FAH和HPD基因敲除兔模型的构建方法和应用与流程

fah和hpd基因敲除兔模型的构建方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及fah和hpd基因敲除兔模型的构建方法和应用。


背景技术：

2.酪氨酸血症(tyrosinemia)是一种罕见的常染色体隐性遗传代谢病，由于酪氨酸降解障碍导致脑、肝、肾、骨骼等多脏器损害，预后不良，致死及致残率很高。
3.人延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fumaroylacetoacetate hydrolase，fah)位于染色体15q25.1，主要在肝和肾中表达，是酪氨酸代谢通路最后一步的酶。fah缺失会导致其上游中间代谢产物在肝细胞中积累，并通过旁代谢通路转化为琥珀酰乙酰乙酸(succinylacetoacetate，saa)和琥珀酰丙酮(succinylacetone，sa)。这两种代谢产物与其它蛋白的巯基结合，影响其功能，最终造成肝、肾损伤，形成i型遗传性酪氨酸血症(ht1)，大多数ht1患者在婴儿早期就会死于急性严重的肝肾功能衰竭。ht1目前的治疗方法主要通过饮食、药物或肝移植治疗控制疾病，降低血酪氨酸及其代谢产物水平，减轻酪氨酸及其代谢产物对机体的损伤，目前没有简便且有效的治愈方法。
4.4-羟基苯丙酮酸氧化酶(4-oh phenylpyruvate dioxygenase，4hppd/hpd)作为一种参与大多数生物体内酪氨酸分解代谢第二步所需的酶，存在于哺乳动物的肝和肾中，能够将4-羟基苯丙酮酸转化为尿黑酸。在iii型酪氨酸血症(mckusick 27671)中，该酶活性低甚至不存在，临床上主要表现为血清酪氨酸水平和尿液4-羟基苯丙酮酸、4-羟基苯乳酸、4-羟基苯乙酸水平显著升高。患者通常会出现神经异常、智力迟钝和轻度共济失调，但尚未确定一致的表型。越来越多的人开始关注这种疾病以及hpd阻滞的后果。
5.通过基因编辑分析基因对于疾病的影响，可以更好的了解该疾病的具体发病机制，但目前尚无研究阐明fah与hpd基因缺失对于动物肝脏影响及酪氨酸败血症的相关影响。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供fah和hpd基因敲除兔模型的构建方法和应用，本发明提供了利用crispr-cas9技术敲除fah和hpd基因，构建条件性肝损伤兔模型，探究该基因对于动物肝脏影响的采用敲除技术建立fah/hpd敲除兔模型的方法。
7.本发明提供了如下任意项在敲除fah和/或hpd基因中的应用：
8.(1)如seq id no:1所示核苷酸序列的靶序列；和/或
9.(2)如seq id no:2所示核苷酸序列的靶序列。
10.本发明提供了敲除fah和hpd基因的sgrna，包括：
11.①
、如seq id no:3所示核苷酸序列的第一sgrna；和/或
12.②
、如seq id no:4所示核苷酸序列的第二sgrna。
13.本发明提供了敲除fah和hpd基因的试剂，包括cas9 mrna和的第一sgrna和第二
sgrna。
14.在一些具体实施例中，所述试剂中cas9 mrna和第一sgrna或第二sgrna的质量比为4:1。
15.采用上述质量比的所述试剂，在进行fah和hpd基因敲除时的敲除效率更高，脱靶率更低，从而获得更准确的试验效果。
16.本发明还提供了所述试剂的制备方法，包括分别构建所述第一sgrna、第二sgrna和cas9 mrna的表达载体，体外转录合成所述第一sgrna、第二sgrna和cas9 mrna。
17.进一步的，所述第一sgrna和第二sgrna的制备方法包括：
18.根据所述的第一sgrna合成如seq id no:5和seq id no:6所示核苷酸序列的第一寡聚核苷酸链，根据所述的第二sgrna合成如seq id no:7和seq id no:8所示核苷酸序列第二寡聚核苷酸链，取所述的第一寡聚核苷酸链和第二寡聚核苷酸链经退火形成双链dna，所述双链dna与经酶切线性化的u6载体重组连接和转化，获得所述第一sgrna表达载体和第二sgrna表达载体并经酶切线性化后，作为模板进行体外转录，合成所述第一sgrna和第二sgrna。
