一种烟草耐低钾相关的基因及应用的制作方法

1.本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一种烟草耐低钾相关的基因及应用。


背景技术：

2.烟草属于嗜钾植物，在低钾条件下，只要在土壤上施加钾肥，烟草生长就会得到改善，提高烟叶产量；如果施钾量超过最高需求值，依然会提高烟叶的产量，不会对烟草生长造成严重的影响，从某种意义上来说，烟草可能是唯一一种不用担心钾奢侈的作物，所以，钾素对于烟草来说的确算得上是名副其实的品质元素。钾含量高，会增加烟叶长度，使烟叶颜色向深桔黄色发展且落黄一致，有利于改善烟叶外观，且可以改善烟叶内在品质，可以降低烟叶中烟碱和焦油含量同时，增施钾肥可以促进烟叶的成熟，有效促进烟叶中有机物的转化，提高干物质重，形成合适的糖碱比。
3.植物生长发育过程中所需要的矿质元素和水分是通过根部吸收实现的，植株钾积累量的高低大多取决于根系，植株根系是对缺钾最敏感的器官。然而，由于土壤中可供植物直接利用的有效钾含量有限，因此，在自然环境中大多数植物常遭受低钾胁迫。但植物本身已经进化出复杂的信号和生理调节网络，以适应缺钾环境。低钾信号会刺激植物通过一系列调控机制来应对低钾胁迫。总结前人的研究发现，钾离子通道基因主要在转录后水平受到调控，调控的方式主要分为两大类，第一类是定位于细胞质膜上的离子通道，通过从胞外吸收k
+
到胞内；第二类是定位在液泡膜上的离子通道，通道将积累在液泡内k
+
排出到细胞质中，以维持k
+
在植物细胞内的动态平衡。
4.为了解决烟草低钾胁迫相关问题，提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明目的通过以下技术方案实现。
6.本发明第一方面提供了一种烟草耐低钾相关的ntab0102170基因，所述ntab0102170基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.优选地，将所述的ntab0102170基因的核苷酸序列进行翻译后，所得氨基酸序列如seq id no.2所示。
8.本发明第二方面提供了第一方面所述烟草耐低钾相关的ntab0102170基因的应用，该基因表达量降低后，烟草植株耐低钾胁迫的能力增加。
9.优选地，所述低钾是指钾离子浓度为10μmol
·
l-1k+
。
10.优选地，基因编辑是通过crispr/cas9介导的基因编辑技术，构建了用于敲除ntab0102170基因的crispr/cas9编辑载体，经遗传转化后获得了ntab0102170基因发生编辑的烟草植株。
11.本发明第三方面提供了第一方面所述烟草耐低钾相关的ntab0102170基因的应用，基因发生编辑的烟草植株烤后烟叶多酚含量低于基因未发生编辑植株烤后烟叶。
12.本发明第四方面提供了第一方面所述烟草耐低钾相关的ntab0102170基因的应
用，基因编辑烟草植株在现蕾开花期的株高、主侧脉角度显著低于对照植株。
13.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
14.1、本发明获得的烟草种质具有较好的烟草耐低钾胁迫的能力。
15.2、本发明的烟草烤后烟叶多酚含量显著低于对照，可以有效降低烟气有害物质释放量，进而降低卷烟危害。
16.3、本发明的ntab0102170基因具有一因多效性，编辑的烟草植株在现蕾开花期的株高、主侧脉角度显著低于对照烟草植株，
附图说明
17.图1为基因编辑烟草(t1)与普通烟草(ck)在正常栽培的生长状态；
18.图2为基因编辑烟草(t1)与普通烟草(ck)在低钾处理下的生长状态。
19.图3为未编辑烟草植株对照样(左)与基因编辑烟草植株(右)在现蕾开花期的株高数据统计图。
20.图4为未编辑烟草植株对照样(左)与基因编辑烟草植株(右)在现蕾开花期的主侧脉角度数据统计图。
具体实施方式
21.下面结合具体实施例对本发明进行说明，但本发明的实施方式不限于此。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件以及手册中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明,均可从商业途径得到。
22.实施例1
23.本实施例主要就烟草耐低钾相关的基因ntab0102170的获得过程，简要介绍如下。
