一种检测曼氏血吸虫的LAMP引物组及其应用

mediated isothermal amplification of dna，lamp)，这种新的核酸扩增技术特异性较高且快速高效。该技术的关键是需要能识别靶序列上8个特定区域的6个特异引物，和一种具有链置换特性的dna聚合酶，即bst dna聚合酶。反应恒定温度为60～65℃，时间仅需要30min到60min。lamp技术相比pcr具有以下优点：灵敏度高；特异性强；快速高效，在1h内即可完成，若在靶序列上进一步设计两条促环形成引物，扩增时间将在原来的基础上减少1/3～1/2；设备简单，在恒温金属浴锅或水浴锅中即可完成。
7.因此，目前急需一种能够既能够快速检测中间宿主螺类中曼氏血吸虫，又具备高灵敏度和特异性的方法。


技术实现要素：

8.本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种用于检测曼氏血吸虫的lamp引物组及其应用。
9.本发明的第一目的是提供一种用于检测曼氏血吸虫的lamp引物组。
10.本发明的第二目的是提供上述lamp引物组在制备检测曼氏血吸虫的试剂盒中的应用。
11.本发明的第三目的是提供一种检测曼氏血吸虫的试剂盒。
12.本发明的第四目的是提供上述lamp引物组和/或上述试剂盒在检测曼氏血吸虫中的应用。
13.本发明的第五目的是提供一种非诊断目的检测曼氏血吸虫的方法。
14.为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
15.一种用于检测曼氏血吸虫的lamp引物组，所述lamp引物组为核苷酸序列如seq id no：1～seq id no：6所示的引物组或核苷酸序列如seq id no：7～seq id no：12所示的引物组。
16.具体的，核苷酸序列如下：
[0017][0018]
现有检测曼氏血吸虫的lamp-lfd引物组的生物素和荧光标签的标记策略多为引入检测探针进行荧光标记，并在fip引物或bip引物进行生物素标记，引入检测探针虽然一定程度增加了检测特异性，但会增加引物二聚体形成风险；本发明所述lamp引物组采用3对引物对靶序列的8个特意序列区的识别，采用环引物(lf/lb)的荧光素/生物素标记策略，在lf和lb的5’端分别用生物素(biotin)标记和羧基荧光素(fam)标记，相比于引入检测探针，在保证了lamp扩增的高度特异性的同时，降低了引物二聚体形成的风险。
[0019]
侧向流动试纸条(lateral flow dipstick，lfd)检测方法是利用乳胶微球免疫层析技术，用乳胶微球标记链霉亲和素捕获扩增产物，检测线上包被羧基荧光素fam单克隆抗体，当待检样品里有biotin和biotin(fam)修饰的目标检测物时，会形成乳胶微球标记物—目标检测物—抗体复合物并富集在检测线上，形成有色沉淀线，从而特异性地检测出目标产物。lfd检测方法与lamp技术联合使用，可降低检测结果判读的难度，并具有高特异性、高灵敏度、简便、安全及成本低的特点。
[0020]
优选地，所述lamp引物组为核苷酸序列如seq id no：1～seq id no：6所示的引物组。
[0021]
本发明还请求保护上述任一所述的lamp引物组在制备检测曼氏血吸虫的试剂盒中的应用。
[0022]
一种检测曼氏血吸虫的试剂盒，所述试剂盒含有上述任一所述的lamp引物组。
[0023]
优选地，所述试剂盒还包含lamp反应试剂，所述所述lamp反应试剂为10
×
reaction buffer、mgso4、dntp mix、ddh2o和/或bst3.0 dna polymerase。
[0024]
优选地，所述试剂盒还包含lamp反应稳定剂，所述lamp反应稳定剂为液体石蜡油。
[0025]
优选地，所述试剂盒还包含lfd检测试纸条，所述lfd检测试纸条为质控线上包被有生物素抗体，检测线上包被有fam单克隆抗体的lfd检测试纸条。
[0026]
本发明还请求保护上述任一所述的lamp引物组和/或上述任一所述的试剂盒在检测曼氏血吸虫中的应用。
[0027]
