一种基于铝佐剂的联合佐剂系统、疫苗制剂及其制备方法与应用

1.本发明涉及生物技术及疫苗技术领域，具体涉及一种基于铝佐剂的联合佐剂系统、疫苗制剂及其制备方法与应用。


背景技术：

2.预防接种后，能够诱导机体产生针对病原体的体液免疫和细胞免疫应答的生物制剂统称为疫苗。现阶段，人们研究最多的是亚单位疫苗。亚单位疫苗，即通过化学分解或有控制性的蛋白质水解方法，提取细菌、病毒的特殊蛋白质结构，筛选出的具有免疫活性的片段制成的疫苗。亚单位疫苗具有产量高、安全性高、稳定性好等优势，但与传统的一些灭活病毒疫苗类似，其免疫原性较低，往往需要外加佐剂来加强免疫应答。
3.佐剂是帮助疫苗提高免疫效果的物质，它们可以更快速的刺激机体启动保护性反应。铝佐剂是最经典，应用最广泛的免疫佐剂，其安全性高，可诱导产生大量特异性抗体。但铝佐剂作为一种th2型免疫佐剂，只能诱导体液免疫反应，而针对一些肿瘤、病毒感染等疾病仅仅依靠体液免疫产生的中和抗体往往很难起到很好的免疫效果，更需要细胞免疫的共同参与。
4.目前，模式识别受体(prr)的配体是佐剂分子研究的重点。sting作为细胞内prr是开发佐剂的重要目标。sting激动剂可以结合并刺激sting受体，从而激活转录因子trf3并诱导ifn-γ的表达。tlr3激动剂也经常用作疫苗佐剂，tlr3的激活可导致产生i型ifn和促炎性细胞因子，并为机体提供针对病毒的保护力。
5.在这里，我们利用铝佐剂自身具有良好的化学性质和疏松多孔的结构以及相关模式识别受体配体分子含磷酸基团的特点，通过化学配位、静电吸附和物理吸附的方式将两种不同免疫模式的相关激动剂分子紧密吸附到铝佐剂上构建新型的通用联合佐剂系统，诱导机体产生强效和全面的免疫保护。


技术实现要素：

6.本发明的目的是为了克服现有技术存在的铝佐剂只能诱导体液免疫反应，针对一些肿瘤、病毒感染等疾病仅仅依靠体液免疫产生的中和抗体往往很难起到很好的免疫效果的问题，提供一种基于铝佐剂的联合佐剂系统、疫苗制剂及其制备方法与应用。本发明提供的联合佐剂系统和疫苗制剂，采用将干扰素基因刺激分子(sting)激动剂和toll样受体激动剂共吸附至铝佐剂形成紧密的配合物的方式制备而成，能够保持铝佐剂自身的形貌以及特性，可以同时诱导体液免疫和细胞免疫应答。
7.为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种基于铝佐剂的联合佐剂系统，所述联合佐剂系统包含铝佐剂、干扰素基因刺激分子激动剂和toll样受体激动剂。
8.优选地，所述铝佐剂为氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂和明矾佐剂中的至少一种。
9.优选地，所述干扰素基因刺激分子激动剂为c-di-gmp、c-di-amp、3',3'-cgamp、
2',3'-cgamp以及c-di-gmp、c-di-amp、3',3'-cgamp、2',3'-cgamp的硫取代物或氟取代物中的至少一种，
[0010][0011][0012]
优选地，所述toll样受体激动剂含有磷酸基团。
[0013]
更优选地，所述toll样受体激动剂包括tlr3激动剂、tlr4激动剂或tlr9激动剂中的至少一种。
[0014]
进一步优选地，所述tlr3激动剂为聚肌胞苷酸、聚腺尿苷酸、聚肌胞苷酸与聚赖氨酸和羧甲基纤维素的结合物、pic
12
u和皮卡佐剂中的至少一种。
[0015]
进一步优选地，所述tlr4激动剂为单磷酸脂质a。
[0016]
进一步优选地，所述tlr9激动剂为cpg-odn。
[0017]
本发明第二方面提供了一种制备前文所述联合佐剂系统的方法，该方法包括以下步骤：
[0018]
(1)向磷酸盐缓冲溶液中加入所述干扰素基因刺激分子激动剂和所述toll样受体激动剂；
[0019]
(2)将步骤(1)所得溶液加入所述铝佐剂胶体中；
[0020]
