用于免疫共沉淀的荧光标记杆状病毒表达载体及其构建方法

1.本发明属于病毒表达载体的构建技术领域，涉及一种用于免疫共沉淀的荧光标记杆状病毒表达载体及其构建方法。


背景技术：

2.免疫共沉淀(co-ip)是一种基于抗原抗体间的专一性结合进行体内分析蛋白质互作的常用方法，其原理是将待验证互作的两种蛋白在同一细胞内表达，然后利用标签抗体或蛋白自身抗体进行沉淀和免疫印迹检测，最后通过序列分析可推断出其核苷酸序列。由于免疫沉淀是自然生理结合，不受人工影响，因此其结果可信度高，其优势是相互作用的蛋白均在自然界中存在且在天然状态下进行，避免了人为影响，可分离得到自然状态下相互作用的蛋白复合物(冯晓琴,徐峰,王嵬等.通过对免疫共沉淀技术的优化验证蛋白质弱相互作用[j].中国科学院研究生院学报,2013,30(01):18-23.)。但该方法需要针对目标蛋白制备出一定量的抗体，且要求蛋白达到一定浓度，两种蛋白质的结合可能不是直接结合，可能存在第三者在中间起桥梁作用(李昊,李义,高建梅.免疫共沉淀技术的研究进展[j].内蒙古医学杂志,2008(04):452-454.)，因此在实际操作中只有高表达蛋白才有明显现象，此方法并不适合所有情况。
[0003]
杆状病毒-昆虫细胞表达系统具有高水平重组蛋白表达的功能，而且昆虫细胞与哺乳动物细胞对重组蛋白的翻译及翻译后修饰的模式和能力相似，表达出的重组蛋白的生物活性与天然蛋白相似。目前，利用杆状病毒表达系统在sf9细胞内分析蛋白间的互作通常采用共转染的方法，即携带a蛋白基因的bacmid和携带b蛋白基因的杆状病毒穿梭载体(bacmid)共转染sf9细胞。但是该方法存在很多不足，例如通常共转染的效率不高(即两种蛋白在同一细胞表达的少)，且不能观察其感染效率的高低。利用绿色荧光蛋白(gfp)对目的蛋白进行荧光标记，可以实现转染效果的可视化。但由于gfp蛋白较大，常与目的蛋白融合以观察目的蛋白在细胞和组织器官中的表达分布或亚细胞定位等，很少作为co-ip的标签蛋白(王明强,武金霞,张玉红等.蛋白质相互作用实验技术的最新进展[j].遗传,2013,35(11):1274-1282.)。若在目的基因的后端融合egfp，虽然能观测到荧光，但融合的egfp较大，会对蛋白结构造成影响，进而影响互作。


