结合ace2的结构(yan et al.,science.2020mar 4；:eabb2762)表明，掩埋在界面中的残基往往是保守的，而在界面外围或底物结合裂隙中的残基是突变耐受的(图4a)。ace2α1螺旋和β3-β4链的c端周围ace2
区域对极性残基的耐受性较弱，而α1的n端和α2的c端的氨基酸更倾向于疏水性(图4b)，可能部分保留α1-α2之间的疏水堆积作用。这些离散的片块(patch)分别接触球状rbd折叠和rbd的长突出环。
[0190]
一起形成共有n-糖基化基序的两个ace2残基(n90和t92)是富集突变的显著热点(图2和图4a)。事实上，n90和t92的所有取代，除了保持n-聚糖的t92s外，都非常有利于s-rbd结合，因此预测n90-聚糖会部分阻碍s/ace2相互作用。
[0191]
挖掘数据识别出许多富集s-rbd结合的ace2突变。例如，文库中35个位置有122个突变，在ncov-s-high分选中log2富集比》1.5。表1列出了这些突变。表2列出了log2富集比》2.0的突变。表3列出了log2富集比》2.5的突变。
[0192]
结构特征界面上至少有十几个ace2突变增强s-rbd结合，并且可能有助于工程化sars-cov-2s的高度特异性和紧密结合物，特别是用于医疗点诊断。其中一些突变如何增强s-rbd结合的分子基础可以从s-rbd结合的低温-em结构中得以合理解释(图4c)：ace2-t27的疏水取代增强了与s-rbd芳香族残基的疏水堆积，ace2-d30e将酸性侧链延伸到s-rbd-k417，ace2-k31的芳香族取代有助于形成芳香族残基的界面簇。然而，在界面处具有突变的工程化ace2受体可能会呈递与天然ace2完全不同的结合表位，从而可能出现病毒逃逸突变体，或者它们可能是菌株特异性的并且缺乏广度。相反，人们注意到第二壳(shell)和更远壳的突变，这些突变不直接接触s-rbd，而是具有推定的结构作用。例如，脯氨酸取代在五个文库位置(s19、l91、t92、t324和q325)富集，它们可能使螺旋的第一圈熵稳定。脯氨酸也在h34处富集，它可能会加强α1中的中央凸起。多个突变也在掩埋位置处富集，它们将改变局部堆积(例如a25v、l29f、w69v、f72y和l351f)。因此，选择高结合信号的ace2变体不仅报告了亲和力，而且还报告了sars-cov-2s识别折叠结构在膜上的呈递。考虑到ace2文库偏向溶剂暴露位置，序列图谱中富集结构突变的存在尤其值得注意。
[0193]
[0194][0195][0196][0197][0198]
实施例2
[0199]
通过被靶向的突变验证了在ncov-s-high分选中高度富集的30个单个取代(图5)。
与野生型ace2相比，rbd-sfgfp与全长ace2突变体的结合增强，但改善不大，并且在表达低ace2水平的细胞上最为明显(图5a)。突变体之间ace2表达的差异也与结合rbd-sfgfp的总体水平相关(图5c)，表明在解释深度突变扫描数据时必须谨慎，因为突变可能会影响活性和表达。为了快速评估格式与治疗研发更相关的突变，将可溶性ace2蛋白酶域与sfgfp融合。sace2-sfgfp的表达水平通过转染培养物的荧光进行定性评估(图6a)，并且通过流式细胞术测量sace2-sfgfp与在质膜处表达的全长s的结合(图6b)。消除n90聚糖的单个取代(t92q)使结合信号略有增强(图6b)，这通过分析纯化的蛋白质(图12)得到证实。关注针对s结合选择中最富集的取代，这些取代也在空间上分离以最小化负上位性(heredia et al.,j virol93(11):e00219-19,2019)，sace2中的突变组合大幅增强s结合(表4和图6b)。虽然该测定仅提供相对差异，但组合突变体已将结合增强了至少一个数量级。未经研究的突变组合可能会产生更大的影响。
[0200]
表4.sace2的组合突变体
[0201]
变体突变sace2.v1h34a、t92q、q325p、a386lsace2.v2t27y、l79t、n330y、a386lsace2.v2.1l79t、n330y、a386lsace2.v2.2t27y、n330y、a386lsace2.v2.3t27y、l79t、a386lsace2.v2.4t27y、l79t、n330ysace2.v3a25v、t27y、t92q、q325p、a386lsace2.v4h34a、l79t、n330y、a386lsace2.v5a25v、t92q、a386lsace2.v6t27y、q42l、l79t、t92q、q325p、n330y、a386l
[0202]
选择单个变体sace2.v2进行纯化和进一步表征(图7)。选择此变体是因为它与sfgfp表达融合良好并保持n90-聚糖，因此将呈递与天然sace2更紧密匹配的表面，以最大限度地降低免疫原性。当纯化为8his标记蛋白(低20％)或igg1-fc融合蛋白(低60％)时，sace2.v2的产量低于野生型蛋白的产量，并且通过分析尺寸排阻色谱(sec)，在37℃培育40小时后发现少量级分sace2.v2聚集(图7d)。否则，sec无法将sace2.v2与野生型区分开来(图7c)。
[0203]
在使用纯化8his标记的sace2的流式细胞术实验中，发现只有sace2.v2-8h与全长s在细胞表面强烈结合，这表明野生型sace2具有高解离速率，造成了样品洗涤过程中的解离(图8a和图13)。野生型和变体之间的差异在igg1-fc融合的情况下不太明显(图8a和图13)，表明亲和力掩盖了突变体结合的增强，再次说明野生型和变体sace2之间存在解离速率差异。可溶性ace2.v2-8h在与表达s细胞的结合方面胜过野生型sace2-igg1，而野生型sace2-8h即使在高10倍的浓度下也不会胜过sace2-igg1(图8b)。此外，当通过elisa测试时，只有工程sace2.v2-8h有效地与三名康复的covid-19患者血清中抗rbd igg竞争(图8e)。这与研究结果一致，即虽然sace2在抑制sars-cov-2于细胞系和细胞器中复制方面非常有效，但需要极高的浓度(monteil et al.,cell doi:10.1016/j.cell.2020.04.004:1
–
28,2020)。使用生物层干涉技术(bli)，发现sace2.v2对固定化rbd的亲和力比野生型蛋白
质高65倍，这几乎完全是由于解离速率较慢(表5与图8c和图8d)。
[0204]
表5.bli动力学数据汇总
[0205]
可溶性分析物固定化配体ka(m-1
s-1
)kd(s-1
)kdsace2(wt)-8hrbd-igg17.1/8.1
×
1041.1/1.1
×
10-2
140/150nmsace2-t92q-8hrbd-igg11.0
×
1058.2
×
10-3
80nmsace2.v2-8hrbd-igg11.5
×
1053.3
×
10-4
2.3nmsace2.v2.2-8hrbd-igg11.3
×
1058.3
×
10-4
6.2nmsace2.v2.4-8hrbd-igg11.4
×
1055.4
×
10-4
3.8nmsace22(wt)-8hrbd-igg19.5
×
104ndndsace22.v2.4-8hrbd-igg11.5
×
105ndndsace22.v2.(cho-s)rbd-igg12.0
×
105ndndrbd-8hsace22(wt)-igg12.8
×
1056.0
×
10-3
22nmrbd-8hsace22.v2-igg15.8
×
1051.4
×
10-4
0.2nmrbd-8hsace22.v2.4-igg15.7
×
1053.5
×
10-4
0.6nm
[0206]
所有测量均使用将igg1(fc)融合蛋白捕获到抗人igg fc生物传感器表面来进行。
[0207]
每个实验使用3-4种分析物浓度。
[0208]
nd，未确定。
[0209]
在所有实验中，无论ace2被纯化为8his标记蛋白还是被用作表达培养基中的sfgfp融合蛋白，无论全长s在质膜上表达还是分离的rbd固定在生物传感器表面上，表征的sace2.v2变体始终显示出一到两个数量级更紧密的结合。这些实验证实深度突变的关键发现，即人ace2中存在的突变会增强与sars-cov-2s的结合。
[0210]
为了解决sace2.v2表达降低的问题，假设突变负荷太高。在第二代设计中，sace2.v2中四个突变中的每一个都恢复为野生型状态(表4)，并且发现在细胞表面与全长s的结合依然紧密(图9a)。纯化其中一种变体(具有突变t27y、l79t和n330y的sace2.v2.4)，其产量比野生型更高，并显示出与rbd的紧密纳摩尔结合(图9)。
[0211]