19.进一步的，在所述cas9 mrna的制备方法包括：取cas9表达质粒经酶切线性化后作为模板进行体外转录，合成所述cas9 mrna。
20.本发明提供了fah和hpd基因敲除动物模型的构建方法，包括取如下ⅰ或ⅱ导入受精卵进行敲除：
[0021]ⅰ、所述的试剂；
[0022]ⅱ、所述制备方法制得的试剂。
[0023]
进一步的，所述敲除的步骤包括：将所述第一sgrna和第二sgrna分别与所述cas9 mrna组成混合物注射到受精卵细胞质后，体外培养发育至桑椹胚时期，经鉴定验证阳性胚胎。
[0024]
在一些具体实施例中，所述受精卵包括兔受精卵。
[0025]
本发明提供了采用所述的构建方法构建的fah和hpd基因敲除兔模型。
[0026]
本发明还提供了检测fah和hpd基因敲除的试剂，包括fah基因和hpd基因鉴定引物组，其中：
[0027]
所述fah基因鉴定引物组包括如seq id no:9所示核苷酸序列的上游引物和如seq id no:10所示核苷酸序列的下游引物；
[0028]
所述hpd基因鉴定引物组包括如seq id no:11所示核苷酸序列的上游引物和如seq id no:12所示核苷酸序列的下游引物。
[0029]
本发明提供了用于制备fah和hpd基因敲除兔模型的sgrna、试剂、所述试剂的制备方法、fah和hpd基因敲除兔模型的制备方法以及检测fah和hpd基因敲除的试剂。通过本发明的实验发现，与单基因敲除兔模型相比，本发明提供的fah/hpd双基因敲除兔模型能够更好地模拟ⅲ型酪氨酸血症，并且该模型的获得能够在给予相应hga刺激后模拟临床ⅰ酪氨酸血症肝功能病的病理过程，能更有效地预测新疫苗、新药和新诊断试剂等在临床应用中的效果，同时大大降低新药研发的风险，为临床研究提供基础模型。
附图说明
[0030]
图1示f0代兔子fah基因潜在脱靶基因位点测序情况；
[0031]
图2示f0代兔子fah基因靶点编辑验证测序结果；
[0032]
图3示f0代兔子hpd基因潜在脱靶基因位点测序情况；
[0033]
图4示f0代兔子hpd基因靶点编辑验证测序结果；
[0034]
图5示不同敲除情况兔子中fah基因表达情况；
[0035]
图6示不同敲除情况兔子中hpd基因表达情况；
[0036]
图7示不同敲除情况兔子中酪氨酸转氨酶(tat)、同源酸1、2-双加氧酶(hgd)和谷胱甘肽s-转移酶zeta1(gstz1)的mrna表达情况；
[0037]
图8示不同敲除情况兔子中天冬氨酸转氨酶(细胞质)、天冬氨酸转氨酶(线粒体)、氢嘧啶脱氢酶和巨噬细胞移动抑制因子的基因表达情况；
[0038]
图9示hpd+/+fah+/-和hpd-/-fah-/-敲除兔子中fah和hpd蛋白的wb验证结果；
[0039]
图10示hpd+/+fah+/-和hpd-/-fah-/-敲除兔子肝脏免疫组化结果；
[0040]
图11示hpd+/+fah+/-和hpd-/-fah-/-敲除兔子肾脏免疫组化结果。
具体实施方式
[0041]
本发明提供了fah和hpd基因敲除兔模型的构建方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0042]
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0043]
实施例1fah和hpd基因敲除兔模型的构建
[0044]
①
、构建sgrna：
[0045]
在fah基因第1个外显子处选取1个sgrna序列作用靶点，合成两对寡聚核苷酸链5
’‑3’
，其中fah及hpd基因的靶序列、sgrna序列及两对寡聚核苷酸链序列如下：
[0046]
fah基因靶序列：
[0047]
