L2蛋白或其编码基因在调控植物荚色中的应用

l2蛋白或其编码基因在调控植物荚色中的应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种l2蛋白或其编码基因在调控植物荚色中的应用。


背景技术：

2.大豆是重要的粮油兼用作物，也是人类优质蛋白及畜牧业饲料蛋白的主要来源。作为大豆起源国，我国的大豆种质资源极为丰富。荚色是长期的驯化和选育的重要目标性状，野生大豆的豆荚一般呈现黑色，在经过长期的驯化和遗传改良后，培育的现代育成品种多为褐色和棕黄色。作为受驯化选择表型，大豆荚色是大豆品种选育过程中的重要环节，其对于提高大豆品种的产量和品质具有重要的作用。因此解析大豆荚色的遗传和调控机制对大豆新品种的选育具有重要意义。尽管有研究指出大豆荚色受到两个基因控制，并且对于这两个基因进行了命名，其中一个基因控制大豆荚色黑色到非黑的部分，另一个基因控制褐色与棕黄色的转换。但是目前这两个基因都尚未被克隆，其序列仍未明确。


技术实现要素：

3.为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种l2蛋白或其编码基因在调控植物荚色中的应用。
4.第一方面，本发明提供一种l2蛋白，或其编码基因，或其编码基因的抑制因子在调控植物荚色中的应用。
5.本发明进一步提供一种l2蛋白，或其编码基因，或其编码基因的抑制因子在制备转基因植物中的应用。
6.本发明通过对大豆基因组进行关联性分析得到可以调控大豆荚色的l2基因，研究发现棕黄色荚品种中l2基因表达水平相较于褐色荚品种显著降低。同时可以预测，当将所述编码基因导入目的大豆中，或在大豆中过表达所述编码基因，也可实现调控荚色的目的，且预测将实现棕黄色荚色转变为褐色。
7.进一步地，通过降低l2蛋白的编码基因的表达水平，调控植物荚色，或通过经将降低l2蛋白的编码基因的表达水平的株系与其他株系杂交，培育不同荚色的转基因植物。
8.进一步地，所述降低l2蛋白的编码基因的表达水平包括：
9.利用靶向l2蛋白的编码基因的crispr-cas9系统进行编辑，降低l2蛋白的编码基因的表达水平，所述crispr-cas9系统中采用所述抑制因子，靶向l2蛋白的编码基因。
10.进一步地，所述l2蛋白的氨基酸序列包括如seq id no.2或seq id no.3所示的序列。
11.进一步地，所述l2蛋白的编码基因包括如seq id no.1所示的核苷酸序列。
12.进一步地，所述抑制因子为grna，包括如seq id no.4所示的同等作用核苷酸序列。
13.进一步地，所述植物为大豆，优选包括野生大豆或栽培大豆。
14.第二方面，本发明提供一种grna，grna核苷酸序列为：
[0015]5’‑
ctgtcattgcggccctatgtagg-3’。
[0016]
本发明进一步提供一种生物材料，所述生物材料包括所述的grna；所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞中的一种或多种。
[0017]
本发明具备如下有益效果：
[0018]
本发明通过对大豆转录组进行关联性分析得到了和大豆荚色相关的l2基因，以及相应的编码基因序列和氨基酸序列，通过对该基因进行不同形式的弱化，降低其表达水平，可以有效调控植物荚色，可用于不同荚色的转基因植物的制备，为依据荚色进行植物品种选育等应用提供了重要依据。
附图说明
[0019]
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0020]
图1是本发明实施例1提供的转录组关联分析结果。
[0021]
图2是本发明实施例1提供的l2基因在棕黄色荚品种和褐色荚品种中表达水平的对比示意图。
[0022]
图3是本发明实施例2提供的l2基因的两个基因编辑事件。
[0023]
图4是本发明实施例2提供的野生型(褐色)和两个基因编辑材料(棕黄色)的荚色表型。
具体实施方式
[0024]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0025]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0026]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027]
