具有改进性能的基因修饰的甲基菌的制作方法

1.本发明通常涉及生物技术工程，特别是甲基菌(methylobacillus)属的基因修饰的细菌，其具有改进的性能，使其在大规模甲醇发酵中特别有用。更具体地，本发明提供了一种甲基菌属的细菌，其与不携带所述修饰的其他相同的细菌相比，该细菌修饰为具有降低的胞外多糖(eps)生产。本发明还提供了一种使用本发明的基因修饰的细菌生产生物化学化合物的方法。


背景技术：

2.甲醇发酵有取代石油化工生产的前景。为了实现这一点，必须开发高效的甲基营养菌株(消耗甲醇或甲烷等单碳化合物或不含碳-碳键的多碳化合物)。目前已经确定出了几种能够利用甲醇作为生长和产物形成的唯一碳源的细菌。一些例子包括甲醇芽孢杆菌(bacillus methanolicus)、扭脱甲基杆菌(methylobacterium extorquens)、糖原甲基菌(methylobacillus glycogenes)和鞭毛甲基菌(methylobacillus flagellatus)。基于甲醇同化途径，甲基营养细菌可以分为两大类。第一步总是在甲醇脱氢酶的催化下将甲醇转化为甲醛。在第一类中，甲醛与单磷酸核糖(rump)反应形成c6化合物，然后进一步代谢。这一类的成员通常被称为“rump循环甲基营养菌”。第二类包括扭脱甲基杆菌，其通过使甲醛与甘氨酸反应而吸收消化甲醛，在被称为丝氨酸循环的途径中形成丝氨酸。这两类甲基营养菌都已用于由甲醇生产各种生物化学品。然而，rump循环比丝氨酸循环更节能，导致生长和生物质形成更快。
3.在海洋、土壤、植物根际甚至生活污水等极其多样化的环境中都可以发现甲基营养微生物。由于甲基营养菌必须可以在这些多样且往往恶劣的环境中生存，则它们往往非常强健，可以抵抗不同类型的压力，而同时在最低限度的营养下高效生长。来自rump循环利用型甲基菌属的菌株具有生化生产流程所需的许多性状；它们在最低矿物介质中快速而可重复生长，并且它们对温度和甲醇浓度的波动不敏感。此外，它们非常适合基因操纵，释放复杂途径代谢工程化的潜力。
4.包括甲基菌在内的许多甲基营养菌产生大量的胞外多糖(eps)，这为生物体在自然环境中提供了多种优势，如防止干燥、生物膜支架形成、能量储备等。在补料分批发酵中，甲基菌生物质可以包含高达30％的eps。
5.相对而言，还未对甲基菌中的eps生产作专门研究。研究还只停留于单菌株，即甲基菌属菌株12s，一种从土壤中分离出的专性甲基营养菌，发现其可以合成称为甲氧烷(methanolan)的新型eps(yoshida et al，2000)。虽然已经识别并表征了甲基菌菌株12s中负责甲氧烷合成的基因簇(yoshida et al，2003)，但尚未在其他甲基菌中进行此类工作。基于生物信息学分析和序列相似性，已经预测了鞭毛甲基菌kt菌株(chistoserdova et al.，2007)和糖原甲基菌(hattori et al.，2020)中的eps基因簇，但这些基因本身还从未被表征。


技术实现要素：

6.本发明的目的是克服基于甲醇的生物过程中的某些缺点。这由本发明人实现，本发明人工程化了具有降低的胞外多糖(eps)生产的不同的基因修饰的甲基菌属的细菌。
7.本发明人研究了甲基菌中的通用eps生产。基于对鞭毛甲基菌和糖原甲基菌基因组的生物信息学分析，本发明人识别出了两个推定的生产eps的基因簇。两个eps簇的中断会导致eps生产的完全消除。
8.在修饰的鞭毛甲基菌和糖原甲基菌菌株中，观察到的出乎意料且预料不到的结果是它们在生长培养物中的行为。当在甲基菌中消除一种或多种参与胞外多糖(eps)生产的内源性多肽的表达时，培养物显示出许多有利于基于甲醇的生物过程的开发的出乎意料且预料不到的性能。出乎意料的是，摇瓶和生物反应器中过量的培养物起泡降低。此外，虽然在未修饰的亲本菌株中观察到细胞聚结(cell clumping)，但在修饰的甲基菌的培养中，这种聚结降低，甚至不存在。当eps生产被消除时，生物质的离心和过滤也得以改善。这些综合特性显著改善了生物过程、菌株处理和下游加工，使修饰的甲基菌适合大规模甲醇发酵。消除eps合成也出乎意料地提高了鞭毛甲基菌和其他甲基菌物种的甲醇耐受性。
9.基于上述发现，本发明在第一方面中提供了一种基因工程化的甲基菌属的细菌，其修饰为与不携带所述修饰的其他相同的细菌相比具有降低的胞外多糖(eps)生产。
10.本发明还提供了一种生产生物化学化合物的方法，包括：在合适的培养条件下，在包含还原的(reduced)单碳化合物如甲醇，或不含碳-碳键的多碳化合物如二甲胺的培养基中培养本发明的细菌。
11.本发明可以通过以下条款概述：
12.1.一种基因修饰的甲基菌属的细菌，其与不携带所述修饰的其他相同的细菌相比，该基因修饰的细菌修饰为降低胞外多糖(eps)生产。
13.2.根据第1款所述的细菌，与不携带所述修饰的其他相同的细菌(参考细菌)相比，该细菌修饰为降低所述细菌中至少一种参与胞外多糖(eps)生产的内源性多肽的表达和/或功能(例如，活性)。