优选地，所述检测曼氏血吸虫包括：鉴定或辅助鉴定曼氏血吸虫和/或检测待测样品中是否含有曼氏血吸虫。
[0028]
一种非诊断目的检测曼氏血吸虫的方法，包括以下步骤：
[0029]
s1.提取待测样品的dna，得到dna样品；
[0030]
s2.以步骤s1得到的dna样品作为模板，利用上述lamp引物组进行环介导等温扩增，收集得到环介导等温扩增产物；
[0031]
s3.将步骤s2得到的环介导等温扩增产物滴加至上述lfd检测试纸条的加样区，得到检测结果；
[0032]
lfd检测试纸条的质控线出现红色条带，检测线未出现红色条带时，检测结果为阴性，说明待测样品不含有曼氏血吸虫或曼氏血吸虫浓度低于最低检出限；lfd检测试纸条的质控线和检测线均出现红色条带时，检测结果为阳性，说明待测样品含有曼氏血吸虫；lfd检测试纸条的质控线和检测线均为出现红色条带时，检测结果失真，重新进行检测。
[0033]
优选地，步骤s1中所述待测样品为螺。
[0034]
更优选地，所述螺为光滑双脐螺。
[0035]
优选地，步骤s1所述提取待测样本的dna具体为：
[0036]
s11.将待测样品和蛋白酶k裂解液混合，于50～60℃水浴消化4～8h，得到消化后样品；
[0037]
s12.将步骤s11得到的消化后样品与有机混合液混合后进行抽提收集水相，向水相中加入异丙醇，充分反应后收集沉淀；
[0038]
所述有机混合液为体积比为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合溶液；
[0039]
s13.将步骤s12得到的沉淀用乙醇洗涤后，离心弃上清后自然晾干后，溶解于te缓冲液中得到dna样品。
[0040]
优选地，步骤s2中所述环介导等温扩增的条件为：先在63～67℃反应25～35min，接着在78～82℃反应4～6min。
[0041]
更优选地，所述环介导等温扩增的条件为：先在65℃反应30min，接着在80℃反应5min。
[0042]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0043]
本发明提供了一种用于检测曼氏血吸虫的lamp引物组，所述lamp引物组为核苷酸序列如seq id no：1～seq id no：6所示的引物组或核苷酸序列如seq id no：7～seq id no：12所示的引物组。利用本发明所述lamp引物组结合侧向流动试纸条制备得到的试剂盒在用于检测曼氏血吸虫时，特异性强，灵敏度高，能够检测到低至10-5
ng/μl的曼氏血吸虫dna；与传统pcr技术和荧光rt-pcr相比，不仅更加灵敏，还具有快速高效的优点，扩增时间可减少1/3，且操作与设备更加简单，在恒温金属浴或水浴中即可完成，减少了仪器设备、实
验场所以及操作人员的限制，有利于实现资源匮乏地区的大规模检测和野外环境中样本的现场检测，为输入性曼氏血吸虫的防控及其中间宿主媒介的监测及传播风险识别提供技术支撑。
附图说明
[0044]
图1为lamp扩增目的片段，下划线英文字母标注的序列为引物结合区域；
[0045]
图2为实施例1对应的检测结果图，其中a为琼脂糖凝胶电泳检测结果图；b为lfd检测结果图；图中m为dl2000 dna marker，1为空白对照组，2为引物组2，3为引物组1；
[0046]
图3为实施例2对应的检测结果，其中a为琼脂糖凝胶电泳检测结果图；b为显色反应结果图；c为lfd检测结果图；图中m为dl2000 dna marker，n为空白对照组；
[0047]
图4为实施例3对应的检测结果，其中a为琼脂糖凝胶电泳检测结果图；b为显色反应结果图；c为lfd检测结果图；图中m为dl2000 dna marker，n为空白对照组；
[0048]
图5为实施例5对应的检测结果，其中a为琼脂糖凝胶电泳检测结果图；b为显色反应结果图；c为lfd检测结果图；图中m为dl2000 dna marker，n为空白对照组；
[0049]
图6为实施例6对应的检测结果，其中a为琼脂糖凝胶电泳检测结果图；b为显色反应结果图；c为lfd检测结果图；图中m为dl2000 dna marker，n为空白对照组。
具体实施方式
[0050]
