一种羟胺苯变位酶突变体及其应用

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种羟胺苯变位酶突变体及其应用。


背景技术：

2.普仑司特(pranlukast)是一种口服支气管哮喘治疗药物，属于白三烯(cyslts)受体拮抗剂，能够有效抑制ltd4受体从而治疗哮喘。普仑司特因具有选择性抑制强、适用性广、副作用小等特点，拥有广阔的市场前景和重大研究价值。
3.3-氨基-2-羟苯乙酮，英文名为1-(3-amino-2-hydroxyphenyl)ethanone(简称3ahap)，是合成普仑司特的关键中间体，其合成方法主要是化学合成法，可通过四步反应途径获得。该途径的第二步涉及fries重排，该重排涉及酚酯在lewis或bronsted酸的催化下重排为o-或p-酰基苯酚。然而，由于使用氯仿和二氯甲烷等有机溶剂，这一步骤具有很高的环境污染风险。同时，反应系统中使用的催化剂，如alcl3、bf3和ticl4，会释放有毒气体，对环境有害。
4.生物合成法是指利用生物催化剂(如酵母菌、细菌、真菌等)或生物转化反应，将底物转化为所需化合物的一种合成方法，利用生物体自然代谢活动的结果，不需要高温、高压等条件，且不会产生有毒有害的废物和污染，是一种绿色、环保的化学合成方法。因此，3-氨基-2-羟苯乙酮的生物合成研究具有重要意义。
5.3-氨基-2-羟苯乙酮的生物合成依靠多酶体系催化，并适合于体外多酶催化。羟胺苯变位酶nitrobenzenenitroreductase(nbza)是一类分布广泛的黄素蛋白酶，与辅基fmn或fad分子结合，以辅酶nad(p)h作为电子供体催化硝基基团生成相应的羟胺或氨基基团。3-氨基-2-羟苯乙酮的生物合成反应以辅酶循环nadph-gdh作为氢供体，首先经硝基还原酶(nbza)催化底物间硝基苯乙酮的硝基还原为羟氨基，然后经羟胺苯变位酶(haba)催化羟胺基重排生成3ahap。但现有羟胺苯变位酶的催化活性较低，因而导致3-氨基-2-羟苯乙酮的生物合成受限。


技术实现要素：

6.为了解决上述羟胺苯变位酶的催化活性低的技术问题，进而解决3-氨基-2-羟苯乙酮的生物合成产率低的问题，本发明提供了一种羟胺苯变位酶突变体及其应用。本发明通过将来源于pseudomonasoleovorans的野生型羟胺苯变位酶序列进行第115位、93和81位的突变，筛选得到羟胺苯变位酶突变体，突变体在催化3-羟基氨基乙酰苯转化为3-氨基-2-羟基苯乙酮的过程中，相较于野生型酶活力大大提高，最大可从0.176u提高至1.40u。
7.本发明的具体技术方案为：本发明提供了一种羟胺苯变位酶突变体l115g，氨基酸序列如seq id no.2所示；或提供了一种羟胺苯变位酶突变体l115p，氨基酸序列如seq id no.3所示；或提供了一种羟胺苯变位酶突变体l115c，氨基酸序列如seq id no.4所示；或提供了一种羟胺苯变位酶突变体l115h，氨基酸序列如seq id no.5所示；或提供了一种羟胺苯变位酶突变体l93a，氨
基酸序列如seq id no.6所示；或提供了一种羟胺苯变位酶突变体v81g，氨基酸序列如seq id no.7所示；或提供了一种羟胺苯变位酶突变体v81e，氨基酸序列如seq id no.8所示；或提供了一种羟胺苯变位酶突变体v81r，氨基酸序列如seq id no.9所示；或提供了一种羟胺苯变位酶突变体v81l，氨基酸序列如seq id no.10所示；或提供了一种羟胺苯变位酶突变体v81a，氨基酸序列如seq id no.11所示。
8.本发明通过将来源于pseudomonas oleovorans的野生型羟胺苯变位酶序列进行第115位、93和81位的突变，筛选得到羟胺苯变位酶突变体，突变体在催化3-羟基氨基乙酰苯转化为3-氨基-2-羟基苯乙酮的过程中，相较于野生型酶活力大大提高，最大可从0.176u提高至1.40u。
9.其中，seq id no.1是来源于pseudomonas oleovorans的羟胺苯变位酶(wthaba)的氨基酸序列；seq id no.2是羟胺苯变位酶突变体的氨基酸序列；seq id no.3是羟胺苯变位酶突变体(记为l115p)的氨基酸序列；seq id no.4是羟胺苯变位酶突变体(记为l115c)的氨基酸序列；seq id no.5是羟胺苯变位酶突变体(记为l115h)的氨基酸序列；seq id no.6是羟胺苯变位酶突变体(记为l93a)的氨基酸序列；seq id no.7是羟胺苯变位酶突变体(记为v81g)的氨基酸序列；seq id no.10是羟胺苯变位酶突变体(记为v81e)的氨基酸序列；seq id no.8是羟胺苯变位酶突变体(记为v81r)的氨基酸序列；seq id no.9是羟胺苯变位酶突变体(记为v81l)的氨基酸序列；seq id no.11是羟胺苯变位酶突变体(记为v81a)的氨基酸序列编码基因是指dna中编码蛋白质序列的基因，它们指导蛋白质的合成，是生物体内蛋白质合成的基础。显然，编码上述羟胺苯变位酶突变体的基因也理应纳入本发明创造的保护范围之中。对于本领域技术人员来说，在披露了上述羟胺苯变位酶突变体氨基酸的基础上，借助本领域相关知识或工具，可以不付出任何智慧性劳动而获得编码上述羟胺苯变位酶突变体的基因。
