一种南美青蛙抗菌肽及其改造体抗菌肽的抗炎作用及应用

1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种南美青蛙(phyl lomedusa tarsius)抗菌肽ms-pt，以及该肽的改造体抗菌肽ms-pt1、6a及其应用。


背景技术：

2.脓毒血症是一种常见的危及生命且花费高昂的疾病，影响世界上数百万患者的健康。在临床上，为了控制早期炎症反应和维持器官功能，脓毒血症的治疗主要依赖于广谱抗生素、加压药和抗休克等支持疗法。在用常规抗生素治疗感染疾病时，抗生素破坏细菌细胞膜的结构，释放大量内毒素如脂多糖(lps)，激活全身炎症级联反应。在脓毒血症发生时，大量细胞因子和由多种细胞产生的损伤相关分子模式分子(damp)，会导致强烈的免疫反应，进而导致炎症风暴和多器官功能障碍综合征(mods)。
3.正因脓毒症治疗的局限性，我们迫切需要寻找一种新式治疗方法来对抗这一问题。抗菌肽是具有抗微生物和/或免疫调节活性的短阳离子两亲肽,是天然免疫系统的核心部分，可以通过联合抗菌和抗炎作用，有效防治感染。革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的表面分别覆盖带着大量负电荷的脂磷壁酸和脂多糖，增加了膜的负电荷，而阳离子抗菌肽可以通过静电相互作用选择性地作用于带负电的膜成分。与抗生素的杀菌作用机制不同，抗菌肽主要通过直接与细菌细胞膜产生物理相互作用，或通过膜作用于细胞内的靶点，来杀灭细菌，从而导致抗菌肽不容易产生耐药性。除了直接杀灭病原体，抗菌肽还可以通过直接或间接调节免疫细胞，影响某些信号通路的传导，控制促炎反应和抗炎反应之间的微妙平衡从而发挥免疫调节活性。抗菌肽或许可以成为传统抗生素的理想替代品。


技术实现要素：

4.为解决以上问题，本发明在于提供一种新的具有抗炎的南美青蛙(phyl lomedusa tarsius)抗菌肽ms-pt，以及该肽的改造体抗菌肽ms-pt1、6a及其应用。
5.发明具有抗菌和抗炎作用的抗菌肽是发明人长期关注的领域。发明人发现，来自南美青蛙皮肤分泌物的抗菌肽ms-pt除了具备抗菌活性，还具有抗炎活性，同时其改造体抗菌肽ms-pt1、6a均表现出优异的抗炎及抗脓毒血症活性,根据该发现发明人提出本发明：
6.本发明提供的技术方案之一，是一种南美青蛙抗菌肽ms-pt。发明人从南美青蛙皮肤分泌物中获得一条具有抗金黄色葡萄球菌及抗炎活性的天然抗菌肽，并命名为medusin-pt(ms-pt)，该抗菌肽由18个氨基酸组成，分子量为1810.3道尔顿，委托江苏金斯瑞生物科技有限公司采用标准fmoc固相肽合成法获得抗菌肽ms-pt。该抗菌肽氨基酸序列为：
7.nh
2-leu leu gly met ile pro val ala ile thr ala ile ser ala leu ser lys leu-amide
8.本发明提供的技术方案之二，是一种南美青蛙抗菌肽的改造体抗菌肽ms-pt1。发明人将上述技术方案一中的抗菌肽ms-pt中10位不带电荷的苏氨酸改变为带正电荷的赖氨酸以增加净电荷，该改造体抗菌肽ms-pt1由18个氨基酸组成，分子量为1837.37道尔顿，委
托江苏金斯瑞生物科技有限公司采用标准fmoc固相肽合成法获得改造体抗菌肽ms-pt1。该改造体抗菌肽氨基酸序列为：
9.nh
2-leu leu gly met ile pro val ala ile lys ala ile ser ala leu ser lys leu-amide
10.本发明提供的技术方案之三，是一种南美青蛙抗菌肽的改造体抗菌肽6a。发明人将上述技术方案二中的改造体抗菌肽ms-pt1中6位脯氨酸改变为丙氨酸以增加螺旋度，该改造体抗菌肽6a由18个氨基酸组成，分子量为1811.33道尔顿，委托江苏金斯瑞生物科技有限公司采用标准fmoc固相肽合成法获得改造体抗菌肽6a。该改造体抗菌肽氨基酸序列为：
11.nh
2-leu leu gly met ile ala val ala ile lys ala ile ser ala leu ser lys leu-amide
