使用源自芽孢杆菌的酶组生物转化的功能性黑豆粉的生物转化工艺开发及其应用的制作方法

1.本公开涉及制备具有增强的功能性和营养特性的黑豆(black soybean)生物转化粉末的方法，更具体地来讲，涉及通过用源自bacillus polyfermenticus菌株的酶溶液进行处理来制备具有增强的各种生理功能的黑豆生物转化粉末的方法。


背景技术：

2.大豆含有对身体有益的蛋白质、脂肪和各种功能性组分，是营养上优异且在饮食中重要和必需的理想食物。此外，近年来，随着新近为人所知的生理功能(如抗癌特性和免疫增强)，大豆作为功能性食品的营养价值正在逐步提高。然而，尽管大豆作为蛋白质和脂肪的营养来源发挥着重要作用，但致密的组织使得消化和吸收非常困难。此外，由于特殊的气味、不易消化的碳水化合物以及生理抑制剂(如胰蛋白酶抑制剂)，加工不当情况下可能发生消化和吸收相关问题，引起副作用(如腹泻)。
3.豆乳是大豆的主要加工食品之一，是具有提高的大豆蛋白利用率的代表性大豆加工产品，因其富含大豆蛋白、必需氨基酸和必需脂肪酸，并且含有大量矿物质(如铁、磷和钾)以及作为功能性组分的生理活性物质(如异黄酮、皂苷和植酸)，从而作为功能性营养饮品为人所知。最近，通过阐明食品成分的生物调节功能，已积极进行研究以强化食品功能性以及开发食源性功能物料。
4.在豆乳的情况下，通过用蛋白水解酶处理豆乳，降解大豆蛋白，进行了通过产生肽来改善功能性的研究，所述肽具有促进消化和吸收的营养功能以及诸如增强血压、促进钙吸收、抗过敏和降低血清胆固醇等的生理活性。然而，对于适合通过大豆蛋白的酶水解加工的功能性调节生物物料的开发以及相关物料的工业化阶段的研究仍然不足。
5.此外，发酵豆乳是以大豆为原料，利用食品中可用的微生物经历发酵而制备的。并且当以其原状仅食用大豆时，只有约30％被吸收，而剩下的70％被排泄；而当大豆经发酵，大豆中超过90％的营养可以被吸收到体内，提供了营养吸收方面的优势。其中，发酵豆乳不仅包含大豆的营养，还包含微生物产生的酶(如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和溶栓酶)，以及通过这些酶的分解产生的各种生理活性物质，如肽、氨基酸、低聚糖、脂肪酸、活性异黄酮、植物甾醇、卵磷脂和皂苷等。然而，豆乳仍在以下方面存在问题：豆腥味(其为特殊的特有气味)，以及归因于粗糙的质地的不愉快的口感，由于发酵使豆乳丧失独特味道而在味道方面不满足消费者的偏好，以及因热处理而使产品凝结或有奇怪的味道。
6.[现有技术文献]
[0007]
[专利文献]
[0008]
韩国专利申请公开第10-2011-0027247号(于2011年3月16日公布)。


技术实现要素：

技术目标
[0009]
为了解决上述问题，本公开的目的在于提供制备具有增强的功能性的生物转化粉末的方法，以及通过使用其中混合有源自bacillus polyfermenticus菌株的各种降解酶和肽合成酶的发酵液处理全豆乳，从而确定形成低分子量的氨基酸、肽和各种功能性组分，提供使用bacillus polyfermenticus菌株的发酵液制备生物转化粉末的方法。技术方案
[0010]
本公开提供了制备生物转化粉末的方法，所述方法包括：(1)将通过浸入水中而被浸泡的大豆粉碎；(2)对粉碎的大豆进行热处理以获得全豆乳；以及(3)用bacillus polyfermenticus kmu01(登录号：kctc 11751bp)菌株、其培养物、其发酵产物或其混合物处理全豆乳。
[0011]
此外，本公开提供了健康功能性食品组合物，所述健康功能性食品组合物包含通过制备生物转化粉末的方法制备的生物转化粉末作为活性成分。有益效果
[0012]
