一种融合蛋白表达质粒载体及其构建方法与应用

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种融合蛋白表达质粒载体及其构建方法与应用。


背景技术：

2.转运rna(transferrna，trna)是破译mrna中遗传密码和蛋白质合成的关键分子，通常由76-90个核苷酸组成，排列成类似三叶草的二级结构，其3’末端可结合特定种类的氨基酸。trna对于氨基酸的识别依靠氨基酰-trna合成酶(aminoacyl-trna synthetases，aars)，它将氨基酸与其对应的trna配对生成氨酰-trna，对trna具有高度专一性。
3.rna甲基化是一种动态可逆的转录后修饰。其中，n1-甲基腺嘌呤(m1a)通过在腺苷酸的n1位添加甲基而形成。n1-甲基腺嘌呤主要存在于转移rna(trna)、核糖体rna(rrna)和信使rna(mrna)中。n1-甲基腺嘌呤在trna中含量最高，主要发生在9、14、22、57、58位上，其过高的含量会影响trna的结构稳定性与折叠，进而调控其生物学功能。
4.alkbh3是n1-甲基腺嘌呤的去甲基化酶，在细胞内过表达alkbh3可以下调mrna和trna的n1-甲基腺嘌呤修饰水平。然而由于trna种类繁多、且序列和结构相似，如何靶向特定trna成为目前的技术难点。
5.因此，寻找一种可以靶向特定trna的去甲基化修饰技术手段，是人们亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种融合蛋白表达质粒载体及其构建方法与应用。本发明提供的融合蛋白表达质粒载体，通过将metrs基因与alkbh3连接得到的metrs-alkbh3融合基因整合到真核表达质粒上，可以靶向特定的trna的去甲基化。
7.本发明的具体技术方案为：本发明提供了一种融合蛋白表达质粒载体，该由以下方法构建而成：将metrs-alkbh3融合基因整合到真核表达质粒上，即得所述融合蛋白表达质粒载体。
8.metrs，即甲硫酰-trna合成酶，是负责甲硫酰-trna活化的氨基酰-trna合成酶，可特异性识别并结合甲硫酰-trna，从而使甲硫酰-trna转运至核糖体中参与蛋白质的翻译。本发明提供的融合蛋白表达质粒载体，通过将metrs基因与alkbh3连接得到的metrs-alkbh3融合基因整合到真核表达质粒上，可以靶向特定的trna的去甲基化。
9.在本发明上述的技术方案中，作为优选，融合蛋白表达质粒载体的核苷酸序列如序列表中seq id no.1所示。
10.另一方面，本发明提供了一种构建所述融合蛋白表达质粒载体的方法，包括以下步骤：(1)以真核表达质粒载体为模板，反向扩增得到载体骨架；
(2)扩增metrs基因，并连接linker片段，得metrs基因-linker片段；(3)扩增alkbh3基因，并连接nes片段，得alkbh3基因-nes片段；(4)将步骤(2)中所述metrs基因-linker片段、步骤(3)中所述alkbh3基因-nes片段通过同源重组技术整合到步骤(1)中所述载体骨架中，即得所述融合蛋白表达质粒载体。
11.在本发明上述的技术方案中，作为优选，真核表达质粒载体为ppb载体，其核苷酸序列如序列表中seq id no.2所示。
12.本发明融合蛋白表达质粒载体以ppb为载体骨架，其表达区域为5’端加有agei酶切位点，3’端加有mfei酶切位点的metrs-alkbh3融合蛋白序列；融合蛋白序列处于ppb上t7启动子的阅读框中。metrs-alkbh3融合基因连接顺序为5
’‑
metrs基因-linker-alkbh3基因-nes-3’，融合基因两端分别有27bp与线性化真核表达载体两端重叠。
13.metrs-alkbh3融合基因以核苷酸序列为seq id no.13、seq id no.14的引物对从基因载体pet20b-metrs、seq id no.15、seq id no.16的引物对从基因载体ppb-alkbh3上扩增获得。基因载体pet20b-metrs的核苷酸序列为seq id no.17，基因载体ppb-alkbh3的核苷酸序列为seq id no.18。
14.在本发明上述的技术方案中，作为优选，metrs基因的核苷酸序列如序列表中seq id no.4所示。
15.在本发明上述的技术方案中，作为优选，alkbh3基因的核苷酸序列如序列表中seq id no.5所示。
16.在本发明上述的技术方案中，作为优选，linker片段的核苷酸序列如序列表中seq id no.6所示。
17.在本发明上述的技术方案中，作为优选，nes片段的核苷酸序列如序列表中seq id no.7所示。
18.作为优选，扩增的方式包括pcr技术、大肠杆菌扩增。在本发明上述的技术方案中，所述扩增技术进一步优选为pcr扩增。
19.与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：(1)本发明提供的融合蛋白表达质粒载体，通过将metrs的甲硫酰-trna靶向性与alkbh3的m1a去甲基化活性结合，可以实现靶向特定的trna的去甲基化。
20.(2)本发明提供的融合蛋白表达质粒载体可以在真核细胞内进行表达。
附图说明
21.图1为本发明的一种融合蛋白表达质粒载体的结构示意图；图2为本发明实施例4中质粒载体的组成元件示意图；图3为本发明实施例4中绘制的质粒载体图谱；图4为本发明实施例5中检测融合蛋白基因表达情况图。
具体实施方式
22.如图1所示，为本发明提供的一种融合蛋白表达质粒载体的结构示意图。下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
23.实施例1ppb(mfei-agei)线性载体合成
在ppb质粒载体上选择mfei和agei作为酶切位点，由这两个位点设计特异性引物，上游引物：5
′‑
caattgagatctagcgtaatctggaac-3
′
(seq id no.9)，下游引物：5
′‑
accggtggtaccctcgagg-3
′
(seq id no.10)，ppb作为模板反向pcr扩增，利用dpni酶消化原模板，pcr产物经5％琼脂糖凝胶电泳检测后用胶回收试剂盒回收得到线性载体供后续使用，核苷酸序列见seq id no.8。表1为pcr扩增反应体系组分及用量。pcr反应条件(30cycles)为：预变性98℃30s-3min；变性98℃5-10s；退火62℃10-30s；延伸72℃3mins；终延伸72℃3min。
24.表1组分反应体系2xsuperpfxmastermix25μlppb-mfei-f2.5μlppb-agei-r2.5μlpet20b-metrs1ngddh2oto25μl实施例2metrs-linker和alkbh3-nes片段扩增利用pet20b-metrs质粒作为模板，根据同源重组方法设计特异性引物，上游引物见序列表中seq id no.13，下游引物中加上linker序列见序列表中seq id no.14；利用ppb-alkbh3质粒作为模板，引物设计原则同上，上游引物见序列表中seq id no.15，下游引物加上nes序列见序列表中seq id no.16。pcr反应扩增体系同实施例1，将pcr产物跑5％琼脂糖电泳检测扩增结果并回收得到metrs-linker和alkbh3-nes两个片段，长度分别为2751bp和911bp，核苷酸序列分别是seq id no.11、seq id no.12。
25.实施例3线性载体与多基因片段的连接使用同源重组技术将实施例1的线性载体和实施例2得到的两个片段进行连接，所述融合基因部分连接顺序为5
’‑
metrs基因-linker-alkbh3基因-nes-3’，核苷酸序列为seq id no.3。反应体系如表2所示。
26.表2组分反应体系2
╳
clonningmastermix5μllinearvector1μlinsert3μlddh2o1μl实施例4重组融合蛋白metrs-alkbh3表达质粒的筛选纯化取2.5μl连接产物转化50μl e.coli dh5α感受态细胞，取100μl菌液涂布含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板进行筛选。挑取阳性转化子，转入5ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基，37℃培养12h，取部分菌液进行测序分析。序列分析结果如seq id no.1，质粒载体的组成元件如图2所示，绘制载体图谱如图3所示。
27.实施例5融合蛋白质粒转染将贴壁的hek293t细胞进行消化重悬，铺板至6孔板，每孔加入5x105细胞，将培养板在培养箱中预培养24h。细胞密度达到50％～60％的汇合度时，采用lipofectamine 8000
(invitrogen)进行转染。转染后的细胞放入37℃、含5％二氧化碳的细胞培养箱中培养24h后，trizol法提取细胞rna，rt-qpcr检测metrs和alkbh3的mrna水平显著升高，如图4，为使用ppb-metrs-alkbh3-nes转染293t细胞后rt-qpcr检测融合蛋白基因的表达情况。
28.本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
29.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