10.质粒可以作为载体，将外源dna片段导入目标细胞中进行蛋白质的表达。携带有编码上述羟胺苯变位酶突变体的基因的质粒，可以作为羟胺苯变位酶突变体的基因的载体，导入目标细胞中进行表达，显然，携带有编码上述羟胺苯变位酶突变体的基因的质粒也理应纳入本发明创造的保护范围之中。同时，该目标细胞，如一种基因工程菌，含有上述羟胺苯变位酶突变体或上述羟胺苯变位酶突变体的编码基因或上述含羟胺苯变位酶突变体编码基因的质粒，也理应纳入本发明创造的保护范围之中。
11.作为优选，所述基因工程菌的宿主菌为大肠杆菌。
12.另一方面，本发明提供了一种上述羟胺苯变位酶突变体或上述羟胺苯变位酶突变体的编码基因或上述含羟胺苯变位酶突变体编码基因的质粒或上述基因工程菌在将硝基催化为氨基中的应用。
13.具体地，提供了一种上述羟胺苯变位酶突变体或上述羟胺苯变位酶突变体的编码基因或上述含羟胺苯变位酶突变体编码基因的质粒或上述基因工程菌在在3-氨基-2-羟苯乙酮生物合成中的应用。
14.应用的方法包括以下步骤：在酶催化体系下，以3-羟基氨基乙酰苯为底物，催化生成3-氨基-2-羟基苯乙酮；其中，所述酶催化体系包括上述羟胺苯变位酶突变体。
15.作为上述技术方案的优选，所述酶催化体系还包括辅酶循环系统，所述辅酶循环系统为nadph-gdh辅酶循环系统。辅酶循环系统作为氢供体，通过将被还原的辅酶再次氧化成其原来的形式，从而使能够再次参与上述催化生成3-氨基-2-羟基苯乙酮的反应，确保反应的持续进行。
16.作为上述技术方案的优选，所述催化生成3-氨基-2-羟基苯乙酮的反应在磷酸盐缓冲液中进行。ph可以为7.0～11.0。
17.具体地，本发明生物合成3-氨基-2-羟基苯乙酮的反应流程为：以硝基苯还原酶nbza、羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶gdh为催化剂并构成酶混合系统，以葡萄糖和间硝基苯乙酮(3nap)为底物，构建反应体系，合成3ahap。具体为：硝基苯还原酶nbza催化间硝基苯乙酮3nap生成3-羟基氨基乙酰苯3haap；羟胺苯变异酶haba催化3-羟基氨基乙酰苯3haap生成3-氨基-2-羟基苯乙酮3ahap；葡萄糖脱氢酶gdh催化葡萄糖生成nadph，为反应提供能量。
18.与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：本发明通过将来源于pseudomonas oleovorans的野生型羟胺苯变位酶序列进行第115位、93和81位的突变，筛选得到羟胺苯变位酶突变体，突变体在催化3-羟基氨基乙酰苯转化为3-氨基-2-羟基苯乙酮的过程中，相较于野生型酶活力大大提高，最大可从0.176u提高至1.40u。羟胺苯变位酶突变体l115g、l115p、l115c、l115h、l93a、v81g、v81e、v81r、v81l、v81a在3-氨基-2-羟基苯乙酮的生物合成中具有较大工业前景。
附图说明
19.图1为本发明实施例4野生型羟胺苯变位酶及其突变体酶l115g、l115p、l115c、l115h、l93a、v81g、v81e、v81r、v81l、v81a的酶活力测定结果图。
具体实施方式
20.下面结合实施例及附图对本发明作进一步的描述。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
21.实施例中使用的质粒提取试剂盒、dna纯化回收试剂盒购自杭州擎科梓熙生物技术有限公司；一步克隆试剂盒购自诺唯赞有限公司；e.coli bl21(de3)、质粒pet-28a(+)和全基因合成等由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；dna标记、低分子量标准蛋白、蛋白预制胶购自北京genstar有限公司；clonexpress ii onestep cloning kit无缝克隆试
剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；pfu dna聚合酶和dpni内切酶购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；引物合成、序列测序工作由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。