ace2构建体被延长以包括颈部域/二聚体化域，从而产生稳定的二聚体(图10a)，在此称为sace22，它与细胞表面上的s或生物传感器上固定化的rbd紧密结合(图14)。与野生型相比，二聚体sace22.v2.4更有效地与康复患者血清中存在的igg抗体竞争(图10b)。通过将sace22-igg1(图15)固定到生物传感器表面并与单体rbd-8h作为分析物一起培育，野生型sace22的rbd的kd确定为22nm(图10c)，与之前的报道非常一致(wrapp et al.,science,eabb2507,2020；shang et al.,nature.382,1199,2020)，而sace22.v2.4结合的亲和力为600pm(图10d)。这与最近分离的单克隆抗体相比具有优势(pinto et al.,nature doi:10.1038/s41586-020-2349-y,2020；hansen et al.,science,eabd0827,2020；brouwer et al.,science,eabc5902,2020；wec et al.,science,eabc7424,2020；wang et al.,nat commun.11,2251,2020；wu et al.,science.368,1274,2020；rogers et al.,science,eabc7520,2020)。
[0212]
单体sace2.v2.4中和sars-cov-2感染所培养veroe6细胞的功效超过野生型蛋白近两个数量级(图11)，与生化结合数据一致。野生型二聚体sace22本身比单体强两个数量级，表明与病毒颗粒表面上的刺突有强烈的相互作用，二聚体sace22.v2.4再次更有效，ic
50
在亚纳摩尔范围内(图11)。尽管在工程化过程中没有考虑sars-cov-1s结构或序列，但二聚体sace22.v2.4也能有效中和sars-cov-1(图11)，并且诱饵受体可能会中和多种尚未传播给人类的利用ace2的冠状病毒。
[0213]
为了提高安全性，未标记的sace22.v2.4在expicho-s细胞中产生(图16a)，发现在37℃培育6天后稳定(图16b)。该蛋白质与野生型sace2
2-igg1竞争细胞表达的s(图16c)并与固定化的rbd紧密结合(图16d)。除了抑制病毒进入外，重组sace2还可能具有第二种治疗机制：对血管紧张素ii(一种血管收缩肽激素)进行蛋白水解以缓解呼吸窘迫症状(imai et al.,nature.436,112
–
116,2005；treml et al.,crit.care med.38,596
–
601,2010)。发现可溶性ace22.v2.4具有催化活性，尽管活性降低(图17)。
[0214]
虽然在复制病毒过程中对病毒蛋白进行深度突变已被广泛研究，以了解药物和抗体的逃逸机制，但这里的工作表明，当选择方法与病毒复制分离并聚焦于宿主因子时，深度突变如何直接应用于治疗设计。科学界以惊人的速度确定了治疗covid-19的多种候选药物，尤其是对蛋白s具有极高亲和力的单克隆抗体。本文公开的研究表明，如何将相当的亲和力工程化到病毒的天然受体中，同时还提出了对病毒-宿主最初相互作用的分子基础的见解。
[0215]
实施例3
[0216]
材料和方法
[0217]
质粒。将人ace2(genbank nm_021804.1)的成熟多肽(氨基酸19-805)克隆到pcep4(invitrogen)的nhei-xhoi位点，pcep4具有n端ha前导序列(mktiialsyifclvfa)、myc-tag和接头序列(gspgga)。通过将ace2的蛋白酶域(氨基酸1-615)经由富含gly/ser的接头序列(gsggsgsgg)基因连接到sfgfp(genbank asl68970)，并粘贴在pcdna3.1(+)(invitrogen)的nhei-xhoi位点之间，构建与超折叠gfp融合的可溶性ace2(p
é
delacq et al.,nat.biotechnol.24,79
–
88,2006)。通过gsg接头序列和8个组氨酸标签或gs接头序列和igg1的fc区(氨基酸d221-k447)克隆等效sace2构建体，而二聚体sace22构建体包含氨基酸1-732，其他方面相同。用于sars-cov-2s(genbank yp_009724390.1)的rbd(氨基酸333-529)的合成人密码子优化基因片段(integrated dna technologies)在n端与ha前导序列融合，在c端与超折叠gfp、igg1的fc区或8个组氨酸标签融合。将组装好的dna片段连接到pcdna3.1(+)的nhei-xhoi位点。从puc57-2019-ncov-s(人类)(molecular cloud)亚克隆人密码子优化的全长s，puc57-2019-ncov-s未标记(氨基酸1-1273)并在成熟多肽(氨基酸16-1273)上游具有n端ha前导序列(mktiialsyifclvfa)、myc-tag和接头序列(gspgga)。
[0218]
组织培养。expi293f细胞(thermofisher)在expi293表达培养基(thermofisher)中以125rpm、8％co2、37℃的条件培养。为了生产rbd-sfgfp、rbd-igg1、sace2-8h和sace2-igg1，将细胞制备成浓度为2
×
106/ml的培养物。对于每毫升培养物，将500ng质粒和3μg聚乙烯亚胺(mw为25,000；polysciences)混合在100μl optimem(gibco)中，在室温下培育20分钟，然后添加到细胞中。转染后18-23小时加入转染增强剂(thermofisher)，并将细胞培养4-5天。通过以800
×
g离心5分钟去除细胞，并将培养基储存在-20℃。解冻后和临用前，通过以20,000
×
g离心20分钟去除剩余的细胞碎片和沉淀物。根据制造商的说明，使用expifectamine(thermofisher)将用于表达sace2-sfgfp蛋白的质粒转染到expi293f细胞中，在转染后22-1
/2小时添加转染增强剂，并在60小时后收获培养基上清液。
[0219]
深度突变。使用具有简并nnk密码子的引物，通过重叠延伸pcr技术(procko et al.,j.mol.biol.425,3563
–
3575,2013)对ace2蛋白酶域内的117个残基进行多样化。在先前所说明的每个细胞通常不会产生超过一个编码变体的条件下，使用expifectamine将质粒文库转染到expi293f细胞中(heredia et al.,j.immunol.200,ji1800343
–
3839,2018；park et al.,j biol chem 294,4759
–
4774,2019)；1ng编码质粒用每毫升细胞培养物(浓度为2
×
106/ml)1,500ng pcep4-δcmv递体质粒稀释，转染后2小时更换培养基。24小时后收集细胞，用补充有0.2％牛血清白蛋白(pbs-bsa)的冰冷pbs洗涤，并在冰上与1/20(重复1)或1/40(重复2)稀释的含rbd-sfgfp培养基的pbs-bsa稀释液培育30分钟。细胞与抗myc alexa 647(克隆9b11，1/250稀释；cell signaling technology)共同染色。细胞用pbs-bsa洗涤两次，并在roy j.carver生物技术中心于bd facs aria ii上分选。通过前向/侧向散射对主要细胞群进行门控以去除碎片和双联体(doublets)，并将dapi添加到样品中以排除死细胞。在myc阳性(alexa 647)群体中，前67％被门控(图1b)。其中，将gfp荧光最高的15％细胞和gfp荧光最低的20％细胞收集在用胎牛血清涂覆过夜且含有expi293表达培养基的试管中(图1d)。使用genejet rna纯化试剂盒(thermo scientific)从收集的细胞中提取总rna，并用高保真accuscript(agilent)逆转录cdna，引物为基因特异性寡核苷酸。ace2的多样化区域被pcr扩增为5个片段。引物上的侧翼序列在产物末端添加了衔接子，用于退火至illumina测序引物(独特的条形码)并用于结合流动池。使用2
×
250nt配对末端方案在illumina novaseq 6000上对扩增子进行测序。使用enrich分析数据(fowler et al.,bioinformatics.27,3430
–
3431,2011)，并在geo数据库中设置命令。简而言之，将ace2变体在分选群体转录本中的频率与其在天然质粒文库中的频率进行比较，以计算log2富集比，然后通过针对野生型的相同计算进行归一化。野生型序列既没有显著富集也没有耗竭，并且log2富集比为-0.2到+0.2。
