一种天麻种子的保存及活力检测方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种天麻种子的保存及活力检测方法。


背景技术：

2.天麻(gastrodia elata bl)是我国传统名贵中药材，又名赤箭芝、离母、合离，属兰科天麻属多年生异养草本植物，2018年被国家卫生健康委员会列入药食同源物质目录。天麻为兰科植物的干燥块茎，主要活性成分为天麻素，此外还含有对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛和多糖等多种功能性成分，具有平抑肝阳、息风止痉、祛风通络等作用，传统上用于治疗头痛、头晕、癫痫、健忘等症状，同时作为药食同源物质，具有较高的保健食用价值，可用于烹饪多种美食，如天麻炖鸡等著名佳肴。天麻作为一种异养型草本植物，无根无叶、种子细小、无胚乳，只有进行有性繁殖时才能完成开花结果等过程，且有性繁殖时需靠萌发菌促进天麻种子进行萌发，无性繁殖时种子萌发的米麻和白麻需与蜜环菌共生成为箭麻，箭麻再抽薹开花、结果直至种子成熟为天麻的整个生命周期，历时两年半跨越三个年份。
3.天麻的种子细小且简单，有着相对较大的表面积，吸湿性强，种胚所占比例大，更促进呼吸强度，与其他种子相较具有特异性，普通条件下很难保持活力，另外成熟天麻蒴果易开裂，种子易散落，活力不高且难保存。天麻的生命周期长、无性栽培农艺性状易退化、种子难保存、制约着天麻种质资源的保存与创新利用，对于优良天麻品种选育与新品种保护造成了较大影响。因此急需探索与天麻种子特性相适应的保存方法。而现有技术中虽然存在天麻种子的保存方法，但天麻种子的有效保存期仍然较短，如：cn106900506a中公开了0℃～6℃的温度下低温冷藏6个月；又如，本发明人团队前期研究不同处理对天麻种子保存时活力的影响时发现，真空冻干天麻种子后玻璃化包埋处理等方式可以有效保存一年。因此，在天麻种质资源的保护与创新利用中，探索天麻种子的中长期有效保存方法仍是本领域亟待解决的技术问题之一。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种天麻种子的保存方法，该方法保存的天麻种子储藏期可达到2年，天麻种子活力可达37.64％。
5.本发明还提供了一种利用水琼脂培养基检测天麻种子活力的方法，可与天麻种子保存方法相配套，为天麻种质资源保护与创新利用奠定坚实的基础。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一种天麻种子的保存方法，所述保存方法包括：将采摘的天麻蒴果进行真空冻干处理至含水量为1.5～2.5％，真空冻干处理后的天麻蒴果冷藏保存。
8.优选的，所述天麻蒴果为180g～220g天麻箭麻抽薹开花进行人工授粉后成熟的蒴果。
9.优选的，所述天麻蒴果为采摘当天的天麻蒴果。
10.优选的，干燥后的天麻蒴果用干燥吸水纸分装，外层再用脱脂棉包被后置于50ml
离心管中，再向离心管管中加入变色硅胶。
11.优选的，所述冷藏保存温度为3℃～6℃。
12.本发明还提供了一种天麻种子的活力检测方法，所述检测方法包括：将上述方法保存的天麻种子均匀抖落于长有萌发菌的水琼脂培养基的平皿中，20℃～25℃进行暗培养，定时观察天麻种子萌发情况，肉眼区分天麻种子萌发或统计天麻原球茎个数。
13.优选的，所述水琼脂培养基主要成分为水和琼脂，所述水琼脂培养基中琼脂添加量为6g/l～8g/l。
14.优选的，所述萌发菌为石斛小菇。
15.本发明的有益效果：
16.(1)本发明将成熟天麻蒴果采取真空冻干处理至含水量为1.5～2.5％后，保存于3℃～6℃的条件下，种子有效储藏期可达到2年，保存时间相对较长，并且保存2年后的天麻种子活力可达37.64％。
17.(2)本发明所述保存方法使用的保存工具成本低廉且简单，保存管具体积小，贮存所需空间少，便于管理。
18.(3)本发明首次建立了天麻种子保存及其配套活力检测体系，该检测体系可以有效检测天麻种子活力，为天麻种质资源的保护打下了坚实基础。
附图说明
19.图1：天麻种子保存流程图。