12.本发明提供的技术方案之四，包括关于南美青蛙抗菌肽ms-pt的设计改造，以及本发明所提及两种改造体抗菌肽ms-pt1、6a的应用。所述抗菌肽ms-pt除了已被证实的抗金黄色葡萄球菌活性，还具有抗炎活性。所述改造体抗菌肽ms-pt1经实验考察后发现，其可以通过很强的lps的中和能力，抑制脂多糖诱导的tlr4炎症经典信号通路的激活，发挥抗炎作用，同时对lps所致的脓毒血症小鼠模型具有很好的保护作用，能够在很大程度上提高小鼠的存活率。所述改造体抗菌肽6a经实验考察后发现，其可以通过与关键靶点md2的物理相互作用，从而抑制lps-md2-tlr4复合物的形成，抑制脂多糖诱导的tlr4炎症经典信号通路的激活，发挥抗炎作用，同时缓解盲肠结扎与穿刺术诱导的脓毒血症模型中的炎症反应，恢复器官功能。故两种改造体抗菌肽有望作为潜在的抗炎、抗脓毒血症药物。
13.综上所述，本发明具有以下有益效果：提供一种新的具有抗炎活性的南美青蛙(phyllomedusa tarsius)抗菌肽ms-pt，以及该肽的改造体抗菌肽ms-pt1、6a，有望作为潜在的抗炎、抗脓毒血症药物。
附图说明
14.图1抗菌肽ms-pt及其改造体抗菌肽ms-pt1对细胞的tnf-α生成量的影响；
15.图2抗菌肽ms-pt及其改造体抗菌肽ms-pt1对细胞的il-6生成量的影响；
16.图3等温滴定量热测定抗菌肽ms-pt1与lps的结合；
17.图4zeta电势检测抗菌肽ms-pt1与lps的结合；
18.图5鲎试剂检测抗菌肽ms-pt1对lps的中和作用；
19.图6ms-pt1对lps诱导的脓毒血症小鼠生存率的影响。
20.图7改造体抗菌肽6a对细胞的tnf-α生成量的影响；
21.图8改造体抗菌肽6a对细胞的il-6生成量的影响；
22.图9改造体抗菌肽6a对tlr4下游nf-κb与mapk信号通路的影响；
23.图10改造体抗菌肽6a与tlr4信号通路上的关键蛋白md2的相互作用；
24.图11改造体抗菌肽6a对小鼠脓毒血症模型血清中tnf-α生成量的影响；
25.图12改造体抗菌肽6a对小鼠脓毒血症模型血清中的il-6生成量的影响。
具体实施方式
26.为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本
专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
27.南美青蛙抗菌肽ms-pt，由18个氨基酸组成，分子量为1810.3道尔顿，其全序列为：nh
2-leu leu gly met ile pro val ala ile thr ala ile ser ala leu ser lys leu-amide
28.改造体抗菌肽ms-pt1，由18个氨基酸组成，分子量为1837.37道尔顿，其全序列为：nh
2-leu leu gly met ile pro val ala ile lys ala ile ser ala leu ser lys leu-amide
29.改造体抗菌肽6a，由18个氨基酸组成，分子量为1811.33道尔顿，其全序列为：nh
2-leu leu gly met ile ala val ala ile lys ala ile ser ala leu ser lys leu-amide。
30.抗菌肽ms-pt及其改造体抗菌肽ms-pt1、6a委托江苏金斯瑞生物科技有限公司通过固相合成法进行合成，纯度》90％，满足活性检测相关实验的要求。
31.实施例一：抗菌肽ms-pt及其改造体抗菌肽ms-pt1的抗炎活性
32.(1)抗菌肽ms-pt及其改造体抗菌肽ms-pt1的抗炎活性的测定
33.小鼠腹腔原代巨噬细胞(mpms)来源于雄性c57bl/6，在37℃下，含5％co2的培养箱培养细胞，2h后更换新的含10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素/链霉素双抗(p/s)的rpmi-1640完全培养基培养过夜，用终浓度为0.5μg/ml的lps刺激细胞。实验设置实验组、空白组、诱导组、阳性对照组：
34.空白组：正常培养2h+24h；
35.诱导组：lps(0.5μg/ml)置培养箱中孵育2h后刺激培养24h；
36.实验组：lps(0.5μg/ml)加样品置培养箱中孵育2h后刺激培养24h；