[0220]
流式细胞术分析ace2-s结合。使用expifectamine(thermofisher)，由pcdna3-myc-ace2、pcdna3-myc-s质粒或pcdna3-s质粒(每毫升培养物含有500ng dna，培养物的浓度为2
×
106/ml)转染expi293f细胞。转染后24小时通过流式细胞术分析细胞。为了分析rbd-sfgfp与全长myc-ace2的结合，用冰冷的pbs-bsa洗涤细胞，并在冰上用1/30稀释的含rbd-sfgfp的培养基和1/240稀释的抗myc alexa 647(克隆9b11，cell signaling technology)培育30分钟。用pbs-bsa洗涤细胞两次并在bd lsr ii上进行分析。为了分析sace2-sfgfp与全长myc-s的结合，用pbs-bsa洗涤细胞，并在冰上用连续稀释的含有sace2-sfgfp的培养基和1/240稀释的抗myc alexa647(克隆9b11，cell signaling technology)培育30分钟。细胞用pbs-bsa洗涤两次，并在bd accuri c6上进行分析，对整个alexa 647阳性群体进行门控分析。为了测量sace2-igg1或sace2-8h的结合，用pbs-bsa洗涤myc-s或s转染的细胞，并与指定浓度的纯化sace2的pbs-bsa溶液一起培育30分钟。将细胞洗涤两次，与二抗(1/100稀释的immunology consultants laboratory鸡抗his-fitc多克隆抗体；或1/250稀释的biolegend抗人igg-apc克隆hp6017)在冰上培育30分钟，再洗涤两次，在bd accuri c6上测量通过fsc-ssc门控以排除碎片后总群体的荧光。使用fcs express(de novo软件)或bd accuri c6软件处理数据。
[0221]
纯化igg1-fc融合蛋白。将澄清表达培养基与kaneka kancapa 3g亲和吸附剂(pall；在pbs中平衡)在4℃下培育90分钟。将树脂收集在色谱柱上，用12倍柱体积(cv)pbs
洗涤，并用5cv 60mm醋酸盐(ph 3.7)洗脱蛋白质。洗脱液立即用1cv的1m tris(ph 9.0)中和，并用100kd mwco离心装置(sartorius)浓缩。在运行缓冲液为pbs的superdex 200increase10/300gl色谱柱(ge healthcare life sciences)上分离蛋白质。汇集峰级分，浓缩至～10mg/ml，溶解度极佳，在液氮中速冻后储存在-80℃。使用单体成熟多肽序列的计算消光系数，通过280nm处的吸光度确定蛋白质浓度。
[0222]
8his标记蛋白的纯化。将pbs中平衡的hispur ni-nta树脂(thermo scientific)与澄清表达培养基在4℃下培育90分钟。将树脂收集在层析色谱柱上，用12倍柱体积(cv)pbs洗涤，并用补充有20mm、50mm和250mm咪唑(ph 8)的pbs分步洗脱液来洗脱蛋白质(每个级分6cv)。用30kd mwco离心装置(milliporesigma)浓缩50mm和250mm咪唑级分。在运行缓冲液为pbs的superdex 200increase 10/300gl色谱柱(ge healthcare life sciences)上分离蛋白质。汇集峰级分，浓缩至～5mg/ml，溶解度极佳，在液氮中速冻后储存在-80℃。
[0223]
其他蛋白质。在expicho-s细胞(thermofisher)中表达的未标记sace22.v2.4由orthogonal biologics,inc.生产和提供。
[0224]
分析尺寸排阻色谱(sec)。在pbs中平衡的superdex 200increase 10/300gl色谱柱(ge healthcare life sciences)上分离蛋白质(200μl，浓度为2μm)。mw标准品来自bio-rad。
[0225]
生物层干涉技术。将水合的抗人igg fc生物传感器(molecular devices)浸入含有rbd-igg1的表达培养基中60秒。在测定缓冲液中洗涤捕获rbd的生物传感器，浸入指定浓度的sace2-8h蛋白中，然后返回测定缓冲液以测量解离作用。在blitz仪器上收集数据，并使用blitz pro数据分析软件(molecular devices)以1:1结合模型进行分析。测定缓冲液是10mm hepes(ph 7.6)、150mm nacl、3mm edta、0.05％聚山梨醇酯20、0.5％脱脂奶粉(bio-rad)。
[0226]
试剂和数据可用性。质粒以id 141183-5、145145-78、149268-71、149663-8和154098-106保存在addgene。原始和处理后的深度测序数据存储在ncbi的基因表达综合数据库(geo)中，序列号为gse147194。
[0227]
ace2催化活性测定。使用荧光ace2活性测定试剂盒(biovision)测量活性，蛋白质在测定缓冲液中稀释至最终浓度为22、7.4和2.5nm。比活性报告为每pmol酶每分钟产生的pmol mca(mu)。在analyst ht(molecular devices)上读取荧光值。
[0228]
elisa。如amant et al.(nat.med.5,562,2020)所述，通过间接elisa测量人血清样品的抗rbd igg滴度。96孔板的孔在4℃下用2μg/ml rbd-8h蛋白涂覆过夜。洗涤后，将所述孔用含3％脱脂牛奶的pbs溶液在室温下封闭1小时。接下来，将各种稀释的热灭活血清(56℃，1小时)添加到封闭的孔中。在室温下2小时后，洗涤孔，然后在室温下与山羊抗人igg-hrp(thermofisher)一起培育1小时。通过洗涤去除任何未结合的hrp缀合抗体，并添加了hrp的tmb底物。比色反应进行10分钟，然后加入2n硫酸终止反应。在450nm处测量产物的吸光度。对于竞争测定，血清稀释液(相当于它们的滴度：p1为1:5000，p2为1:2000，p3为1:1000)与不同浓度的sace2预混合。将血清-sace2混合物添加到封闭板中，并按上述方法继续所述方案。
[0229]
非人类受试者研究(nhsr)确定。芝加哥大学(患者p2和p3)和商业供应商(患者p1；raybiotech)提供了covid-19康复患者的去标识化的血清样品。伊利诺伊大学研究受试者
保护办公室确定，在elisa研究中使用的样品不符合45cfr46(d)(f)或21cfr56.102(c)(e)中限定的人类受试者研究标准并且不需要irb批准。
[0230]
病毒微中和测定。培养vero e6细胞，并按照wec et al.(science,eabc7424,2020)的描述测定真实sars-cov-2对它们的感染。简而言之，将可溶性ace2蛋白在培养基中连续稀释，并与sars-cov-2(病毒分离株2019-ncov/usa-wa1-a12/2020；genbank收录号mt020880.1)一起培育1小时。将混合物以0.2的moi加入veroe6细胞并培育24小时。对细胞进行固定并用抗sars-cov-2核衣壳抗体(sino biological)和alexa fluor 488缀合山羊抗兔二抗免疫染色。将孔板在operetta(perkinelmer)上成像以确定感染细胞的数量，并与仅有病毒的对照孔进行比较以计算相对感染的百分比。
[0231]
实施例4
[0232]
与普遍存在的造成常见呼吸道疾病的人冠状病毒不同，这些具有大流行潜力的人畜共患病冠状病毒会导致严重而复杂的疾病，部分原因是它们的组织趋向性由受体利用驱动。严重急性呼吸综合征冠状病毒1(sars-cov-1)和2(sars-cov-2)与血管紧张素转化酶2(ace2)结合以进行细胞附着并进入细胞(zhou et al.,nature.579,270
–
273,2020；walls et al.,cell,2020),doi:10.1016/j.cell.2020.02.058；wan et al.,sars.j.virol.,2020),doi:10.1128/jvi.00127-20；wrapp et al.,science,eabb2507,2020；hoffmann et al.,cell,2020),doi:10.1016/j.cell.2020.02.052；li et al.,nature.426,450
–
454,2003；letko et al.,nat microbiol.11,1860,2020)。ace2是一种负责调节血容量和压力的蛋白酶，它在肺、心脏和胃肠道以及其他组织的细胞表面表达(samavati,b.d.uhal,front.cell.infect.microbiol.10,752,2020；jiang et al.,nat rev cardiol.11,413
