一种提高干细胞治疗能力的制剂的制作方法

1.本发明属于干细胞治疗技术领域，尤其涉及一种提高干细胞治疗能力的制剂。


背景技术：

2.骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，mscs）是一种有多向分化潜能的成体干细胞，最初是从骨髓组织中分离出来的。骨髓间充质干细胞可以分化成多种细胞类型，包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等，因此具有很大的临床应用价值，可用于组织再生和修复、免疫调节等多个领域。此外，骨髓间充质干细胞的来源很广泛，可以从骨髓、脐带、脂肪组织等多种组织中获得，因此具有很好的应用前景。
3.在骨髓间充质干细胞发挥其治疗效果时，其所具有的迁移和归巢能力是其在体内定位到损伤部位并发挥治疗作用的关键因素之一。如果干细胞不能正确地定位到受损组织或器官，它们就无法发挥其治疗效果。因此，提高干细胞的迁移和归巢能力可以增强其在治疗过程中的效果。
4.其次，干细胞治疗的效果还受干细胞的衰老状态和寿命的影响，因此，如何延长干细胞的寿命和减缓干细胞衰老过程，对于干细胞治疗的提高也同样具有重要的意义和潜在的价值。
5.magnolin（木兰脂素）是一种植物提取物，具有抗过敏，抗炎，降压，抑菌的作用。而且，现有研究显示柽柳黄素具有抗肿瘤和调节胃肠功能的作用。然而，经查阅国内外相关文献，并未见到有关magnolin在提高干细胞治疗能力方面的研究报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种通过提高干细胞迁移和降低干细胞衰老速度来提高干细胞治疗能力的制剂。
7.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：第一方面，本发明提供了一种提高干细胞治疗能力的制剂，其特征在于，所述制剂为液体制剂，所述液体制剂中的核心有效成分为木兰脂素。
8.优选地，所述干细胞为骨髓间充质干细胞。
9.优选地，所述制剂提高干细胞迁移和归巢能力并降低干细胞的衰老速度。
10.第二方面，本发明提供了木兰脂素在制备提高干细胞治疗能力的制剂中的应用。
11.优选地，所述木兰脂素通过提高干细胞迁移和归巢能力来提高干细胞治疗能力。
12.优选地，所述木兰脂素通过降低干细胞的衰老速度来提高干细胞治疗能力。
13.其三方面，本发明提供了木兰脂素在制备提高干细胞迁移和归巢能力的制剂中的应用。
14.优选地，所述制剂通过促进sdf-1a和cxcr4的表达来促进骨髓间充质干细胞的迁移和归巢。
15.第四方面，本发明提供了木兰质素在制备降低干细胞衰老的制剂中的应用。
16.本发明的有益效果在于：本发明提供了木兰脂素在提高干细胞治疗能力的新能力，扩招了木兰脂素的应用范围并未提高干细胞治疗能力提供了一种低价的制剂。
17.本发明发现木兰脂素能够通过促进sdf-1a和cxcr4的蛋白表达来提高干细胞的迁移和归巢能力，并能够降低干细胞的衰老速度，从而可以使干细胞在治疗时可以更好并更长时间的发挥治疗效果。
附图说明
18.图1为木兰脂素对骨髓间充质干细胞细胞活性调控的结果图；图2为木兰脂素对于骨髓间充质干细胞中sdf-1a和cxcr4的蛋白表达调控的结果图；图3为木兰脂素对于骨髓间充质干细胞迁移调控的结果图；图4为木兰脂素对于骨髓间充质干细胞归巢调控的结果图；a为检测结果，b为统计结果，***表示p＜0.001；图5为木兰脂素对于骨髓间充质干细胞衰老调控的结果图；a为检测结果，b为统计结果，**表示p＜0.01。
具体实施方式
19.木兰脂素的分子式为c
23h28
o7，cas号为31008-18-1，购自四川维克奇生物科技有限公司，纯度98%，使用dmso进行溶解。
20.实施例1：木兰脂素对于骨髓间充质干细胞的细胞活性的调控：（1）将p4代的骨髓间充质干细胞使用胰酶消化后制成单细胞悬液，按照1
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105的细胞密度接种于96孔板中，随机分为正常对照组和实验组1-5（20μm，40μm, 60μm, 80μm, 100μm），每组设置6个复孔；（2）培养24h后，对照组更换为完全培养基，实验组1-5按照设定添加终浓度20μm，40μm,60μm,80μm,100μm的木兰脂素；（3）继续培养24h后，使用mtt发测定细胞活力。
21.本实施例所得到的结果展示于图1中，可以看出当木兰脂素的浓度小于100μm的情况下，对于骨髓间充质干细胞的活性没有显著的影响，说明木兰脂素在浓度小于100μm的情况下对于骨髓间充质干细胞无毒性。
22.实施例2：木兰脂素对于骨髓间充质干细胞中sdf-1a和cxcr4的蛋白表达的调控，sdf-1a（基质细胞衍生因子1a）/cxcr4（趋化因子受体）在干细胞的迁移和归巢过程中发挥重要的作用，因此，本发明首先检测木兰脂素对于sdf-1a和cxcr4蛋白表达的调控。
23.（1）将p4代的骨髓间充质干细胞使用胰酶消化后制成单细胞悬液并接种于6孔板中，待细胞密度达到80%以上时，对照组更换为新的完全培养基，实验组更换为含有终浓度100μm木兰脂素的完全培养基，每组设置3个重复孔；（2）继续培养24h后，去除培养基，使用冷pbs清洗细胞2次，加入预冷的裂解液（含蛋白酶抑制剂），置于冰上裂解20min后，12000g离心15min；
（3）取少量的上清使用bca试剂盒检测蛋白浓度，向上清中加入4