14.3.根据第1或2款所述的细菌，与不携带所述修饰的其他相同的细菌(参考细菌)相比，该细菌修饰为降低所述细菌中至少一种参与胞外多糖(eps)生产的内源性多肽的表达。
15.4.根据第1-3款中任一款所述的细菌，与不携带所述修饰的其他相同的细菌(参考细菌)相比，该细菌修饰为降低所述细菌中至少两种参与胞外多糖(eps)生产的内源性多肽的表达。
16.5.根据第1-4款中任一款所述的细菌，与不携带所述修饰的其他相同的细菌(参考细菌)相比，该细菌修饰为降低所述细菌中至少三种参与胞外多糖(eps)生产的内源性多肽的表达。
17.6.根据第1-5款中任一款所述的细菌，与不携带所述修饰的其他相同的细菌(参考细菌)相比，该细菌修饰为降低所述细菌中至少四种参与胞外多糖(eps)生产的内源性多肽的表达。
18.7.根据第1-6款中任一款所述的细菌，与不携带所述修饰的其他相同的细菌(参考细菌)相比，该细菌修饰为降低所述细菌中至少五种参与胞外多糖(eps)生产的内源性多肽的表达。
19.8.根据第1-7款中任一款所述的细菌，与不携带所述修饰的其他相同的细菌(参考细菌)相比，该细菌修饰为降低所述细菌中至少六种参与胞外多糖(eps)生产的内源性多肽的表达。
20.9.根据第1-8款中任一款所述的细菌，与不携带所述修饰的其他相同的细菌(参考细菌)相比，该细菌修饰为降低所述细菌中所有参与胞外多糖(eps)生产的内源性多肽的表达。
21.10.根据第2-9款中任一款所述的细菌，其中所述至少一种参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的多肽选自由以下组成的组：a)包含seq id no:1-38中任一个所述的氨基酸序列的多肽，和b)包含与seq id no:1-38中任一个具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并具有与参考多肽相同的功能特性的多肽。
22.11.根据第2-10款中任一款所述的细菌，其中所述至少一种参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的多肽选自由以下组成的组：a)包含seq id no:1-26中任一个所述的氨基酸序列的多肽，和b)包含与seq id no:1-26中任一个具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并具有与参考多肽相同的功能特性的多肽。
23.12.根据第2-10款中任一款所述的细菌，其中所述至少一种参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的多肽选自由以下组成的组：a)包含seq id no:27-38中任一个所述的氨基酸序列的多肽，和b)包含与seq id no:127-38中任何一个具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并具有与参考多肽相同的功能特性的多肽。
24.13.根据第2-12款中任一款所述的细菌，其中所述至少一种参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的多肽选自有以下组成的组：a)包含seq id no:39-86中任一个所述的氨基酸序列的多肽，和b)包含与seq id no:39-86中任一个具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并具有与参考多肽相同的功能特性的多肽。
25.14.根据第2-13款中任一款所述的细菌，其中所述至少一种参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的多肽选自由以下组成的组：a)包含seq id no:39-60中任一个所述的氨基酸序列的多肽，和b)包含与seq idno:39-60中任一个具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并具有与参考多肽相同的功能特性的多肽。
26.15.根据第2-13款中任一款所述的细菌，其中所述至少一种参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的多肽选自有以下组成的组：a)包含seq id no:61-86中任一个所述的氨基酸序列的多肽，和b)包含与seq id no:61-86中任一个具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并具有与参考多肽相同的功能特性的多肽。