实施例1
[0028]
本实施例提供大豆荚色l2基因的全转录组关联分析鉴定结果，具体包括如下流程：
[0029]
本发明通过对大豆栽培品种的荚色(褐色与棕黄色)转录组进行关联性分析，发现l2唯一候选基因(图1)。
[0030]
具体针对基因组所有基因的表达量同表型多样性(褐色与棕黄色)进行关联分析，流程如下：
[0031]
1、材料
[0032]
国家大豆种质资源库中选取343个栽培大豆品种，其中褐色荚275份，棕黄色68份。
[0033]
2、转录组测序获取表达量
[0034]
343个栽培大豆品种，幼苗展开第二片复叶时，取子叶节(不含)以上部分，每个品种取三株，混样提取rna，进行双末端150bp测序。每个品种测序量不低于6gb。将测序片段比对到参考基因组glycine max wm82.a2.v1(soybase，https://www.soybase.org)上，获取每个注释基因的表达量，并进行均一化处理，使不同品种间表达量具有可比性。
[0035]
3、转录组关联分析
[0036]
采用混合线性模型，对每个基因的均一化表达量同荚色表型进行关联分析。其中，采用基因表达量主成分分析的前三个主成分进行群体结构控制。获取的每个基因关联显著性p值，采用bonferroni多重校正(α＝0.05)，即阈值为0.05/分析中基因数。
[0037]
4、候选基因
[0038]
转录组关联分析获得了唯一关联基因(图1)，该基因在棕黄色荚品种的表达量相较于褐色荚品种显著降低(图2)，此基因在参考基因组wm82.a2.v1的编号为glyma.03g005700，基因序列如seq id no.1所示，其编码氨基酸序列如seq id no.2所示。wm82为棕黄色荚，此基因型为棕黄色荚型(或突变型)。野生大豆参考基因组版本glycine soja w05.a1.v1，w05的l2基因为野生型(qi et al.,2014；xie et al.,2019)，基因编号为glysoja.03g005682。其编码氨基酸序列如seq id no.3所示。
[0039]
实施例2
[0040]
本实施例针对大豆荚色l2基因构建突变体植物表达载体，并对其功能进行了验证：
[0041]
1、突变体植物表达载体的挖掘构建。
[0042]
本实施例中用于构建表达载体所用的引物如下：
[0043]
用于扩增包含guide rna序列的引物：
[0044]
l2-primer-f：
[0045]
tgtgccaccacatggattctgtcattgcggccctatgtagggttttagagctagaaatagc；
[0046]
l2-primer-r：
[0047]
gctcggcaacgcgttctagaaaaaaaagcaccgactcggt用于扩增u6片段的引物：
[0048]
u6-stul-f：
[0049]
tagatcggaagcttaggcctaaaataaatggtaaaatgtc；
[0050]
u6-r：caatccatgtggtggcacat。
[0051]
1.1扩增目的片段
[0052]
(1)反应体系：
[0053][0054]
jrh0645载体骨架为puc19，gmu6及sgrna序列来源于文献(sun et al.,2015)，具体构建方法参考文献(meng et al.,2017)。
[0055]
(2)反应程序：
[0056]
预热98℃2分钟；变性98℃10s，退火60℃10s，延伸68℃30s(1kb/min)，35个循环；终延伸68℃5分钟；12℃保存。
[0057]
利用引物u6-stui-f/u6-r扩增u6片段，利用引物l2-primer-f/l2-primer-r扩增含有grna的片段。
[0058]
1.2pcr产物回收和产物连接
[0059]
琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自axygen公司)回收pcr产物，然后按照上述程序，以u6和grna片段为模板，利用引物u6-xbai-f/l2-primer-r进行扩增，将两个片段连在一起。
[0060]
1.3酶切
[0061]
利用xbai和stui双酶切载体jrh0645，反应体系如下：
[0062]
(1)反应体系：
[0063][0064]