37.阳性对照组：lps(0.5μg/ml)加阳性对照(20μm的tak-242)置培养箱中孵育2h后刺激培养24h；
38.培养完成后收集上清。采用elisa试剂盒测定不同浓度抗菌肽ms-pt及其改造体抗菌肽ms-pt1对诱导后细胞炎症因子(tnf-α、il-6)生成量的影响。根据试剂盒中标准品检测结果绘制标准曲线，计算得到tnf-α或il-6的浓度值，实验重复三次。
39.结果如图1-2所示，抗菌肽ms-pt在20μm的浓度下能够抑制小鼠腹腔巨噬细胞中lps诱导的促炎因子il-6和tnf-α表达，而改造体抗菌肽ms-pt1在10μm下就可显著抑制促炎因子的表达，表明抗菌肽ms-pt1具有较强的抗炎活性。
40.(2)等温滴定量热测定抗菌肽ms-pt1与lps的结合
41.先将lps用ph＝6.0的pbs(10mm)缓冲液溶解，使其终浓度为25μm,涡旋10min，超声波震荡10min以脱去气体，取700μl加入itc微热量池，保证加入过程中无气泡。再用同样的缓冲液将抗菌肽ms-pt1溶解为1mm，超声震荡10min，取50μl加入上样注射器中。程序设定为滴定20次，间隔2min，每次滴定量2.5μl，滴定温度在37℃，测定每次滴定热量的变化。抗菌肽与lps结合过程中的热力学参数如解离常数ka，结合常数ka，烙变值
△
h及墒变值
△
s由该仪器自带的分析软件分析处理得到。
42.itc是用来检测热量连续变化的量热器，其滴定进行时反应物的相互作用触发结合反应会形成大分子/配体复合物，而复合物的形成往往伴随着能量的释放和吸收，然而反
应体系需要始终保持在实验温度，因此反馈系统会提供或降低热量来补偿反应池的温度变化，这就可以直接的反映化合物的结合与热量变化的关系。ms-pt1与lps结合过程中伴随着热力学参数的变化，因此使用itc在37℃条件下检测热量的变化去衡量ms-pt1与lps的结合程度。如图3所示，在lps与ms-pt1作用过程中产生正的焓变(δh＞0)，是一个吸热反应，且最后3次滴定时ms-pt1与lps反应趋于饱和，表明两者反应到达饱和状态。
43.(3)zeta电势检测抗菌肽ms-pt1与lps的结合；
44.将lps用超纯水溶解，使其终浓度为50μm，涡旋10min，超声波震荡10min以脱去气体，同时用同样的缓冲液将抗菌肽ms-pt1配成不同浓度，加入lps工作液使抗菌肽与lps的摩尔比为0-5，涡旋10min，室温孵育0.5h。使用nano zs 90设备通过相位分析光散射原理测量zeta电势，每组测量三次取平均值；使用helmholtz-smoluchowski方程，由聚集体在19.2v
·
cm-1的驱动电场中的迁移率计算出zeta电位。
45.lps由于内部的磷酸基团而使得lps整体呈电负性，而ms-pt1整体带正电，因此ms-pt1和lps作用过程中会伴随电荷的变化。如图4所示，在无lps存在条件下，ms-pt1的zeta电势值大于0。在有lps存在条件下，lps的zeta电势值小于0，但是随着ms-pt1的加入，带正电荷的ms-pt1能够与带负电荷的lps结合产生电荷补偿现象，使负电荷逐渐被中和减少，并与ms-pt1呈剂量依赖关系。随着ms-pt1浓度的增大，lps的负电荷逐渐被中和，在ms-pt1与lps的摩尔比为7.5时，负电荷被完全中和从而电势值大于0。这时溶液可能发生了电荷过量补偿现象，ms-pt1可能通过静电作用力与lps结合后又在通过疏水作用插入到了lps的疏水分子中。
46.(4)鲎试剂检测抗菌肽ms-pt1对lps的中和作用
47.使用内毒素检测鲎试剂盒(厦门鲎试剂生物科技股份有限公司，中国)检测抗菌肽中和lps实验。根据卖方提供的实验方案进行实验。在试剂盒附带的无热原的水中制备抗菌肽ms-pt和ms-pt1以及阳性对照药pmb的储备液。分别将浓度为100、50、25、15、8、4、2、1和0μm的抗菌肽ms-pt、ms-pt1或阳性对照药pmb与1eu/ml的lps工作液在37℃的平底无热源96孔细胞培养板中孵育30min，使它们与lps结合。然后将50μl的lal试剂添加到等体积的肽和lps混合物中，并将混合物再温育16min，接着添加100μl的显色基质工作液中，在37℃条件下温育6min。通过添加稀硫酸反应终止液来终止反应，于405nm波长处读取吸光度值。反应结束到读取吸光度值的时间不应超过5小时。