27.16.根据第2-15款中任一款所述的细菌，其中所述至少一种参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的多肽选自由以下组成的组：具有肽基-脯氨酰基顺-反异构酶(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase)活性的多肽；可以充当多糖输出的多肽；作用为链长决定蛋白的多肽；和具有蛋白-酪氨酸激酶活性的多肽。
28.17.根据第16款所述的细菌，其中所述具有肽基-脯氨酰顺-反异构酶活性的多肽包含与seq id no:6具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，所述可以充当多糖输出的多肽包含具有与seq id no:7具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，所述作用为链长决定蛋白的多肽包括与seq id no:8具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且所述具有蛋白-酪氨酸激酶活性的多肽包含与seq id no:9具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
29.18.根据第16款所述的细菌，其中所述具有肽基-脯氨酰基顺-反异构酶活性的多肽包含与seq id no:42具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，所述可以充当多糖输出的多肽包含具有与seq id no:43至少70％序列同一性的氨基酸序列，所述作用为链长决定蛋白的多肽包含与seq id no:44具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且所述具有蛋白-酪氨酸激酶活性的多肽包含与seq id no:45具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
30.19.根据第2-18款中任一款所述的细菌，其中所述细菌中参与胞外多糖(eps)生产的至少一种多肽的表达降低了至少50％，例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。
31.20.根据第2-19款中任一款所述的细菌，其中与其他相同的细菌相比，该细菌中至少一种参与胞外多糖(eps)生产的多肽的表达被消除。
32.21.根据第2-20款中任一款所述的细菌，其中编码所述参与该细菌中胞外多糖(eps)生产的多肽的内源性基因被灭活。
33.22.根据第2-21款中任一款所述的细菌，其中所述编码参与该细菌中胞外多糖(eps)生产的多肽的内源性基因通过缺失部分或全部基因序列而失灭活。
34.23.根据第2-22款中任一款所述的细菌，其中通过在该细菌中引入或表达可以通过dna切割选择性灭活编码所述多肽的内源基因的相应稀切核酸内切酶，灭活编码所述参与该细菌胞外多糖(eps)生产的多肽的内源性基因。
35.24.根据第23款的细菌，其中所述稀切核酸内切酶选自由转录激活子样效应器(tale)核酸酶、巨核酸酶、锌指核酸酶(zfn)和rna引导核酸内切酶组成的组。
36.25.根据第24款所述的细菌，其中所述rna引导核酸内切酶是催化灭活的cas9蛋白。
37.26.根据第25款所述的细菌，其包含(例如，表达)至少一种在细胞条件下与编码所述酶的基因组dna特异性杂交(例如，结合)的单引导rna(sgrna)。
38.27.根据第2-21款中任一款所述的细菌，其中所述细菌中参与胞外多糖(eps)生产的多肽的表达通过编码所述多肽的内源性基因的转录和/或翻译抑制而降低(例如，被抑制)。
39.28.根据第2-21款中任一款所述的细菌，其中所述细菌中参与胞外多糖(eps)生产的多肽的表达通过在该细菌中引入或表达至少一种在细胞条件下与编码所述多肽的细胞mrna和/或基因组dna特异性杂交(例如，结合)的抑制性核酸分子而降低(例如，被抑制)。
40.29.根据第28款的细菌，其中所述抑制性核酸分子是反义寡核苷酸、核酶或干扰rna(rnai)分子。
41.30.根据第29款所述的细菌，其中所述干扰rna分子是微rna(mirna)、小干扰rna(sirna)或短发夹rna(shrna)。
42.31.根据第2-30款中任一款所述的细菌，其中所述细菌中一种或多种参与胞外多糖(eps)生产的内源性多肽由第一eps基因簇和/或第二eps基因簇中包含的一个或多个基因进行编码。
43.32.根据第31款所述的细菌，其中所述第一eps基因簇包括由seq id no:174或177中存在的开放阅读框(orf)定义或与其同源的基因。
44.33.根据第31或32款所述的细菌，其中所述第一eps基因簇包括基因epsd、epse、
epsf、epsg、epsb、epsl、epsh、epsi、epsj和epss，或其直系同源物。
45.34.根据第31-33款中任一款所述的细菌，其中所述第一eps基因簇包括基因epsd、epse、epsf和epsg，或其直系同源物。