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0051]
以下实施例中10
×
reaction buffer、mgso4(100mm)、dntp mix(10mm)、bst3.0dna polymerase均购自neb，即纽英伦生物技术(北京)有限公司，无需再额外加入逆转录酶。
[0052]
lfd试纸条以及lfd样品稀释液均购自南京钟鼎生物技术有限公司。
[0053]
实施例1lamp特异性引物序列的设计、筛选与优化
[0054]
1、引物设计
[0055]
基于曼氏血吸虫克隆51ga序列(dq137684.1，1082bp，核苷酸序列如seq id no：13所示)，设计适用于lamp的特异性引物组合，共设计生成5组引物；图1为曼氏血吸虫51ga序列，其中下划线部分为引物结合区域。
[0056]
根据lamp引物设计原则，筛选出2组稳定性好、不易形成引物二聚体的引物组，记为引物组1和引物组2。每个引物组包括六条引物：2条外引物、2条内引物和2条环引物。
[0057]
引物组1的核苷酸序列如seq id no：1～seq id no：6所示，引物组2的核苷酸序列如seq id no：7～seq id no：12所示；具体核苷酸序列信息如表1所示。
[0058]
表1lamp引物组核苷酸序列信息
[0059]
[0060][0061]
2、引物优化筛选
[0062]
(1)模板获取与纯化
[0063]
将感染曼氏血吸虫的光滑双脐螺置于6孔板中，加入去氯水至6孔板体积的2/3处，充分给予光照释放光滑双脐螺中的尾蚴，收集尾蚴并放入装有50ml去氯水的ep管中，冰浴30min后，以6000rpm的速度离心10min，接着按照全基因组dna提取试剂盒说明书提取并纯化尾蚴dna，将提取得到的尾蚴dna溶于100μl的ddh2o中，利用nanodrop 2000可见光分光光度计(thermo scientific公司，美国)平行检测3次浓度，并用超纯水稀释至dna浓度为1ng/μl，得到曼氏血吸虫lamp-lfd检测模板。
[0064]
(2)lamp-lfd检测
[0065]
以步骤(1)得到的曼氏血吸虫lamp-lfd检测模板作为dna模板，分别利用步骤1得到的引物组1和引物组2进行lamp反应扩增，具体如下：
[0066]
引物组1的扩增体系为：2.5μl的10
×
reaction buffer、1.5μl的mgso4(100mm)、3.5μl的dntp mix(10mm)、1μl的51ga-1-f3(5μm，seq id no：1)、1μl的51ga-1-b3(5μm，seq id no：2)、4μl的51ga-1-fip(10μm，seq id no：3)、4μl的51ga-1-bip(10μm，seq id no：4)、1μl的51ga-1-lf(10μm，seq id no：5)、1μl的51ga-1-lb(10μm，seq id no：6)、3.5μl的ddh2o、1μl的bst3.0 dna polymerase(8000u/ml)和1μl检测模板。
[0067]
引物组2的扩增体系为：2.5μl的10
×
reaction buffer、1.5μl的mgso4(100mm)、3.5μl的dntp mix(10mm)、1μl的51ga-2-f3(5μm，seq id no：7)、1μl的51ga-2-b3(5μm，seq id no：8)、4μl的51ga-2-fip(10μm，seq id no：9)、4μl的51ga-2-bip(10μm，seq id no：10)、1μl的51ga-2-lf(10μm，seq id no：11)、1μl的51ga-2-lb(10μm，seq id no：12)、3.5μl
的ddh2o、1μl的bst3.0 dna polymerase(8000u/ml)和1μl检测模板。
[0068]
空白对照组设置为与扩增体系等体积的ddh2o；
[0069]