48.鳖试剂主要是从海洋生物鳖血液里的变形细胞中提取而来，而十分微量的lps即可活化其凝固酶原进而与特定底物发生显色反应，因此我们可以考察显色反应od值的变化去定量检测lps的浓度，从而间接反映抗菌肽对lps的中和能力，该反应具有很强的特异性和灵敏性。如图5所示，ms-pt、ms-pt1和阳性药pmb均能够显著的抑制lps介导的lal凝固酶的活化，并呈现浓度依赖关系，而且ms-pt1在浓度为5μm就中和了超过80％的lps。
49.实施例二：抗菌肽ms-pt1的抗脓毒血症活性
50.(1)休克性脓毒血症小鼠模型的建立
51.为了检验抗菌肽ms-pt1的治疗效果，将lps通过尾静脉注射到小鼠体内建立内毒素血症模型，以20mg/kg体重浓度剂量的salmonella typhosa lps(sigma-aldrich)建立实验性小鼠脓毒血症模型。空白对照组不做药物治疗，两次尾静脉注射等体积的0.9％无菌生理盐水，期间间隔1h；lps造模处理组，尾静脉注射20mg/kg体重浓度剂量的lps注射液后，1h
后注射等体积的0.9％无菌生理盐水；ms-pt和ms-pt1各治疗组，在注射20mg/kg体重浓度剂量的lps溶液后，分别于尾静脉给予一次性注射20mg/kg体重浓度剂量的ms-pt和10mg/kg体重浓度剂量的ms-pt1溶液。治疗后统计72小时内小鼠的存活率。
52.如图6所示，在lps诱导的小鼠脓毒血症模型中，如未在随后的1小时内接受抗菌肽治疗的小鼠在48小时内全部死亡。相反，经过ms-pt和ms-pt1治疗后小鼠的存活率和存活时间都有极大提高，它们七天内的存活率分别为：ms-pt(20mg/kg)治疗组80％以上；ms-pt1(10mg/kg)治疗组100％。
53.实施例三：改造体抗菌肽6a的抗炎活性
54.改造体抗菌肽6a委托江苏金斯瑞生物科技有限公司通过固相合成法进行合成，纯度》90％，满足活性检测相关实验的要求。
55.(1)改造体抗菌肽6a抗炎活性的测定
56.小鼠腹腔原代巨噬细胞(mpms)来源于雄性c57bl/6，在37℃下，含5％co2的培养箱培养细胞，2h后更换新的含10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素/链霉素双抗(p/s)的rpmi-1640完全培养基培养过夜，用终浓度为0.5μg/ml的lps刺激细胞。实验设置实验组、空白组、诱导组、阳性对照组：
57.空白组：正常培养2h+12h；
58.诱导组：lps(0.5μg/ml)置培养箱中孵育2h后刺激培养12h；
59.实验组：lps(0.5μg/ml)加样品置培养箱中孵育2h后刺激培养12h；
60.阳性对照组：lps(0.5μg/ml)加阳性对照(10μm的多粘菌素b(pmb))置培养箱中孵育2h后刺激培养12h；
61.培养完成后收集上清。采用elisa试剂盒测定不同浓度改造体抗菌肽6a对诱导后细胞炎症因子(tnf-α、i l-6)生成量的影响。根据试剂盒中标准品检测结果绘制标准曲线，计算得到tnf-α或i l-6的浓度值，实验重复三次。
62.结果如图1-2所示，改造体抗菌肽6a能够显著抑制小鼠腹腔巨噬细胞中lps诱导的促炎因子tnf-α和i l-6表达，表明改造体抗菌肽6a具有较强的抗炎活性。
63.(2)改造体抗菌肽6a抑制lps诱导nf-κb与mapk信号通路的活化
64.将小鼠腹腔原代巨噬细胞接种到6孔板中，按(1)方法设置实验组、空白组、诱导组、阳性对照组，培养15min，培养完成后弃上清，用预先混有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液(抑制剂：裂解液＝1:100)充分裂解用考马斯亮蓝(bradford)法测定蛋白浓度，根据所需的蛋白上样量配制样品，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)电泳分离样品，并通过湿转法将其转移到聚偏二氟乙烯膜(pvdf膜)上，使用bio-rad凝胶成像系统成像，最后用image j软件统计各条带的灰度值并做图。