46.35.根据第31-34款中任一款所述的细菌，其中所述第一eps基因簇包括与seq id no:174或177的核苷酸序列具有至少50％序列同一性的核苷酸序列。
47.36.根据第31-34款中任一款所述的细菌，其中所述第一eps基因簇包括与seq id no:174的核苷酸序列具有至少50％序列同一性的核苷酸序列。
48.37.根据第31-36款中任一款所述的细菌，其中所述第一eps基因簇中的至少一个基因，例如，通过缺失部分或全部基因序列而被灭活。
49.38.根据第31-37款中任一款所述的细菌，其中至少一个选自epsd、epse、epsf、epsg、epsb、epsl、epsh、epsi、epsj和epss的基因或其直系同源物，例如，通过缺失部分或全部基因序列而被灭活。
50.39.根据第31-38款中任一款所述的细菌，其中至少一个选自epsd、epse、epsf和epsg的基因或其直系同源物，例如，通过缺失部分或全部基因序列而被灭活。
51.40.根据第31-39款中任一款所述的细菌，其中所述基因epsd、epse、epsf和epsg或其直系同源物，例如，通过缺失部分或全部基因序列而被灭活。
52.41.根据第39或40款所述的细菌，其中所述基因epsd会编码包含与seq id no:6具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述基因epse会编码包含与seq id no:7具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述基因epsf会编码包含与seq id no:8具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中所述基因epsg会编码包含与seq id no:9具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
53.42.根据第41款所述的细菌，其中所述基因epsd包含与seq id no:92具有至少70％序列同一性的核苷酸序列，所述基因epse包含与seq id no:93具有至少70％序列同一性的核苷酸序列，并且所述基因epsg包含与seq id no:95具有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
54.43.根据第39或40款所述的细菌，其中所述基因epsd会编码包含与seq id no:42具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述基因epse会编码包含与seq id no:43具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述基因epsf会编码包含与seq id no:44具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中所述基因epsg会编码包含与seq id no:45具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
55.44.根据第43款所述的细菌，其中epsd基因包含与seq id no:128具有至少70％序列同一性的核苷酸序列，所述基因epse包含与seq id no:129具有至少70％序列同一性的核苷酸序列，所述基因epsf包含与seq id no:130具有至少70％序列同一性的核苷酸序列，并且所述基因epsg包含与seq id no:131具有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
56.45.根据第31-44款中任一款所述的细菌，其中所述第一eps基因簇被灭活。
57.46.根据第31-45款中任一款所述的细菌，其中所述第一eps基因簇通过所述簇的部分或整个序列缺失而灭活。
58.47.根据第31-45款中任一款所述的细菌，其中所述第一eps基因簇通过修饰(例如，通过在其中引入至少一种突变)启动子和/或核糖体结合位点区域导致基因表达缺乏而
灭活。
59.48.根据第31-47款中任一款所述的细菌，其中所述第二eps基因簇包括由seq id no:175或179中存在的开放阅读框(orf)定义或与其同源的基因。
60.49.根据第31-48款中任一款所述的细菌，其中所述第二eps基因簇包括与seq id no:175或179的核苷酸序列具有至少50％序列同一性的核苷酸序列。
61.50.根据第31-48款中任一款所述的细菌，其中所述第二eps基因簇包括与seq id no:175的核苷酸序列具有至少50％序列同一性的核苷酸序列。
62.51.根据第31-50款中任一款所述的细菌，其中所述第二eps基因簇中的至少一个基因，通过例如缺失部分或全部基因序列而灭活。