以引物组1的扩增体系为例，进行lamp扩增：将配置好的扩增体系置于ep管中，瞬时离心混匀得到混合液，并在混合液上方加入50μl液体石蜡油进行封闭，进行lamp扩增，得到扩增产物混合液；lamp扩增程序为65℃金属恒温浴反应50min，80℃金属恒温浴反应5min。
[0070]
采用lfd试纸对扩增产物进行检测(lfd检测试纸条依次设置有加样区、检测线和质控线，质控线上包被有生物素抗体，检测线上包被有fam单克隆抗体)，同时采用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物检测结果进行验证，具体如下：
[0071]
lfd检测：吸取2μl的扩增产物混合液，加入100μl的lfd样品稀释液中混合均匀得到lfd检测液。吸取50μl的lfd检测液加入lfd试纸的加样区，反应10min后读取lfd检测结果。
[0072]
lfd检测试纸条的质控线出现红色条带，检测线未出现红色条带时，检测结果为阴性，说明待测样品不含有曼氏血吸虫或曼氏血吸虫浓度低于最低检出限；lfd检测试纸条的质控线和检测线均出现红色条带时，检测结果为阳性，说明待测样品含有曼氏血吸虫；lfd检测试纸条的质控线和检测线均为出现红色条带时，检测结果失真，重新进行检测。
[0073]
琼脂糖凝胶电泳检测：取5μl扩增产物混合液，加入至含有0.5μg/ml溴化乙锭染料的2％的琼脂糖凝胶中，在180～200v下电泳30min，电泳结束后在凝胶成相系统上观察结果。
[0074]
对引物组2和空白对照组进行同等lamp扩增和检测。
[0075]
3、实验结果
[0076]
琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2a所示，其中m为dl2000 dna marker的电泳结果；1为空白对照组的电泳结果；2为引物组2的电泳结果；3为引物组1的电泳结果。结果显示：引物组1和引物组2均出现特异性梯形条带，而空白对照组未出现条带；且相较于引物组2，引物组1的凝胶电泳条带更加清晰明亮。
[0077]
lfd检测结果如图2b所示，结果显示：引物组1(编号为3)和引物组2(编号为2)对应的lfd试纸条的质控线(c)和检测线(t)均出现特异性红色条带，结果显示为阳性；空白对照组(编号为1)对应的lfd试纸条仅仅在质控线(c)出现特异性红色条带，结果显示为阴性。
[0078]
结果说明：引物组1和引物组2均能够检测出曼氏血吸虫，且lfd检测结果更为直观，琼脂糖凝胶电泳显示引物组1具有更强的扩增效率，因此后续选择引物组1(核苷酸序列如seq id no：1～seq id no：6)作为曼氏血吸虫检测试剂盒的检测引物。
[0079]
实施例2曼氏血吸虫lamp-lfd检测反应体系温度的优化
[0080]
1、实验方法
[0081]
以实施例1步骤2(1)得到的曼氏血吸虫lamp-lfd检测模板作为模板，以实施例1得到的引物组1作为lamp的扩增引物，配置lamp扩增体系。
[0082]
lamp扩增体系为：2.5μl的10
×
reaction buffer、1.5μl的mgso4(100mm)、3.5μl的dntp mix(10mm)、1μl的51ga-1-f3(5μm，seq id no：1)、1μl的51ga-1-b3(5μm，seq id no：2)、4μl的51ga-1-fip(10μm，seq id no：3)、4μl的51ga-1-bip(10μm，seq id no：4)、1μl的51ga-1-lf(10μm，seq id no：5)、1μl的51ga-1-lb(10μm，seq id no：6)、3.5μl的ddh2o、1μl
的bst3.0 dnapolymerase(8000u/ml)和1μl模板。
[0083]
将配置好的扩增体系置于ep管中，瞬时离心混匀得到混合液，并在混合液上方加入50μl液体石蜡油进行封闭，进行lamp扩增，并收集扩增产物1；lamp扩增程序为：56℃金属恒温浴反应50min，80℃金属恒温浴反应5min。
[0084]
将lamp扩增程序修改为：59℃金属恒温浴反应50min，80℃金属恒温浴反应5min，得到扩增产物2；
[0085]
将lamp扩增程序修改为：62℃金属恒温浴反应50min，80℃金属恒温浴反应5min，得到扩增产物3；