24.以栽培种烟草红花大金元根为实验材料，利用rna提取试剂盒提取烟草根部总rna，反转录为cdna备用：
25.按照植物rna提取试剂盒说明书提取烟草总rna。
26.1μg从叶片中提取总rna用于反转录，转录体系如下：
27.totalrna1μg
28.oligo(dt)(10μm)1.5μl
29.ddh2oupto15μl
30.将上述体系混匀后置于pcr中，70℃保温5min，去除后立即置于冰上5min，之后向体系中加入以下试剂：
[0031][0032]
上述体系放入pcr仪中，42℃下65min，65℃下10min，4℃保温，之后置于-20℃冰箱中保存使用。
[0033]
通过同源比对的方法，参考拟南芥基因的序列及已知烟草部分基因序列，设计扩增引物序列如下：
[0034]
f：5
’‑
gactctcttatgtcgccggg-3’；(seq id no.3)
[0035]
r：5
’‑
aggtggggaatggagcaatg-3’；(seq id no.4)
[0036]
以上述所制备cdna为模板，利用上述引物进行pcr扩增：
[0037]
扩增体系(50μl)：
[0038][0039][0040]
混匀离心后进行pcr扩增，pcr反应条件为：95℃10sec，52℃30sec，72℃2min，共30个循环；72℃10min；25℃hold。
[0041]
对扩增产物进行提纯后测序，获得烟草耐低钾相关的基因ntab0102170序列，其碱基序列如seq id no.1所示，cds序列如seq id no.2。对该基因序列进行翻译后，其所编码蛋白序列如seq id no.3所示，进一步对比分析表明，该蛋白含有同源性很高的序列，高度保守。
[0042]
实施例2
[0043]
利用实施例1中所获得烟草耐低钾相关的基因ntab0102170，本发明进一步构建了crispr/cas9载体，以及利用叶盘法转化获得基因编辑植株。
[0044]
选择ntab0102170基因中较特异的23nt核苷酸序列ccgcttcggttattaccgttttt(seq id no.5)为crispr/cas9的引导序列，并将该序列片段与crispr/cas9载体(由西南大学提供)进行连接、转化和pcr扩增检测，pcr阳性克隆送测序公司进行测序确认，最后得到crispr/cas9-ntab0102170编辑载体。
[0045]
利用上一步所构建的crispr/cas9-ntab0102170编辑载体质粒，以红花大金元为例，进行遗传转化和组培，以获得烟草耐低钾相关的基因ntab0102170发生敲除编辑的植株，相关实验过程简要介绍如下。
[0046]
将烟草种子表面消毒后点种至ms培养基上，待长到4片子叶(15-20d)，移入含ms固体培养基的培养瓶中，于25
±
1℃、光照强度30-50μmol/(m2
·
s)，光照时间为16h/d条件继续培养35-40d，备用。
[0047]
取出-80℃保存的lba4404电转化感受态农杆菌细胞，置于冰上冻融。待感受态刚刚解冻时，加入crispr/cas9-ntab0102170编辑载体质粒的2μl，混匀，置于冰上。后将混匀的感受态转移至预冷的电转杯中，将电转杯置于电转仪中进行转化，转化完成后加入1ml的yeb液体培养基与转化液进行混合，后置于摇床28℃，200rpm培养1.5-2h。8000rpm离心菌体弃掉上清培养基，然后用200μl的yeb液体培养基悬浮菌体，涂于含50mg/l利福平、50mg/l链
霉素和50mg/l卡那霉素的yeb固体培养基上28℃倒置黑暗培养2-3d。
[0048]
在超净工作台中制作烟草叶盘成边长为1cm的方形叶盘，用ms液体制备含有crispr/cas9-ntab0102170编辑载体的农杆菌菌落成悬浮菌液(od600＝0.6-0.8)。利用悬浮农杆菌菌液浸泡侵染烟草叶盘10min。之后将叶盘置于含2.0mg/lnaa+0.5mg/l 6-ba的ms固体培养基上，28℃，黑暗，共培养3d。之后进行继代培养，放置于含2.0mg/l naa+0.5mg/l 6-ba+250mg/l cb+50mg/l kan的ms固体培养基上，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2
·