(3)将步骤(2)所得产物在室温下涡旋混合30～60min，控制混合速率为1000～2500rpm，然后置于3～5℃下吸附11～13h。
[0021]
本发明第三方面提供了一种前文所述联合佐剂系统以及前文所述方法制备的联合佐剂系统在制备治疗性和预防性疫苗制剂中的应用。
[0022]
本发明第四方面提供了一种疫苗制剂，所述疫苗制剂包含联合佐剂系统和抗原蛋白或所述疫苗制剂包含联合佐剂系统和灭活病毒，其中，所述联合佐剂系统为前文所述联合佐剂系统以及前文所述方法制备的联合佐剂系统。
[0023]
优选地，所述抗原蛋白来源于细菌、病毒、真菌、肿瘤和人为合成的抗原蛋白中的
至少一种。
[0024]
更优选地，所述病毒抗原蛋白为中东呼吸综合征冠状病毒、非典型肺炎和2019新型冠状病毒结构蛋白中的至少一种。
[0025]
进一步优选地，所述2019新型冠状病毒结构蛋白为核衣壳蛋白、突刺蛋白及核衣壳蛋白、突刺蛋白的亚单位中的至少一种。
[0026]
优选地，所述灭活病毒为灭活的流感病毒、灭活的狂犬病毒、灭活的甲型肝炎病毒、灭活的乙型肝炎病毒、灭活的乙型脑炎病毒、灭活的脊髓灰质炎病毒和灭活的冠状病毒中的至少一种。
[0027]
本发明第五方面提供了一种制备前文所述疫苗制剂的方法，该方法包括以下步骤：
[0028]
s1、向磷酸盐缓冲溶液中加入所述干扰素基因刺激分子激动剂和所述toll样受体激动剂；
[0029]
s2、将步骤s1所得溶液加入所述铝佐剂胶体中；
[0030]
s3、向步骤s2所得胶体中加入所述蛋白抗原或所述灭活病毒，混合均匀；
[0031]
s4、将步骤s3所得产物在室温下涡旋混合30～60min，控制混合速率为1000～2500rpm，然后置于3～5℃下吸附11～13h即得。
[0032]
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
[0033]
(1)基于铝佐剂的联合佐剂系统不改变铝佐剂自身的形貌和特性，吸附的3',3'-cgamp和poly i:c佐剂也分别完成了临床i和临床ii期的研究，保证了佐剂自身的安全性；
[0034]
(2)基于铝佐剂的联合佐剂系统能有效避免3',3'-cgamp和poly i:c小分子佐剂由于扩散而导致的系统性毒性，改变其药代动力学；
[0035]
(3)基于联合佐剂系统的sars-cov-2亚单位疫苗能诱导机体产生显著的高滴度抗s1的特异性igg抗体，加强体液免疫；
[0036]
(4)基于联合佐剂系统的sars-cov-2亚单位疫苗能诱导强烈的细胞免疫；
[0037]
(5)基于联合佐剂系统的sars-cov-2亚单位疫苗诱导产生的中和抗体能有效中和sars-cov-2突变株；
[0038]
(6)基于联合佐剂系统的sars-cov-2亚单位疫苗仅需免疫2针即可引发机体的强效免疫应答；
[0039]
(7)基于铝佐剂的联合佐剂系统表现出明显的协同作用。
附图说明
[0040]
图1表示实施例1，2中铝佐剂分别对c-gamp(a)，poly i:c(b)和s1蛋白(c)的吸附标准曲线；
[0041]
图2表示实施例4中，2次免疫后小鼠血清中产生的抗s1的igg抗体滴度评价；
[0042]
图3表示实施例4中，2次免疫后小鼠血清中产生的igg抗体亚型滴度评价；
[0043]
图4表示实施例5中，2次免疫后小鼠脾脏处淋巴细胞产生的ifn-γ细胞因子；
[0044]
图5表示实施例6中，2次免疫后小鼠脾脏处cd4+，cd8+t细胞各自产生ifn-γ和tnf-α细胞因子的水平；
[0045]
图6表示实施例7中，2次免疫后小鼠血清中假病毒中和抗体滴度评价；
[0046]
图7表示实施例7中，2次免疫后联合佐剂系统组小鼠血清对突变株的中和抗体滴度评价。
具体实施方式
[0047]
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0048]