22.催化工艺所用试剂间硝基苯乙酮和3-氨基-2-羟基苯乙酮购自阿拉丁试剂(中国上海)，其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
23.下列实施例通过高效液相色谱(hplc)分析法进行反应产物的检测，并对产物进行分析。
24.hplc分析方法为：色谱柱/phenyl；柱温/40℃；流速/1ml/min；检测波长/235nm；流动相：13.5mm三氟乙酸：纯乙腈＝75:25。
25.seq id no.1是来源于pseudomonas oleovorans的羟胺苯变位酶(wthaba)的氨基酸序列；seq id no.2是羟胺苯变位酶突变体(记为l115g)的氨基酸序列；seq id no.3是羟胺苯变位酶突变体(记为l115p)的氨基酸序列；seq id no.4是羟胺苯变位酶突变体(记为l115c)的氨基酸序列；seq id no.5是羟胺苯变位酶突变体(记为l115h)的氨基酸序列；seq id no.6是羟胺苯变位酶突变体(记为l93a)的氨基酸序列；seq id no.7是羟胺苯变位酶突变体(记为v81g)的氨基酸序列；seq id no.10是羟胺苯变位酶突变体(记为v81e)的氨基酸序列；seq id no.8是羟胺苯变位酶突变体(记为v81r)的氨基酸序列；seq id no.9是羟胺苯变位酶突变体(记为v81l)的氨基酸序列；seq id no.11是羟胺苯变位酶突变体(记为v81a)的氨基酸序列；seq id no.12是来源于pseudomonas oleovorans的羟胺苯变位酶的核苷酸序列。
26.实施例1野生型羟胺苯变位酶粗酶液的制备将来源于pseudomonas oleovorans的野生型羟胺苯变位酶(wthaba)(genbank号：aab94122.1，氨基酸序列为seq id no.1所示，核苷酸序列为seq id no.5所示)的基因序列进行全基因合成后，插入表达质粒pet-28a(+)，得到pet-28a(+)-nbza。测序验证无误后将pet-28a(+)-nbza转入表达宿主大肠杆菌e.coli bl21(de3)中用于后续重组酶的表达。
27.lb液体培养基组成：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl 10g/l，用水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。
28.将上述测序无误的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的10ml lb液体培养基中，37℃震荡培养12h，按2％接种量转接至100ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜lb液体培养基中，37℃震荡至od
600
达到0.8时，降温至30℃，加入iptg至其终浓度为0.5mm，诱导培养16h，培养结束后，将培养液8000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-20℃冰箱中保存，待用。将培养结束后收集到的菌体，用50mm ph8.0磷酸缓冲液洗涤两次，之后重悬于50mlph8.0的磷酸缓冲液中，均质破碎，破碎液离心去除沉淀，得到含重组wthaba酶的粗酶液。
29.实施例2羟胺苯变位酶突变体的构建在野生型羟胺苯变位酶序列的基础上，突变其第115位、93和81位。针对突变的羟胺苯变位酶序列的第115位、93和81位进行突变的突变体设计pcr的引物序列。设计引物序列按突变位点的突变顺序如表1、表2、表3所示。
30.表1序号引物名引物序列
1115gfttgtgacattcctgggctttagtctgattccg 2115pfttgtgacattcctgccgtttagtctgattccg 3115cfttgtgacattcctgtgctttagtctgattccg 4115hfttgtgacattcctgcattttagtctgattccg 5115rcaggaatgtcacaacacgttctttcagcg表2序号引物名引物序列193afggtgcgggtgctaaagctgctcctattgccgca 293rttagcacccgcaccccacagtgccgccag表3序号引物名引物序列181gfgatttatggtacatatgccaattggctgggaggccagctggcggcact 281efgatttatggtacatatgccaattggctgggacagcagctggcggcact 381rfgatttatggtacatatgccaattggctgggacgtcagctggcggcact 481lfgatttatggtacatatgccaattggctgggactgcagctggcggcact 581afgatttatggtacatatgccaattggctgggagctcagctggcggcact 681rtatgtaccataaatcagcagccaaaatgttgccagttgccaagpcr(25μl)扩增体系为：2