s)，25℃黑暗培养8h/d，培养45-60d，直至分化芽形成，每7-10d更换一次分化培养培养基，更换3-4次；培养至分化芽形成；将已有分化芽形成的愈伤组织切下，置于含有500mg/l羧苄青霉素与50mg/l卡那霉素的ms培养基上进行培养，待愈伤组织上分化芽培养长至2-4cm高，培养条件与分化培养条件一致，培养8-14d；再生植株生根培养，将分化芽切下，插入含有500mg/l羧苄青霉素与50mg/l卡那霉素的ms培养基上进行生根培养，培养条件与分化培养条件一致，培养20-30d，再生移栽至花盆后进行培养，后进行转化植株叶片取样，送华大基因进行分子检测，确定获得ntab0102170基因编辑植株，之后进行收种获得t0代编辑植株种子。t0代种子按23倍进行自交纯合扩繁，待植株长到5-6片叶时，单株的叶片取样，送华大基因进行分子检测，确定获得ntab0102170基因发生纯合编辑的植株，之后进行收种获得ntab0102170基因纯合编辑的t1代种子。
[0049]
本发明所述的烟草耐低钾相关的基因ntab0102170的应用为在烟草植株体内降低所述ntab0102170基因的表达，可提高烟草植株耐低钾胁迫的能力。现有技术领域内常用的降低基因表达或者基因沉默的方法均适用于本发明。
[0050]
实施例3
[0051]
1、试验过程
[0052]
采用漂浮育苗的方法，对实施例2得到的t1代基因编辑烟草和普通烟草红花大金元进行培养。
[0053]
每个材料选取约50粒颗粒饱满色泽均匀的种子作为供试材料，均匀播撒于18*12*15cm的小白盘中，保持土壤湿度为70-80％，于26℃、16h(光)/8h(暗)人工气候培养室中培养15天。前15天进行正常栽培，观察正常生长状况下基因编辑烟草与普通烟草红花大金元的生长状态。正常培育时，培养基中的钾元素含量为20mm。
[0054]
选取生长状况一致的植株转移至霍尔格兰营养液缓苗4天，选取生长状况一致的植株转移到低钾处理液中生长所述低钾培养液中包含10μmol
·
l-1k+
(低钾处理)，每次处理使用低钾培养液的体积是6000毫升，每隔3d更换一次。处理15天后观察低钾胁迫下的基因编辑烟草与普通烟草的生长状态，并对处理后的植株地上部叶片测定钾含量。所述低钾培养液为1/30低钾ms培养基，将低钾ms培养基稀释30倍得到。
[0055]
2、结果
[0056]
(1)生长状态：如图1所示，正常栽培下的基因编辑烟草与红花大金元植株无的生长状态无显著差异，表明本发明所述烟草耐低钾胁迫基因ntab0102170在正常环境下对烟草表型无明显作用。受到低钾胁迫处理的2个基因编辑烟草株系，其长势明显优于红花大金元植株，这表明，本发明所述烟草耐低钾胁迫基因ntab0102170在低钾环境下能够显著提高植物长势，减少逆境对植物生长的影响。
[0057]
(2)烟叶k
+
含量的测定
[0058]
(a)k
+
含量测定标准曲线的制作
[0059]
准确称取烘干的分析纯kcl粉末(国药)0.9534g加入蒸馏水少量，溶解后，使用容量瓶定容至500ml，即得到1000ppm的母液i，吸取50ml母液i，定容至500ml，即得到100ppm的母液ii，表1为利用母液配置不同浓度的k
+
标准溶液的配比情况。
[0060]
采用火焰分光光度计(6400a)对配置好的k
+
标准溶液进行测定，获得对应的吸收值，对应k
+
标准溶液的浓度，绘制k
+
测定标准曲线。
[0061]
表1.k
+
溶液配置方法
[0062][0063]
(b)烟叶k
+
含量测定
[0064]
将称量干重后的材料磨碎成粉末，取冠部干粉末0.01g，加入8ml 0.5m hcl，20℃，150rpm浸提30min，然后过滤定容至浸提体积即为待测液。使用0.5m hcl配制好k+的标准溶液，用火焰分光光度计(6400a)测定离子含量。钾含量计算公式：
[0065]k+
(mmol g-1dw)＝((a/m)*v*稀释倍数*0.001)/ma：由读数根据标准曲线计算的浓度；m：k
+
的相对分子质量；v：读数体积；m：样品干重。
[0066]
基因编辑烟草株系和红花大金元植株的钾含量测定结果如表2所示，在低钾胁迫条件下，基因编辑植株t1的地上部k
+
含量较ck红花大金元提高1.63％。
[0067]
表2.不同材料k
+
含量
[0068][0069]
实施例4
[0070]