[0086]
将lamp扩增程序修改为：65℃金属恒温浴反应50min，80℃金属恒温浴反应5min，得到扩增产物4；
[0087]
将lamp扩增程序修改为：68℃金属恒温浴反应50min，80℃金属恒温浴反应5min，得到扩增产物5；
[0088]
空白对照组设置为与扩增体系等体积的ddh2o；
[0089]
按照实施例1步骤2(2)中所示方法对扩增产物1～扩增产物5进行lfd检测和琼脂糖凝胶电泳检测，记录相应的结果。
[0090]
以扩增产物1为例，进行显色反应：向25μl扩增产物1中加入1μl的荧光显色剂1000
×
sybr green i，充分混合后在自然光下观察结果；扩增产物变为绿色即为阳性，扩增产物为橙色则为阴性。
[0091]
对扩增产物2～扩增产物5进行同等显色反应，并记录结果；将空白对照组进行同等处理，并记录结果。
[0092]
2、实验结果
[0093]
琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3a所示，结果显示：温度为56℃反应30min时，琼脂糖凝胶电泳未出现明显梯形条带；空白对照组(编号为n)对应的琼脂糖凝胶电泳也未出现明显梯形条带；温度为59～68℃时，琼脂糖凝胶电泳均出现特异性梯形条带，并且在温度为65℃时，凝胶电泳条带最为清晰。
[0094]
显色反应结果如图3b所示，结果显示：反应温度为56℃时，扩增产物1颜色为橙色，结果为阴性；反应温度为59℃时，扩增产物2颜色为浅橙色，结果为弱阳性；反应温度为62～68℃时，扩增产物3～扩增产物5的颜色为绿色，结果为强阳性；空白对照组(编号为n)对应的颜色为橙色，结果为阴性。
[0095]
lfd检测结果如图3c所示，结果显示：空白对照组(编号为n)对应的lfd试纸条仅仅在质控线(c)出现特异性红色条带，结果显示为阴性；反应温度为56℃时，lfd试纸条仅仅在质控线(c)出现特异性红色条带，结果显示为阴性；反应温度为59～68℃时，lfd试纸条的质控线(c)和检测线(t)均出现特异性红色条带，结果为阳性。
[0096]
结果说明：核苷酸序列如seq id no：1～seq id no：6所示的引物组1在检测曼氏血吸虫时，lamp反应的最优温度为65℃金属恒温浴反应50min，80℃金属恒温浴反应5min。
[0097]
实施例3曼氏血吸虫lamp-lfd检测反应体系时间的优化
[0098]
1、实验方法
[0099]
按照实施例2步骤1所述方法配置lamp扩增体系，将配置好的扩增体系置于ep管中，瞬时离心混匀得到混合液，并在混合液上方加入50μl液体石蜡油进行封闭，进行lamp扩
增，并收集扩增产物6；lamp扩增程序为：65℃金属恒温浴反应20min，80℃金属恒温浴反应5min。
[0100]
将lamp扩增程序修改为：65℃金属恒温浴反应30min，80℃金属恒温浴反应5min，得到扩增产物7；
[0101]
将lamp扩增程序修改为：65℃金属恒温浴反应40min，80℃金属恒温浴反应5min，得到扩增产物8；
[0102]
将lamp扩增程序修改为：65℃金属恒温浴反应50min，80℃金属恒温浴反应5min，得到扩增产物9；
[0103]
空白对照组设置为与扩增体系等体积的ddh2o；
[0104]
按照实施例1步骤2(2)中所示方法对扩增产物6～扩增产物9进行lfd检测和琼脂糖凝胶电泳检测，记录相应的结果；按照实施例2步骤1中所示步骤对扩增产物6～扩增产物9进行显色反应。
[0105]
将空白对照组进行同等处理，并记录结果。
[0106]
2、实验结果
[0107]
琼脂糖凝胶电泳检测结果如图4a所示，结果显示：空白对照组(编号为n)对应的琼脂糖凝胶电泳也未出现明显梯形条带；反应时间为20～50min时，琼脂糖凝胶电泳均出现特异性梯形条带，反应时间为20min时，电泳条带较浅，不易于结果判断；反应时间30min后，电泳条带清洗可见。
[0108]
显色反应结果如图4b所示，结果显示：空白对照组(编号为n)对应的颜色为橙色，结果为阴性；反应时间为20min时，扩增产物6的颜色为浅橙色，结果为弱阳性；反应时间为30～50min时，扩增产物7～扩增产物9的颜色为绿色，结果为强阳性。