根据本公开，通过使用其中混合有源自bacillus polyfermenticus菌株的各种降解酶和肽合成酶的发酵液来处理全豆乳，以确定形成低分子量的氨基酸、肽和各种功能组分，可以提供使用bacillus polyfermenticus菌株的发酵液制备生物转化粉末的方法。
附图说明
[0013]
图1示出了bacillus polyfermenticus kmu01菌株的遗传图谱和酶组的基因。
[0014]
图2示出了确定全豆乳和生物转化粉末的大豆蛋白降解和大豆肽产生的程度的结果。
[0015]
图3为评价全豆乳和生物转化粉末的抗氧化活性的结果。
具体实施方式
[0016]
考虑到本文中的功能，本文中使用的术语已尽可能地从当前广泛使用的通用术语中选择，但这些术语可根据本领域技术人员的意图或先例、新技术的出现等而变化。此外，在特定情况下，存在由申请人任意选择的术语，并且在这种情况下，本公开的说明书中将详细描述其含义。因此，本文中使用的术语不应被定义为术语的简单名称，而是应基于术语的含义和本公开的整体内容。
[0017]
除非另有定义，否则本文中使用的所有术语(包括技术术语或科学术语)具有与本公开所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。术语(如在常用词典中定义的那些术语)应被解释为具有与相关领域的背景下的含义相一致的含义，并且除非在本技术中明确定义，否则不应被解释为理想化的或过于正式的含义。
[0018]
数值范围包括上述范围内定义的数值。本文给出的所有最大数值限值包括所有较低的数值限值，如对较低的数值限值所清楚说明的。本文给出的所有最小数值限值包括所有较高的数值限值，如对较高的数值限值所清楚说明的。本文给出的所有数值限值将包括处于较宽数值范围内的所有更好的数值范围，如对更窄的数值限值所清楚说明的。
[0019]
在下文中，将更详细地描述本公开。
[0020]
因此，作为力图开发制备具有增强的功能特性和营养特性的生物转化粉末的方法的结果，本发明人通过使用酶组来优化全豆乳的酶促水解条件，并研究全豆乳水解产物的
功能性以开发出具有增强的功能特性和营养特性的生物转化粉末以及允许以粉末形式应用的差异化制备方法，从而完成了本公开，所述酶组中混合有从发酵食品中分离的gras发酵食品来源的微生物所分泌和产生的各种蛋白水解酶和肽合成酶。
[0021]
生物转化是指利用微生物或微生物产生的酶的生物反应转化现有物料(底物)的技术，具体而言，生物转化是指使用酶组对大豆或黑豆(底物)进行转化，所述酶组是其中包含由bacillus polyfermenticus kmu01(登录号：kctc 11751bp)菌株产生的各种酶的培养上清液，并且通过上述生物转化获得的产物被称为生物转化粉末。
[0022]
本公开提供了制备生物转化粉末的方法，所述方法包括：(1)将通过浸入水中而被浸泡的大豆粉碎；(2)对粉碎的大豆进行热处理以获得全豆乳；以及(3)用bacillus polyfermenticus kmu01(登录号：kctc 11751bp)菌株、其培养物、其发酵产物或其混合物处理全豆乳。
[0023]
bacillus polyfermenticus kmu01(登录号：kctc 11751bp)菌株于2010年8月25日在韩国典型培养物保藏中心(kctc)以解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)kimchi的名称注册，但后于2018年6月27日更名为bacillus polyfermenticus kmu01，因为其确切种名被鉴定为bacillus polyfermenticus。
[0024]
