一种线粒体功能化胶原支架及其制备方法和应用

1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种线粒体功能化胶原支架及其制备方法和应用。


背景技术：

2.脊髓损伤是一种十分严重的中枢神经系统疾病，因脊髓损伤而导致截瘫的患者逐年增加。目前针对脊髓损伤来说，组织工程治疗的方法被广泛的应用。组织工程治疗的主旨是使组织更好的再生从而恢复受损组织原有的功能。在组织再生过程中，血管生成是基础，血管的重建为组织细胞提供牵引作用与能量供给。与此同时，减少损伤组织细胞的死亡也是治疗的关键，存活的细胞可以帮助组织重建。但脊髓损伤区的不利微环境，为血管重建与组织细胞存活增加了难度。
3.在众多的治疗方式中，线粒体治疗是目前的热点之一。研究发现在生物体内的细胞之间，线粒体可以在细胞之间传递，由治疗细胞传递至受损细胞进行治疗。组织细胞受损时，ca
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大量进入细胞并进入线粒体缓存，ca
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的大量涌入会诱发凋亡基因引起细胞凋亡。细胞间线粒体的转移可以缓释受损细胞内的大量ca
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，抑制细胞凋亡的发生，同时线粒体的转移会增加受损细胞的代谢水平，促进细胞增殖加快组织修复的进程。而目前利用线粒体治疗的方式主要是静脉注射，利用血液循环将线粒体带至损伤部位进行修复。但很多组织都是处于体液的生存环境中，例如脊髓是处于脑脊液环境且损伤后需要长时间的恢复治疗，将线粒体利用静脉注射的方式引入生物体内进行治疗会导致在体液的大量冲刷下难以实现在损伤区的长时间驻留和发挥作用，大量线粒体会在运输过程中发生损耗导致最终治疗效果不理想。
4.目前需要一种更加高效且具有保护性的线粒体引入方式来发挥其治疗的功能。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种线粒体功能化胶原支架及其制备方法和应用。本发明所述线粒体功能化胶原支架既可以抑制损伤细胞的凋亡，又能促进组织新生血管生成，在脊髓损伤修复中具有重要的应用价值。
6.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
7.第一方面，本发明提供一种线粒体功能化胶原支架，所述线粒体功能化胶原支架包括通过dpc功能多肽连接的线粒体与胶原支架材料；
8.所述胶原支架材料与dpc功能多肽上的胶原特异性结合肽段tkktlrt相连接；
9.所述线粒体与dpc功能多肽上的酯基端通过物理插入的方式相连接。
10.优选地，所述胶原支架包括线性有序胶原支架、胶原水凝胶、静电纺丝胶原纤维、胶原海绵或胶原管中任意一种，优选为线性有序胶原支架。
11.优选地，所述线粒体包括人脐静脉内皮细胞来源的线粒体、人源间充质干细胞来源的线粒体、人心肌细胞来源的线粒体或人星形胶质细胞来源的线粒体中任意一种；优选
为人脐静脉内皮细胞来源的线粒体。
12.本发明中，所述dpc可以在不损伤线粒体膜电位与膜蛋白功能的前提下，将线粒体与胶原支架成功连接；所述人脐静脉内皮细胞来源的线粒体可以促进内皮细胞的增殖；所述人脐静脉内皮细胞来源的线粒体可以在脊髓损伤区抑制受损细胞的凋亡；所述人脐静脉内皮细胞来源的线粒体可以促进脊髓损伤区成血管；最终整个线粒体功能化胶原支架体系既可以抑制损伤细胞的凋亡，又能促进组织新生血管生成。
13.第二方面，本发明提供一种第一方面所述的线粒体功能化胶原支架的制备方法，所述方法包括：
14.将dpc功能多肽与胶原支架材料共孵育，得到修饰后的胶原支架，再将线粒体与修饰后的胶原支架共孵育，得到线粒体功能化胶原支架。
15.优选地，所述修饰后的胶原支架具体采用如下方式得到：采用溶剂溶解dpc功能多肽，再加入胶原支架材料共孵育10-12h(例如可以是10h、11h或12h等)，所述孵育的温度为0-4℃(例如可以是0℃、2℃或4℃等)。