(2)反应条件：37℃水浴，30分钟。
[0065]
1.4in-fusion连接
[0066]
所用试剂为clontech 5
×
in-hd enzyme premix。
[0067]
将回收得到的dna片段与酶切完回收的jrh0645载体进行连接。
[0068]
(1)反应体系：
[0069][0070]
(2)反应条件：50℃，30分钟。
[0071]
1.5大肠杆菌top10转化
[0072]
(1)从-80℃取出top10感受态细胞(康为世纪)置于冰盒中，待感受态细胞稍微融化后，取50μl到1.5ml ep管中，用移液枪将2.5μl连接产物加入其中，轻弹管壁使二者充分混匀，放置在冰上10分钟；
[0073]
(2)将离心管置于42℃水浴锅中热激30s，然后迅速冰浴2分钟；
[0074]
(3)在每个离心管加入600μl不含抗生素的lb培养基，置于37℃摇床振荡培养1小时；
[0075]
(4)瞬间离心12000rpm，移液器吹打混匀留下约50μl lb培养基；
[0076]
(5)将菌液均匀涂在加入抗生素的lb平板培养基上，待平板干后，倒置于37℃恒温箱中培养过夜。
[0077]
1.6阳性克隆的鉴定
[0078]
用枪头挑取平板上的单克隆，然后在含有无菌ddh2o的管中轻轻吹打几下，进行菌落pcr鉴定。可以挑取多个单克隆，并在平板上做好标记，以增加获得阳性克隆的概率。之后将剩余菌液放到含有抗生素的lb液体培养基上，37℃过夜培养用于提取质粒。
[0079]
(1)反应体系：(2
×
taq mastermix购自康为公司)
[0080][0081]
(2)反应程序：
[0082]
预热98℃3分钟；变性98℃10s，退火60℃10s，延伸68℃40s(1kb/min)，35个循环；终延伸68℃5分钟；12℃保存。
[0083]
pcr产物经电泳检测，将有目的片段的克隆，送菌液测序，获得连接正确的阳性克隆。
[0084]
1.7质粒提取
[0085]
对于测序正确的单克隆，扩摇菌液，用试剂盒提取质粒，步骤如下：
[0086]
(1)取2ml培养过夜的菌液，先用短暂超声处理破碎菌体，然后进行12000g离心1分钟，弃尽上清。
[0087]
(2)加250μl含有rnase的buffer s1，使用定量移液器吹打悬浮细菌沉淀以保证均匀。
[0088]
(3)将样品转移到冰上，加入250μl buffer s2，温和地上下翻转数次混合均匀，使菌体充分裂解。此步骤不宜超过5分钟，以防质粒dna被裂解。
[0089]
(4)将样品放在冰上冷却10分钟，然后加入350μl buffer s3，温和并充分地混合数次，12000g离心10分钟。
[0090]
(5)吸取上清转移到制备管(置于2ml离心管中)，12000g离心1分钟，弃滤液。
[0091]
(6)将制备管放回2ml离心管中，将500μl buffer w1加热到50℃左右，加入样品，然后放在冰上冷却2-3分钟，12000g离心1分钟，弃滤液。
[0092]
(7)将制备管放回离心管，将700μl buffer w2加热到50℃左右，将样品放在冰上冷却2-3分钟后加入buffer w2，然后将离心管翻转数次，以确保buffer w2和质粒dna充分接触。12000g离心1分钟，弃滤液；重复一次
[0093]
(8)将制备管放回2ml离心管中，12000g离心1分钟。
[0094]
(9)将制备管移入干净的1.5ml离心管中，在吸附管膜中央加40μl ddh2o，将样品放在冰上冷却2-3分钟，室温静置1分钟。12000g离心1分钟，洗脱质粒dna。
[0095]
(10)使用nanodrop检查洗脱的质粒dna的纯度和浓度。
[0096]
2、大豆纯合突变体植株的获得
[0097]
将上述步骤1得到的质粒电击转化农杆菌后，进行大豆转化。
[0098]
2.1农杆菌感受态的制备与转化
[0099]
(1)农杆菌感受态的制备
[0100]
挑取农杆菌k599、eha105单菌落分别置于5ml含100μg/ml链霉素和100μg/ml利福平的lb液体培养基中，28℃培养过夜；取500μl过夜培养菌液接种于50ml lb含相同抗生素的液体培养基中，28℃培养直至od
600
＝0.8，然后4000rpm离心5分钟，去掉上清。加入30ml 10％预冷的甘油悬浮菌体，4000rpm离心5分钟，去掉上清，重复此步骤。去上清后加入3ml 10％甘油悬浮菌体，将其分装在1.5ml无菌离心管中(每管200μl)，置于-80℃冰箱备用。