豆乳可以包括通过常规方法获得的所有豆乳，并且可以使用商业化市场上的豆乳。例如，可以使用通过研磨经蒸制的大豆得到的液体，所述大豆通过将去皮的大豆或脱脂大豆浸入水中而膨胀；并且可以使用通过从所述液体中除去渣滓得到的液体；但不限于此。此外，可以使用其中溶解有全大豆粉或脱脂大豆粉的溶液；根据jas标准，可以使用大豆固形物含量为8.0％以上的豆乳；大豆固形物含量6.0％以上的豆乳可以用于调制豆乳；或者大豆固形物含量4.0％以上的豆乳可以用作豆乳饮品，但在大豆固形物含量方面不受限制。
[0025]
可以按3％(v/v)至7％(v/v)、优选5％(v/v)的浓度用bacillus polyfermenticus kmu01(登录号：kctc 11751bp)菌株、其培养物、其发酵产物或其混合物处理全豆乳。
[0026]
bacillus polyfermenticus kmu01(登录号：kctc 11751bp)菌株、其培养物、其发酵产物或其混合物可在35℃至40℃下处理3小时至5小时，优选在37℃下处理4小时。
[0027]
培养物可以是通过培养bacillus polyfermenticus kmu01(登录号：kctc 11751bp)菌株获得的人工培养基，并且发酵产物可为使用bacillus polyfermenticus kmu01(登录号：kctc 11751bp)菌株发酵的天然培养基。
[0028]
人工培养基可为能够培养bacillus polyfermenticus和细菌的商业制备的合成培养基，例如胰蛋白酶大豆肉汤(tbs)、胰蛋白酶大豆肉汤(tsb)、营养肉汤(nb)和luria-bertani肉汤(lb)，但不限于此。
[0029]
天然培养基指可以由细菌发酵的天然产物，并且可为使用天然产物(如土豆、番茄和奶)的培养基，但不限于此。
[0030]
培养物和发酵产物可表现出蛋白酶、γ-谷氨酰转移酶(ggt)和纳豆激酶的活性。
[0031]
蛋白酶是用蛋白水解酶水解构成蛋白质的氨基酸之间的肽键的酶，其中一些包括切割蛋白质的氨基末端(氨肽酶)或羧基末端(羧肽酶)的外肽酶，以及切割蛋白质中间的内肽酶(例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶)。γ-谷氨酰转移酶(ggt)是将γ-谷氨酰化合物中的谷氨酰基团转移到合适的受体(胺)的酶，并且是一种转酰酶。纳豆激酶是在发酵大豆时由纳豆芽孢杆菌(bacillus natto)通过摄入大豆的营养在生
长过程中产生的溶栓酶，包括维生素b复合物和大量抗氧化酶。
[0032]
生物转化粉末可表现出抗氧化活性。
[0033]
此外，本公开提供了保健功能性食品组合物，所述保健功能性食品组合物包含通过制备生物转化粉末的方法制备的生物转化粉末作为活性成分。
[0034]
本公开通常可用作常用食品产品。
[0035]
本公开的食品组合物可用作保健功能性食品。本文所使用的术语“保健功能性食品”是指根据韩国保健性功能食品法，以具有对人体有用的功能性的原料或成分制造和加工而成的食品，并且本文所使用的术语“功能性”是指获得健康保健(例如人体结构和功能的生理作用或营养物质的调节)的有效性的摄入。
[0036]
本公开的食品组合物可以包含常见的食品添加剂，并且除另有规定外，作为“食品添加剂”的适用性根据韩国食品和药品安全部批准的韩国食品添加剂法典的通用规则和通用试验方法，由与相应项目有关的规范和标准进行确定。
[0037]“韩国食品添加剂法典”中所列的项目可包括例如：化学合成的化合物，如酮类、甘氨酸、柠檬酸钾、烟酸和肉桂酸；天然添加剂，如柿子色素、甘草提取物、结晶纤维素、高梁色素和瓜尔胶；以及混合制剂，如l-谷氨酸钠制剂、面条添加的碱剂、防腐剂和焦油着色剂。
[0038]
本公开的食品组合物可以以片剂、胶囊、粉剂、颗粒、液体剂和丸剂的形式制造和加工。