×
pcrbuffer缓冲液25μl，上下游引物各1.5μl，模板质粒1μl，dntp 1μl，高保真酶1μl，加入ddh2 o补足至50μl。
31.pcr扩增程序为：(1)95℃预变性5min，(2)95℃变性30秒，(3)58℃退火30秒，(4)72℃延伸5min，30个循环，(5)72℃延伸10min，(6)4℃保存。
32.pcr结束后取5μl对扩增产物进行核酸凝胶电泳分析，将得到的目标条带清晰的pcr产物加入2μldpn i内切酶，放于37℃下消化模板1h。反应完成后clean up转化至bl21感受态细胞，涂布在含有50μg/ml卡纳霉素的lb培养基，37℃培养过夜，收集菌体，得到包含突变体的转化子。
33.实施例3高通量筛选突变体文库将实施例2中所得转化子经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的10ml lb液体培养基中，37℃震荡培养12h，按2％接种量转接至100ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜lb液体培养基中，37℃震荡至od
600
达到0.8时，降温至30℃，加入iptg至其终浓度为0.5mm，诱导培养16h，培养结束后，将培养液8000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-20℃冰箱中保存，待用。将培养结束后收集到的菌体，用50mm ph8.0磷酸缓冲液洗涤两次，之后重悬于50mlph8.0的磷酸缓冲液中，均质破碎，破碎液离心去除沉淀，得到wthaba酶的突变体粗酶液。
34.显色反应：将硝基还原酶破碎液与一定浓度的间硝基苯乙酮反应10小时后12000rpm离心10分钟，用排枪吸取离心后的反应液上清于96孔透明板中，加入得到的wthaba酶的突变体粗酶液，充分反应一段时间生成黄棕色化合物，利用酶标仪高通量检测445nm吸光值。以野生型wthaba酶(实施例1制备得到野生型wthaba酶粗酶液)为对照，筛选
阳性克隆子。
35.结果得到阳性克隆子l115g、l115p、l115c、l115h、l93a、v81g、v81e、v81r、v81l、v81a。羟胺苯变位酶突变体l115p氨基酸序列如seq id no.3所示；羟胺苯变位酶突变体l115c氨基酸序列如seq id no.4所示；羟胺苯变位酶突变体l115h氨基酸序列如seq id no.5所示；羟胺苯变位酶突变体l93a氨基酸序列如seq id no.6所示；羟胺苯变位酶突变体v81g氨基酸序列如seq id no.7所示；羟胺苯变位酶突变体v81e氨基酸序列如seq id no.8所示；羟胺苯变位酶突变体v81r氨基酸序列如seq id no.9所示；羟胺苯变位酶突变体v81l氨基酸序列如seq id no.10所示；羟胺苯变位酶突变体v81a氨基酸序列如seq id no.11所示。
36.实施例4羟胺苯变位酶突变体酶活的比较对初筛得到的阳性克隆子l115g、l115p、l115c、l115h、l93a、v81g、v81e、v81r、v81l、v81a的菌体进行培养并用于复筛。
37.将上述阳性克隆子的工程菌经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的10ml lb液体培养基中，37℃震荡培养12h，按2％接种量转接至100ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜lb液体培养基中，37℃震荡至od
600
达到0.8时，降温至30℃，加入iptg至其终浓度为0.5mm，诱导培养16h，培养结束后，将培养液8000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，得到复筛菌体，将复筛菌体用50mm ph8.0磷酸缓冲液洗涤两次，之后重悬于50mlph8.0的磷酸缓冲液中，均质破碎，破碎液离心去除沉淀，得到复筛粗酶液。
38.取复筛粗酶液进行复筛反应，1ml反应体系包括：40g/l底物间硝基苯乙酮，50mm ph8.0磷酸盐缓冲液，100g/l葡萄糖，0.15g/l硝基还原酶破碎液，0.32g/l葡萄糖脱氢酶，0.28g/l羟胺苯变位酶(实施例1得到的wthaba酶的粗酶液)或各个复筛粗酶液。