[0101]
(2)农杆菌转化
[0102]
取200μl感受态细胞冰上解冻，加入5μg质粒dna混匀后置于电击杯中，将电击杯推入电击仪，按pulse键5s后，向电击杯中加入的500μl yeb液体培养基，将所有液体转移到1.5ml的离心管中。28℃，180rpm振荡培养2h。在超净工作台中，取出200μl菌液均匀涂布在加入卡那霉素(kana)抗生素和利福平(rif)的yeb固体培养基上，28℃倒置培养36h。
[0103]
2.2大豆发根检测crispr载体编辑效率
[0104]
(1)种子消毒：用4ml浓盐酸和100ml naclo反应出的氯气对挑选外表完好、饱满、光滑、圆润、无斑的大豆种子进行灭菌16-18h后取出，在超净工作台中利用0.5-1h吹干氯气。
[0105]
(2)种子萌发：将豆子均匀摆放在催芽培养基上，每皿10粒。温室中光照培养三天左右直至胚根2cm左右。
[0106]
(3)切豆子，调菌液od值：切子叶，取萌发3-5天的豆子，自下胚轴0.3-0.5cm处切下，将子叶一分为二切开，去除顶芽。取出摇好的菌液(od
600
＝0.5-0.7)，4000rpm离心10分钟，加入液体共培培养基(3.21g/l维生素b5+0.59g/l mes+20g/l蔗糖)进行重悬，使菌液od
600
＝0.6，将切好的豆子中加入上述菌液，浸染30分钟，其中每隔10分钟手摇一次，取出后吹10分钟左右。
[0107]
(4)共培养：在共培培养基中铺上已灭菌滤纸，然后将菌液浸染的种子均匀地放在培养基中(20个/皿)，28℃暗培养3天。
[0108]
(5)诱导培养：培养3天后，长出胚芽，用无菌水和加入激素的液体诱导培养基分别清洗4-5次，直至将农杆菌洗净并用滤纸吸干。胚芽朝上斜插入固体诱导培养基中，放入温室中光照培养。在温室培养10-14天左右长出发根。
[0109]
(6)取根检测：取不同转化载体的大豆根毛，2-3根/管，一般取3个重复，ctab法提取dna，进行pcr检测，测序。
[0110]
(7)选取可以发生编辑(碱基缺失或增加)的位点进行大豆转化。
[0111]
2.3大豆转化
[0112]
(1)种子灭菌：利用同样方法对豆子进行灭菌，摇菌。
[0113]
(2)种子萌发：将大豆种子置于培养皿，加入无菌水浸泡9-16h，直至种子悬浮，将豆子对半切开，去掉一部分胚尖，在豆子的分生区部分划伤口，浸泡在无菌水中。取出摇好的菌液，离心(4000rpm，10分钟)，调菌，使菌液od
600
＝0.4～0.6，将倒掉无菌水的豆子中加入调好的菌液，放在摇床中28℃，200rpm，摇30分钟，取出吹10分钟左右，平铺于共培培养基中，暗培养3天。
[0114]
(3)农杆菌侵染：用手术刀切去1/2下胚轴，然后在两个子叶中间将胚轴纵向切开，去掉顶芽及侧芽。将子叶节外植体放在重悬的农杆菌菌液中(od
600
＝0.6)，再放入26℃培养箱中侵染0.5～4h，每隔10～20分钟摇晃一次，使外植体充分接触菌液。侵染完成后倒掉多
余的农杆菌菌液，超净台吹10分钟左右，然后平铺于共培培养基，26℃暗培养3天。
[0115]
(4)恢复培养：切除长出的下胚轴，保留3-4mm，有伤口的一面斜插入恢复培养基中，10个外植体/皿，放入组培室中26℃培养7天(光照16h/黑暗8h)。
[0116]
(5)芽诱导：切除长出的下胚轴，仍保留3-4mm，将外植体接种到芽诱导培养基上，5个/皿，在24℃培养21天(光照16h/黑暗8h)。
[0117]
(6)芽伸长：在丛生芽诱导后期，将外植体的子叶部分切除，将生长点的基部作为新的水平方向切口，切口朝下接种至伸长培养基中，5个/皿，4℃培养21天(光照16h/黑暗8h)，直至有伸长的外植体，则可直接进行根诱导。
[0118]
(7)根诱导：当伸长芽伸长至3-4cm时，从伸长芽的基部将伸长芽与丛生芽分离，然后接种到生根培养基中进行根诱导。待生根14天后，将培养皿上的封口膜揭开，炼苗3-5天。
[0119]
(8)移栽：将苗移入土中，每棵苗按照表上豆子品种，基因名称，生根日期和土培日期进行标注。加入适量水，盖上一层薄膜，在光照下培养3天后去膜。
[0120]
3、基因编辑阳性株系的鉴定
[0121]