16.优选地，所述溶剂选自dmso，所述dpc功能多肽的终浓度为3-5mg/ml(例如可以是3mg/ml、4mg/ml或5mg/ml等)，每80-120μl(例如可以是80μl、100μl或120μl等)溶液中添加3-4mg(例如可以是3mg、3.5mg或4mg等)胶原支架材料。
17.优选地，所述线粒体与修饰后的胶原支架共孵育1-2h(例如可以是1h或2h等)，所述孵育的温度为0-4℃(例如可以是0℃、2℃或4℃等)。
18.优选地，线粒体与修饰后的胶原支架孵育时的质量比(200-1000μg):(3-4mg)，其中，200-1000μg例如可以是200μg、500μg、800μg或1000μg等，3-4mg例如可以是3mg、3.5mg或4mg等。
19.优选地，所述dpc功能多肽采用包括如下步骤的方法制备得到：将dspe-peg-mal与胶原特异性结合肽段tkktlrt-c混合反应，在反应结束后透析，进行冻干后获得dpc。
20.优选地，所述dspe-peg-mal与胶原特异性结合肽段tkktlrt-c的摩尔比为1:(2.5-3.5)，例如可以是1:2.5、1:3或1:3.5等。
21.优选地，所述dspe-peg-mal的分子量为2500-3500da(例如可以是2500da、2700da、2900da、3000da、3100da、3300da或3500da等)，优选为2900-3000da。
22.优选地，所述混合反应的ph值为6.5-7.5(例如可以是6.5、7或7.5等)，所述混合反应的时间为60-72h(例如可以是60h、62h、65h、68h、70h或72h等)。
23.第三方面，本发明提供一种修复脊髓损伤的功能产品，所述功能产品包括第一方面所述的线粒体功能化胶原支架。
24.优选地，所述功能产品还包括辅料。
25.第四方面，本发明提供第一方面所述的线粒体功能化胶原支架在制备修复脊髓损伤的药物中的应用。
26.优选地，所述药物抑制脊髓损伤区受损细胞的凋亡。
27.优选地，所述药物促进脊髓损伤区新生血管生成。
28.优选地，所述药物促进脊髓损伤区内皮细胞的增殖。
29.优选地，所述线粒体功能化胶原支架作为单一活性成分或与其他药学上可接受的活性成分构成组合物以制备所述药物。
30.第五方面，本发明提供第一方面所述的线粒体功能化胶原支架在制备抑制脊髓损伤区受损细胞的凋亡的药物中的应用。
31.第六方面，本发明提供第一方面所述的线粒体功能化胶原支架在制备促进脊髓损伤区新生血管生成的药物中的应用。
32.第七方面，本发明提供第一方面所述的线粒体功能化胶原支架在制备促进脊髓损伤区内皮细胞的增殖的药物中的应用。
33.第八方面，本发明提供第一方面所述的线粒体功能化胶原支架在修复脊髓损伤中的应用，包括：将所述的线粒体功能化胶原支架移植到全横断大鼠脊髓损伤处。
34.本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
35.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
36.本发明提供的线粒体功能化胶原支架体系能够将线粒体连接至胶原支架材料上，通过dpc的桥接作用，在不损伤线粒体功能的前提下减少线粒体在损伤部位的流失。在大鼠的脊髓损伤应用时，能够为内源性血管内皮细胞提供有利微环境，更有利的诱导内源血管内皮细胞的成血管化，促进大鼠脊髓组织的恢复。
附图说明
37.图1a是dspe-peg-tkktlrt功能肽的合成表征质谱图；
38.图1b是dspe-peg-tkktlrt功能肽的合成表征高效液相色谱图；
39.图2是线粒体通过dpc与胶原支架连接的表征；
40.图3a是线粒体功能化胶原支架促进神经干细胞迁移的分析图；
41.图3b是线粒体功能化胶原支架促进神经干细胞分化为神经元细胞的分析图；
42.图4是线粒体功能化胶原支架减少脊髓损伤区细胞凋亡数量的分析图；
