甘肃贝母中异甾体生物碱岷贝素甲的分离方法及抗阿尔茨海默病药物的应用

1.本发明涉及制药行业中中药提取制备领域，特别是甘肃贝母中一种异甾体生物碱的分离方法及作为治疗阿尔兹海默病药物的应用。


背景技术：

2.贝母属植物主要分布于北半球温带地区，特别是地中海区域、北美洲和亚洲中部。该属植物独特的化学结构和药理活性使其持续成为研究热点。不少研究都紧紧围绕着贝母药材的药理活性、化学成分、临床应用、作用机制等方面开展，取得了许多重要成果。甘肃贝母(fritillaria przewalskii maxim)属于百合科贝母属多年生草本植物，又称“岷贝”，主产于甘肃南部，为甘肃省名贵药材之一。其鳞茎在使用中常被用作镇咳、平喘、祛痰和降压药，收载于1985年版至今《中国药典》一部各版的川贝母项下。
3.阿尔茨海默症(alzheimer’s disease，ad)是一种神经退行性疾病，多发于60岁以上的老年人群。ad的临床症状包括认知和行为能力的逐渐下降，最终导致记忆衰退、混乱和日常活动的困难，其不仅给家人带来沉重的压力，也给社会造成了严重的经济负担。然而迄今为止，还没有发现能阻止或逆转ad的治疗方法，只有极少数药物能够适当延缓ad发展，减轻临床症状。
4.目前关于ad的发病机制，有以下几种假说：胆碱能假说、tau蛋白过度磷酸化、aβ淀粉样沉积、氧化应激反应等，除这些之外，也有推测其发病机制与基因的突变、神经细胞损伤、血糖和脑损伤有关。其中被广泛认可的是胆碱能假说，胆碱能通路受损是公认的ad发病机制之一，由于乙酰胆碱酯酶(ache)广泛分布于人脑中的神经组织，它可以降解突触间隙的神经递质乙酰胆碱，因而通过抑制ache活性，可维持乙酰胆碱在突触间隙的正常水平，使胆碱能神经信号传递正常，恢复ad患者的认知障碍。迄今ache抑制剂是临床主要使用的抗ad药物，这包括选择性ache抑制剂多奈哌齐和加兰他敏，在我国还有石杉碱甲。近年来有研究表明，丁酰胆碱酯酶(bche)也可以代偿性地降解乙酰胆碱。在ad发病与进展过程中，bche的含量、活性和表达部位均有所改变。特别在ad发展中后期，ache的作用急剧下降，而bche的功能则大幅上升。因此对ad中后期来说bche是相当重要的药物作用靶标。
5.一直以来，天然产物在中枢神经系统药物或先导化合物的开发过程中占据着非常重要的角色，而在抗ad药物研究方面尤为活跃。从植物中寻找具有结构新颖、活性强的胆碱酯酶(即ache和bche)抑制剂成为医药领域研究的热点。近年贝母属植物中异甾体生物碱具有显著胆碱酯酶抑制作用的研究屡有报道，但甘肃贝母中此类活性成分迄今未知。为此我们对甘肃贝母中异甾体生物碱类化学成分进行了深入挖掘，对其胆碱酯酶抑制活性进行了筛选研究。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对上述技术分析，提供了一种甘肃贝母中异甾体类生物碱作为
治疗阿尔兹海默病药物的制备及应用。该制备方法为从甘肃贝母中分离并鉴定出化合物岷贝素甲，经过药理学筛选，发现岷贝素甲能有效抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性。
7.本发明的技术方案概述如下：
8.岷贝素甲，属于异甾体类生物碱，其分子式为c
27h43
no3，具有式(i)的结构：
[0009][0010]
岷贝素甲的分离方法，包括如下步骤：
[0011]
(1)以甘肃贝母的干燥鳞茎为原料，粉碎后加入原料8-10质量倍的乙醇(或甲醇)溶剂，加热回流提取2-3次，每次提取2-3小时，依次过滤得到其提取液。然后加入原料6-10质量倍的体积分数为20％-80％的乙醇水溶液(或甲醇水溶液)，回流提取2-3次，每次提取2-3小时，依次过滤得到其提取液。将两部分提取液旋转蒸发至无乙醇后，加少量水混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇溶剂进行萃取，每种溶剂萃取2-3次，每次1-3小时，回收溶剂后依次得到石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷和正丁醇浸膏；