为了确定crispr基因编辑阳性位点，在幼苗期取鲜嫩的一叶，提取dna。利用如下引物，对于crispr敲除突变体，对其grna所在位置两侧进行pcr扩增，测序。
[0122]
l2-primer-f1：
[0123]
attctctacccgagtacattcca；
[0124]
l2-primer-r1：
[0125]
aaaatttataacgagactttttt。
[0126]
经pcr检测，确定存在两个编辑事件，分别命名为突变体1和突变体2，其中突变体1存在45bp缺失，突变体2存在32bp缺失。如图3所示。
[0127]
4、基因编辑大豆表型鉴定
[0128]
本实验所用表型鉴定的野生型和两种基因编辑事件的考察植株数量各为12株，具有统计学意义。
[0129]
如表1和图4所示，两个不同编辑材料的荚色由野生型(褐色)变为突变体型(棕黄色)。
[0130]
表1不同编辑材料的荚色统计结果
[0131][0132]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而并非对其作出限制；虽然前述实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解，他们仍可对前述各实施例所记载的技术方案进行修改或替换其中的部分技术特征，而这些修改或替换并不会改变相应技术方案的本质，也不会使其超出本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种l2蛋白，或其编码基因，或其编码基因的抑制因子在调控植物荚色中的应用。2.一种l2蛋白，或其编码基因，或其编码基因的抑制因子在制备转基因植物中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，通过降低l2蛋白的编码基因的表达水平，调控植物荚色，或通过经将降低l2蛋白的编码基因的表达水平的株系与其他株系杂交，培育不同荚色的转基因植物。4.根据权利要求所述的应用，其特征在于，所述降低l2蛋白的编码基因的表达水平包括：利用靶向l2蛋白的编码基因的crispr-cas9系统进行编辑，降低l2蛋白的编码基因的表达水平，所述crispr-cas9系统中采用所述抑制因子，靶向l2蛋白的编码基因。5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，所述l2蛋白的氨基酸序列包括如seq id no.2或seq id no.3所示的序列。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述l2蛋白的编码基因包括如seq id no.1所示的核苷酸序列。7.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述抑制因子为grna，包括如seq id no.6所示的同等作用核苷酸序列。8.根据权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为大豆，包括野生大豆或栽培大豆。9.一种grna，其特征在于，所述grna核苷酸序列为：5
’‑
ctgtcattgcggccctatgtagg-3’。10.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料包括权利要求9所述的grna；所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞中的一种或多种。

技术总结
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种L2蛋白或其编码基因在调控植物荚色中的应用。本发明针对不同大豆品种进行全转录组关联分析，得到控制大豆荚色的L2基因。本发明发现调控该基因的表达水平可以调控大豆豆荚的荚色，在其表达水平降低时，荚色会由褐色向棕黄色转变。本发明提供的L2基因为调控植物荚色提供了新的基因选择，并且为依据荚色进行植物品种选育等方面的应用提供了重要依据。种选育等方面的应用提供了重要依据。种选育等方面的应用提供了重要依据。


技术研发人员：邱丽娟 李英慧 李德林
受保护的技术使用者：中国农业科学院作物科学研究所
技术研发日：2023.05.10
技术公布日：2023/8/23