[0039]
例如，胶囊形式的保健功能性食品中的硬胶囊制剂可以通过将根据本公开的组合物与添加剂(如赋形剂)一起混合并填充在传统的硬胶囊中来制备，而软胶囊制剂可以通过将根据本公开的组合物与添加剂(如赋形剂)混合，然后将其填充在胶囊基质(例如明胶)中来制造。如有必要，软胶囊制剂可包含增塑剂(如甘油或山梨醇)、着色剂和防腐剂。
[0040]
对赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、增味剂和调味剂的术语的定义在本领域已知的文献中有所描述，并且包括具有相同或相似功能的那些。食品的类型没有特别限制，并包括普通意义上的所有保健功能性食品。实施例
[0041]
在下文中，将详细描述示例性实施方式，以帮助理解本公开。然而，以下示例性实施方式仅为对本公开的内容的说明，并且本公开的范围不限于以下实施例。提供本公开的示例性实施方式以向本领域普通技术人员更完整地解释本公开。
[0042][0043]
实施例1.源自发酵食品微生物的酶的各种活性的评价
[0044]
为了制备功能性发酵全豆乳，对发酵菌株bacillus polyfermenticus kmu01(登录号：kctc 11751bp)菌株的各种酶活性进行了评价。
[0045]
首先，评价蛋白酶、γ-谷氨酰转移酶(ggt)和纳豆激酶(纳豆激酶)的活性。将发酵菌株接种在50ml胰蛋白酶大豆肉汤(tsb)培养基中，并在37℃下培养24小时，并收集培养物上清液并以8000rpm离心20分钟。将经离心的培养物的上清液用于评价每种酶的活性。
[0046]
对于蛋白酶的活性，将0.1ml 0.5％偶氮酪蛋白溶液和0.1ml辅酶溶液作为底物加入到eppendorf管中，在37℃下在恒温水浴中进行反应1小时，然后加入0.4ml 10％三氯乙酸溶液以停止反应。将反应溶液以13,000rpm离心5分钟以收集上清液，然后通过向0.6ml上清液加入0.6ml 0.525n naoh溶液来中和上清液，在420nm处测量吸光度，并将在反应条件
下1分钟释放1μg酪氨酸的酶的量设为1单位来评价蛋白酶的活性。
[0047]
对于γ-谷氨酰转移酶(ggt)的活性，将0.01ml辅酶溶液和含有0.1mmγ-l-谷氨酰基对硝基苯胺(p-na-glu，sigma-aldrich)的0.09ml 50mm磷酸盐缓冲溶液(ph 7.0)混合，在40℃下进行反应30分钟，然后加入0.01ml 3.5n乙酸以停止反应。在410nm处测量游离的对硝基苯胺的量。使用对硝基苯胺为标准溶液，通过绘制标准曲线计算酶活性。对于ggt的1单位的酶活性，通过计算每分钟使1摩尔对硝基苯胺从p-na-glu中释放的酶的量，来评价ggt的酶活性程度。
[0048]
对于纳豆激酶的活性，将350μl 50mm硼酸缓冲液(ph 8.5)、100μl 1％纤维蛋白原溶液和25μl 10单位凝血酶溶液混合，在37℃下进行反应10分钟，然后加入25μl辅酶溶液，随后在37℃下进行反应1小时。向反应溶液中加入500μl 0.2m tca溶液以停止反应，然后将混合物在37℃下静置10分钟。在通过以8,000rpm将反应溶液离心20分钟来收集上清液之后，在275nm处测量所收集的上清液的吸光度，并且根据以下计算公式计算酶活性以评价溶栓活性的程度。
[0049][0050]
溶栓活性程度(fu/ml)＝a1-a0/0.01
×
1/60
×
1/0.025
×d[0051]
a1：样品的吸光度值
[0052]
a0：未添加辅酶溶液制备的空白试验样品的吸光度值(空白)
[0053]
0.01：吸光度每分钟增加0.01的酶的活性
[0054]
60：酶反应时间(min)
[0055]
0.025：酶用量