20.图2：天麻种子保存过程中变色硅胶变色情况：a、a为保存较好情况；b、b为保存较差情况。
21.图3：真空冻干不同处理时间的天麻种子的含水量变化图。
22.图4：真空冻干后4℃保存两年的红天麻种子在水琼脂培养基上的萌发情况。
23.图5：4℃保存对不同含水量天麻种子的活力影响：a、b、c、d、e分别为含水量5.8％、3.9％、3.0％、2.1％、1.6％真空冻干天麻种子在4℃中保存两年后的ttc染色情况；a、b、c、d、e分别为对应含水量天麻种子拌菌栽培半年后的收获情况。
具体实施方式
24.本发明提供了一种天麻种子的保存方法，所述保存方法包括：将采摘的天麻蒴果进行真空冻干处理至含水量为1.5～2.5％，真空冻干处理后的天麻蒴果冷藏保存。本发明所述含水量优选为1.6～2.1％。本发明所述天麻种子位于天麻蒴果中，通过对天麻蒴果的处理保存实现对天麻种子的有效保存。
25.本发明所述天麻蒴果为180g～220g天麻箭麻抽薹开花进行人工授粉后成熟的蒴果，优选为先选取180g～220g天麻箭麻种植，箭麻抽薹开花进行人工授粉，待天麻蒴果成熟后，选择同一时间内采摘同一批天麻蒴果；更优选的，选取天麻为种源信息明确、无病虫害、无损伤、大小均匀的180g～220g天麻箭麻，用细河沙覆盖进行种植，箭麻抽薹开花进行人工授粉后，待天麻蒴果用手轻轻一捏蒴果开裂成熟后，选择同一时间内采摘同一批天麻蒴果。本发明所述天麻箭麻包括红天麻、黄天麻、绿天麻、乌天麻、松天麻。本发明所述河沙含水量优选为39％～41％，河沙覆盖厚度优选为2.4cm～2.6cm。
26.天麻箭麻重量在180g～220g时，其果实鲜重较高，果实数量也较多，本发明选择180g～220g的天麻箭麻抽薹开花进行人工授粉后成熟的蒴果进行保存相对于使用其他重量的天麻箭麻抽薹开花进行人工授粉后成熟的蒴果而言更经济。更优选的，本发明所述天麻为重量在180g～220g的红天麻。
27.本发明所述天麻蒴果为采摘当天的蒴果。天麻蒴果采摘后，随着放置时间的递增，储存在蒴果中种子的能量会随着呼吸作用释放，种子有机质含量和种子活力也会发生一定的改变，本发明通过选择采摘当天的蒴果进行真空冻干处理、冷藏保存，更有利于长期保存后种子活力的维持。
28.本发明所述真空冻干处理后的天麻蒴果用干燥吸水纸分装，外层再用脱脂棉包被后置于50ml离心管中，再向离心管管中加入变色硅胶。优选的，本发明所述变色硅胶的加入量为离心管的2/10。本发明通过加入变色硅胶，不但可以维持保存环境的干燥，而且可以根据变色硅胶褪色情况来判断保存环境的气密性，从而直观的判断天麻种子是否进行了有效的保存。变色硅胶未变色证明保存效果较好，变色硅胶变色则证明保存效果较差，种子可能已经吸入水分，对于种子之后的活力会有一定影响，可以提前干预以保证种子保存效果(图2)。
29.本发明将含有真空冻干处理的天麻蒴果的离心管进行冷藏保存，所述冷藏保存温度为3℃～5℃。更优选的，所述冷藏保存温度为4℃。
30.本发明所述方法保存的天麻种子有效储藏期可达到2年，保存2年后的天麻种子活力可达37.64％。
31.本发明还提供了一种天麻种子的活力检测方法，所述方法包括：将上述方法保存的天麻种子均匀抖落于长有萌发菌的水琼脂培养基的平皿中，20℃～25℃进行暗培养，定时观察天麻种子萌发情况，肉眼区分天麻种子萌发或统计天麻原球茎个数。优选的，在定时观察天麻种子萌发情况期间，每间隔5天用体视显微镜观察天麻种子萌发情况。本发明所述暗培养的温度更优选为22℃。
32.作为可选的实施方式，本发明将保存中的天麻蒴果于无菌超净工作台中取出，酒精擦拭蒴果表面后快速过火灭菌放于无菌平皿中备用，剪开天麻蒴果荚壳，收集天麻种子并混匀，将天麻种子均匀抖落于长有萌发菌的培养基的平皿中，20℃～25℃进行暗培养。
33.本发明所述水琼脂培养基成分为水和琼脂，琼脂添加量为6g/l～8g/l，优选为7g/l。作为可选的实施方式，本发明将琼脂7g、自来水1000ml混匀，自然ph、121℃灭菌30min，得到水琼脂培养基。
34.本发明所述萌发菌为石斛小菇；所述石斛小菇的培养方法：无菌条件下转接约1平方厘米指甲壳大小的石斛小菇菌种于水琼脂培养基中，25℃暗培养至菌丝生长至整个平皿的2/3，得到长有萌发菌的水琼脂培养基。