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0049]
本发明第一方面提供了一种基于铝佐剂的联合佐剂系统，所述联合佐剂系统包含铝佐剂、干扰素基因刺激分子(sting)激动剂和toll样受体激动剂。
[0050]
在具体实施方式中，所述铝佐剂为氢氧化铝佐剂磷酸铝佐剂和imject
tm
明矾佐剂(imject)中的至少一种。在优选实施方式中，所述铝佐剂为imject
tm
明矾佐剂(imject)。
[0051]
在具体实施方式中，所述干扰素基因刺激分子(sting)激动剂为c-di-gmp、c-di-amp、3',3'-cgamp、2',3'-cgamp以及c-di-gmp、c-di-amp、3',3'-cgamp、2',3'-cgamp的硫取代物或氟取代物中的至少一种，
[0052][0053]
在优选实施方式中，所述干扰素基因刺激分子(sting)激动剂为3',3'-cgamp和2',3'-cgamp。
[0054]
在具体实施方式中，所述toll样受体激动剂含有磷酸基团，例如包括tlr3激动剂、
tlr4激动剂或tlr9激动剂中的至少一种。在优选实施方式中，所述tlr3激动剂为聚肌胞苷酸(poly i:c)、聚腺尿苷酸(poly a:u)、聚肌胞苷酸与聚赖氨酸和羧甲基纤维素的结合物(poly ic:lc)、pic
12
u和佐剂(pickca)中的至少一种。在优选实施方式中，所述tlr4激动剂为单磷酸脂质a(mpla)。在优选实施方式中，所述tlr9激动剂为cpg-odn。
[0055]
本发明第二方面提供了一种制备前文所述联合佐剂系统的方法，该方法包括以下步骤：
[0056]
(1)向磷酸盐(pbs)缓冲溶液中加入所述干扰素基因刺激分子激动剂和所述toll样受体激动剂；
[0057]
(2)将步骤(1)所得溶液加入所述铝佐剂胶体中；
[0058]
(3)将步骤(2)所得产物在室温下涡旋混合30～60min，控制混合速率为1000～2500rpm，然后置于3～5℃(例如3℃、3.5℃、4℃、4.5℃或5℃，优选为4℃)下吸附11～13h。
[0059]
在具体实施方式中，可以将步骤(2)所得产物在室温下涡旋混合30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min。
[0060]
在具体实施方式中，在步骤(3)中，可以控制混合速率为1000rpm、1500rpm、2000rpm或2500rpm。
[0061]
在具体实施方式中，在步骤(3)中，吸附时间可以为11h、12h或13h，优选为12h。
[0062]
本发明第三方面提供了一种前文所述联合佐剂系统以及前文所述方法制备的联合佐剂系统在制备治疗性和预防性疫苗制剂中的应用。所述疫苗制剂包括中东呼吸综合征冠状病毒(mers)、非典型肺炎(sars-cov)和2019新型冠状病毒(sars-cov-2)疫苗制剂，优选为2019新型冠状病毒(sars-cov-2)疫苗制剂。
[0063]
本发明第四方面提供了一种疫苗制剂，所述疫苗制剂包含联合佐剂系统和抗原蛋白或所述疫苗制剂包含联合佐剂系统和灭活病毒，其中，所述联合佐剂系统为前文所述联合佐剂系统以及前文所述方法制备的联合佐剂系统。
[0064]
在具体实施方式中，所述抗原蛋白来源于细菌、病毒、真菌、肿瘤和人为合成的抗原蛋白中的至少一种。
[0065]
在具体实施方式中，所述病毒抗原蛋白为中东呼吸综合征冠状病毒(mers)、非典型肺炎(sars-cov)和2019新型冠状病毒(sars-cov-2)结构蛋白中的至少一种。在优选实施方式中，所述病毒抗原蛋白为2019新型冠状病毒(sars-cov-2)结构蛋白。
[0066]
在更优选的实施方式中，所述2019新型冠状病毒(sars-cov-2)结构蛋白为核衣壳蛋白(n蛋白)、突刺蛋白(s蛋白)及核衣壳蛋白(n蛋白)、突刺蛋白(s蛋白)的亚单位中的至少一种。