[0109]
lfd检测结果如图4c所示，结果显示：空白对照组(编号为n)对应的lfd试纸条仅仅在质控线(c)出现特异性红色条带，结果显示为阴性；反应时间为20～50min时，lfd试纸条的质控线(c)和检测线(t)均出现特异性红色条带，结果为阳性；反应时间为20min时，检测线(t)显色较为模糊，反应时间为30～50min时，检测线(t)清晰可见，呈现明显阳性结果。
[0110]
综上所述，核苷酸序列如seq id no：1～seq id no：6所示的引物组1在检测曼氏血吸虫时，lamp反应的最优反应程序为：65℃金属恒温浴反应50min，80℃金属恒温浴反应5min。
[0111]
实施例4一种基于lamp-lfd技术检测曼氏血吸虫的试剂盒
[0112]
1、组成
[0113]
试剂盒包含试剂盒使用试剂和检测试纸条，
[0114]
试剂盒包含试剂盒使用试剂和lfd检测试纸条。
[0115]
其中试剂盒使用试剂包括：核苷酸序列如seq id no：1～seq id no：6所示的引物组1、lamp反应试剂、液体石蜡油(lamp反应稳定剂)、0.05m的tris-hcl(ph 8.0，lfd检测样品稀释液)。
[0116]
其中lamp反应试剂包括2.5μl的10
×
reaction buffer、1.5μl的mgso4(100mm)、3.5μl的dntp mix(10mm)、3.5μl的ddh2o、1μl的bst3.0 dnapolymerase。
[0117]
lfd检测试纸条上依次设置有加样区、检测线和质控线，质控线上包被有生物素抗体，检测线上包被有fam单克隆抗体。
[0118]
2、使用方法
[0119]
s1.待测dna样品的提取
[0120]
1)将100mg的待测样本和200μl蛋白酶k裂解液混合，置于55℃水浴锅中消化4～8h，得到消化后样品；
[0121]
2)将步骤1)得到的消化后样品与等体积的有机混合液充分混合后抽提，取水相并加入与水相等体积的异丙醇，充分反应后收集沉淀；
[0122]
其中有机混合液为体积比为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合溶液；
[0123]
3)将步骤2)得到的沉淀用100μl的70％乙醇(v/v)洗涤后以8000rpm的速度离心8min，弃上清后自然晾干，用50μl的te缓冲液溶解即得待测dna样品。
[0124]
s2.环介导等温扩增
[0125]
扩增体系为：2.5μl的10
×
reaction buffer、1.5μl的mgso4(100mm)、3.5μl的dntp mix(10mm)、1μl的51ga-1-f3(5μm，seq id no：1)、1μl的51ga-1-b3(5μm，seq id no：2)、4μl的51ga-1-fip(10μm，seq id no：3)、4μl的51ga-1-bip(10μm，seq id no：4)、1μl的51ga-1-lf(10μm，seq id no：5)、1μl的51ga-1-lb(10μm，seq id no：6)、3.5μl的ddh2o、1μl的bst3.0 dna polymerase(8000u/ml)和1μl待测dna样品。
[0126]
将配置好的扩增体系置于ep管中，瞬时离心混匀得到混合液，并在混合液上方加入50μl液体石蜡油进行封闭，进行lamp扩增，得到扩增产物混合液；lamp扩增程序为65℃金属恒温浴反应30min，80℃金属恒温浴反应5min。
[0127]
s3.lfd检测
[0128]
吸取2μl步骤s2得到的扩增产物混合液，加入100μl的lfd检测样品稀释液中，混合均匀得到lfd检测液。吸取50μl的lfd检测液加入lfd检测试纸条的加样区，反应10min后读取lfd检测结果。
[0129]
3、结果判读
[0130]
lfd检测试纸条的质控线出现红色条带，检测线未出现红色条带时，检测结果为阴性，说明待测样品不含有曼氏血吸虫或曼氏血吸虫浓度低于最低检出限；lfd检测试纸条的质控线和检测线均出现红色条带时，检测结果为阳性，说明待测样品含有曼氏血吸虫；lfd检测试纸条的质控线和检测线均为出现红色条带时，检测结果失真，重新进行检测。