63.52.根据第31-51款中任一款所述的细菌，其中所述第二eps基因簇被灭活。
64.53.根据第31-52款中任一款所述的细菌，其中所述第二eps基因簇通过所述簇的部分或整个序列的缺失而被灭活。
65.54.根据第31-52款中任一款所述的细菌，其中所述第二eps基因簇通过修饰(例如，通过在其中引入至少一种突变)启动子和/或核糖体结合位点区域导致基因表达的缺乏而灭活。
66.55.根据第1-52中任一款所述的细菌，其中编码参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的酶的所有内源基因被灭活，例如缺失。
67.56.根据第1-55款中任一款所述的细菌，其中所述细菌选自鞭毛甲基菌(methylobacillus flagellatus)、糖原甲基菌(methylobacillus glycogenes)、草原甲基菌(methylobacillus pratensis)、根际甲基菌(methylobacillus rhizosphaerae)、草状甲基菌(methylobacillus gramineus)、树状甲基菌(methylobacillus arboreus)、隆凸甲基菌(methylobacillus caricics)、食甲基甲基菌(methylobacillus methilovorans)和甲基菌属(methylobacillus sp)。
68.57.根据第1-56款中任一款所述的细菌，其中所述细菌选自鞭毛甲基菌和糖原甲基菌。
69.58.根据第1-55款中任一款所述的细菌，其中所述细菌是鞭毛甲基菌。
70.59.根据第1-55款中任一款所述的细菌，其中所述细菌是糖原甲基菌。
71.60.一种生产生物化学化合物的方法，包括在合适的培养条件下，在包含还原的单碳化合物如甲醇或不含碳-碳键的多碳化合物如二甲胺的培养基中培养第1-59款中任一款所述的细菌。
72.61.根据第60款所述的方法，其中所述培养基包含甲醇。
73.62.根据第60或61款所述的方法，其中所述培养在生物反应器中进行。
74.63.根据第60-62款中任一款所述的方法，其中所述生物化学化合物选自有机酸、氨基酸、脂肪酸及其衍生物。
附图说明
75.图1：水解的鞭毛甲基菌摇瓶上清液的糖含量。深灰色条表示以mg/l计的总葡萄糖，浅灰色条表示总单糖。误差条是技术性复制品的标准偏差。
76.图2：由不同鞭毛甲基菌的菌株生产的生物反应器液的测量粘度。
77.图3：野生型鞭毛甲基菌和糖原甲基菌培养24小时后的照片。左侧为野生型abme 5和6，随后是鞭毛甲基菌的单簇破坏，最后是双簇破坏。
78.图4：abme 6和abme 131两种代表性生物反应器发酵期间消泡剂添加量(y轴)相对于发酵时间(x轴)的图表。
79.图5：野生型鞭毛甲基菌的生物反应器发酵液(左)与双簇破坏菌株abme 131(右)的相差显微镜图像。
80.图6：与亲本菌株相比，无eps的abme131的生长得到改善。
81.现在将在下面更详细地描述本发明。
具体实施方式
82.除非本文中有明确定义，否则所使用的所有技术和科学术语具有与生物化学、遗传学和微生物学领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。
83.与本文所述方法和材料相似或等效的所有方法和材料，采用本文描述的合适方法和材料都可以用于本发明的实践或测试。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都以引用方式以其全部内容结合于本文中。如有冲突，以包括定义在内的本说明书为准。此外，除非另有规定，否则材料、方法和实施例仅为举例说明性的，而非旨在进行限制。
84.除非另有说明，否则本发明的实践将采用本领域技术范围内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、基因修饰的生物学、微生物学和重组dna的常规技术。这些技术在文献中有充分解释。例如，参见current protocols in molecular biology(frederick m.ausubel,2000,wiley and son inc,library of congress,usa)；molecular cloning:a laboratory manual,third edition,(sambrook et al,2001,cold spring harbor,new york:cold spring harbor laboratory press)；oligonucleotide synthesis(m.j.gait ed.,1984)；mullis et al.u.s.pat.no.4,683,195；nucleic acid hybridization(b.d.harries&s.j.higgins eds.1984)；transcription and translation(b.d.hames&s.j.higgins eds.1984)；culture of animal cells(r.i.freshney,alan r.liss,inc.,1987)；immobilized cells and enzymes(irl press,1986)；b.perbal,a practical guide to molecular cloning(1984)；the series,methods in enzymology(j.abelson and m.simon,eds.