[0012]
(2)将二氯甲烷浸膏与硅胶拌样后干法上样，然后以硅胶柱进行梯度柱层析分离，具体做法是依次以石油醚、体积比为20∶1的石油醚-乙酸乙酯混合液、乙酸乙酯、二氯甲烷、体积比为20∶1的二氯甲烷-甲醇混合液、体积比为15∶1的二氯甲烷-甲醇混合液、体积比为10∶1的二氯甲烷-甲醇混合液、体积比为5∶1的二氯甲烷-甲醇混合液、甲醇为洗脱剂进行梯度柱层析；
[0013]
(3)将上述体积比为20∶1的石油醚-乙酸乙酯混合液洗脱的流分合并浓缩，将所得物质继续以体积比为5∶1的石油醚-乙酸乙酯混合液为洗脱液进行硅胶柱层析，之后以甲醇为洗脱剂的sephadex lh-20凝胶柱纯化，最后再以体积比为2∶1的甲醇-水混合液为洗脱剂的toyopeal hw-40凝胶柱纯化，得到式i所示岷贝素甲。
[0014]
本发明的优点是：本发明通过从甘肃贝母中提取分离的方法成功制得化合物岷贝素甲，且以本发明提供的岷贝素甲经过ellman法胆碱酯酶抑制活性测试，发现岷贝素甲能有效地抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性，制成治疗药物后可用于阿尔兹海默病患者的治疗。经检索，化合物岷贝素甲为未见文献报道的新化合物。
具体实施方式
[0015]
实施例1
[0016]
岷贝素甲的分离方法，包括如下步骤：
[0017]
(1)以甘肃贝母的干燥鳞茎(10kg)为原料，粉碎后加入原料9质量倍的甲醇溶剂，水加热回流提取3次，每次提取3小时，依次过滤得到其提取液。然后加入原料7质量倍的体积分数为50％的乙醇水溶液，回流提取3次，每次提取2小时，依次过滤得到其提取液。将两部分提取液旋转蒸发至无乙醇后，加少量水混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇四种有机溶剂进行萃取，每种溶剂萃取2次，每次1小时，回收溶剂后依次得到各部分浸膏；
[0018]
(2)将二氯甲烷浸膏与硅胶拌样后干法上样，然后以硅胶柱进行梯度柱层析分离，先后以石油醚
→
石油醚∶乙酸乙酯(20∶1，v∶v)
→
乙酸乙酯
→
二氯甲烷∶甲醇(20∶1，v∶v)
→
二氯甲烷∶甲醇(15∶1，v∶v)
→
二氯甲烷∶甲醇(10∶1，v∶v)
→
二氯甲烷∶甲醇(5∶1，v∶v)
→
纯甲醇为洗脱剂进行梯度柱层析，每份接收150ml，共收集245份流分；
[0019]
(3)将上述石油醚∶乙酸乙酯(20∶1，v∶v)洗脱时所得的32至47流分合并后，继续以石油醚∶乙酸乙酯(5∶1，v∶v)为洗脱剂进行硅胶柱层析，每份接收150ml，共收集32份流分，其中4至11份合并，再经纯甲醇为洗脱剂的sephadex lh-20凝胶柱纯化，然后再经以甲醇∶水(2∶1，v∶v)为洗脱剂的toyopeal hw-40凝胶柱纯化，得到固体粉末化合物i(3.4mg)。
[0020]
将所得化合物i进行波谱测试，所得数据如下：
[0021]
hr-esi-ms(positive mode)m/z：430.3336[m+h]
+
(calculated for c
27h44
no3，430.3321)，确定此化合物分子式为c
27h43
no3；1h-nmr(400mhz，cdcl3)δ：1.26(m，1h，h-1α)，1.57(m，1h，h-1β)，1.45(m，1h，h-2β)，1.84(m，1h，h-2α)，3.56(m，1h，w
1/2