acatccctgggggacccgtccagctttctgtgcaaatgagctttgcccgcccgaggctttcccctgctgaccacgccgtctcctcccagcccagaccccggattggcgtggccatcggcgaccagatcctggacctgagtgccatcaagcacctcttcacagggcctgtcctctcccaacaccaggatgtcttcgatgag(seq id no:1)；
[0048]
hpd基因靶序列：
[0049]
gtacctgagaaacctgcagttccaccgcttctggtccgtggacgacacgcaggtgcacacagagtacagctccctgcgctccatcgtggtggccaactacgaggagtccatcaaaatgcccatcaacgagccagcgcctggccgcaagaagtcccagatccaggtgggggctcccctgcctgggggaggggaaggcaggg(seq id no:2)；
[0050]
fah基因的sgrna序列(第一sgrna)：aaatgagctttgcccgcccg(seq id no:3)；
[0051]
hpd基因的sgrna序列(第二sgrna)：actacgaggagtccatcaaa(seq id no:4)；
[0052]
第一寡聚核苷酸链：
[0053]
fah-f：caccgaaatgagctttgcccgcccg(seq id no:5)；
[0054]
fah-r：gggcaaagctcatttcaaacaaa(seq id no:6)；
[0055]
第二寡聚核苷酸链：
[0056]
hpd-f：caccgactacgaggagtccatcaaa(seq id no:7)；
[0057]
hpd-r：tttgatggactcctcgtagtcaaa(seq id no:8)。
[0058]
②
、合成双链dna：
[0059]
两条合成的寡聚核苷酸链经退火形成双链dna；反应条件：95℃5min后室温放置1h；双链dna反应体系(10ul)如表1所示。
[0060]
表1双链dna反应体系
[0061][0062]
③
、u6载体线性化：
[0063]
u6载体在与
②
中合成的dna连接时，需要先经bas1线性化，并回收纯化；酶切反应体系(50ul)如表2所示，配制后37℃，酶切过夜。
[0064]
表2酶切反应体系
[0065][0066]
④
、连接u6载体和双链dna：
[0067]
按如下连接体系进行混样，简短离心，放入16℃连接仪连接过夜，连接反应体系(10ul)如表3所示，配制后16℃反应30min。
[0068]
表3连接反应体系表
[0069][0070]
⑤
、转化：
[0071]
(1)从-80℃冰箱取50μl感受态细菌，加入10μl
④
中的连接产物，混匀，在冰上冷却30分钟；
[0072]
(2)42℃水浴热激90s，冰上冷却2分钟；
[0073]
(3)加200μl lb液体培养基，在恒温震荡培养箱37℃，250rpm震荡培养30min；
[0074]
(4)吸取200μl菌液均匀地涂布在氨苄抗性lb平板上，放于37℃恒温培养箱中培养12小时；
[0075]
⑥
、单克隆的挑取及质粒dna的提取：
[0076]
从培养基中挑取单菌落，接种于5ml液体lb培养基中，培养基中含65μl氨苄青霉素，放于摇床中，37℃培养12-14h；将细菌中的质粒提取出来；
[0077]
⑦
、鉴定质粒测序
[0078]
使用u6通用引物对质粒进行测序分析，测序连接正确后可用于后续实验；
[0079]
⑧
、cas9表达质粒，经酶切线性化，用于体外转录；cas9mrna的合成在体外利用t7rna聚合酶完成，酶切37℃3h，电泳跑胶后，使用普通dna琼脂糖胶回收试剂盒进行回收；酶切体系如下表4所示。
[0080]
表4酶切体系
[0081][0082]
⑨
、受精卵的获取和显微注射
[0083]
注射卵泡刺激素，之后注射人绒毛膜促性腺激素，获取受精卵，通过显微注射仪器将预混合好的cas9mrna与第一sgrna或第二sgrna混合物注射到细胞质中，其中cas9mrna(400ng/μl)和sgrna(200ng/μl)的体积比为2:1。