43.图5a是脊髓损伤区神经干细胞与神经元数量进行统计(nestin)；
44.图5b是脊髓损伤区神经干细胞与神经元数量进行统计(tuj-1)。
45.发明详述
46.发明人经长期研究和大量实践，得出本发明的主要技术方案，其主要是提供一种线粒体功能化胶原支架用于脊髓损伤修复。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
47.细胞间的线粒体由供体细胞向受损细胞转移已被证实是细胞内部治疗的一种有效方式。线粒体作为真核细胞的共有细胞器具有良好的生物相容性，同时可以为受损细胞提供有效的能量补给，帮助损伤细胞抵抗不利环境，还可以促进细胞增殖。因此本发明利用线粒体针对脊髓损伤区的受损细胞进行治疗。
48.本发明实施例的一个方面提供的一种线粒体功能化胶原支架，其包括人脐静脉内皮细胞来源线粒体，以及胶原支架材料。
49.在一些优选实施例中，所述线粒体来源包括人脐静脉内皮细胞(如下可简称为“huvec”)，但不限于此，还可以是人源间充质干细胞。
50.在一些优选实施例中，所述胶原支架材料为线性有序胶原支架(如下可简称为“locs”)，但不限于此，还可以是其他多种胶原基支架。
51.本发明实施例的另一个方面还提供了前述线粒体功能化胶原支架的制备方法，其包括：将dpc功能多肽与胶原支架材料共混并在0-4℃环境下放置过夜，然后将dpc功能多肽连接后的胶原支架冻干，最后将线粒体与修饰后的胶原支架
52.进一步地，所述线粒体与胶原支架材料的结合是通过dpc先与支架孵育，再利用dpc的酯基端通过物理插入的方式插入到线粒体膜中，将线粒体结合在胶原支架上。
53.进一步地，所述胶原支架材料裁剪至4mm，然后将其与2-4mg的dpc在dmso中0-4℃孵育过夜，并在第二天冻干获得dpc修饰后的胶原支架。
54.进一步地，将200-1000μg的线粒体与修饰dpc的胶原支架在0-4℃孵育1-2h，得到多功能胶原支架。
55.在本发明一个实施方式中，线粒体从人脐静脉内皮细胞系中获取，利用赛默飞世尔线粒体分离试剂盒将线粒体从人脐静脉内皮细胞中分离。收集线粒体后，通过jc-1线粒体膜电位试剂盒对线粒体功能进行鉴定。
56.本发明实施例的另一个方面还提供了前述多功能胶原支架于制备产品中的应用，所述产品至少具有抑制脊髓损伤后组织细胞凋亡和促进新生微血管生成的功能。
57.本发明实施例的另一个方面还提供了一种修复脊髓损伤的功能产品，其包含前述多功能胶原支架。
58.本发明实施例的另一个方面还提供了一种功能肽，其可以连接线粒体和胶原支架。
具体实施方式
59.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
60.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
61.实施例1线粒体的分离与表征
62.利用人脐静脉内皮细胞系获得足够数量的细胞。
63.利用赛默飞世尔线粒体分离试剂盒对人脐静脉内皮细胞的线粒体进行提取。首先收集贴壁人脐静脉内皮细胞，然后加入裂解液裂解细胞，5min后加入终止液终止裂解，然后700g 4℃离心5min，取上清12000g 4℃离心10min，沉淀即为线粒体。收集线粒体后，通过jc-1线粒体膜电位检测试剂盒对线粒体进行功能鉴定。
64.实施例2dspe-peg-tkktlrt功能肽的制备与表征
65.利用dspe-peg-mal与tkktlrt-c在ph值在7.0的环境中按1：1的配比反应24h，在反应结束后透析24h并进行冻干，获得dspe-peg-tkktlrt(dpc)功能肽。
66.冻干完成的dspe-peg-tkktlrt功能肽利用质谱仪和高效液相色谱仪进行合成表征，表征结果如图1a和图1b所示，图1a为质谱图，质谱图说明tkktlrt的成功合成，图1b为高效液相色谱图，最大峰面积占所有峰面积的95％，说明合成的dpc纯度达到95％。
67.实施例3线粒体与胶原支架结合与表征