[0067]
在本发明中，所述病毒抗原蛋白可以为sars-cov-2病毒的重组s1蛋白。
[0068]
在具体实施方式中，所述灭活病毒为灭活的流感病毒、灭活的狂犬病毒、灭活的甲型肝炎病毒、灭活的乙型肝炎病毒、灭活的乙型脑炎病毒、灭活的脊髓灰质炎病毒和灭活的冠状病毒中的至少一种。
[0069]
本发明第五方面提供了一种制备前文所述疫苗制剂的方法，该方法包括以下步骤：
[0070]
s1、向磷酸盐(pbs)缓冲溶液中加入所述干扰素基因刺激分子激动剂和所述toll
样受体激动剂；
[0071]
s2、将步骤s1所得溶液加入所述铝佐剂胶体中；
[0072]
s3、向步骤s2所得胶体中加入所述蛋白抗原或所述灭活病毒，混合均匀；
[0073]
s4、将步骤s3所得产物在室温下涡旋混合30～60min，控制混合速率为1000～2500rpm，然后置于3～5℃(例如3℃、3.5℃、4℃、4.5℃或5℃，优选为4℃)下吸附11～13h即得。
[0074]
在具体实施方式中，可以将步骤s4所得产物在室温下涡旋混合30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min。
[0075]
在具体实施方式中，在步骤s4中，可以控制混合速率为1000rpm、1500rpm、2000rpm或2500rpm。
[0076]
在具体实施方式中，在步骤s4中，吸附时间可以为11h、12h或13h，优选为12h。
[0077]
本发明所提供的联合佐剂系统采用将两种不同免疫通路受体的相关配体共吸附至铝佐剂形成紧密的配合物的方式制备，在保持铝佐剂原有形貌和特性的基础上，进一步加强佐剂的免疫增强作用以及激活细胞免疫的能力。与sars-cov-2病毒的重组s1蛋白结合制备的亚单位疫苗在接种两剂次后能快速诱导高滴度的igg特异性抗体和强效的细胞免疫应答，并对相关sars-cov-2假病毒以及突变株有明显的中和作用。
[0078]
以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
[0079]
以下实例中，所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例和附图中的cgamp是指3',3'-cgamp。
[0080]
实施例1：基于铝佐剂的联合佐剂系统的制备
[0081]
疫苗级3',3'-cgamp和poly i:c分别用去离子水配制成浓度为1μg/μl的溶液。分别吸取25μl 3',3'-cgamp溶液和250μl poly i:c溶液于325μl pbs溶液中，涡旋混合均匀。然后加入600μl imject明矾佐剂中，在室温条件下涡旋混合30min，控制混合速率为2000rpm，然后置于4℃下过夜吸附12h，使用前取出涡旋混匀10min即可。
[0082]
结果如图1a和图1b所示，从图1a和图1b中可以看出imject明矾佐剂对3',3'-cgamp和poly i:c的吸附率均超过98％，吸附效果良好。
[0083]
实施例2：基于联合佐剂系统的sars-cov-2疫苗制剂的制备
[0084]
疫苗级3',3'-cgamp和poly i:c分别用去离子水配制成浓度为1μg/μl的溶液。取25μl 3',3'-cgamp溶液和250μl poly i:c溶液于pbs溶液中，得到600μl含有25μg 3',3'-cgamp和250μg poly i:c的pbs溶液，混合后加入600μl imject明矾佐剂中，涡旋混合均匀；再加入60μg sars-cov-2病毒的重组s1蛋白，室温条件涡旋混合30min，控制混合速率为2000rpm，然后置于4℃下过夜吸附12h，使用前取出涡旋混匀10min。
[0085]
结果如图1c所示，从图1c中可以看出imject明矾佐剂对s1蛋白的吸附率超过95％，吸附效果良好。
[0086]