[0084]
⑩
、体外培养受精卵并进行发育
[0085]
将显微注射的受精卵转移到培养液中，置于37℃恒温培养箱中培养，发育到桑椹胚时期时，用吸卵针将单个胚胎转移到离心管中，用于后面实验；
[0086]
胚胎fah和hpd基因敲除情况鉴定
[0087]
显微注射后的胚胎，体外培养5d后，取出发育至桑椹胚期的胚胎，放于pbs中清洗3次后，收集单个胚胎至于pcr管中，在单个胚胎中加入5μl np40裂解液进行胚胎裂解，裂解条件为：56℃，1h；95℃，10min，以裂解产物为模板，使用pcr上游和下游引物进行pcr扩增，电泳鉴定，并进行dna测序，得到基因型鉴定结果，pcr体系如下表5所示，pcr程序如下表6所示，设计pcr引物如下：
[0088]
fah
[0089]
上游引物：cttgagaaggggcttggacc(sense)(seq id no:9)
[0090]
下游引物：aggtgcttgatggcactcag(antisense)(seq id no:10)
[0091]
hpd
[0092]
上游引物：tctcaaagcaaccgacctcc(sense)(seq id no:11)
[0093]
下游引物：gaggaaggagttctcaccgc(antisense)(seq id no:12)表5pcr体系
[0094][0095]
表6 pcr程序
[0096][0097]
验证成功后，注射sgrna的单细胞受精卵移植，母兔子的产后护理和新生兔子的基因鉴定和病理验证进行规范化饲养。
[0098]
实施例2靶点验证
[0099]
采用实施例1中新生兔子进行脱靶率检测，确保我们的sgrna有较低的脱靶。脱靶验证结果如图1及图3所示，双敲突变体中的fah和hpd基因如图2及图4所示，表7示本发明潜在脱靶基因及位点信息，其中包括第一sgrna与第二sgrna，另外，表中fah-sg2 rna pots和hpd-sg2 rna pots为实验过程中设置的另外一个sgrna序列，潜在脱靶基因位点序列中加粗斜体序列为潜在脱靶位点。
[0100]
结果发现，双敲突变体中fah和hpd基因均有敲除(如图2及图4所示)。在双敲和单敲兔子的潜在脱靶位点上，包括fah基因的两个sgrna(第一sgrna和fah-sg2 rna pots)对应的潜在靶点、hpd基因的两个sgrna(第二sgrna和hpd-sg2 rna pots)对应的潜在靶点(如表7所示)，均未观察到脱靶突变(如图1及图3所示)，证明，本发明提供的sgrna能够有效的靶向敲除fah和hpd基因，且准确率高。
[0101]
表7潜在脱靶基因及位点信息
[0102]
[0103]
[0104][0105]
实施例3f0代兔子qpcr鉴定分析
[0106]
取f0代兔子组织进行qpcr检测，具体实验步骤如下：
[0107]
每50mg组织，1ml trizol，匀浆，最大转速瞬离匀浆管。将溶液吸入到新的ep管中，室温放置5min。加入0.2ml(1/5trizol)氯仿，剧烈混匀，溶液呈现乳状，室温静置5min，4℃12000g离心15min。吸取上层水相于新的ep管中(注意不要吸到中间层，一般1ml trizol可以吸到400-500ul液体)。加入1.5倍体积的异丙醇(600ul)，上下颠倒混匀，室温静置10min，4℃12000g离心10min。弃上清，注意不要弃去rna白色沉淀，加入1ml 75％乙醇(用depc水配)洗涤三次，室温晾干5-10min。加入30ul depc水溶解rna。
[0108]
去除基因组dna反应：全波长酶标仪测出rna浓度(单位ng/ul)；按照以下表8剂量配制10ul体系。
[0109]
表8去除基因组dna反应体系
[0110]
试剂使用量5
×
gdna eraser buffer2μlbuffer 2.0μl gdna eraser1ultotal rna1ug/rna浓度rnase free dh2oup to10 ul
[0111]
pcr程序：42℃2min；4℃∞。
[0112]
反转录反应：按照以下表9剂量配制20ul体系.