65.由于nf-κb和mapks信号通路是经典的lps/tlr4下游信号通路，因此我们研究了改造体抗菌肽6a对nf-κb和mapks信号通路的影响。基于前面实验的结果，我们选用5与10μm的浓度进行机制研究。如图3所示，与对照组相比，lps显著增加了ikkα/β、jnk、erk、p38的磷酸化和iκbα的降解。
66.(3)改造体抗菌肽6a与tlr4信号通路上的关键蛋白md2的相互作用
67.将小鼠腹腔原代巨噬细胞接种到中皿中，按(1)方法获取蛋白样品，首先使用protein a+g琼脂糖磁珠去除非特异性结合，2h后吸取上清，加入2μgigg/tlr4抗体，置于4
℃混匀仪上，孵育过夜。第二天往上述上清中加入20μl新的protein a+g磁珠，置于4℃混匀仪上，孵育2h。随后弃上清，制备蛋白样品，并按(2)中方法进行免疫印迹分析。
68.改造体抗菌肽6a可通过抑制tlr4下游通路关键蛋白的激活发挥抗炎活性，我们预测改造体抗菌肽6a的抗炎作用是通过对上游分子md2的作用介导的，如图4所示，使用改造体抗菌肽6a(10μm)处理小鼠腹腔原代巨噬细胞可以抑制lps诱导的md2-tlr4复合物的形成。
69.实施例四：抗菌肽6a的抗脓毒血症活性
70.(1)小鼠脓毒血症模型的构建
71.将雄性c57bl/6小鼠随机分为四组，这些组包括对照组(con)，clp造模组(clp)，clp造模+改造体抗菌肽6a高剂量给药组(clp+6a 10mg/kg)，clp造模+改造体抗菌肽6a低剂量给药组(clp+6a 5mg/kg)。通过盲肠结扎与穿刺术(clp)构建小鼠脓毒血症模型：每只小鼠进行0.2ml戊巴比妥钠(100mg/kg)腹腔注射实施麻醉，刮走毛发并消毒，在无菌区域进行剖腹手术，暴露盲肠，在离末端1cm的位置进行结扎并用16号针刺穿两次。轻微挤压以释放少量肠道内容物，然后将盲肠放回腹腔，缝合腹部皮肤并进行表皮消毒。同时，假手术组中的小鼠在没有结扎或穿刺的情况下进行了相同的程序。手术后所有小鼠立即注射皮下生理盐水并保持温暖，直到小鼠恢复意识，将它们放回笼中观察。在clp术后30min，分别注射改造体抗菌肽6a或生理盐水，clp后6h收集血清并测量炎症因子的水平。
72.(2)小鼠脓毒血症模型血清中tnf-α、i l-6的测定
73.同实施例一(1)中测定方法一致。如图5-6所示，与对照组相比，clp模型小鼠血清i l-6和tnf-α水平显著升高，经改造体抗菌肽6a处理后，这些指标的增加得到显著缓解，这表明改造体抗菌肽6a有效地减轻了脓毒血症带来的大规模全身炎症。
74.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
75.76.77.
技术特征：
1.一种具有抗炎活性的南美青蛙抗菌肽ms-pt，其特点在于：来源于一种叫phyllomedusatarsius的南美青蛙的皮肤分泌物，其具有高度保守的序列：n端六肽序列lgmipl-、内部序列-vaisaisa-、以及c端四肽序列-lskl酰胺化修饰，含有18个氨基酸残基，分子量为1810.30道尔顿，该氨基酸序列如seq id no.1所示。2.一种南美青蛙抗菌肽的改造体抗菌肽ms-pt1，其特征在于，所述改造体抗菌肽含有18个氨基酸残基，分子量1837.37道尔顿，其氨基酸序列如seq id no.2所示。3.一种南美青蛙抗菌肽的改造体抗菌肽6a,其特征在于：所述改造体抗菌肽6a含有18个氨基酸残基，分子量1811.33道尔顿，其氨基酸序列如seq id no.3所示。4.权利要求1或2或3所述的南美青蛙抗菌肽及改造体抗菌肽的应用，其特征在于：所述抗菌肽及其改造体抗菌肽作为制备潜在的抗炎、抗脓毒血症药物的应用。

技术总结
本发明提供了一种具有抗炎活性的南美青蛙抗菌肽MS-PT，另外还包括其改造体抗菌肽及应用，属于生物医学领域。其中，抗菌肽MS-PT及其改造体抗菌肽MS-PT1和6A，均含有18个氨基酸残基，分子量分别为1810.30道尔顿、1837.37道尔顿和1811.33道尔顿。本发明提供的抗菌肽MS-PT、改造体抗菌肽MS-PT1和6A均具有抗炎活性，同时具有缓解小鼠脓毒血症模型的作用，故可作为潜在的抗炎、抗脓毒血症药物。抗脓毒血症药物。抗脓毒血症药物。


技术研发人员：吴迪 高艺恬 梁广 杨婕 唐启东
受保护的技术使用者：温州医科大学
技术研发日：2023.06.08
技术公布日：2023/8/23