实施例3：小鼠免疫
[0087]
小鼠分为两部分。第一部分小鼠免疫时间分别为第1天和第15天，第二部分小鼠免疫时间分别为第1天和第15天以及29天，注射方式为皮下注射。取血方式为断尾取血，取血时间：每次免疫后14天取血，血液取出后经离心机离心后取出血清。
[0088]
表1：实施例3中各组疫苗制剂的成分
[0089][0090]
实施例4：免疫小鼠血清中抗体含量测定
[0091]
96孔酶标板(购自corning 3590)中，每孔包被100μl抗原溶液(s1：1μg/ml，ph 9.4-9.6的碳酸盐缓冲溶液)，4℃过夜；pbst(含0.05％吐温-20的pbs溶液)洗板3次，然后用含3％牛血清白蛋白(bsa)的pbs溶液封闭，37℃孵育1h；再次用pbst洗板3次，加入用0.1％bsa的pbs溶液稀释后的血清，37℃孵育1h；pbst洗板3次，加入用pbs溶液4000：1稀释的hrp标记的羊抗鼠二抗igg、igm、iga、ige、igg1、igg2a、igg2b、igg3，37℃孵育1h；pbs洗板2次，pbst洗板3次，加入新配置的tmb显色液，避光孵育15min，加入2m硫酸终止显色。通过酶标仪测定450nm波长下的吸光度。
[0092]
结果如图2和图3所示，从图2中可以看出接种2剂次疫苗后，联合佐剂组(s1+alum+c-gamp+poly i:c)诱导出了高滴度的s1特异性igg抗体，分别为无佐剂组(s1)的320倍和铝佐剂组(s1+alum)的155倍；从图3中可以看出联合佐剂组(s1+alum+c-gamp+poly i:c)相比于其他对照组诱导了更高滴度的igg2a和igg2b抗体亚型。
[0093]
实施例5：免疫小鼠脾脏细胞分泌ifn-γ的含量测定
[0094]
全程需在超净台中保持无菌操作；取空白小鼠和免疫后小鼠的脾脏，通过细胞筛研磨于5ml冷的pbs中，离心收集细胞，加入2ml红细胞裂解液，裂解3min后再次离心，收集细胞后分别用冷的pbs和培养基1640洗涤，离心；收集细胞，加入3ml完全培养基重悬细胞。
[0095]
按照达优elispot试剂盒说明书步骤进行操作：在超净台中将预包被捕获抗体的elispot板用200μl无血清培养基活化10min，倒出培养基，每孔加入100μl相应组别的细胞悬液(106cell/孔)，加入2μl s1肽库刺激，在细胞培养箱中孵育18-24h(孵育过程中严禁移动或晃动)。孵育结束后倾倒液体，加入200μl冷的去离子水，4℃放置10min裂解细胞；甩出液体，用washing buffer洗涤6次，扣干，加入100μl稀释好生物素标记的抗体，37℃孵育1h；甩出液体，用washing buffer洗涤6次，扣干，加入100μl稀释好的hrp标记的亲和素，37℃孵育1h；甩出液体，用washing buffer洗涤5次，去离子水洗2次，扣干；每孔加入100μl新鲜配制的aec显色液，37℃孵育箱显色30min；甩出液体，用去离子水洗涤5次，终止显色，将elispot板放置于阴凉处自然晾干后，elispot分析仪进行计数。
[0096]
结果如图4所示，从图4中可以看出接种2剂次疫苗后，联合佐剂组(s1+alum+c-gamp+poly i:c)诱导出了高水平的ifn-γ细胞因子，分别为无佐剂组(s1)的22倍和铝佐剂组(s1+alum)的11倍。
[0097]
实施例6：免疫小鼠脾脏cd4+,cd8+细胞水平
[0098]