[0113]
表9反转录反应体系
[0114]
试剂使用量步骤1的反应液10ulprimescript rt enzyme mix i1ulrt primer mi1ul5
×
primescript buffer 2(for real time)4ulrnase free dh2o4ultotal20ul
[0115]
pcr程序：37℃15min；85℃5s；4℃∞
[0116]
real time pcr：按照以下表10剂量配制20ul体系。
[0117]
表10 real time pcr反应体系
[0118]
试剂使用量sybr@premix ex taqii(2x)10ulf primer(10um)0.8ulr primer(10um)0.8ulrox reference ii0.4ul反应2的dna模板2ulddh2o6ul
[0119]
在qpcr仪选择96孔板进行扩增，对结果进行分析。
[0120]
结果如图5～8所示，其中，hpd-/-为敲除hpd基因纯合子，fah-/-为敲除fah基因纯合子(单fah基因敲除纯合子致死)，hpd-/+fah-/+为敲除hpd和fah基因杂合子，hpd+/+fah-/+为敲除fah的杂合子，hpd-/-fah-/-为敲除hpd和fah基因纯合子。
[0121]
图5为hpd-/+fah-/+、hpd+/+fah-/+和hpd-/-fah-/-敲除兔中fah基因的表达结果，由图可知，与wt相比，在双敲兔子中fah不表达，在单敲兔子中fah处于低表达；图6为hpd-/+fah-/+、hpd+/+fah-/+和hpd-/-fah-/-敲除兔中hpd基因的表达结果，由图可知，与wt相比，在双敲的兔子中hpd不表达，单敲兔子hpd处于低表达。由图5与图6结果可知，fah和hpd双敲兔模型构建成功，可用于后续推广应用。
[0122]
tat、hgd和gstz1是与酪氨酸血症的相关蛋白，在酪氨酸通路受阻后表达量降低。图7表明，相比wt，hpd-/-fah-/-敲除兔的酪氨酸转氨酶(tat)、同源酸1、2-双加氧酶(hgd)和谷胱甘肽s-转移酶zeta1(gstz1)的mrna表达水平有所降低。与此同时，与hpd+/+fah-/+
兔相比，双突变体中这些基因的表达显著增加，提示敲除hpd可缓解酪氨酸通路受阻情况，说明双敲兔模型更适合用于酪氨酸血症的相关研究；
[0123]
天冬氨酸转氨酶[got1](细胞质)、天冬氨酸转氨酶[got2](线粒体)是与hpd共表达基因，图8表明，不论是单敲fah杂合子、双敲杂合子还是双敲纯合子的肝脏中天冬氨酸转氨酶[got1](细胞质)、天冬氨酸转氨酶[got2](线粒体)的表达量都有所降低，说明敲除兔子对细胞质和线粒体中的天冬氨酸转氨酶有影响。通过单敲与双敲杂合子兔模型对比发现，单敲fah的杂合子兔模型中，氢嘧啶脱氢酶[dpyd]、巨噬细胞移动抑制因子[mif](糖基化抑制因子)表达量降低，提示fah的缺失可能影响机体免疫系统，而敲除hpd后表达量有所上升，说明hpd的敲除可能会缓解兔子机体的免疫系统的损伤。
[0124]
实施例4f0代兔子wb鉴定
[0125]
从图9的wb中可以看出来，双敲兔子hpd条带明显浅，蛋白表达量显著减少。fah单敲和双敲的条带都有变浅，表达量降低，hpd-/-fah-/-的条带比hpd+/+fah-/+更浅。wb为半定量可作为一定的依据，证明fah和hpd双敲兔模型构建成功，可用于后续推广应用。
[0126]
实施例5f0代兔子免疫组化鉴定
[0127]
免疫组化鉴定采用通用步骤，结果如图10-11所示。
[0128]
图10示hpd+/+fah+/-和hpd-/-fah-/-敲除兔子肝脏免疫组化结果，与单敲fah杂合子相比，双敲纯合子fah-/-hpd-/-肝脏出血减少，炎症细胞也有所减少，说明双敲纯合子fah-/-hpd-/-对肝脏损伤较小；
[0129]
图11示hpd+/+fah+/-和hpd-/-fah-/-敲除兔子肾脏免疫组化结果，与单敲fah杂合子相比，双敲纯合子fah-/-hpd-/-的肾脏损伤减少，出血也有所减少，且双敲兔子肾脏形态学完好，说明双敲纯合子fah-/-hpd-/-对肾脏损伤较少；