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loading buffer，放置在水浴锅中100℃水浴5min；（4）安装好电泳槽后，配置12%下层胶10ml，灌胶并使用无水乙醇封胶，凝固后弃去上层液并使用去离子水轻轻冲洗，使用吸水纸吸干；（5）配置5%上层胶6ml，灌胶并插入梳子，凝固后拔出梳子；（6）将凝胶固定在电泳架上，加入电泳缓冲液，加入蛋白样品和蛋白marker，每孔加入30μg；（7）调整电源为恒压80v至蛋白marker分开时，调整电源为恒压120v，待溴酚蓝到达电泳胶底端时停止电泳；（8）将pvdf膜放置在无水甲醇中15s，之后和滤纸一起放置在电转缓冲液中，按照海绵、滤纸、凝胶、pvdf膜、滤纸、海绵的顺序进行摆放，之后锁紧电转夹，放入冰盒，电源调整为恒流300ma，1.5h；（9）电转结束后，将pvdf膜取出并使用tbst溶液漂洗3次，每次10min，之后放置在封闭液中封闭1h；（10）裁取sdf-1a，cxcr4和gapdh的蛋白条带放入到相应的一抗稀释液中，4℃孵育一夜；（11）将膜取出并使用tbst溶液漂洗3次，每次10min，配置二抗稀释液，将条带放入到二抗稀释液中，室温温和震荡孵育1h；（12）将膜取出并使用tbst溶液漂洗3次，每次10min，将pvdf膜正面向上平铺于一平皿内， 加入适量新鲜配制好的化学发光底物，室温避光孵育5min后用bio-rad凝胶成像系统照相记录。
24.本实施例所得到的结果展示于图2中，可以看出使用木兰脂素处理后，细胞中sdf-1a和cxcr4的蛋白表达量上调，说明使用木兰脂素处理能够有效的促进骨髓间充质干细胞中sdf-1a和cxcr4的表达，因此，本发明猜测木兰脂素能够通过促进sdf-1a和cxcr4的表达来促进骨髓间充质干细胞的迁移和归巢。
25.实施例3：木兰脂素对于骨髓间充质干细胞迁移的调控：（1）将p4代的骨髓间充质干细胞使用胰酶消化后制成单细胞悬液并接种于6孔板中；（2）待细胞密度达到90%以上时，去除培养基，使用200μl的黄色枪头在培养孔的垂直方向滑过细胞层；（3）使用pbs漂洗掉脱落下来的细胞，对照组加入完全培养基，实验组加入含有终浓度100μm木兰脂素的完全培养基，显微镜下记录划痕；（4）放入细胞培养箱中培养24h后，再次在显微镜下记录划痕。
26.本实施例所得到的结果展示于图3中，可以看出，使用木兰脂素处理后，细胞迁移的距离明显增大，说明木兰脂素能够促进骨髓间充质干细胞的迁移。
27.实施例4：木兰脂素对于骨髓间充质干细胞归巢的调控：（1）将肝癌细胞hepg2接种于6孔板中，培养48h后收集上清液用于后续实验；（2）将p4代的骨髓间充质干细胞使用胰酶消化后制成单细胞悬液并接种于6孔板中；
（3）待细胞完全贴壁后，一部分加入含有终浓度100μm木兰脂素的完全培养基预处理细胞24h，另一部分添加完全培养基继续培养24h，之后胰酶消化，并使用无血清培养基制成细胞悬液（悬液1：完全培养基培养，悬液2：含木兰脂素的完全培养基培养）；（4）按照如下分组进行处理：对照组：24孔板的孔中加入完全培养基，放入transwell小室，小室中加入200μl细胞悬液1，含细胞:1
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104个；实验组1:24孔板的孔中加入步骤（1）收集的上清液，放入transwell小室，小室中加入200μl细胞悬液1，含细胞1
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104个；实验组2：24孔板的孔中加入步骤（1）收集的上清液，放入transwell小室，小室中加入200μl细胞悬液2，含细胞1
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104个；（5）将24 孔transwell 小室放置到细胞培养箱内孵育12 h，剪切transwell上室底面的聚碳酯膜，去除膜向上一侧未能迁移humscs，pbs 洗涤，重复3 次；（6）加入多聚甲醛固定15 min，添加结晶紫染色，15 min 后用pbs 轻轻冲洗聚碳酯膜，洗去多余的染料，显微镜下(
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200)统计迁移到小室膜向下一侧的数量，随机抽取5 个视野的均数作为迁移的细胞数量的平均数。
28.本实施例得到的结果展示于图4中，可以看出实验组1穿过transwell小室的数量多于对照组，说明肝癌细胞的培养液能够促进骨髓间充质干细胞的归巢；同时，可以看出实验组2穿过transwell小室的细胞数量多于对照组1，说明使用木兰脂素处理骨髓就间充质干细胞后能够提高骨髓干细胞的归巢能力。
29.实施例5：木兰脂素对于骨髓间充质干细胞衰老的调控：（1）将p4代的骨髓间充质干细胞接种于培养皿中，对照组使用完全培养基进行培养，实验组使用含有终浓度40μm木兰脂素的完全培养基培养；（2）当细胞培养至p8代时，将对照组和实验组的细胞接种于6孔培养板中；（3）培养24h后，每孔加入4%多聚甲醛，室温固定15min；（4）去除多聚甲醛后，使用pbs漂洗细胞3次，每次5min；（5）加入lml的β-半乳糖苷酶染色液，使用保鲜膜封住6孔板并放置在37℃孵育过夜；（6）去除β-半乳糖苷酶染色液，加入pbs后置于进行观察和拍照，随机选取5个视野进行计数。
30.本实施例得到的结果展示于图5中，可以看出，使用低浓度的处理骨髓间充质干细胞可以有效的降低细胞衰老速度。