技术特征：
1.一种融合蛋白表达质粒载体，其特征在于：由以下方法构建而成：将metrs
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alkbh3融合基因整合到真核表达质粒上，即得所述融合蛋白表达质粒载体。2. 如权利要求1所述的一种融合蛋白表达质粒载体，其特征在于：所述融合蛋白表达质粒载体的核苷酸序列如序列表中seq id no.1所示。3.构建如权利要求1或2所述的融合蛋白表达质粒载体的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）以真核表达质粒载体为模板，反向扩增得到载体骨架；（2）扩增metrs基因，并连接linker片段，得metrs基因-linker片段；（3）扩增alkbh3基因，并连接nes片段，得alkbh3基因-nes片段；（4）将步骤（2）所述metrs基因-linker片段、步骤（3）所述alkbh3基因-nes片段整合到步骤（1）所述载体骨架中，即得所述融合蛋白表达质粒载体。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述真核表达质粒载体选自ppb、pcdna3、pegfp、pcmvp、psv2、cmv4。5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述metrs基因的核苷酸序列如序列表中seq id no.4所示。6. 如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述alkbh3基因的核苷酸序列如序列表中seq id no.5所示。7. 如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述linker片段的核苷酸序列如序列表中seq id no.6所示。8. 如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述nes片段的核苷酸序列如序列表中seq id no.7所示。9.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述扩增采用pcr技术。10.如权利要求1-2之一所述的融合蛋白表达质粒载体或权利要求3-9之一所述的方法构建得到的融合蛋白表达质粒载体在去甲基化中的应用。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，公开了一种融合蛋白表达质粒载体及其构建方法与应用。本发明提供的融合蛋白表达质粒载体，通过将MetRS基因与ALKBH3连接得到的MetRS-ALKBH3融合基因整合到真核表达质粒上，可以靶向特定的tRNA的去甲基化。同时，本发明提供的融合蛋白表达质粒载体可以在真核细胞内进行表达。粒载体可以在真核细胞内进行表达。粒载体可以在真核细胞内进行表达。


技术研发人员：王红胜 钟科 黎婕昕 王召同
受保护的技术使用者：中山大学
技术研发日：2023.03.03
技术公布日：2023/8/23