脾脏淋巴细胞的收集同实例5中所述；在超净台中将重悬的细胞液加入24孔板中(每孔400μl完全培养基，200μl细胞悬液)，加入2μl肽库刺激，放入细胞培养箱中孵育；3h后取出，每孔加入4μl蛋白转运抑制剂(2μl莫能霉素和2μl布雷非德菌素a)，继续放置在细胞培养箱中孵育12h；移取细胞液至2ml ep管中，离心，弃去上清液；细胞用stain buffer(1％bsa,1％fbs,0.1％nan3,pbs)洗涤，离心，弃去上清液；每管加入500μl稀释的cd3+,cd4+和cd8+细胞染色液，混匀后置于冰中染色30min；离心，弃去上清液，stain buffer洗涤2次；每管加入250μl固定破膜液，4℃下固定10min，wash buffer洗涤2次；每管加入250μl稀释的ifn-γ和tnf-α细胞因子染色液，混匀后置于4℃避光染色30min；离心，弃去上清液，washbuffer洗涤2次，用400μl 0.1％bsa的pbs溶液重悬细胞，细胞筛过滤后流式细胞仪上机测试。
[0099]
结果如图5所示，从图5中可以看出联合佐剂组(s1+alum+c-gamp+poly i:c)诱导产生了更高比例的分泌tnf-α和ifn-γ细胞因子的cd4+和cd8+细胞。
[0100]
实施例7：免疫小鼠血清中假病毒中和抗体滴度测定
[0101]
取不同组别的免疫后小鼠血清进行热灭活处理(56℃水浴，15-30min)，将处理后的血清样品按不同浓度梯度用opti-mem稀释，移液枪吹打均匀后加入96孔板。随后将假病毒从-80℃取出，置于4℃复融，复融后的假病毒用opti-mem稀释(0.15μl假病毒/25μl稀释液)，并加入上述96孔板中，与血清样品在室温下共孵育1h。共孵育期间开始准备ace2-hek293t细胞，对ace2-hek293t细胞计数，用完全培养基(不含双抗)调整细胞浓度为300000cell/ml,放入细胞培养箱待用。血清样品与假病毒共孵育结束后，取出准备好的ace2-hek293t细胞，吹打均匀，每孔加入50μl细胞悬液，同时将边缘用pbs封闭，后将96孔板放入细胞培养箱中培养；24h后每孔再补加50μl完全培养基，继续培养24h。培养结束后小心移除孔内培养基，pbs洗涤一次，每孔加入100μl细胞裂解液，室温振荡15min，再加入80μl荧光素酶检测剂，避光，混匀后测定化学发光值。
[0102]
结果如图6和图7所示，从图6中可以看出联合佐剂组(s1+alum+c-gamp+poly i:c)的中和抗体滴度pvnt
50
高于其他对照组，分别是无佐剂组(s1，830)的13倍和铝佐剂组(s1+alum，2087)的5倍；从图7中可以看出联合佐剂组(s1+alum+c-gamp+poly i:c)对sars-cov-2的值得关注的突变株也有交叉中和能力。
[0103]
由上述疫苗免疫测试结果得知，本发明提供的联合佐剂极大提高了蛋白的免疫原性。接种2剂次疫苗后，联合佐剂组(s1+alum+c-gamp+poly i:c)诱导出了高滴度的s1特异性igg抗体，分别为无佐剂组(s1)的320倍和铝佐剂组(s1+alum)的155倍，表现出了佐剂之间良好的协同增强作用。此外，疫苗相较于铝佐剂组(s1+alum)，能产生适度和平衡的th1/th2细胞免疫应答；
[0104]
小鼠脾脏处的t淋巴细胞分泌ifn-γ细胞因子的研究结果显示：该疫苗具有激活细胞免疫的能力。接种2剂次疫苗后，联合佐剂组(s1+alum+c-gamp+poly i:c)能有效激活t淋巴细胞，分别为无佐剂组(s1)的22倍和铝佐剂组(s1+alum)的11倍；
[0105]
假病毒中和抗体测试的结果显示：联合佐剂组(s1+alum+c-gamp+polyi:c)的中和抗体滴度pvnt
50
达到了11139，远远优于其他对照，分别是无佐剂组(s1，830)的13倍和铝佐剂组(s1+alum，2087)的5倍；同时，对sars-cov-2突变株也有交叉中和能力。
[0106]
这些结果表明，本发明提供的联合佐剂系统疫苗制剂的免疫效果较传统铝佐剂的疫苗制剂有较大提升。