技术实现要素：

[0004]
本发明提供一种用于免疫共沉淀的荧光标记杆状病毒表达载体及其构建方法。本发明通过在载体中插入新的启动子单独表达egfp绿色荧光基因，构建的杆状病毒表达载体既含有单独表达的egfp基因，具有荧光标记，又可以同时表达a和b两种不同蛋白，且它们之间无相互影响。本发明既可以通过荧光观察病毒感染效率，又可以在同一细胞中表达两种蛋白，但不影响插入的两个蛋白，使得转染成功的重组病毒更好观察，便于在昆虫细胞中分析蛋白间的互作。
[0005]
本发明的技术方案如下：
[0006]
用于免疫共沉淀的荧光标记杆状病毒表达载体，为插入seq id no.1所示的启动子sv40-ie2、seq id no.2所示的egfp序列、融合ha标签的相互作用蛋白a序列和融合flag标签的相互作用蛋白b序列的重组pfastbac-dual载体，其中egfp连接在插入的启动子sv40-ie2后，融合ha标签的相互作用蛋白a序列连接在pfastbac-dual载体自带的启动子p10后，融合flag标签的相互作用蛋白b序列连接在pfastbac-dual载体自带的启动子polh后，所述的pfastbac-dual载体的序列如seq id no.3所示。
[0007]
本发明所述的相互作用蛋白a和b为待分析相互作用的两种不同蛋白，在具体实施方式中，相互作用蛋白a为rsv pc4蛋白，其核苷酸序列如seq id no.4所示，相互作用蛋白b为灰飞虱actin蛋白，其核苷酸序列如seq id no.5所示。
[0008]
本发明所述的荧光标记杆状病毒表达载体的构建方法，具体如下：
[0009]
将seq id no.1所示的启动子sv40-ie2、seq id no.2所示的egfp序列插入seq id no.3所示的pfastbac-dual载体中，构建ie2启动子启动下的绿色荧光蛋白表达载体pbacdual-ie2-egfp，将pbacdual-ie2-egfp质粒转化dh10bac细胞，通过蓝白斑筛选、pcr鉴定获得含有重组杆粒bacmid-pbacdual-ie2-egfp的dh10bac细胞，将相互作用蛋白a融合ha标签、相互作用蛋白b融合flag标签后，分别插入pbacdual-ie2-egfp的polh和p10启动子下，构建含egfp、相互作用蛋白a和相互作用蛋白b的荧光标记杆状病毒表达载体pbacdual-egfp-a-b。
[0010]
在本发明具体实施方式中，所述的荧光标记杆状病毒表达载体为pbacdual-egfp-pc4-at，具体构建方法如下：
[0011]
将seq id no.1所示的启动子sv40-ie2、seq id no.2所示的egfp序列插入seq id no.3所示的pfastbac-dual载体中，构建ie2启动子启动下的绿色荧光蛋白表达载体pbacdual-ie2-egfp，将pbacdual-ie2-egfp质粒转化dh10bac细胞，通过蓝白斑筛选、pcr鉴定获得含有重组杆粒bacmid-pbacdual-ie2-egfp的dh10bac细胞，将seq id no.4所示的rsv pc4融合ha标签、seq id no.5所示的灰飞虱actin融合flag标签后，分别插入pbacdual-ie2-egfp的polh和p10启动子下，构建含egfp、相互作用蛋白a和相互作用蛋白b的荧光标记杆状病毒表达载体pbacdual-egfp-pc4-at。
[0012]
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0013]
本发明在pfastbac-dual载体基础上构建荧光标记的co-ip载体，进行免疫共沉淀实验。pfastbac-dual载体的特点是在单个载体上有两个启动子，用于在昆虫细胞中同时表达两个蛋白质。为了验证rsv pc4与灰飞虱actin间的互作，为了更好的判断产生的重组病毒转染情况，本发明以自带两个启动子的pfastbac-dual载体为基础，构建了一种荧光标记的、用于co-ip的杆状病毒表达载体，通过在载体中插入新的启动子sv40-ie2单独表达egfp绿色荧光基因，在不影响插入的两个相互作用蛋白表达的前提下，可以通过荧光观察查看病毒感染效率，又可以在同一细胞中表达两种蛋白，使得转染成功的重组病毒更好观察，便于在昆虫细胞中分析蛋白间的互作。
附图说明
[0014]
图1为各目的片段连入t载体后的双酶切鉴定电泳图。其中m：dna marker(dl-5000)；1：xbaⅰ/pstⅰ双酶切t-sv40-ie2；2：pstⅰ/hidiii双酶切t-egfp。
[0015]
图2为重组载体pbacdual-ie2酶切图。其中m：dnamarker(dl-10000)；1：xbaⅰ/pstⅰ双酶切pbacdual-ie2。
[0016]
图3为重组载体pbacdual-ie2-egfp酶切图。其中m：dnamarker(dl-5000)；1：xbaⅰ/hidiii双酶切pbacdual-ie2-egfp。
[0017]
图4为显微镜观察重组病毒vac
pbacdual-ie2-egfp
转染的sf9细胞。图5为ha-pc4，flag-at连入t载体后的双酶切鉴定电泳图。其中m：dnamarker(dl-5000)；1：xhoi/sphi双酶切t-ha-pc4；2：bamhi/noti双酶切t-flag-at。
[0018]
图6为重组载体pfastbacdual-ha-pc4-ie2-egfp酶切图。其中m：dna marker(dl-10000)；1：xhoi/sphi双酶切pfastbacdual-ha-pc4-ie2-egfp。
[0019]
图7为重组载体pfastbacdual-ha-pc4-flag-at-ie2-egfp酶切图。其中m：dna marker(dl-10000)；1：bamhi/noti双酶切pfastbacdual-ha-pc4-flag-at-ie2-egfp。
[0020]
图8为显微镜观察重组病毒vac
ha-pc4-flag-at
转染的sf9细胞。
[0021]