–
426,2014)。sars-cov-2及其引起的疾病(covid-19)的持续传播对全球医疗保健系统和经济造成严重影响，迫切需要有效的治疗方法和疫苗。
[0233]
随着sars-cov-2在人群中流行，它有可能发生变异并发生遗传漂变。随着越来越多的人被感染并产生反免疫反应，这种情况将在多大程度上发生尚不清楚，但病毒刺突蛋白s(d614g)的变体已经迅速从多个独立事件中出现并影响s蛋白的稳定性和动力学(zhang et al.,biorxiv,2020.06.12.148726,2020；korber et al.,cell.182,812
–
827.e19,2020)。另一种s变体(d839y)在葡萄牙流行，可能是由于奠基者效应(borges et al.,medrxiv,2020.08.10.20171884,2020)。冠状病毒具有中到高的突变率(以hcov-nl63中每个位点每年10-4
个取代进行测量(pyrc et al.,j.mol.biol.364,964
–
973,2006)，hcov-nl63是一种尽管通过较小界面也结合ace2的α冠状病毒，所述界面仅与sars相关β冠状病毒的rbd部分共享(wu et al.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.106,19970
–
19974,2009))，并且冠状病毒基因组因重组事件在自然界中经常发生重大变化，特别是在共感染水平可能很高的蝙蝠身上(su et al.,trends microbiol.24,490
–
502,2016；boni et al.,nat microbiol 5,1408-1417,2020)。在骆驼身上也有mers-cov重组的记录(sabir et al.,science.351,81
–
84,2016)。这一切都将对当前大流行的轨迹、未来冠状病毒大流行的可能性以及sars-cov-2的耐药性是否普遍存在产生深远的影响。
[0234]
病毒刺突是中和单克隆抗体(正在进入临床阶段)易攻击的靶标，但在组织培养中，刺突中的逃逸突变迅速出现在所有测试的抗体中(baum et al.,science,eabd0831,2020)。通过酵母表面展示对分离的受体结合域(rbd)进行深度突变，很容易识别出s中的突
变，这些突变保持高表达水平和ace2亲和力，但不再与单克隆抗体结合并产生抗药性(greaney et al.,biorxiv,2020.09.10.292078,2020)。这促进了研发非竞争性单克隆抗体鸡尾酒疗法(baum et al.,science,eabd0831,2020；tortorici et al.,science,eabe3354,2020)，灵感来自治疗hiv-1和埃博拉病毒的教训，从而限制病毒逃逸的可能性。这还未能解决未来冠状病毒从抗原性可能不同的野生动物溢出的问题。实际上，需要进行大量筛选工作才能从康复的sars-cov-1患者身上找到与sars-cov-2发生交叉反应的抗体(pinto et al.,nature,2020),doi:10.1038/s41586-020-2349-y)，这表明抗体与刺突表面上可变表位相互作用的能力有限，并且不太可能广泛用于所有sars相关病毒，并用它们具有泛特异性。
[0235]
一种替代单克隆抗体的基于蛋白质抗病毒药物是使用可溶性ace2(sace2)作为诱饵来竞争病毒刺突上的受体结合位点(li et al.,nature.426,450
–
454,2003；hofmann et al.,biochem.biophys.res.commun.319,1216
–
1221,2004；lei et al.,nat commun.11,2070,2020；monteil et al.,cell,2020,doi:10.1016/j.cell.2020.04.004；chan et al.,science.4,eabc0870,2020)。原则上，该病毒在不同时降低对天然ace2受体亲和力的情况下，逃逸sace2介导的中和作用的潜力有限，从而减弱病毒的毒力。多个研究小组现在已经对sace2进行工程化，从而产出sars-cov-2高亲和力诱饵，与成熟的单克隆抗体相媲美并有效中和感染(chan et al.,science.4,eabc0870,2020；glasgow et al.,biorxiv,2020.07.31.231746,2020；higuchi et al.,biorxiv,2020.09.16.299891,2020)。在本文公开的研究中，深度突变用于识别ace2中大量增强与s亲和力的突变(chan et al.,science.4,eabc0870,2020)。这些突变分布在界面上，也分布在远端位点，预期它们会增强病毒识别构象的折叠。三个突变的组合，称为sace22.v2.4，将亲和力提高35倍，并以与最好单克隆抗体相当的亲和力结合sars-cov-2s(k
d 600pm)(chan et al.,science.4,eabc0870,2020)。通过与膜上表达的三聚体刺突强烈结合，可以达到更高的表观亲和力。尽管工程化过程只专注于sars-cov-2亲和力，但sace22.v2.4在有效地中和了组织培养物中真实sars-cov-1和-2的感染，这表明它与野生型受体很高的相似性使其一般对利用ace2的β冠状病毒具有广泛的活性。可溶性ace22.v2.4是二聚体和单分散体，无聚集，具有催化活性，高度可溶，在37℃下储存数天后稳定，并且较佳的表达水平高于野生型蛋白质。sace22.v2.4将高活性和所需生产特性完美结合，是临床前研发的真正候选药物。
[0236]
工程化的高亲和力诱饵受体虽然与天然ace2非常相似，但在相互作用表面处或附近存在突变。因此，病毒刺突变体有可能区分工程诱饵和野生型受体，从而产生了抗性途径。本文公开了工程诱饵sace22.v2.4广泛而紧密地结合使用ace2进入细胞的多种sars相关β冠状病毒的rbd。虽然在竞争结合测定中发现了许多有利于结合工程诱饵的突变，但在直接接触ace2且可能存在逃逸突变的rbd中没有发现突变，这些突变将特异性转向野生型受体。结果表明，对工程诱饵受体的抗性将是罕见的，并且sace22.v2.4针对sars相关病毒中与s亲和力的共同属性。
[0237]
结果
[0238]
一种工程诱饵受体以紧密的亲和力广泛结合sars相关cov的rbd
[0239]
测定了诱饵受体sace22.v2.4对从菊头蝠属(rhinolophus)蝙蝠物种的五种冠状病毒(分离株lyra11、rs4231、rs7327、rs4084和rsshc014)和两种人冠状病毒(sars-cov-1
和sars-cov-2)s蛋白中纯化的rbd亲和力。这些病毒属于使用ace2作为进入受体的β冠状病毒的共同进化枝(letko et al.,nat microbiol.11,1860,2020)。它们在rbd核内具有接近的序列同一性，而在功能性ace2结合位点(图18和图19)内变异最高，可能是由于在生态多样化的蝙蝠物种中与多态性ace2序列进行共同进化的“军备竞赛”所致(frank et al.,biorxiv.5,562,2020)。通过生物层干涉技术(bli)测量亲和力，其中sace22(氨基酸s19-g732)与固定在传感器表面人igg1的fc部分在c端融合，单体8his标记的rbd用作可溶性分析物。这种设置排除了亲和力效应，否则当溶液中的二聚体sace22与修饰相互作用表面的固定化rbd结合时，会导致人为的高(皮摩尔)表观亲和力。野生型sace22结合所有rbd，对sars-cov-2的亲和力为16nm，对lyra11的亲和力为91nm，中位亲和力为60nm(表6)。对sars-cov-1和sars-cov-2的rbd测得的亲和力与已公开的数据相当(wrapp et al.,science,eabb2507,2020；chan et al.,science.4,eabc0870,2020；shang et al.,nature.382,1199,2020；kirchdoerfer et al.,sci rep.8,15701,2018；li et al.,embo j.24,1634
–
1643,2005)。工程sace22.v2.4对所有rbd的亲和力显著增加，对于sars-cov-2的kd为0.4nm，对于分离株rs4231的kd为3.5nm，中位亲和力小于2nm(表6)。工程诱饵的亲和力增加了约35倍，这普遍适用于测试组中的冠状病毒，因此亲和力增强的分子基础必须基于rbd/ace2识别的共同属性。