68.将2-4mg的dpc与胶原支架材料在dmso溶液中4℃共孵育过夜。将共孵育后的胶原支架冻干2h。利用获取的200-1000μg的线粒体与修饰后的胶原支架在4℃的条件下共孵育2h，获得线粒体功能化胶原支架。采用共聚焦显微镜表征，线粒体的结合。结果如图2所示，图中，绿色部分是fitc标记的胶原支架，红色为mitotracker red标记的线粒体。对照组为直接将线粒体与胶原支架材料共孵育，实验组为线粒体通过dpc与胶原支架材料共孵育，结果表明，通过dpc的加入，线粒体连接到胶原支架材料上的数量显著增加。
69.实施例4多功能胶原支架用于大鼠脊髓全横断损伤修复
70.取60只健康成年雌性sd大鼠(sprague-dawley)，体重180-200g，购入后饲养一周后进行手术，术前24h禁食禁水。以戊巴比妥钠腹腔注射，待大鼠全身肌肉松弛，四肢无力时即表示麻醉成功。大鼠俯卧位固定，用碘伏擦拭皮肤，取合适位置刮除多余毛发。在t7-t9段上方用手术刀划开皮肤，剥离脊柱两侧肌肉，并打开锥板，暴露脊髓，在t8段进行脊髓横断。以胶原海绵按压止血后，将各处理组移植入横断区，缝合针依次缝合肌肉与皮肤，同时以空白胶原支架作为对照。
71.实验结果如图3a合图3b所示，从图3a的结果说明线粒体功能化胶原支架可以促进神经干细胞的募集。图3b说明线粒体功能化胶原支架可以促进更多的早期神经元存活。
72.实施例5多功能胶原支架在大鼠脊髓全横断损伤修复中抑制细胞凋亡
73.使用一步法tunel凋亡检测试剂盒(beyotime；china)检测损伤细胞的严重程。tunel染色液与细胞共孵育1h。用共聚焦显微镜观察染色结果。凋亡细胞的细胞核dna呈tunel片段(绿色)。
74.实验结果如图4所示，与对照组相比，多功能胶原支架组显著的减少了tunel阳性细胞数量，说明多功能胶原支架可以在大鼠脊髓全横断损伤种抑制受损细胞凋亡，为后期的组织再生提供基础。
75.测试例1
76.本实施例对比了实施例3中制备得到的线粒体功能化胶原支架与对照组样品在脊髓损伤修复中的效果。
77.实验组：实施例3中制备得到的线粒体功能化胶原支架(mfcs)；
78.对照组1：实施例1中分离得到的线粒体；
79.对照组2：实施例1中裁剪后的胶原支架材料。
80.具体实验步骤如下所示：
81.(1)如实施例1所述，利用赛默飞世尔线粒体分离试剂盒提取huvec的线粒体。
82.(2)如实施例3所述，构建线粒体功能化胶原支架。
83.(3)如实施例4所述，构建大鼠全横断脊髓损伤模型，并分别将单独提取的线粒体、胶原支架和线粒体功能化胶原支架引入到全横断损伤区。
84.(4)在7天后对不同组脊髓损伤区神经干细胞与神经元数量进行统计。
85.实验结果如图5a和图5b所示，nestin和tuj-1分别标记了了神经干细胞与早期神经元，与胶原支架组和线粒体组相比线粒体功能化胶原支架组nestin和tuj-1的阳性荧光强度更高，这表明线粒体功能化胶原支架在早期显著的促进了神经干细胞的募集与神经元的存活，为脊髓损伤修复提供了良好的细胞基础。
86.上述实施例及其检测结果表明本发明所述线粒体功能化胶原支架能成功应用于
脊髓损伤。将多功能胶原支架植入后，通过短期的动物实验发现，线粒体的引入促进脊髓损伤后，损伤部位细胞凋亡数量减少。同时也发现多功能胶原支架组在短期实验中可以促进新生微血管的生成。
87.综合分析以上结果，可以看到，本发明提供的多功能胶原支架能够将外源线粒体通过dpc结合在胶原支架上，减少线粒体的损耗。在大鼠的脊髓损伤应用时，能够更有利的诱导内源神经干细胞向损伤区迁移和分化，促进大鼠行为功能的恢复。