[0131]
实施例5一种基于lamp-lfd技术检测曼氏血吸虫的试剂盒的灵敏度测试
[0132]
1、实验方法
[0133]
将实施例1步骤2(1)得到的曼氏血吸虫lamp-lfd检测模板(dna浓度为1ng/μl)使用ddh2o进行稀释，分别得到10-1
ng/μl、10-2
ng/μl、10-3
ng/μl、10-4
ng/μl、10-5
ng/μl和10-6
ng/μl的检测dna样品。
[0134]
分别以不同浓度的检测dna样品作为待测样品，按照实施例4步骤2所示试剂盒使用方法进行检测，并按照实施例1步骤2(2)中所示方法对不同浓度的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，按照实施例2步骤1中所示步骤对不同浓度的扩增产物进行显色反应。
[0135]
空白对照组设置为与扩增体系等体积的ddh2o，按照上述处理方法进行检测。
[0136]
2、实验结果
[0137]
琼脂糖凝胶电泳检测结果如图5a所示，结果显示：空白对照组(编号为n)对应的琼脂糖凝胶电泳也未出现明显梯形条带，为阴性结果；在dna样品浓度为10-1
ng/μl、10-2
ng/μ
l、10-3
ng/μl、10-4
ng/μl和10-5
ng/μl的组别中，均出现特异性条带，呈阳性结果；dna样品浓度为10-6
ng/μl时，电泳条带模糊，呈弱阳性结果。
[0138]
显色反应结果如图5b所示，结果显示：空白对照组(编号为n)对应的颜色为橙色，结果为阴性；在dna样品浓度为10-1
ng/μl、10-2
ng/μl、10-3
ng/μl、10-4
ng/μl和10-5
ng/μl的组别中，试管内液体颜色为绿色，结果为阳性；dna样品浓度为10-6
ng/μl时，试管内液体颜色为橙色，为阴性结果。
[0139]
lfd检测结果如图5c所示，结果显示：空白对照组(编号为n)对应的lfd试纸条仅仅在质控线(c)出现特异性红色条带，结果显示为阴性；在dna样品浓度为10-1
ng/μl、10-2
ng/μl、10-3
ng/μl、10-4
ng/μl和10-5
ng/μl的组别中，对应的lfd试纸条的质控线(c)和检测线(t)均出现特异性红色条带，结果为阳性；当dna样品浓度为10-6
ng/μl时，仅仅在质控线(c)出现特异性红色条带，结果显示为阴性。
[0140]
结果说明：实施例4所示试剂盒可以检测到低至10-5
ng/μl的曼氏血吸虫dna。
[0141]
实施例6一种基于lamp-lfd技术检测曼氏血吸虫的试剂盒的特异性检测
[0142]
1、实验方法
[0143]
按照实施例1步骤2(1)所示方法，提取广州管圆线虫、日本血吸虫和曼氏血吸虫的dna，得到广州管圆线虫dna模板(ac)、日本血吸虫dna模板(sj)和曼氏血吸虫dna模板(sm)；空白对照组设置为ddh2o。
[0144]
分别以广州管圆线虫dna模板(ac)、日本血吸虫dna模板(sj)和曼氏血吸虫dna模板(sm)作为待测样品，按照实施例4步骤2所示试剂盒使用方法进行检测，并按照实施例1步骤2(2)中所示方法对不同dna模板来源的的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，按照实施例2步骤1中所示步骤对不同dna模板来源的扩增产物进行显色反应。
[0145]
对空白对照组进行同等处理检测。
[0146]
2、实验结果
[0147]
琼脂糖凝胶电泳结果如图6a所示，n为空白对照组，ac为广州管圆线虫dna模板，sj为日本血吸虫dna模板，sm为曼氏血吸虫dna模板，结果显示：仅有曼氏血吸虫dna样品对应的扩增产物的电泳结果中出现特异性梯形条带，为阳性；广州管圆线虫dna样品和日本血吸虫dna样品对应的扩增产物的电泳结果中均没有出现条带，为阴性结果。
[0148]
显色反应结果如图6b所示，结果显示：仅有曼氏血吸虫dna样品对应的扩增产物的试管中的颜色变为绿色，为阳性；广州管圆线虫dna样品和日本血吸虫dna样品对应的扩增产物的试管中的颜色均为橙色，为阴性结果。