35.在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
36.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
37.在本发明具体实施例中，所述天麻种子活力的ttc染色方法为：
38.取适量种子加入1.5ml离心管中的0.25ml刻度处，用移液枪吸入1ml的1％ttc溶液，于30℃温度下黑暗静置48h后，用移液枪吹打将种子混匀，混匀后吸取种子混合液滴于载玻片中央，并用吸水纸吸去染液，置于体视显微镜下，随机挑选3个视野，对种子染色情况进行观察，有活力种子种胚会被染成橙色或者粉红色，无活力种子种胚会不着色或染成黄色，最后分别计数每个视野的种子总数和有活力种子总数，并计算种子活力。种子活力＝(有活力种子总数/统计种子总数)
×
100％。每个样品设3次重复。
39.在本发明具体实施例中，所用真空冻干机型号为：(thermo scientific)heto powerdry ll1500。
40.实施例1
41.材料：红天麻蒴果、红天麻种子均为贵州省农作物品种资源研究所(现代中药材研究所)提供的箭麻生产，其箭麻经鉴定为兰科天麻属植物天麻的原变型红天麻gastrodia elatabl.f.elata。
42.步骤一：箭麻和天麻蒴果及种子的选择
43.选取天麻种源信息明确、无病虫害、无损伤、大小均匀的红天麻箭麻120g，150g，180g，200g，220g，用细河沙进行覆盖，河沙含水量约40％，覆盖厚度2.5cm。待箭麻抽薹开花进行人工授粉后，天麻蒴果用手轻轻一捏果胶开裂成熟时，选择同一时间内采摘同一批天麻蒴果，每种重量的箭麻重复种植约100株，统计不同重量箭麻抽薹的果实鲜重和果实数量。结果见表1。
44.表1不同重量箭麻对于果实鲜重和果实数量的影响
[0045][0046]
由表1可知，红天麻箭麻重量为120g时，其果实鲜重为1.41g，果实数量为70.29个；150g时，其果实鲜重为1.67g，果实数量为79.11个；180g时，其果实鲜重为1.84g，果实数量为85.21个；200g时，其果实鲜重为1.83g，果实数量为84.3个；220g时，其果实鲜重为1.99g，果实数量为88.55个，以上数据说明天麻箭麻重量在180g～220g时，其果实鲜重较高，果实数量也较多；没有选择220g以上的箭麻进行留种是考虑其经济效益较高，比较适合进行市场交易。
[0047]
步骤二：采摘过后天麻蒴果放置时间的选择
[0048]
同一时间内采摘大小、成熟度一致的天麻蒴果，放置室温条件下，选择不同放置时间，放置0天、1天、2天、3天后对其活力进行检测，样本设置3个重复，研究天麻蒴果采摘过后放置时间对于天麻种子的活力影响。采摘过后放置时间保存对于天麻种子的活力(利用ttc法测得其种子活力)影响见表2。
[0049]
表2不同放置天数对天麻种子活力的影响
[0050][0051]
由表2可知，随着时间的递增其活力也在逐渐下降，采摘当天(0d)时其ttc活力为90.22％，1d时其ttc活力为88.25％，2d时其ttc活力为83.84％，3d时其ttc活力为79.17％，随着时间的增加其活力逐渐下降，因此采摘天麻蒴果之后应在其活力较高时也就是采摘当天进行保存较为最佳。
[0052]
步骤三：通过真空冻干对天麻蒴果进行处理
[0053]
采摘当天的天麻蒴果随机分为5组，分装入玻璃平皿中，天麻蒴果刚好遮住平皿面，再将各组天麻蒴果置于真空冻干机中进行真空冻干处理，真空冻干处理时间分别为24h、30h、36h、42h、48h，对真空冻干处理后的天麻蒴果中种子含水量进行测定，每次测定3个样本。真空冻干不同处理时间的天麻蒴果中种子的含水量变化见图3。
[0054]
由图3可知，真空冻干前24h内，天麻种子水分散失较快，含水量下降至5.4％，即可达到超干种子的临界状态(5％含水量)；干燥30h时，天麻种子含水量能到3.9％；干燥36h时，天麻种子含水量能到3.0％；干燥42h时，天麻种子含水量能到2.1％；干燥48h时，天麻种子含水量能到1.6％。