[0130]
由图10-11的免疫组化可知，与单敲fah杂合子相比，双敲纯合子fah-/-hpd-/-对肝肾组织器官的损伤较少，提示敲除hpd可缓解肝脏损伤，更有利于后续推广应用。
[0131]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.如下任意项在敲除fah和/或hpd基因中的应用：(1)、如seq id no:1所示核苷酸序列的靶序列；(2)、如seq id no:2所示核苷酸序列的靶序列。2.敲除fah和hpd基因的sgrna，其特征在于，包括：
①
、如seq id no:3所示核苷酸序列的第一sgrna；和/或
②
、如seq id no:4所示核苷酸序列的第二sgrna。3.敲除fah和hpd基因的试剂，其特征在于，包括cas9 mrna和权利要求2所述的第一sgrna和第二sgrna。4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述试剂中cas9 mrna和第一sgrna或第二sgrna的质量比为4:1。5.权利要求3或4所述试剂的制备方法，其特征在于，分别构建所述第一sgrna、第二sgrna和cas9 mrna的表达载体，体外转录合成所述第一sgrna、第二sgrna和cas9 mrna。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述第一sgrna和第二sgrna的制备方法包括：根据所述的第一sgrna合成如seq id no:5和seq id no:6所示核苷酸序列的第一寡聚核苷酸链，根据所述的第二sgrna合成如seq id no:7和seq id no:8所示核苷酸序列第二寡聚核苷酸链，取所述的第一寡聚核苷酸链和第二寡聚核苷酸链经退火形成双链dna，所述双链dna与经酶切线性化的u6载体重组连接和转化，获得所述第一sgrna表达载体和第二sgrna表达载体并经酶切线性化后，作为模板进行体外转录，合成所述第一sgrna和第二sgrna。7.fah和hpd基因敲除动物模型的构建方法，其特征在于，取如下ⅰ或ⅱ导入受精卵进行敲除：ⅰ、权利要求3或4所述的试剂；ⅱ、权利要求5或6所述制备方法制得的试剂。8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述敲除的步骤包括：将所述第一sgrna和第二sgrna分别与所述cas9 mrna组成混合物注射到受精卵细胞质后，体外培养发育至桑椹胚时期，经鉴定验证阳性胚胎。9.根据权利要8所述的构建方法，其特征在于，所述受精卵包括兔受精卵。10.检测fah和hpd基因敲除的试剂，其特征在于，包括fah基因和hpd基因鉴定引物组，其中：所述fah基因鉴定引物组包括如seq id no:9所示核苷酸序列的上游引物和如seq id no:10所示核苷酸序列的下游引物；所述hpd基因鉴定引物组包括如seq id no:11所示核苷酸序列的上游引物和如seq id no:12所示核苷酸序列的下游引物。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，具体涉及FAH和HPD基因敲除兔模型的构建方法和应用。本发明提供了用于制备FAH和HPD基因敲除兔模型的sgRNA、试剂、所述试剂的制备方法、FAH和HPD基因敲除兔模型的制备方法以及检测FAH和HPD基因敲除的试剂。本发明提供的FAH/HPD敲除兔模型能够模拟Ⅲ型酪氨酸血症，并且该模型的获得能够在给予相应HGA刺激后模拟临床Ⅰ酪氨酸血症肝功能病的病理过程，能更有效地预测新疫苗、新药和新诊断试剂等在临床应用中的效果，同时大大降低新药研发的风险，为临床研究提供基础模型。基础模型。


技术研发人员：关雅今 徐菲 别亚男 谢水林
受保护的技术使用者：广东明珠生物技术有限公司
技术研发日：2023.05.18
技术公布日：2023/8/23