-in-chief,academic press,inc.,new york),specifically,vols.154and 155(wu et al.eds.)and vol.185,"gene expression technology"(d.goeddel,ed.)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.h.miller and m.p.calos eds.,1987,cold spring harbor laboratory)。
85.本发明的细菌
86.如上所述，本发明基于出乎意料且预料不到的发现，即基于甲醇的生物过程中的某些缺点可以通过下调甲基菌属的细菌中的胞外多糖(eps)生产而克服。
87.因此，本发明在第一方面中提供了一种基因修饰的甲基菌属的细菌，其经过修饰为与不携带所述修饰的其他相同的细菌相比具有降低的胞外多糖(eps)生产。
88.更具体地，本发明提供了一种基因修饰的甲基菌属的细菌，其修饰为与不携带所述修饰的其他相同的细菌(参考细菌)相比具有降低的所述细菌中至少一种参与胞外多糖
(eps)生产的内源性多肽的表达和/或活性。
89.根据一些实施方式，与不携带所述修饰的其他相同的细菌(参考细菌)相比，本发明的基因修饰的细菌修饰为降低了至少一种，例如至少两种，参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的内源性多肽的表达。
90.根据一些实施方式，与不携带所述修饰的其他相同的细菌(参考细菌)相比，本发明的基因修饰的细菌修饰为降低了至少三种，例如至少四种，参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的内源性多肽的表达。
91.根据一些实施方式，与不携带所述修饰的其他相同的细菌(参考细菌)相比，本发明的基因修饰的细菌修饰为降低了至少五种，例如至少六种，参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的内源性多肽的表达。
92.根据一些实施方式，与不携带所述修饰的其他相同的细菌(参考细菌)相比，本发明的基因修饰的细菌修饰为降低了至少七种，例如至少八种，参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的内源性多肽的表达。
93.根据一些实施方式，与不携带所述修饰的其他相同的细菌(参考细菌)相比，本发明的基因修饰的细菌修饰为降低了至少九种，例如至少十种，参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的内源性多肽的表达。
94.根据一些实施方式，与不携带所述修饰的其他相同的细菌(参考细菌)相比，本发明的基因修饰的细菌修饰为降低了至少十一种，例如至少十二种，参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的内源性多肽的表达。
95.根据一些实施方式，与不携带所述修饰的其他相同的细菌(参考细菌)相比，本发明的基因修饰的细菌修饰为降低了至少十三种，例如至少十四种，参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的内源性多肽的表达。
96.根据一些实施方式，与不携带所述修饰的其他相同的细菌(参考细菌)相比，本发明的基因修饰的细菌修饰为降低了至少十五种，例如至少十六种，参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的内源性多肽的表达。
97.根据一些实施方式，与不携带所述修饰的其他相同的细菌(参考细菌)相比，本发明的基因修饰的细菌修饰为降低了所有参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的内源性多肽的表达。
98.根据一些实施方式，至少一种参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的多肽选自由以下组成的组：a)包含seq id no:1-38中任一个所述的氨基酸序列的多肽，和b)包含与seq id no:1-38中任一个具有至少70％，例如，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列并且具有与参考多肽相同的功能性质的多肽。