[0240][0241][0242]
深度突变扫描在全长s情况下的rbd，发现ace2结合位点中的残基具有突变耐受性
[0243]
为了探究sars-cov-2s中可能作为耐药性“储存库”的潜在序列多样性，通过深度突变评估了rbd的突变耐受性(fowler and fields,nat.methods.11,801
–
807,2014)。饱和突变集中于全长s的rbd(氨基酸c336-l517)，所述全长s在细胞外n端用c-myc表位进行标记，用于检测表面表达。在细胞通常获得不超过单个序列变体的条件下，将包含3,640个单个氨基酸取代的刺突文库转染到人expi293f细胞中(heredia et al.,j.immunol.200,ji1800343
–
3839,2018；park et al.,j biol chem.294,4759
–
4774,2019)。将培养物与野生型8his标记的二聚体sace22在亚饱和浓度(2.5nm)下一起培育。结合的sace2
2-8h和表面表达的s用荧光抗体染色，用于流式细胞术分析(图20a)。与表达野生型s的细胞相比，该文库表达不佳，表明许多突变对折叠和表达有害。可以清楚地识别出表达与ace2结合亲和力降低的s变体的细胞群(图20b)。在对表达s的c-myc阳性细胞进行门控后，通过荧光激活细
胞分选(facs)收集具有高水平和低水平结合sace22的细胞，分别称为ace2-high群体和ace2-low群体(图20c)。在分选过程中，表达和sace22结合信号都在几分钟到几小时内下降，这可能是由于s1亚基的脱落。因此，从三个单独的facs实验中收集和汇集细胞，分选时间合计为8小时。
[0244]
对分选细胞的转录本进行illumina测序，并与天然质粒文库进行比较以确定每个氨基酸取代的富集比(fowler et al.,bioinformatics.27,3430
–
3431,2011)。s中表达和紧密结合ace2的突变在ace2-high分选中选择性富集(图21)；表达但ace2结合减少的突变在ace2-low分选中选择性富集；表达不佳的突变从两个分选的群体中耗竭。通过对残基位置处每个可能氨基酸的log2富集比进行平均来计算位置保守性得分。通过加上ace2-high和ace2-low分选的保守性得分，得出了表面表达的分数，这表明疏水性rbd核对于折叠和运输病毒刺突是严格保守的(图22a)。相比之下，在暴露的rbd表面上的残基突变能够进行s表面表达。这通常与蛋白质的突变耐受性相匹配。
[0245]
对于ace2的紧密结合(例如，ace2-high群体中的s变体)，ace2界面处rbd残基的保守性增强，但突变耐受性仍然很高(图22c)。因此，在ace2结合位点表现出高度多样性的天然β冠状病毒中观察到序列多样性，在深度突变扫描中得以复制，这预测sars-cov-2刺突可耐受受体结合位点的大量遗传多样性以发挥作用。从这种可获得的序列多样性中，sars-cov-2可能会发生突变以获得对靶向ace2结合位点的单克隆抗体或工程诱饵受体的抗性。
[0246]
对由酵母表面展示的分离rbd进行深度突变扫描的比较
[0247]
据报道，对酵母表面展示的分离rbd进行了两次深度突变扫描(starr et al.,biorxiv,2020.06.17.157982,2020；linsky et al.,biorxiv,2020.08.03.231340,2020)。本文所述数据选自人细胞中表达的全长s，与可公开获得的starr et al数据集进行了比较。rbd中用于人细胞全长刺突的表面表达的重要残基，与酵母表面展示分离的rbd的数据密切相关(图22b)，但一个显著区域除外。与ace2结合位点(例如v362、y365和c391)相对的rbd表面可以自由突变以进行酵母表面展示，但其序列在本实验中受到限制；rbd的这个区域通过将结构元件连接到封闭构象(这是s亚基的主要构象，并且无法与受体结合)s亚基的全局折叠而被掩埋(walls et al.,cell,2020),doi:10.1016/j.cell.2020.02.058；wrapp et al.,science,eabb2507,2020；cai et al.,science.369,1586,2020；yao et al.,cell 183(3),730-738.e13,2020)。被靶向的突变用于单独测试rbd中所有半胱氨酸的丙氨酸取代(图23)。所有半胱氨酸到丙氨酸的突变都严重降低了expi293f细胞中的s表面表达，包括rbd“背面”上的c391a和c525a，它们在酵母展示扫描中是中性的。这些差异表明，在人细胞膜上表达完整刺突的情况下，对rbd存在更严格的序列限制，但总体而言，这两个数据集非常一致。
[0248]
对于与二聚体sace22结合，在starr et al数据集中，界面残基更加保守(图22d)，原因可能是深度突变实验之间的三个差异。第一，质膜上s变体的ace2结合选择似乎主要反映了突变对表面表达的影响，这在人细胞中几乎可以肯定更为严格。酵母使得许多折叠不良的蛋白质泄漏到细胞表面(rocklin et al.,science.357,168
–
175,2017)。第二，在多种sace2浓度下进行酵母选择，从中计算出表观kd变化；starr et al在这方面的数据非常全面。由于人细胞文库需要较长的分选时间，而只有一小部分细胞表达刺突，因此分选是在单一sace22浓度下进行的，无法准确定量地记录一系列不同的结合亲和力。第三，二聚体
sace22可以在几何上与密集堆积在人细胞膜上的三聚体s互补，从而使亲和力掩盖了亲和力降低突变的影响。尽管如此，人们普遍认为ace2结合通常在rbd表面发生突变后持续存在，这些数据仅表明突变耐受性可能比starr et al已经观察到的更强。
[0249]
筛选优先结合野生型ace2而非工程诱饵的s变体
[0250]
在证明sars-cov-2蛋白s的ace2结合位点可以耐受许多突变之后，研究是否可能发现对工程诱饵sace22.v2.4产生抗性的突变。抗性突变预计会在保持与野生型受体结合的同时失去对sace22.v2.4的亲和力，并且最有可能存在于进行物理接触的rbd中。类似的推理为通过酵母表面展示对分离的rbd进行深度突变选择奠定了基础，从而发现单克隆抗体的逃逸突变，结果预测了假病毒生长选择中的逃逸突变(greaney et al.,biorxiv,2020.09.10.292078,2020)。
[0251]
为了解决是否可能在rbd中发现工程诱饵的逃逸突变，s蛋白文库被重新用于特异性选择。表达该文库(编码rbd中所有可能取代)的细胞，与融合到igg1 fc区的野生型sace22和8his标记的sace22.v2.4在两种蛋白质竞争结合的浓度下共同培育(chan et al.,science.4,eabc0870,2020)。通过对表达s文库的expi293f培养物进行流式细胞术立即明显地看出，存在表达s变体的细胞转向优先结合sace22.v2.4，但没有大量群体优先结合野生型受体(图24a-24b)。对表达可能优先结合sace22(wt)-igg1或sace22.v2.4的s变体的细胞进行门控，并通过facs(图24c)收集，然后对s转录本进行深度测序以确定富集比。两个独立的重复实验非常一致(图24d-24g)。大多数rbd突变在分选后被耗竭，这与对s折叠和表达的有害影响一致。
[0252]
可溶性ace22.v2.4具有野生型ace2的三个突变：掩埋在rbd界面内的t27y，以及在界面外围的l79t和n330y(图25a)。s的rbd中大量突变被选择性富集以优先结合sace22.v2.4(图25b，左上象限)。虽然可以在ace2中紧邻工程突变位点处发现sace22.v2.4特异性突变(具体是与ace2-l79相邻的s-f486突变和与ace2-n330相邻的s-t500突变)，sace22.v2.4特异性突变的主要热点也确定在rbd环498-506，该环接触ace2-α1螺旋与β-发夹基序堆积的区域(图25a)。相比之下，rbd中没有sace22(wt)特异性突变的热点。实际上，只有少数突变被选择性富集以优先结合野生型受体(图25b)，并且这些推定野生型特异性突变的丰度几乎不超过深度突变数据中预期噪声水平。因此，在该竞争测定中，s与野生型sace22的结合对rbd突变比s与工程化sace22.v2.4的结合更敏感。
[0253]