＝24.0hz，h-3α)，1.43(m，1h，h-4β)，1.95(m，1h，h-4α)，2.12(d，1h，j＝11.8hz，h-5α)，1.96(m，1h，h-7β)，2.51(m，1h，h-7α)，1.68(m，1h，h-8β)，1.70(m，1h，h-9α)，1.20(m，1h，h-11β)，1.85(m，1h，h-11α)，1.96(m，1h，h-12α)，2.13(d，1h，j＝12.6hz，h-13β)，1.75(m，1h，h-14α)，1.55(m，1h，h-15α)，1.76(m，1h，h-15β)，1.79(m，1h，h-16α)，1.97(m，1h，h-16β)，0.74(m，1h，h-17α)，2.63(m，1h，h-18α)，3.26(d，1h，j＝11.6hz，h-18β)，0.77(s，3h，h-19)，1.79(m，1h，h-20β)，0.88(d，3h，j＝6.9hz，h-21)，2.47(m，1h，h-22α)，1.03(m，1h，h-23α)，1.73(m，1h，h-23β)，1.87(m，1h，h-24β)，0.98(m，1h，h-24α)，2.61(m，1h，h-25α)，3.22(d，1h，j＝7.7hz，h-26α)，2.63(m，1h，h-26β)，0.90(d，3h，j＝7.0hz，h-27)；
13
c-nmr(100mhz，cdcl3)δ：36.7(c-1)，30.5(c-2)，70.8(c-3)，30.0(c-4)，56.9(c-5)，210.8(c-6)，45.8(c-7)，39.2(c-8)，56.6(c-9)，38.3(c-10)，28.3(c-11)，40.6(c-12)，38.4(c-13)，44.0(c-14)，24.2(c-15)，23.8(c-16)，45.7(c-17)，72.4(c-18)，12.6(c-19)，35.3(c-20)，14.5(c-21)，76.3(c-22)，24.3(c-23)，32.2(c-24)，25.5(c-25)，75.3(c-26)，18.4(c-27).
[0022]
由上述数据鉴定结构，确定化合物i为未见文献报道的新化合物，命名为岷贝素甲。其结构如下所示：
[0023][0024]
实施例2
[0025]
岷贝素甲的分离方法，包括以下步骤：
[0026]
(1)以甘肃贝母的干燥鳞茎(3kg)为原料，粉碎后加入原料8质量倍的乙醇溶剂，加热回流提取2次，每次提取2小时，依次过滤得到其提取液。然后加入原料8质量倍的体积分数为70％的甲醇水溶液，回流提取2次，每次提取3小时，依次过滤得到其提取液。将两部分提取液旋转蒸发至无乙醇后，加少量水混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇四种有机溶剂进行萃取，每种溶剂萃取3次，每次3小时，回收溶剂后依次得到各部分浸膏；
[0027]
步骤(2)-(3)同实施例1中步骤(2)-(3)。
[0028]
实施例3
[0029]
岷贝素甲的分离方法，包括以下步骤：
[0030]
(1)以甘肃贝母的干燥鳞茎(5kg)为原料，粉碎后加入原料10质量倍的甲醇溶剂，加热回流提取3次，每次提取2小时，依次过滤得到其提取液。然后加入原料6质量倍的体积分数为20％的乙醇水溶液，回流提取3次，每次提取2小时，依次过滤得到其提取液。将两部分提取液旋转蒸发至无乙醇后，加少量水混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇四种有机溶剂进行萃取，每种溶剂萃取2次，每次2小时，回收溶剂后依次得到各部分浸膏；
[0031]
步骤(2)-(3)同实施例1中步骤(2)-(3)。
[0032]
实施例4
[0033]
岷贝素甲的胆碱酯酶抑制活性检测
[0034]
采用改进的ellman法对甘肃贝母中分离提取出的岷贝素甲进行乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶抑制活性的测定。
[0035]
在96孔板中依次加入140μl 100mm的pbs缓冲液，20μl 0.05u/ml的ache(或20μl 0.05u/ml bche)，20μl待测化合物岷贝素甲，混合均匀后放入25℃恒温箱中培养15分钟。然后加入10μl 10.0mm dntb和10μl7.5mm atci(或10μl 7.5mm btci)，再放入恒温箱中，在37℃下培养30分钟后，测量96孔板中溶液在412nm下的吸光值大小。用20μl 0.01mol/l的dmso作为阴性对照，用20μl加兰他敏代替待测化合物作为阳性对照，空白组则是通过加入20μl100mm的pbs缓冲液代替待测化合物。每组数据平行做3次，取平均值。