99.根据一些实施方式，至少一种参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的多肽选自由以下组成的组：a)包含seq id no:1-26中任一个所述的氨基酸序列的多肽，和b)包含与seq id no:1-26中任一个具有至少70％，例如，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列并且具有与参考多肽相同的功能性质的多肽。
100.根据一些实施方式，至少一种参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的多肽选自由以下组成的组：a)包含seq id no:27-38中任一个所述的氨基酸序列的多肽，和b)包含与seq id no:27-38中任一个具有至少70％，例如，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％
或至少95％序列同一性的氨基酸序列并且具有与参考多肽相同的功能性质的多肽。
101.根据一些实施方式，至少一种参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的多肽选自由以下组成的组：a)包含seq id no:39-86中任一个所述的氨基酸序列的多肽，和b)包含与seq id no:39-86中任一个具有至少70％，例如，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列并且具有与参考多肽相同的功能性质的多肽。
102.根据一些实施方式，至少一种参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的多肽选自由以下组成的组：a)包含seq id no:39-60中任一个所述的氨基酸序列的多肽，和b)包含与seq id no:39-60中任一个具有至少70％，例如，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列并且具有与参考多肽相同的功能性质的多肽。
103.根据一些实施方式，至少一种参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的多肽选自由以下组成的组：a)包含seq id no:61-86中任一个所述的氨基酸序列的多肽，和b)包含与seq id no:61-86中任一个具有至少70％，例如，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列并且具有与参考多肽相同的功能性质的多肽。
104.根据一些实施方式，至少一种参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的多肽选自由以下组成的组：具有肽基-脯氨酰基顺-反异构酶活性的多肽、可以充当多糖输出的多肽；作用为链长决定蛋白的多肽；和具有蛋白-酪氨酸激酶活性的多肽。
105.根据一些实施方式，具有肽基-脯氨酰基顺-反异构酶活性的多肽包含与seq id no:6具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
106.根据一些实施方式，可以充当多糖输出其的多肽包含与seq id no:7具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
107.根据一些实施方式，作用为链长决定蛋白的多肽包含与seq id no:8具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
108.根据一些实施方式，具有蛋白-酪氨酸激酶活性的多肽包含与seq id no:9具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
109.根据一些实施方式，具有肽基-脯氨酰基顺-反异构酶活性的多肽包含与seq id no:42具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
110.根据一些实施方式，可以充当多糖输出的多肽包含与seq id no:43具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
111.根据一些实施方式，作用为链长决定蛋白的多肽包含与seq id no:44具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
112.根据一些实施方式，具有蛋白-酪氨酸激酶活性的多肽包含与seq id no:45具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