为了确定通过深度突变发现的潜在野生型ace2特异性突变是否是真实的，而不是由于数据噪声导致的错误预测，对通过被靶向的突变在野生型特异性门中选择性富集的24个s突变体进行测试(图25b中的蓝色数据点)。仅观察到向结合野生型sace22的微小移动(图26)。在sace22滴定实验中进一步研究了两个s突变体，n501w和n501y，它们都保持了高受体结合，并在竞争实验中展示出向野生型sace22的小幅移动。s的n501位于498-506环中，它被大芳香族侧链取代可能会改变环构象，从而导致与sace22.v2.4中邻近ace2突变n330y的空间张力。在滴定不同浓度的8his标记的sace22(wt)和sace22.v2.4并通过流式细胞术测量与s表达细胞的结合蛋白后，发现s-n501w和s-n501y确实显示出对野生型sace22的特异性增强，但是效果很弱并且sace22.v2.4仍然是更强的结合物(图25c)；因此，这些突变不会使病毒对工程诱饵产生抗性。
[0254]
二聚体sace22与s蛋白在膜表面紧密结合；在感染测定中，还观察到sace22与真实
sars-cov-2上刺突紧密的相互作用(chan et al.,science.4,eabc0870,2020)。bli动力学测量，其中固定化的sace2
2-igg1与单体rbd相互作用，用于确定观察到的sace22与s表达细胞紧密结合的变化如何转化为单价亲和力的变化。sars-cov-2rbd的n501w和n501y突变体都展示出对野生型ace2和工程ace2.v2.4的亲和力增强，对野生型受体的亲和力增强得更多(表6)。这与流式细胞术数据一致，表明对野生型ace2的特异性发生了小幅变化，但不足以逃逸工程诱饵。相比之下，在sars-cov-2的s中很容易发现多个独立的逃逸突变，它们将单克隆抗体的功效降低了多个数量级(baum et al.,science,eabd0831,2020；greaney et al.,biorxiv,2020.09.10.292078,2020)。
[0255]
最后，克隆了根据深度突变扫描预测的8个s的代表性突变，以增强对sace22.v2.4的特异性(图25b)，并且发现7个突变在竞争测定中大幅转变优先结合sace22.v2.4(图27)。这些s突变是y449k/q/s、l455g/r/y和g504k。为什么突变会增强对工程sace22.v2.4特异性，其依据尚不明确，因为rbd残基y449、l455和g504不与受体的工程位点直接接触。对固定化sace2
2-igg1和作为分析物的单体rbd之间的bli动力学，显示代表性突变体rbd-y449k对野生型和工程sace22的亲和力降低(表6)。然而，sace22.v2.4在皮摩尔范围内亲和力的变化在细胞表面与全长s-y449k的紧密结合过程中被隐藏，而野生型sace22与s-y449k的紧密结合(亲和力通过bli在中等毫摩尔范围内测量)显著降低。这一发现可以解释为什么竞争选择发现了许多将特异性转变到工程sace22.v2.4的突变，因为导致亲和力小幅下降的突变可能对紧密结合所述弱结合野生型受体产生了更大的影响。
[0256]
总体而言，通过被靶向突变的验证证实了，这种选择可以成功地发现s中特异性改变的突变。无法在rbd中找到对野生型受体具有高度特异性的突变，这意味着此类突变很少见，甚至可能不存在，至少在与受体发生直接物理接触的受体结合域内是如此。不能排除在其他地方具有长程构象效应的突变。因此，工程可溶性诱饵受体能够作为病毒无法轻易逃逸的广泛治疗候选药物。
[0257]
讨论
[0258]
可溶性诱饵受体的魅力在于病毒不能轻易变异以逃逸中和作用。降低可溶性诱饵亲和力的突变也可能降低对宿主细胞上野生型受体的亲和力，从而以降低传染性和毒力为代价。然而，这一假设尚未经过严格测试，并且由于工程诱饵受体与其野生型对应物不同，即使仅通过少量突变，病毒也有可能进化以区分两者。在这里证实了，尽管ace2结合位点的序列多样性很高，sars-cov-2的工程诱饵受体以低纳摩尔kd广泛结合使用ace2进入细胞的sars相关β冠状病毒的刺突。在rbd内所有取代的全面筛选中，未发现s中对野生型ace2产生高特异性的突变。因此，所述工程诱饵受体广泛抵抗人畜共患的利用ace2的冠状病毒(未来可能从动物宿主溢出)，以及随着当前covid-19大流行的肆虐而可能出现的sars-cov-2变体。诱饵受体不太可能像单克隆抗体或设计的微型蛋白结合物所需要的那样需要组合在鸡尾酒制剂中，以防止抗性的迅速出现(baum et al.,science,eabd0831,2020；cao et al.,science,eabd9909,2020)。
[0259]
可溶性诱饵受体已在临床上被证明是有效的，尤其是在调节免疫反应方面。依那西普(商品名可溶性tnf受体)、阿柏西普(vegf受体1和2的可溶性嵌合体)和阿巴西普(可溶性ctla-4)只是三个对人类疾病治疗产生深远影响的可溶性受体实例(usmani et al.,plos one.12,e0181748,2017)，但针对病毒病原体的可溶性受体
pharmacokinet 52,783
–
792,2013)。当sace22.v2.4以0.5mg/kg每天两次静脉施用5天(第0、1、2、3和4天)时，未观察到毒性。小鼠在第7天被安乐死，血液化学、血液学和组织病理学表明与模拟处理的小鼠没有差异。
[0263]
为了延长血清半衰期，测试了sace22与igg1 fc的融合。虽然其他小组已经研究了sace22与igg1突变体(iwanaga et al.,biorxiv,in press,doi:10.1101/2020.06.15.152157)或igg4 fc(svilenov et al.,biorxiv,in press,doi:10.1101/2020.12.06.413443)的融合以抑制与促炎性fcγr的相互作用，但本研究使用未修饰的igg1(同种异型ng1m1)招募效应功能，这些功能已在抗sars-cov-2mab中证实为实现最佳保护所必需的(et al.,j exp med.218(2020),doi:10.1084/jem.20201993)。关于sace22与igg1融合，已公开的pk数据参差不齐。虽然有明确的证据表明，鼠sace2
2-igg1融合在小鼠中持续数天(liu et al.,kidney int.94,114
–
125,2018)，但人sace2
2-igg1融合的结果是相互矛盾的。使用elisa检测人igg1部分的两份报告表明sace2
2-igg1的血清半衰期为数天(iwanaga et al.,biorxiv,in press,doi:10.1101/2020.06.15.152157；lei et al.,nat commun.11,2070,2020)，但另一项使用elisa检测ace2部分的研究报告称在数小时内快速清除(higuchi et al.,biorxiv,in press,doi:10.1101/2020.09.16.)。只有一份已发表的报告检测到融合蛋白的两个部分，使用抗ace2捕获抗体和抗igg1检测抗体来测量人融合蛋白在小鼠中的长血清半衰期(liu et al.,int j biol macromol.165,1626
–
1633,2020)。差异的原因尚不清楚，但可能表明融合蛋白切割产生了血清稳定性不同的片段。
[0264]
使用elisa检测人igg1，在雄性小鼠中静脉施用(2.0mg/kg)后，野生型sace2
2-igg1和sace22.v2.4-igg1(seq id no:11)显示血清pk相同，蛋白质存在超过7天(图29)。因此得出结论，高亲和力sace22.v2.4变体中的三个突变(t27y、l79t和n330y)不会显著改变pk，这与之前对另一修饰的sace2衍生物的研究一致(higuchi et al.,biorxiv,in press,doi:10.1101/2020.09.16.299891)。由于材料不足，无法进一步表征血清组分，因此在雄性和雌性小鼠中进行了另一项pk研究，以更彻底地追踪在血清中sace22.v2.4-igg1如何随时间变化。同样，人igg1蛋白在血清中持续存在数天(图30a)，但根据ace2 elisa(图30b)，ace2部分在24小时内迅速清除。对ace2催化活性的测量显示了更快的衰减(图30c)。人igg1的免疫印迹证实融合蛋白在小鼠血液中被水解以释放长期存在的igg1片段(图30d)。总体而言，sace22.v2.4与igg1 fc的融合仅适度增强了血清的稳定性。对小鼠静脉施用sace22.v2.4-igg1(2.0mg/kg)，7天后进行血液化学、血液学和组织病理学分析，未观察到毒性。
[0265]
为了改善静脉施用后所观察到的血清pk，进行了一项研究，以将所述蛋白质直接递送到呼吸道，这是sars-cov-2感染的主要部位。在气管内递送(1.0mg/kg)后，通过ace2 elisa、人igg1 elisa和抗人igg1免疫印迹，发现sace22.v2.4-igg1在肺部高水平持续至少4小时(图31a-31c)。吸收到血液中的sace22.v2.4-igg1水平太低而无法检测。正如静脉施用时所观察到的，野生型sace2