[0107]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种基于铝佐剂的联合佐剂系统，其特征在于，所述联合佐剂系统包含铝佐剂、干扰素基因刺激分子激动剂和toll样受体激动剂。2.根据权利要求1所述的联合佐剂系统，其特征在于，所述铝佐剂为氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂和明矾佐剂中的至少一种。3.根据权利要求1所述的联合佐剂系统，其特征在于，所述干扰素基因刺激分子激动剂为c-di-gmp、c-di-amp、3',3'-cgamp、2',3'-cgamp以及c-di-gmp、c-di-amp、3',3'-cgamp、2',3'-cgamp的硫取代物或氟取代物中的至少一种，4.根据权利要求1所述的联合佐剂系统，其特征在于，所述toll样受体激动剂含有磷酸基团；优选地，所述toll样受体激动剂包括tlr3激动剂、tlr4激动剂或tlr9激动剂中的至少一种；更优选地，所述tlr3激动剂为聚肌胞苷酸、聚腺尿苷酸、聚肌胞苷酸与聚赖氨酸和羧甲基纤维素的结合物、pic
12
u和皮卡佐剂中的至少一种；更优选地，所述tlr4激动剂为单磷酸脂质a；更优选地，所述tlr9激动剂为cpg-odn。5.一种制备权利要求1-4中任意一项所述联合佐剂系统的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)向磷酸盐缓冲溶液中加入所述干扰素基因刺激分子激动剂和所述toll样受体激动剂；(2)将步骤(1)所得溶液加入所述铝佐剂胶体中；(3)将步骤(2)所得产物在室温下涡旋混合30～60min，控制混合速率为1000～
2500rpm，然后置于3～5℃下吸附11～13h。6.权利要求1-4中任意一项所述联合佐剂系统以及权利要求5所述方法制备的联合佐剂系统在制备治疗性和预防性疫苗制剂中的应用。7.一种疫苗制剂，其特征在于，所述疫苗制剂包含联合佐剂系统和抗原蛋白或所述疫苗制剂包含联合佐剂系统和灭活病毒，其中，所述联合佐剂系统为权利要求1-4中任意一项所述联合佐剂系统以及权利要求5所述方法制备的联合佐剂系统。8.根据权利要求7所述的疫苗制剂，其特征在于，所述抗原蛋白来源于细菌、病毒、真菌、肿瘤和人为合成的抗原蛋白中的至少一种；优选地，所述病毒抗原蛋白为中东呼吸综合征冠状病毒、非典型肺炎和2019新型冠状病毒结构蛋白中的至少一种；更优选地，所述2019新型冠状病毒结构蛋白为核衣壳蛋白、突刺蛋白及核衣壳蛋白、突刺蛋白的亚单位中的至少一种。9.根据权利要求7所述的疫苗制剂，其特征在于，所述灭活病毒为灭活的流感病毒、灭活的狂犬病毒、灭活的甲型肝炎病毒、灭活的乙型肝炎病毒、灭活的乙型脑炎病毒、灭活的脊髓灰质炎病毒和灭活的冠状病毒中的至少一种。10.一种制备权利要求7-9中任意一项所述疫苗制剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：s1、向磷酸盐缓冲溶液中加入所述干扰素基因刺激分子激动剂和所述toll样受体激动剂；s2、将步骤s1所得溶液加入所述铝佐剂胶体中；s3、向步骤s2所得胶体中加入所述蛋白抗原或所述灭活病毒，混合均匀；s4、将步骤s3所得产物在室温下涡旋混合30～60min，控制混合速率为1000～2500rpm，然后置于3～5℃下吸附11～13h即得。

技术总结
本发明涉及生物技术及疫苗技术领域，公开了一种基于铝佐剂的联合佐剂系统、疫苗制剂及其制备方法与应用。所述联合佐剂系统包含铝佐剂、干扰素基因刺激分子(STING)激动剂和Toll样受体激动剂。所述疫苗制剂包含联合佐剂系统和抗原蛋白或所述疫苗制剂包含联合佐剂系统和灭活病毒。本发明提供的联合佐剂系统和疫苗制剂，采用将两种不同免疫通路受体的相关配体共吸附至铝佐剂形成紧密的配合物的方式制备而成，能够保持铝佐剂自身的形貌以及特性，可以同时诱导体液免疫和细胞免疫应答。以同时诱导体液免疫和细胞免疫应答。以同时诱导体液免疫和细胞免疫应答。


技术研发人员：郭军 杨光富 张如岩
受保护的技术使用者：华中师范大学
技术研发日：2022.02.25
技术公布日：2023/8/23