[0056]
d：样品的稀释率
[0057]
如下表1所示，发现蛋白酶活性为78u/ml，ggt活性为3500mu/ml，且指示溶栓活性的纳豆激酶活性为24u/ml。
[0058]
表1
[0059]
此外，使用pacbio_20k测序仪和smrt 2.3.0(hgap2)assembler对bacillus polyfermenticus kmu01(登录号：kctc 11751bp)菌株的基因组进行分析，以鉴别各种功能酶的基因。结果如图1所示，确定了bacillus polyfermenticus kmu01(登录号：kctc 11751bp)菌株具有61个肽酶基因、23个蛋白酶基因、8个葡糖苷酶基因、6个脂肪酶基因、2个γ-谷氨酰转肽酶(ggt)基因、2个纤维素酶基因、淀粉酶基因和纳豆激酶基因。
[0060][0061]
实施例2.利用发酵菌株制备功能性生物转化粉末
[0062]
将以下用作对全豆乳进行生物转化的酶溶液：通过在37℃下在胰蛋白酶大豆肉汤(tsb)培养基中培养bacillus polyfermenticus kmu01(登录号：kctc 11751bp)菌株24小时而获得的上清液。为了制备全豆乳，将产自益山的cv.socheongja洗涤并浸入水中14小时，然后去除水，随后在去除水的同时使用研磨机进行研磨。将经研磨的样品在100℃下煮
沸30分钟，然后获得全豆乳。将获得的全豆乳用5％(v/v)的比率的酶溶液处理，在37℃下进行反应4小时进行生物转化，并实施冷冻干燥以制备生物转化粉末。
[0063]
表2类别生物转化条件全豆乳(ml)95酶溶液(ml)5反应温度(℃)37反应时间(hr)4
[0064][0065]
实施例3.生物转化粉末的水解程度的评价
[0066]
对实施例2中制备的生物转化粉末评价对蛋白质的水解程度。从各个样品中取2ml水解产物，加入含有2ml 20％(w/v)三氯乙酸(tca)的试管中，然后在混合后离心(3000
×
g，10min)，并取一定量的离心上清液测量蛋白质的量并计算水解程度。计算结果发现，生物转化粉末的水解程度为53.8％。
[0067]
此外，作为通过进行10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)来鉴别黑豆蛋白的分子量差异的结果，如图2所示，与对照组(全黑豆乳)相比，生物转化粉末(经酶处理的黑豆乳)中10,000da以下的大豆肽的含量增加了1.23倍。
[0068][0069]
实施例4.生物转化粉末中氨基酸的组成分析
[0070]
使用自动氨基酸分析仪(biochrom 30+)分析生物转化粉末中的功能性氨基酸。如下表3所示，功能性氨基酸(例如肌肉生长所需的支链氨基酸(bcaa)和作为神经递质前体氨基酸的芳香族氨基酸)的含量有所增加。
[0071]
表3表3
[0072][0073]
实施例5.生物转化粉末的组成分析
[0074]
为了鉴别生物转化粉末的功能组分，通过向韩国功能食品研究院、韩国分析试验研究院和韩国基础科学研究院提出请求，对大豆膳食纤维、大豆低聚糖、异黄酮、黄酮和花青素进行了分析。如下表4所示，大豆膳食纤维、大豆低聚糖(棉子糖、水苏糖)、苷元(aglycon)异黄酮、黄酮和花青素被鉴别为生物转化粉末的组分。
[0075]
表4
[0076]
此外，作为韩国基础科学研究院对g-肽的分析结果，如下表5所示，经酶处理的豆乳中，γ-谷氨酰甘氨酸(γ-glu-gly)、γ-谷氨酰-缬氨酸(γ-glu-val)、γ-谷氨酰-半胱氨酸(γ-glu-cys)、γ-谷氨酰-亮氨酸(γ-glu-leu)和γ-谷氨酰-谷氨酰胺(γ-glu-gln)的含量增加，它们增加味道(厚味(kokumi))以及缓解炎症性肠病和炎症的功能已被报道。