2-igg1和sace22.v2.4-igg1在气管内施用后肺部的pk相同(在实验误差范围内)。进一步研究了通过吸入施用sace22.v2.4-igg1。在这项研究中，将所述蛋白质雾化到容纳有小鼠的小室30分钟。虽然雾化器容纳小室中的剂量低于通过气管内施用所达到的剂量，但仍观察到sace22.v2.4-igg1在4小时内保持较高水平且相对恒定，这
通过ace2 elisa、人igg1elisa和免疫印迹测量(图31d-31f)。直接递送至呼吸道可在超过4小时内，实现了肺组织中的高蛋白质水平，降解程度最低。基于施用途径的不同pk特征(例如，直接递送到肺部的蛋白质存在数小时，但在血浆中未达到可检测的水平，而静脉内递送的蛋白质达到高但短暂的血浆浓度)使以下临床机会成为可能：以不同方式治疗患者(可能取决于疾病的进展程度或感染是否是全身性的)，或使用静脉和气管内或吸入施用途径治疗患者。
[0266]
实施例6
[0267]
这个实施例说明了使用sars-cov-2假病毒实施的实验，以评估修饰的ace2多肽是否能够阻止病毒进入细胞。
[0268]
过表达ace2受体的人a549肺上皮细胞、人a549肺上皮细胞和人肺内皮细胞与vsv-sars-cov-2-萤光素酶-假型病毒和野生型sace2
2-igg1或工程sace22.v2.4-igg1肽在浓度为0、5或25μg/ml的条件下一起培育。每个实验都包含无病毒对照；所有其他样品都含有病毒，moi为0.01。收获细胞并根据萤光素酶报告基因的表达，量化病毒进入的程度(图32)。工程sace22.v.2.4-igg1对于防止sars-cov-2假病毒进入人肺上皮细胞和人内皮细胞的效果卓越。
[0269]
在第二项研究中，k18-hace2转基因小鼠，在上皮细胞中表达人ace2受体，被静脉注射野生型sace2
2-igg1或sace22.v2.4-igg1，并在腹膜内注射vsv-sars-cov-2-荧光素酶假型病毒。在24小时收获肺和肝脏，并通过萤光素酶活性量化病毒进入的程度(图33)。工程sace22.v.2.4-igg1对防止sars-cov-2假型病毒进入表达人ace2小鼠的肺和肝脏的效果卓越。
[0270]
总之，这些结果表明，在组织培养和动物模型中，可溶性ace2的v2.4衍生物更有效地阻止sars-cov-2假病毒进入表达人ace2的细胞。
[0271]
实施例7
[0272]
本实施例描述了一项研究，旨在研究sace22.v2.4-igg1在covid-19小鼠模型中是否对sars-cov-2诱导的肺血管渗漏表现出保护和/或治疗效果。虽然提供了特定方法，但本领域技术人员将认识到使用的方法也可以偏离这些特定方法，包括增加或省略一个或更多个步骤。
[0273]
本研究的记录关于肺血管渗漏和肺水肿形成。以下动物组用于本研究：
[0274]
·
第1组(对照)，4只小鼠(2只雄性和2只雌性，2个月大)。
[0275]
·
第2组(sars-cov-2，5x 104pfu/小鼠，持续7天)，4只小鼠(2只雄性和2只雌性，2个月大)。
[0276]
·
第3组(在sars-cov-2感染前数小时静脉施用(10mg/kg)或气管内施用(2mg/kg)或吸入施用sace22.v2.4-igg1，5x 104pfu/小鼠，持续7天)，4只小鼠(2只雄性和2只雌性，2个月大)。该小组评估暴露前预防。
[0277]
·
第4组(在sars-cov-2感染后静脉施用(10mg/kg)或气管内施用(2mg/kg)或吸入施用sace22.v2.4-igg1，5x 104pfu/小鼠，持续7天)，4小鼠(2只雄性和2只雌性，2个月大)。该小组评估感染后的治疗。
[0278]
通过几种方法之一(例如，静脉、气管内、吸入)向小鼠施用sace22.v2.4-igg1多肽，并通过气道感染sars-cov-2以模拟人肺部感染。
[0279]
预期sace22.v2.4-igg1将减轻sars-cov-2诱导的肺血管渗漏并减缓水肿形成，肺血管渗漏和水肿形成是导致covid-19患者呼吸衰竭和死亡的主要原因。
[0280]
实施例8
[0281]
本实施例描述了一项研究，旨在研究sace22.v2.4-igg1在covid-19小鼠模型中是否对sars-cov-2诱导的肺血管损伤和长期纤维化表现出保护和/或治疗效果。虽然提供了特定方法，但本领域技术人员将认识到使用的方法也可以偏离这些特定方法，包括增加或省略一个或更多个步骤。
[0282]
本研究的记录关于h&e染色、masson三色和天狼星红染色、mpo测定和蛋白质裂解物，以评估信号转移和炎症病理学。以下动物组用于本研究：
[0283]
·
第1组(对照)，4只小鼠(2只雄性和2只雌性，2个月大)。
[0284]
·
第2组(sars-cov-2，5x 104pfu/小鼠，持续7天)，4只小鼠(2只雄性和2只雌性，2个月大)。
[0285]
·
第3组(在sars-cov-2感染前静脉施用(10mg/kg)或气管内施用(2mg/kg)或吸入施用sace22.v2.4-igg1，5x 104pfu/小鼠，持续7天)，4只小鼠(2只雄性和2只雌性，2个月大)。该小组评估暴露前预防。
[0286]
·
第4组(在sars-cov-2感染后静脉施用(10mg/kg)或气管内施用(2mg/kg)或吸入施用sace22.v2.4-igg1，5x 104pfu/小鼠，持续7天)，4小鼠(2只雄性和2只雌性，2个月大)。该小组评估感染后的治疗。
[0287]
预期sace22.v2.4-igg1会降低在此类covid-19小鼠模型中炎症损伤和纤维化。
[0288]
实施例9
[0289]
此实施例描述了一项研究，即研究sace22.v2.4(与igg1 fc融合或未融合)是否阻断高传染性sars-cov-2变体的刺突蛋白。sars-cov-2突变体已经出现，显示出传播能力增强，并且毒性可能增强。截至2021年3月，令人关注的病毒变体是源自南非的b.1.351(tegally et al.,medrxiv,in press,doi:10.1101/2020.12.21.20248640)、源自巴西的p.1和源自英格兰的b.1.1.7(leung et al.,eurosurveillance 26,2021,doi:10.2807/1560-7917.es.2020.26.1.2002106；volz et al.,medrxiv,in press,doi:10.1101/2020.12.30.20249034)。所有三种病毒变体都具有s的n501y突变，将对野生型ace2的单价亲和力提高了20倍(实施例4-表6)。高亲和力v2.4 ace2衍生物也以增强的亲和力结合(实施例4-表6)。本研究测试了二聚体sace2
2-igg1(野生型和v2.4)与p.1、b.1.1.7和b.1.351谱系全长s变体的表观单价亲和力和紧密结合。
[0290]
s蛋白在人expi293f细胞中表达，所述s蛋白带有n端c-myc标签，用于使用荧光抗myc抗体和流式细胞术测量表面表达。将细胞与一系列稀释的sace2-8his和sace2.v2.4-8his(单体：ace2残基19-615)一起培育，洗涤，并使用抗his荧光抗体染色通过流式细胞术来测量结合蛋白。细胞还与一系列稀释的sace2
2-igg1和sace22.v2.4-igg1(二聚体：ace2残基19-732)一起培育，洗涤，并使用抗人igg1荧光抗体通过流式细胞术测量结合蛋白。基于先前描述的深度突变(实施例4)，预期结果将证实高度传染性病毒变体仍然容易与sace2工程v2.4衍生物紧密结合。
[0291]
鉴于可以应用所公开主题原理的许多可能实施方案，应该认识到所示实施方案仅是本公开的优选实施例，并且不应被视为限制本公开的范围。相反，本公开的范围由以上权
利要求限定。因此，我们要求保护属于这些权利要求的范围和精神之内的所有内容。

技术特征：