[0036]
抑制率的计算方法如下：
[0037]
抑制率＝(空白组-实验组)/空白组
×
100％
[0038]
活性结果(ic
50
值)见表1。
[0039]
结果表明岷贝素甲能有效地抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的活性，对乙酰胆碱酯酶的抑制活性更强。从而说明本发明的岷贝素甲、含岷贝素甲的甘肃贝母提取物、含岷贝素甲的组合物能制备成治疗乙酰和/或丁酰胆碱不足相关联疾病的药物。乙酰胆碱不足相关联的疾病包括阿尔茨海默病、重症肌无力、青光眼等。
[0040]
表1 岷贝素甲对胆碱酯酶抑制的活性结果(ic
50
值)
[0041][0042]
本发明所述化合物岷贝素甲具有药理活性，因此，含有化合物岷贝素甲的甘肃贝母提取物或含有岷贝素甲的组合物也具有药理活性。

技术特征：
1.岷贝素甲，其特征是具有式(i)的结构：2.权利要求1所述岷贝素甲的分离方法，其特征在于包括如下步骤：(1)以甘肃贝母的干燥鳞茎为原料，粉碎后加入原料8-10质量倍的乙醇(或甲醇)溶剂，加热回流提取2-3次，每次提取2-3小时，依次过滤得到其提取液。然后加入原料6-10质量倍的体积分数为20％-80％的乙醇水溶液(或甲醇水溶液)，回流提取2-3次，每次提取2-3小时，依次过滤得到其提取液。将两部分提取液旋转蒸发至无乙醇后，加少量水混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇溶剂进行萃取，每种溶剂萃取2-3次，每次1-3小时，回收溶剂后依次得到石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷和正丁醇浸膏；(2)将二氯甲烷浸膏与硅胶拌样后干法上样，然后以硅胶柱进行梯度柱层析分离，具体做法是依次以石油醚、体积比为20∶1的石油醚-乙酸乙酯混合液、乙酸乙酯、二氯甲烷、体积比为20∶1的二氯甲烷-甲醇混合液、体积比为15∶1的二氯甲烷-甲醇混合液、体积比为10∶1的二氯甲烷-甲醇混合液、体积比为5∶1的二氯甲烷-甲醇混合液、甲醇为洗脱剂进行梯度柱层析；(3)将上述体积比为20∶1的石油醚-乙酸乙酯混合液洗脱的流分合并浓缩，将所得物质继续以体积比为5∶1的石油醚-乙酸乙酯混合液为洗脱液进行硅胶柱层析，之后以甲醇为洗脱剂的sephadex lh-20凝胶柱纯化，最后再以体积比为2∶1的甲醇-水混合液为洗脱剂的toyopeal hw-40凝胶柱纯化，得到式i所示岷贝素甲。3.权利要求1的岷贝素甲在制备抗阿尔茨海默病药物以及抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的药物中的应用。4.包含权利要求1的岷贝素甲的甘肃贝母提取物。5.权利要求4的甘肃贝母提取物在制备抗阿尔茨海默病药物以及抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的药物中的应用。6.一种药物组合物，其特征是包含权利要求1的岷贝素甲或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。7.权利要求6的药物组合物在制备抗阿尔茨海默病药物以及抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了岷贝素甲及分离方法及应用，岷贝素甲是具有式(I)的结构：本发明的岷贝素甲为新化合物，能有效地抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性，提示本发明化合物可作为抗阿尔茨海默病的药物。合物可作为抗阿尔茨海默病的药物。


技术研发人员：刘玉明 张淑丽 马瑞雪
受保护的技术使用者：天津理工大学
技术研发日：2022.02.14
技术公布日：2023/8/23