39.反应10h后，取反应液样品进行处理，使用高效液相色谱仪测定3-氨基-2羟基苯乙酮的浓度并计算酶活力u，酶活计算公式如下：野生型羟胺苯变位酶及其突变体酶l115g、l115p、l115c、l115h、l93a、v81g、v81e、v81r、v81l、v81a的酶活力测定结果见表4及图1。
40.表4表4由图1及表4可知，羟胺苯变位酶突变体l115g、l115p、l115c、l115h、l93a、v81g、
v81e、v81r、v81l、v81a的酶活力相较于野生型大大提高，其中，羟胺苯变位酶突变体v81g酶活力提高最大，从0.176u提高至1.40u。
41.本发明催化反应体系所用硝基还原酶破碎液为将来源于pseudomonas oleovorans的硝基还原酶采用实施例1相同方法制备得到的粗酶液。
42.本发明催化反应体系在ph为7.0～11.0的磷酸缓冲液中进行均有较好的催化效果，本发明实施例所用磷酸缓冲液ph为8.0。本发明催化反应体系实验组和对照组所用硝基还原酶以及葡萄糖脱氢酶相同。
43.本发明所述酶活性包括酶的比酶活和酶活的特性。
44.本发明大写英文字母代表如本领域技术人员熟知的氨基酸。
45.本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见j.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
46.本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备，均市售可得；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
47.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

技术特征：
1.一种羟胺苯变位酶突变体，其特征在于：所述羟胺苯变位酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示，或如seq id no.3所示，或如seq id no.4所示，或如seq id no.5所示，或如seq id no.6所示，或如seq id no.7所示，或如seq id no.8所示，或如seq id no.9所示，或如seq id no.10所示，或如seq id no.11所示。2.一种基因，所述基因编码权利要求1所述的羟胺苯变位酶突变体。3.一种质粒，其特征在于，所述的质粒携带有权利要求2所述基因。4.一种基因工程菌，所述基因工程菌含有权利要求1所述羟胺苯变位酶突变体或权利要求2所述的基因或权利要求3所述质粒。5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主菌为大肠杆菌。6.一种权利要求1所述的羟胺苯变位酶突变体或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的质粒或权利要求4～5任一项所述的基因工程菌在将硝基催化为氨基中的应用。7.一种权利要求1所述的羟胺苯变位酶突变体或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的质粒或权利要求4～5任一项所述的基因工程菌在3-氨基-2-羟苯乙酮生物合成中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用的方法包括以下步骤：在酶催化体系下，以3-羟基氨基乙酰苯为底物，催化生成3-氨基-2-羟基苯乙酮；其中，所述酶催化体系包括权利要求1所述的羟胺苯变位酶突变体。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述酶催化体系还包括辅酶循环系统，所述辅酶循环系统为nadph-gdh辅酶循环系统。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述催化生成3-氨基-2-羟基苯乙酮的反应在磷酸盐缓冲液中进行。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，本发明公开了一种羟胺苯变位酶突变体及其应用。本发明通过将来源于Pseudomonas oleovorans的野生型羟胺苯变位酶序列进行第115位、93和81位的突变，筛选得到羟胺苯变位酶突变体，突变体在催化3-羟基氨基乙酰苯转化为3-氨基-2-羟基苯乙酮的过程中，相较于野生型酶活力大大提高，最大可从0.176U提高至1.40U。本发明提供羟胺苯变位酶突变体在3-氨基-2-羟基苯乙酮的生物合成中具有较大工业前景。有较大工业前景。有较大工业前景。


技术研发人员：薛亚平 汤恒 朱红利 郑裕国
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：2023.05.10
技术公布日：2023/8/23