1.一种修饰的血管紧张素转化酶2(ace2)多肽，包含人ace2或其片段，其中所述多肽相对于seq id no:1的野生型人ace2包含至少一个氨基酸取代，并且相对于野生型人ace2增强了与严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)的s蛋白结合。2.根据权利要求1所述的修饰的多肽，其中所述至少一个氨基酸取代是参照seq id no:1选自由以下组成的组的取代：t27y、l79t、n330y、s19p、e23f、q24t、a25v、k26i、k26a、k26d、t27m、t27l、t27a、t27d、t27k、t27h、t27w、t27f、t27c、l29f、d30i、d30e、k31w、k31y、n33d、h34v、h34a、h34s、h34p、e35v、e35c、l39k、l39r、f40d、f40r、y41r、q42m、q42l、q42i、q42v、q42k、q42c、a65w、w69i、w69v、i69t、i69k、f72y、e75a、e75s、e75t、e75k、e75r、e75w、e75g、q76m、q76i、q76v、q76t、q76r、q76y、l79i、l79v、l79w、l79y、l79f、l79p、m82c、q89i、q89d、q89p、n90m、n90l、n90i、n90v、n90a、n90s、n90t、n90q、n90d、n90e、n90k、n90r、n90h、n90w、n90y、n90f、n90p、n90g、n90c、l91p、t92m、t92l、t92i、t92v、t92a、t92n、t92q、t92d、t92e、t92k、t92r、t92h、t92w、t92y、t92f、t92p、t92g、t92c、t324e、t324p、q325p、n330l、n330h、n330w、n330f、l351f、a386l、a386i、p389d、r393k和r518g。3.根据权利要求1所述的修饰的多肽，其中所述至少一个氨基酸取代是参照seq id no:1选自由以下组成的组的取代：t27y、l79t、n330y、s19p、a25v、t27m、t27l、t27a、t27d、t27h、t27w、t27f、t27c、d30e、k31w、h34v、h34a、h34p、l39k、l39r、q42m、q42l、q42c、w69v、f72y、e75k、e75r、q76v、q76t、l79i、l79v、l79w、l79y、l79f、q89p、n90m、n90l、n90i、n90v、n90a、n90s、n90t、n90q、n90d、n90e、n90k、n90r、n90h、n90p、n90g、n90c、l91p、t92m、t92l、t92i、t92v、t92a、t92n、t92q、t92d、t92e、t92k、t92r、t92h、t92w、t92y、t92f、t92p、t92g、t92c、t324e、t324p、q325p、n330l、n330h、n330w、n330f、l351f和a386l。4.根据权利要求1所述的修饰的多肽，其中所述至少一个氨基酸取代是参照seq id no:1选自由以下组成的组的取代：t27y、l79t、n330y、a25v、t27m、t27l、k31w、h34v、h34a、h34p、q42l、q42c、l79i、l79v、l79w、l79y、l79f、n90a、n90s、n90t、n90q、n90e、n90h、l91p、t92m、t92l、t92i、t92v、t92n、t92q、t92d、t92e、t92r、t92h、t92w、t92y、t92f、t92g、t92c、t324p、q325p、n330h、n330w、n330f和a386l。5.根据权利要求1所述的修饰的多肽，其中所述至少一个氨基酸取代位于seq id no:1人ace2的残基19、23、24、25、26、27、29、30、31、33、34、35、39、40、41、42、65、69、72、75、76、79、82、89、90、91、92、324、325、330、351、386、389、393或518。6.根据权利要求5所述的修饰的多肽，其中所述至少一个氨基酸取代是参照seq id no:1选自由以下组成的组的取代：t27y、l79t、n330y、s19p、a25v、k26d、l29f、n33d、l39r、f40d、w69v、f72y、q76t、q89p、l91p、t324p、t324e、q325p、r518g、l351f、a386l、q24t、t27h、d30e、k31y、h34a、y41r、q42l、q42k、e75k、l79v、n90q、t92q、n330h和r393k。7.根据权利要求1-6中任一项所述的修饰的多肽，其中所述至少一个氨基酸取代去除了seq id no:1的人ace2残基n90、l91和t92处的糖基化基序。8.根据权利要求1-6中任一项所述的修饰的多肽，包含：t27y、l79t和n330y氨基酸取代；h34a、t92q、q325p和a386l氨基酸取代；t27y、l79t、n330y和a386l氨基酸取代；l79t、n330y和a386l氨基酸取代；
t27y、n330y和a386l氨基酸取代；t27y、l79t和a386l氨基酸取代；a25v、t27y、t92q、q325p和a386l氨基酸取代；h34a、l79t、n330y和a386l氨基酸取代；a25v、t92q和a386l氨基酸取代；或者t27y、q42l、l79t、t92q、q325p、n330y和a386l氨基酸取代，其中所述氨基酸取代参照seq id no:1。9.根据权利要求1-6中任一项所述的修饰的多肽，相对于seq id no:1的人ace2具有单个氨基酸取代。10.根据权利要求1-9中任一项所述的修饰的多肽，包含全长人ace2并且相对于野生型人ace2包含至少一个氨基酸取代。11.根据权利要求10所述的修饰的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与seq id no:1至少95％相同。12.根据权利要求10所述的修饰的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与seq id no:1至少99％相同。13.根据权利要求1-9中任一项所述的修饰的多肽，其中所述多肽由人ace2的片段组成。14.根据权利要求13所述的修饰的多肽，其中所述人ace2的片段是细胞外片段。15.根据权利要求14所述的修饰的多肽，其中所述细胞外片段对应于seq id no:1的人ace2的残基19至615。16.根据权利要求14所述的修饰的多肽，其中所述细胞外片段对应于seq id no:1的人ace2残基20至615。17.根据权利要求14-16中任一项所述的修饰的多肽，其中所述细胞外片段的氨基酸序列与seq id no:1的残基19至615至少95％相同。18.根据权利要求14-17中任一项所述的修饰的多肽，其中所述细胞外片段的氨基酸序列与seq id no:1的残基19至615至少99％相同。19.根据权利要求13所述的修饰的多肽，其中所述片段对应于seq id no:1的人ace2的残基1-732、19-732或19-740。20.根据权利要求19所述的修饰的多肽，其中所述片段对应于seq id no:1的人ace2的残基19-732。21.根据权利要求20所述的修饰的多肽，其中所述片段的氨基酸序列由seq id no:10组成。22.根据权利要求1-21中任一项所述的修饰的多肽，其中所述多肽形成二聚体。23.一种融合蛋白，包含权利要求1-22中任一项所述的修饰的多肽和异源多肽。24.根据权利要求23所述的融合蛋白，其中所述异源多肽是fc蛋白。25.根据权利要求24所述的融合蛋白，其中所述fc蛋白是人fc蛋白。26.根据权利要求25所述的融合蛋白，其中所述人fc蛋白是人igg1 fc。27.根据权利要求23-26中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白的氨基酸序列包含seq id no:11或由其组成。
cov)、人冠状病毒oc43(oc43-cov)、人冠状病毒229e(229e-cov)或人冠状病毒nl63(nl63-cov)。45.根据权利要求31-34和38-42中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒是人畜共患冠状病毒。46.根据权利要求45所述的方法，其中所述人畜共患冠状病毒是蝙蝠冠状病毒或啮齿动物冠状病毒。47.根据权利要求46所述的方法，其中所述蝙蝠冠状病毒是lyra11、rs4231、rs7327、rs4084或rsshc014。48.一种试剂盒，包含权利要求1-22中任一项所述修饰的多肽，或权利要求23-28中任一项所述的融合蛋白，所述多肽或融合蛋白与固体支持物结合。

技术总结
本公开描述了修饰的血管紧张素转化酶2(ACE2)多肽。所述修饰的多肽包括至少一个氨基酸取代，其通过直接提高亲和力或改善ACE2的折叠和表达，使所述多肽能够更好地结合使用ACE2作为细胞进入受体的冠状病毒S表面糖蛋白。还描述了所述修饰的ACE2多肽在抑制CoV进入、复制和/或传播，CoV暴露前和暴露后预防以及治疗CoV感染(例如COVID-19)的用途。19)的用途。19)的用途。


技术研发人员：E
受保护的技术使用者：伊利诺伊大学董事会
技术研发日：2021.03.16
技术公布日：2023/8/16