图9为co-ip检测pc4与actin间的互作图。其中ib:ha表示用ha抗体免疫印迹检测细胞内蛋白；ib:flag表示用flag抗体免疫印迹检测细胞内蛋白；ip:haib:flag表示用ha抗体进行免疫沉淀，利用flag抗体免疫印迹检测。
具体实施方式
[0022]
下面结合具体实施方式和附图对本发明作进一步说明。
[0023]
实施例1
[0024]
构建重组表达载体bacmid-pbacdual-ie2-egfp：
[0025]
设计引物，通过pcr扩增sv40-ie2(seq id no.1)、egfp(seq id no.2)，将它们分别克隆至pmd19-t载体中，构建了重组质粒t-sv40-ie2、t-egfp。测序验证后，提取质粒分别经xbaⅰ/pstⅰ、pstⅰ/hidiii双酶切(如图1)，利用t4 dna连接酶先将sv40-ie2连接到pfastbac-dual载体上，构建重组质粒pbacdual-ie2(如图2)，然后将egfp连接到pbacdual-ie2载体上，经过双酶切验证后，成功构建重组载体pbacdual-ie2-egfp(如图3)。经过双酶切验证后，提取质粒转化dh10bac感受态菌株，经过蓝白斑筛选、pcr验证成功得到重组杆状病毒表达载体bacmid-pbacdual-ie2-egfp。
[0026]
设计的引物为：
[0027]
sv40-ie2-f：seq id no.6所示，
[0028]
sv40-ie2-r：seq id no.7所示，
[0029]
egfp-f：seq id no.8所示，
[0030]
egfp-r：seq id no.9所示。
[0031]
sv40-ie2-f、sv40-ie2-r分别为sv40-ie2基因的上下游扩增引物，引入的酶切位点分别为xbaⅰ、pstⅰ；egfp-f、egfp-r分别为egfp基因的上下游扩增引物，引入的酶切位点分别为pstⅰ、hidiii。以商品化质粒piz/v5-his为模板，利用引物sv40-ie2-f、sv40-ie2-r扩增sv40 pa和opie2基因片段。以商品化质粒pegfp-n1为模板，利用引物egfpph-f、egfpph-r扩增egfp基因片段。
[0032]
实施例2
[0033]
制备重组病毒vac
pbacdual-ie2-egfp
：
[0034]
重组载体pbacdual-ie2-egfp转化dh10bac感受态菌株，经过蓝白斑筛选、pcr验证成功，得到重组杆状病毒表达载体bacmid-pbacdual-ie2-egfp。用dotap真核细胞转染试剂将重组杆状病毒表达载体bacmid-pbacdual-ie2-egfp转染sf9昆虫细胞，转染5-6天后，倒置荧光显微镜下观察荧光情况，结果如图4所示，观察到大量绿色荧光蛋白的表达，表明重组病毒vac
pbacdual-ie2-egfp
构建成功。
[0035]
实施例3
[0036]
重组pbacdual-ha-pc4-flag-at-ie2-egfp载体的构建：
[0037]
利用引物ha-pc4-f(seq id no.10)/ha-pc4-r(seq id no.11)、flag-at-f(seq id no.12)/flag-at-r(seq id no.13)对pc4、actin基因片段进行pcr扩增。将它们分别克隆至pmd19-t载体中，构建了重组质粒t-ha-pc4、t-flag-at，鉴定正确后，分别利用xhoi/sphi、bamhi/noti将pc4、actin基因从pmd19-t载体上切下(如图5)，连接同样酶切的pbacdual-ie2-egfp载体(如图6)。酶切鉴定(如图7)，成功构建重组pbacdual-ha-pc4-flag-at-ie2-egfp载体。构建好的pbacdual-ha-pc4-flag-actin-ie2-egfp转化dh10bac感受态细胞。白色单菌落提取质粒dna进行pcr鉴定，鉴定正确后使用omegabac/pac dna纯化试剂盒提取重组bacmid dna，获得bacmid-ha-pc4-flag-at。
[0038]
实施例4
[0039]
制备重组病毒vac
ha-pc4-flag-at
：
[0040]
将pbacdual-ha-pc4-flag-actin-ie2-egfp转化dh10bac感受态细胞，经过蓝白斑筛选、pcr验证成功得到重组杆状病毒表达载体bacmid-pbacdual-ha-pc4-flag-actin-ie2-egfp。用dotap真核细胞转染试剂将重组杆状病毒表达载体bacmid-pbacdual-ha-pc4-flag-actin-ie2-egfp转染sf9昆虫细胞，转染5-6天后，倒置荧光显微镜下观察荧光情况(如图8)，观察到大量绿色荧光蛋白的表达，表明重组病毒vac
ha-pc4-flag-at
构建成功。
[0041]
实施例5
[0042]
免疫共沉淀(co-ip)：
[0043]
重组病毒vac
ha-pc4-flag-at
感染sf9细胞，在细胞中表达待测蛋白。通过裂解细胞，用ha标签抗体免疫沉淀rsv pc4蛋白，用flag标签抗体免疫检测灰飞虱actin，检测rsv pc4蛋白和at蛋白是否成功表达(如图9)。图9中，从左往右三列分别为pbacdual-ha-pc4-flag-at-ie2-egfp、pbacdual-ha-pc4-ie2-egfp和pbacdual-flag-at-ie2-egfp重组载体。ib:ha和ib:flag结果表明带有标签的rsv pc4蛋白和at蛋白成功表达；ip:ha ib:flag为先用ha标签抗体沉淀带有ha标签的rsv pc4蛋白，然后用flag标签抗体检测带有flag标签的at蛋白，实验结果表明rsv pc4与actin存在互作关系。
[0044]
综上所述，本发明构建的重组载体中既含有单独表达的egfp基因，又可以同时表达a和b蛋白，且它们之间无相互影响。既可以通过荧光观察查看病毒感染效率，又可以在同一细胞中表达两种蛋白，成功验证了pc4与灰飞虱actin间的互作。