技术特征：
1.一种提高干细胞治疗能力的制剂，其特征在于，所述制剂为液体制剂，所述液体制剂中的核心有效成分为木兰脂素；所述干细胞为骨髓间充质干细胞；所述制剂提高干细胞迁移和归巢能力并且降低干细胞的衰老速度。2.木兰脂素在制备提高干细胞治疗能力的制剂中的应用，其特征在于，所述干细胞为骨髓间充质干细胞；所述木兰脂素通过提高干细胞迁移和归巢能力并且降低干细胞的衰老速度来提高干细胞治疗能力。3.木兰脂素在制备提高干细胞迁移和归巢能力的制剂中的应用，其特征在于，所述制剂通过促进sdf-1a和cxcr4的表达来促进骨髓间充质干细胞的迁移和归巢。

技术总结
本发明提供了一种提高干细胞治疗能力的制剂，属于干细胞治疗技术领域。本发明所提供的提高干细胞治疗能力的制剂的核心有效成分为木兰脂素。木兰脂素通过提高干细胞迁移和归巢能力以及降低干细胞的衰老速度来提高干细胞治疗能力，从而可以使干细胞在治疗时可以更好并更长时间的发挥治疗效果。好并更长时间的发挥治疗效果。好并更长时间的发挥治疗效果。


技术研发人员：王琳娜 吴欣 沈正浩 于亚平
受保护的技术使用者：青岛瑞源细胞生物科技开发有限公司
技术研发日：2023.07.18
技术公布日：2023/8/16