利用实施例2中分子检测确定为ntab0102170基因纯合敲除的植株，进行收种获得基因纯合编辑素材。随后进行ntab0102170基因纯合敲除素材与对照素材烤后烟叶中的多酚含量比较。
[0071]
对照样未编辑烟草植株及ntab0102170基因纯合编辑烟草植株的多酚含量的比较结果如表3所示。
[0072]
表3
[0073][0074]
由表3可以看出，ntab0102170基因编辑烟草植株与对照植株相比新绿原酸、莨菪苷、绿原酸、隐绿原酸显著降低57.34％、52.93％、45.01％、56.09％，总多酚含量降低了47.77％，由此可知，本发明所述基因编辑植株可以有效降低烟气有害物质释放量，进而降低卷烟危害。
[0075]
实施例5
[0076]
利用实施例2中分子检测确定为ntab0102170基因纯合敲除的植株，进行收种获得基因纯合编辑素材。随后在ntab0102170基因纯合敲除素材的现蕾开花期进行农艺性状调查，具体包括烟草株高、主侧脉角度的记录。
[0077]
选择现蕾开花期的烟株，记录60株对照样未编辑烟草植株样本的株高、主侧脉角度。选择现蕾开花期的烟株，记录60株ntab0102170基因纯合编辑的烟草植株样本的株高、主侧脉角度。
[0078]
对照样未编辑烟草植株及ntab0102170基因纯合编辑烟草植株株高、主侧脉角度的记录分析结果如图3、4所示。
[0079]
图3为未编辑烟草植株对照样(左)与基因编辑烟草植株(右)在现蕾开花期的株高数据统计图，图4为未编辑烟草植株对照样(左)与基因编辑烟草植株(右)在现蕾开花期的主侧脉角度数据统计图。由图3、4可以看出，ntab0102170基因编辑烟草植株的株高、主侧脉角度均小于对照样的未编辑烟草植株。
[0080]
seq id no.1
[0081][0082]
seq id no.2
[0083][0084]
seq id no.3
[0085]
gactctctta tgtcgccggg 20
[0086]
seq id no.4
[0087]
aggtggggaa tggagcaatg 20
[0088]
seq id no.5
[0089]
ccgcttcggt tattaccgtt ttt 23

技术特征：
1.一种烟草耐低钾相关的ntab0102170基因，其特征在于，所述ntab0102170基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，将所述的ntab0102170基因核苷酸序列进行翻译后，所得氨基酸序列如seq id no.2所示。3.根据权利要求1-2任一所述烟草耐低钾相关的ntab0102170基因的应用，其特征在于，该基因表达量降低后，烟草植株对耐低钾胁迫能力增加。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述低钾是指钾离子浓度为10μmol
·
l-1
k
+
。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，基因编辑是通过crispr/cas9介导的基因编辑技术，构建了用于敲除ntab0102170基因的crispr/cas9编辑载体，经遗传转化后获得了ntab0102170基因发生编辑的烟草植株。6.根据权利要求1-2任一所述烟草耐低钾相关的ntab0102170基因的应用，其特征在于，基因发生编辑的烟草植株烤后烟叶中多酚含量低于基因未发生编辑的烟草植株烤后烟叶。7.根据权利要求1-2任一所述烟草耐低钾相关的ntab0102170基因的应用，其特征在于，基因编辑烟草植株在现蕾开花期的株高、主侧脉角度显著低于对照植株。

技术总结
本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一种烟草耐低钾相关的基因及应用，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明获得的烟草种质具有较好的耐低钾胁迫能力，而且本发明所述的烟草烤后烟叶中多酚含量显著低于对照，可以有效降低烟气有害物质释放量，进而降低卷烟危害。进而降低卷烟危害。进而降低卷烟危害。


技术研发人员：邓乐乐 杨叶昆 杨文武 李雪梅 高茜 米其利 向海英 曾婉俐 张建铎 许力 蒋佳芮 许永
受保护的技术使用者：云南中烟工业有限责任公司
技术研发日：2023.06.29
技术公布日：2023/8/16