技术特征：
1. 用于免疫共沉淀的荧光标记杆状病毒表达载体，其特征在于，为插入seq id no.1所示的启动子sv40-ie2、seq id no.2所示的egfp序列、融合ha标签的相互作用蛋白a序列和融合flag标签的相互作用蛋白b序列的重组pfastbac-dual载体，其中egfp连接在插入的启动子sv40-ie2后，融合ha标签的相互作用蛋白a序列连接在pfastbac-dual载体自带的启动子 p10后，融合flag标签的相互作用蛋白b序列连接在pfastbac-dual载体自带的启动子polh 后，所述的pfastbac-dual载体的序列如seq id no.3所示。2. 根据权利要求1所述的荧光标记杆状病毒表达载体，其特征在于，相互作用蛋白a为rsv pc4蛋白，其核苷酸序列如seq id no.4所示，相互作用蛋白b为灰飞虱actin蛋白，其核苷酸序列如seq id no.5所示。3.根据权利要求1所述的荧光标记杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于，具体如下：将seq id no.1所示的启动子sv40-ie2、seq id no.2所示的egfp序列插入seq id no.3所示的pfastbac-dual载体中，构建ie2启动子启动下的绿色荧光蛋白表达载体pbacdual-ie2-egfp，将pbacdual-ie2-egfp质粒转化dh10bac细胞，通过蓝白斑筛选、pcr鉴定获得含有重组杆粒bacmid-pbacdual-ie2-egfp的dh10bac细胞，将相互作用蛋白a融合ha标签、相互作用蛋白b融合flag标签后，分别插入pbacdual-ie2-egfp的polh和p10启动子下，构建含egfp、相互作用蛋白a和相互作用蛋白b的荧光标记杆状病毒表达载体pbacdual-egfp-a-b。4.根据权利要求2所述的荧光标记杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于，具体如下：将seq id no.1所示的启动子sv40-ie2、seq id no.2所示的egfp序列插入seq id no.3所示的pfastbac-dual载体中，构建ie2启动子启动下的绿色荧光蛋白表达载体pbacdual-ie2-egfp，将pbacdual-ie2-egfp质粒转化dh10bac细胞，通过蓝白斑筛选、pcr鉴定获得含有重组杆粒bacmid-pbacdual-ie2-egfp的dh10bac细胞，将seq id no.4所示的rsv pc4融合ha标签、seq id no.5所示的灰飞虱actin融合flag标签后，分别插入pbacdual-ie2-egfp的polh和p10启动子下，构建含egfp、相互作用蛋白a和相互作用蛋白b的荧光标记杆状病毒表达载体pbacdual-egfp-pc4-at。

技术总结
本发明公开了一种用于免疫共沉淀的荧光标记杆状病毒表达载体及其构建方法。所述荧光标记杆状病毒表达载体通过在pFastBac-Dual载体中插入启动子SV40-IE2，并将eGFP序列连接在启动子SV40-IE2后，融合HA标签的相互作用蛋白A序列和融合Flag标签的相互作用蛋白B序列分别连接在载体自带的启动子p10和启动子polh后。本发明的表达载体可以通过荧光观察查看病毒感染效率，又可以在同一细胞中表达两种蛋白，使得转染成功的重组病毒更好观察，便于在昆虫细胞中分析蛋白间的互作。昆虫细胞中分析蛋白间的互作。昆虫细胞中分析蛋白间的互作。


技术研发人员：梁昌镛 马媛媛 赵淑玲
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：2023.05.10
技术公布日：2023/8/23