[0055]
步骤四：不同含水量天麻种子4℃保存两年
[0056]
首先每个离心管准备280mg～300mg步骤三中不同冻干时间的天麻蒴果，用干燥吸水纸分装上述不同冻干时间处理的天麻蒴果，外层再用脱脂棉包被后置于离心管中，再加入占离心管2/10的变色硅胶，对照组不放置变色硅胶，紧盖离心管管盖，再置于4℃冰箱保存。
[0057]
步骤五：保存期间注意观察变色硅胶的颜色变化。
[0058]
不同含水量的天麻种子保存两年后，采用ttc染色检测种子活力，结果如表3所示。
[0059]
表3不同组别保存两年后天麻种子的活力
[0060][0061]
注：不同小写字母表示在0.05水平的显著差异。
[0062]
表3结合图3表明天麻种子含水量为1.6％时，4℃保存2年后ttc染色种子活力为37.64％，天麻种子含水量为2.1％时，4℃保存2年后ttc染色种子活力为36.22％，相对于真空冻干处理至含水量为3～5.4％的种子而言，4℃保存2年后种子活力显著提高。
[0063]
实施例2
[0064]
对实施例1中保存的天麻种子采用萌发菌培养基测定活力：
[0065]
(1)pda培养基：马铃薯(去皮)200g、葡萄糖20g、琼脂7g、自来水1000ml、自然ph、
121℃灭菌30min。
[0066]
(2)pda综合培养基：马铃薯(去皮)200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、琼脂7g、v
b1
110mg、自来水1000ml、自然ph、121℃灭菌30min。
[0067]
(3)加富pda培养基：马铃薯(去皮)200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、琼脂7g、蛋白胨g、v
b1
110mg、自来水1000ml、自然ph、121℃灭菌30min。
[0068]
(4)水琼脂培养基：琼脂7g、自来水1000ml、自然ph、121℃灭菌30min。
[0069]
(5)青冈树落叶培养基：将灭过菌青冈树落叶平铺于含有pda综合培养基平皿中；青冈树落叶培养基的使用方法为在无菌条件下，接入萌发菌暗培养至叶片上染菌，然后转入底部铺有湿润海绵灭菌的平皿中培养；培养过程中保持海绵湿润。
[0070]
(6)石斛小菇的培养，无菌条件下转接约1平方厘米指甲壳大小的石斛小菇母种于(1)～(5)培养基中，25℃暗培养至菌丝生长至整个平皿的2/3即可。
[0071]
(7)天麻种子活力检测(萌发菌培养基萌发法)：将实施例1中保存的天麻蒴果于无菌超净工作台中取出，75％酒精擦拭蒴果表面后过火灭菌放于无菌平皿中备用，解剖刀剪开天麻蒴果荚壳，用吸管收集天麻种子并混匀。最后于超净工作台中，无菌条件下取100mg天麻种子均匀抖落于长有萌发菌的各培养基的平皿中。
[0072]
(8)天麻种子的萌发情况统计：室内培养基播种完后，22℃暗培养，间隔5天用体视显微镜观察天麻种子萌发情况，最终肉眼区分天麻种子萌发情况。统计结果见表4～表5：
[0073]
表4保存两年的红天麻冻干种子在不同类型培养基上的萌发时间(单位：d)
[0074][0075][0076]
表5保存两年的红天麻冻干种子在不同类型培养基上种子萌发数(单位：粒)
[0077][0078]
其中含石斛小菇的水琼脂培养基对含水量为1.6％的红天麻种子的萌发促进作用最好(图4)，种子萌发时间较早，30天就已萌发，萌发数最多能达234粒(表4)，水琼脂培养基含水量为2.1％的红天麻种子的萌发促进作用次之。表明真空冻干的4℃保存两年的红天麻种子在石斛小菇的促进萌发下，含水量在1.6％的时候红天麻种子在水琼脂培养基上的萌发促进作用最好。从培养基的准备复杂程度、萌发时效来看，水琼脂的培养基更适宜天麻种子的室内萌发。
[0079]
实施例3
[0080]
对实施例1中保存的天麻种子进行拌菌栽培验证天麻种子的活力：
[0081]
取真空冻干的不同含水量的4℃保存两年的红天麻种子取100mg与掰成核桃大小的萌发菌(石斛小菇)菌块拌匀，然后装入塑料袋(注意透气)，20℃恒温放至菌块转白，再与蜜环菌伴栽于花盆中，采用细河沙填充，覆盖厚度为3cm。室温伴栽，半年后测白麻、米麻的产量，验证天麻种子的活力。