[0149]
lfd检测结果如图6c所示，结果显示：仅有曼氏血吸虫dna样品对应的lfd试纸条的质控线(c)和检测线(t)均出现特异性红色条带，结果为阳性；广州管圆线虫dna样品和日本血吸虫dna样品对应的lfd试纸仅仅在质控线(c)出现特异性红色条带，结果显示为阴性。
[0150]
结果显示：实施例4所示试剂盒的检测特异性良好，仅仅能够特异性检测曼氏血吸虫的dna，与其他虫株无交叉反应。
[0151]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范
围之内。

技术特征：
1.一种用于检测曼氏血吸虫的lamp引物组，其特征在于，所述lamp引物组为核苷酸序列如seq id no：1～seq id no：6所示的引物组或核苷酸序列如seq id no：7～seq id no：12所示的引物组。2.根据权利要求1所示的lamp引物组，其特征在于，所述lamp引物组为核苷酸序列如seq id no：1～seq id no：6所示的引物组。3.权利要求1～2任一所述的lamp引物组在制备检测曼氏血吸虫的试剂盒中的应用。4.一种检测曼氏血吸虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1～2任一所述的lamp引物组。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含lamp反应试剂，所述lamp反应试剂为10
×
reaction buffer、mgso4、dntp mix、ddh2o和/或bst3.0 dna polymerase。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含lamp反应稳定剂，所述lamp反应稳定剂为液体石蜡油。7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含lfd检测试纸条，所述lfd检测试纸条为质控线上包被有生物素抗体，检测线上包被有fam单克隆抗体的lfd检测试纸条。8.权利要求1～2任一所述的lamp引物组和/或权利要求4～7任一所述的试剂盒在检测曼氏血吸虫中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测曼氏血吸虫包括：鉴定或辅助鉴定曼氏血吸虫和/或检测待测样品中是否含有曼氏血吸虫。10.一种非诊断目的检测曼氏血吸虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1.提取待测样品的dna，得到dna样品；s2.以步骤s1得到的dna样品作为模板，利用权利要求1～2任一所述的引物组进行环介导等温扩增，收集得到环介导等温扩增产物；s3.将步骤s2得到的环介导等温扩增产物滴加至权利要求7中所述lfd检测试纸条的加样区，得到检测结果；lfd检测试纸条的质控线出现红色条带，检测线未出现红色条带时，检测结果为阴性，说明待测样品不含有曼氏血吸虫或曼氏血吸虫浓度低于最低检出限；lfd检测试纸条的质控线和检测线均出现红色条带时，检测结果为阳性，说明待测样品含有曼氏血吸虫；lfd检测试纸条的质控线和检测线均为出现红色条带时，检测结果失真，重新进行检测。

技术总结
本发明公开了一种用于检测曼氏血吸虫的LAMP引物组，所述LAMP引物组为核苷酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6所示的引物组或核苷酸序列如SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：12所示的引物组。利用本发明所述LAMP引物组结合侧向流动试纸条制备得到的试剂盒在用于检测曼氏血吸虫时，特异性强，灵敏度高，能够检测到低至10-5


技术研发人员：吴忠道 胡云逸 沈佳 孙希
受保护的技术使用者：中山大学
技术研发日：2023.05.24
技术公布日：2023/8/23