[0077]
表5
[0078][0079]
实施例6.生物转化粉末的抗氧化活性的评价
[0080]
对dpph自由基清除活性进行分析，以评价生物转化粉末的抗氧化活性。对于dpph自由基清除能力，作为通过使稳定的自由基1,1-二苯基-2-苦基肼基(dpph)与预定的样品溶液反应来使用分光光度计测量dpph自由基减少程度的方法，将50μl样品和50μl 0.1mm dpph溶液混合，使混合物在暗室中于室温下静置30分钟，然后在517nm处测量吸光度以计算与对照组相比的自由基减少程度。通过将50μl水和50μl 0.1mm dpph溶液混合来测量空白吸光度，并通过将50μl样品和95％乙醇混合来测量各个样品的对照吸光度。使用抗坏血酸作为阳性对照组的样品。如图3所示，与对照组(全黑豆乳)相比，生物转化粉末中显示出74％的高dpph自由基清除活性。
[0082]
如上所述，详细描述了本公开内容的具体部分，对于本领域的普通技术人员来说
明确的是，该具体描述仅为优选的实施方式，而本公开的范围不受其限制。换言之，本公开的实质范围可以由所附权利要求及其等同物来限定。
[0083][0084]
(译文)原始保藏证明致：成文喜韩国首尔市城北区贞陵洞861-1号，国民大学，136-702，以上译文与原文没有区别 [0085]
(译文)关于科学描述和/或分类学定位的后来载明和修正的证明致：成文喜韩国首尔市城北区贞陵路77号，国民大学，02707

技术特征：
1.一种制备生物转化粉末的方法，所述方法包括：(1)将通过浸入水中而被浸泡的大豆粉碎；(2)对粉碎的大豆进行热处理以获得全豆乳；以及(3)用登录号：kctc 11751bp的bacillus polyfermenticus kmu01菌株、其培养物、其发酵产物或其混合物处理所述全豆乳。2.如权利要求1所述的方法，其中，以3％(v/v)至7％(v/v)的浓度用所述登录号：kctc 11751bp的bacillus polyfermenticus kmu01菌株、其培养物、其发酵产物或其混合物进行处理。3.如权利要求1所述的方法，其中，在35℃至40℃下用所述登录号：kctc 11751bp的bacillus polyfermenticus kmu01菌株、其培养物、其发酵产物或其混合物处理3至8小时。4.如权利要求1所述的方法，其中，所述培养物是通过培养所述登录号：kctc 11751bp的bacillus polyfermenticus kmu01菌株获得的人工培养基。5.如权利要求1所述的方法，其中，所述发酵产物是使用所述登录号：kctc 11751bp的bacillus polyfermenticus kmu01菌株发酵的天然培养基。6.如权利要求1所述的方法，其中，所述培养物和所述发酵产物表现出蛋白酶、γ-谷氨酰转移酶(ggt)和纳豆激酶的活性。7.如权利要求1所述的方法，其中，所述生物转化粉末表现出抗氧化活性。8.一种保健功能性食品组合物，所述保健功能性食品组合物包含通过权利要求1-7中任一项所述的方法制备的生物转化粉末作为活性成分。

技术总结
本发明涉及通过用源自Bacillus polyfermenticus菌株的酶溶液进行处理来制备具有各种改进的生理活性功能的生物转化粉末的方法，并且通过确认用混合有源自Bacillus polyfermenticus菌株的各种降解酶和肽合成酶的发酵液处理全豆乳形成了低分子量的氨基酸、肽和各种功能成分，提供了使用Bacillus polyfermenticus菌株的发酵液制备生物转化粉末的方法。末的方法。末的方法。


技术研发人员：成文喜
受保护的技术使用者：国民生物公司
技术研发日：2021.09.23
技术公布日：2023/8/24