[0082]
拌菌栽培半年后，如图5所示，真空冻干的低含水量1.6％时天麻种子产的白麻、米麻较多。
[0083]
总结：
[0084]
本发明中天麻箭麻重量在180g～220g时，其果实鲜重较重，果实数量也较多；同时采摘蒴果后过后放置0d也就是在当天内其活力较高，比较适合当天进行真空冻干；
[0085]
本发明人之前的研究表示：4℃保存一年后，虽然真空冻干天麻种子活力显著性高于新鲜天麻种子的4℃与室温保存处理，但不同含水量的真空冻干天麻种子间种子活力没有显著性差异(不同处理对天麻种子保存时活力的影响[j].中药材，2018,41(10):2261-2265.)。该研究中的数据计算一年间种子活力的保存率为34～37％，按照该规律进一步的推导，保存两年后种子活力应在11.5～14％。但是本发明进一步研究发现，采取真空冻干处理至含水量为1.5～2.5％，4℃保存两年后，种子活力可达36～38％，这样的种子活力是远超理论推导的。
[0086]
进一步的，种子含水量在1.6～2.1％时，在水琼脂培养基上萌发数均值个数也较多，同时拌菌栽培后，其产量也较多，这说明降低天麻种子的含水量对于长时间储存中的天麻种子活力的保持是很重要的。
[0087]
总之，在本发明保存天麻种子时其箭麻应选择180g～220g为最佳，同时采收的种
子应当天在其活力最高时候进行保存，之后应及时进行真空冻干处理至含水量为1.5～2.5％，同时保存时通过添加介质变色硅胶对天麻种子保存过程的效果进行鉴定，在对保存天麻种子完毕之后进行活力检测时直接通过在水琼脂培养基上萌发查看其数均值验证其活力，以上说明真空干燥保存方法保存天麻种子是一种有效的中长期保存手段。
[0088]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种天麻种子的保存方法，其特征在于，所述保存方法包括：将采摘的天麻蒴果进行真空冻干处理至含水量为1.5～2.5％，真空冻干处理后的天麻蒴果冷藏保存。2.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述天麻蒴果为180g～220g天麻箭麻抽薹开花进行人工授粉后成熟的蒴果。3.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述天麻蒴果为采摘当天的天麻蒴果。4.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于，干燥后的天麻蒴果用干燥吸水纸分装，外层再用脱脂棉包被后置于50ml离心管中，再向离心管管中加入变色硅胶。5.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述冷藏保存温度为3℃～6℃。6.一种天麻种子的活力检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：将权利要求1～5任意一项所述方法保存的天麻种子均匀抖落于长有萌发菌的水琼脂培养基的平皿中，20℃～25℃进行暗培养，定时观察天麻种子萌发情况，肉眼区分天麻种子萌发或统计天麻原球茎个数。7.根据权利要求6所述的天麻种子的活力检测方法，其特征在于，所述水琼脂培养基主要成分为水和琼脂，所述水琼脂培养基中琼脂添加量为6g/l～8g/l。8.根据权利要求6所述的天麻种子的活力检测方法，其特征在于，所述萌发菌为石斛小菇。

技术总结
本发明提供了一种天麻种子的保存及活力检测方法，属于生物技术领域。本发明将采摘当天的天麻蒴果进行真空冻干处理至含水量为1.5～2.5％，再将干燥后的天麻蒴果冷藏保存；该方法保存的天麻种子有效储藏期可达到2年。本发明还提供了一种利用水琼脂培养基检测天麻种子活力的方法，可与天麻种子保存方法相配套，为天麻种质资源保护与创新利用奠定坚实的基础。础。础。


技术研发人员：黄晓润 黄万兵 卢颖颖 朱国胜 刘倾城 龚光禄 桂阳
受保护的技术使用者：贵州省农作物品种资源研究所
技术研发日：2023.07.05
技术公布日：2023/8/16