88.应当理解，上述实施例仅为说明本技术的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本技术的内容并据以实施，并不能以此限制本技术的保护范围，例如，前述人脐静脉内皮细胞来源线粒体亦可替代为其它线粒体活性强的细胞提取的线粒体。凡根据本技术精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.一种线粒体功能化胶原支架，其特征在于，所述线粒体功能化胶原支架包括通过dpc功能多肽连接的线粒体与胶原支架材料；所述胶原支架材料与dpc功能多肽上的胶原特异性结合肽段tkktlrt相连接；所述线粒体与dpc功能多肽上的酯基端通过物理插入的方式相连接。2.根据权利要求1所述的线粒体功能化胶原支架，其特征在于，所述胶原支架材料包括线性有序胶原支架、胶原水凝胶、静电纺丝胶原纤维、胶原海绵或胶原管中任意一种，优选为线性有序胶原支架；优选地，所述线粒体包括人脐静脉内皮细胞来源的线粒体、人源间充质干细胞来源的线粒体、人心肌细胞来源的线粒体或人星形胶质细胞来源的线粒体中任意一种；优选为人脐静脉内皮细胞来源的线粒体。3.一种权利要求1或2所述的线粒体功能化胶原支架的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将dpc功能多肽与胶原支架材料共孵育，得到修饰后的胶原支架，再将线粒体与修饰后的胶原支架共孵育，得到线粒体功能化胶原支架。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述修饰后的胶原支架具体采用如下方式得到：采用溶剂溶解dpc功能多肽，再加入胶原支架材料共孵育10-12h，所述孵育的温度为0-4℃；优选地，所述溶剂选自dmso，所述dpc功能多肽的终浓度为3-5mg/ml，每80-120μl溶液中添加3-4mg胶原支架材料；优选地，所述线粒体与修饰后的胶原支架共孵育1-2h，所述孵育的温度为0-4℃；优选地，线粒体与修饰后的胶原支架孵育时的质量比(200-1000μg):(3-4mg)；优选地，所述dpc功能多肽采用包括如下步骤的方法制备得到：将dspe-peg-mal与胶原特异性结合肽段tkktlrt-c混合反应，在反应结束后透析，进行冻干后获得dpc；优选地，所述dspe-peg-mal与胶原特异性结合肽段tkktlrt-c的摩尔比为1:(2.5-3.5)；优选地，所述dspe-peg-mal的分子量为2500-3500da，优选为2900-3000da；优选地，所述混合反应的ph值为6.5-7.5，所述混合反应的时间为60-72h。5.一种修复脊髓损伤的功能产品，其特征在于，所述功能产品包括权利要求1或2所述的线粒体功能化胶原支架；优选地，所述功能产品还包括辅料。6.权利要求1或2所述的线粒体功能化胶原支架在制备修复脊髓损伤的药物中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物抑制脊髓损伤区受损细胞的凋亡；优选地，所述药物促进脊髓损伤区新生血管生成；优选地，所述药物促进脊髓损伤区内皮细胞的增殖；优选地，所述线粒体功能化胶原支架作为单一活性成分或与其他药学上可接受的活性成分构成组合物以制备所述药物。8.权利要求1或2所述的线粒体功能化胶原支架在制备抑制脊髓损伤区受损细胞的凋亡的药物中的应用。
9.权利要求1或2所述的线粒体功能化胶原支架在制备促进脊髓损伤区新生血管生成的药物中的应用。10.权利要求1或2所述的线粒体功能化胶原支架在制备促进脊髓损伤区内皮细胞的增殖的药物中的应用。

技术总结
本发明提供了一种线粒体功能化胶原支架及其制备方法和应用，所述线粒体功能化胶原支架包括通过DPC功能多肽连接的线粒体与胶原支架；所述胶原支架与DPC功能多肽上的胶原特异性结合肽段TKKTLRT相连接；所述线粒体与DPC功能多肽上的酯基端通过物理插入的方式相连接。本发明所述线粒体功能化胶原支架既可以抑制损伤细胞的凋亡，又能促进组织新生血管生成，在脊髓损伤修复中具有重要的应用价值。在脊髓损伤修复中具有重要的应用价值。在脊髓损伤修复中具有重要的应用价值。


技术研发人员：陈艳艳 郭嘉运 戴建武
受保护的技术使用者：中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
技术研发日：2023.03.31
技术公布日：2023/8/14