113.与其他相同的细菌相比，该内源性多肽的表达水平可以例如降低至少50％，例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。
114.内源性多肽表达的降低可以通过本领域已知的任何合适方法实现。例如，通过灭活编码所述参与该细菌中胞外多糖(eps)生产的多肽的内源性基因，例如，通过缺失部分或全部基因序列，可以降低表达。
115.根据一些实施方式，与其他相同的细菌相比，所述细菌中至少一种参与胞外多糖
(eps)生产的多肽的表达被消除。
116.根据一些实施方式，编码参与该细菌中胞外多糖(eps)生产的多肽的内源性基因通过例如缺失部分或整个基因序列而灭活。
117.根据一些实施方式，编码参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的多肽的内源性基因已通过在细菌中引入或表达可以通过dna切割选择性灭活编码所述酶的内源性基因的稀切核酸内切酶而灭活。根据本发明用于灭活内源性基因的稀切核酸内切酶可以是例如转录激活子样效应子(tale)核酸酶、巨核酸酶、锌指核酸酶(zfn)或rna引导核酸内切酶。
118.一种灭活编码参与所述细菌胞外多糖(eps)生产的多肽的内源性基因的方法是使用crispri系统。crispri系统作为靶向抑制基因表达或阻断基因组靶向位置的工具而开发。crispri系统由催化失活的“死亡”cas9蛋白(dcas9)和定义dcas9与dna结合位点的引导rna组成。
119.根据一些实施方式，通过抑制方式降低细菌中参与胞外多糖(eps)生产的内源性多肽的表达。
120.可以通过本领域已知的任何合适手段抑制多肽的表达。例如，通过涉及使用抑制性核酸分子，如反义寡核苷酸、核酶或干扰rna(rnai)分子，如微rna(mirna)，小干扰rna(sirna)或短发夹rna(shrna)的基因沉默技术可以抑制该表达。
121.根据一些实施方式，参与细菌中胞外多糖(eps)生产的内源性多肽的表达通过编码所述多肽的内源性基因的转录和/或翻译抑制而降低(例如抑制)。
122.根据一些实施方式，通过在细菌中引入或表达抑制性核酸分子，抑制该细菌中参与胞外多糖(eps)生产的内源性多肽的表达。例如，抑制性核酸分子可以通过包含编码可操作地连接至细菌中引起所述抑制性核酸分子产生的功能的启动子如诱导型启动子的所述抑制性核酸分子的核苷酸序列的外源核酸分子的方式引入。合适的是，该抑制性核酸分子是在细胞条件下与编码关注的内源性多肽的细胞mrna和/或基因组dna特异性杂交(例如结合)的核酸分子。取决于靶标，编码基因组dna的转录和/或编码mrna的翻译会受到抑制。
123.根据一些实施方式，抑制性核酸分子是反义寡核苷酸、核酶或干扰rna(rnai)分子。优选地，这样的核酸分子包含编码所关注多肽的细胞mrna和/或基因组dna的补体的至少10个连续核苷酸。
124.根据一些实施方式，该抑制性核酸是反义寡核苷酸。这种反义寡核苷酸是在细胞条件下与编码所关注酶的细胞mrna和/或基因组dna特异性杂交(例如，结合)的核酸分子(dna或rna)。
125.根据一些实施方式，该抑制性核酸分子是核酶，如锤头状核酶。核酶分子设计为催化切割mrna转录物而防止所关注的多肽的翻译。
126.根据一些实施方式，抑制性核酸分子是干扰rna(rnai)分子。rna干扰是其中rna分子抑制表达的生物过程，通常会导致特定mrna的破坏。rnai分子的示例性类型包括微rna(mirna)、小干扰rna(sirna)和短发夹rna(shrna)。根据一些实施方式，rnai分子是mirna。根据一些实施方式，rnai分子是sirna。根据一些实施方式，rnai分子是shrna。
127.根据一些实施方式，与不携带所述修饰的其他相同的微生物(参考细菌)相比，本发明的细菌修饰为降低至少一种参与该细菌中胞外多糖(eps)生产的多肽的功能(例如，活性)。
128.至少一种内源性多肽的功能(例如，活性)的降低可以通过本领域已知的任何合适的手段实现。例如，如果多肽是一种酶，则通过在该酶的活性位点中引入一个或多个导致活性降低或丧失的突变来降低活性。因此，根据一些实施方式，至少一种参与细菌中胞外多糖(eps)生产的内源性酶的活性通过至少一个导致活性降低或丧失的活性位点突变而降低。至少一个活性位点突变可以是例如至少一个非保守氨基酸取代。
129.如上所述，本发明人已经在甲基菌的基因组中确定出了两种推定的eps基因簇。参与胞外多糖(eps)生产的一种或多种内源性多肽因此由包括在第一eps基因簇和/或第二eps基因簇中的一个或多个基因编码。
130.根据一些实施方式，参与该细菌中胞外多糖(eps)生产的内源性多肽由包括在第一eps基因簇和/或第二eps基因簇中的一个或多个基因编码。
131.根据一些实施方式，第一eps基因簇包括由seq id no:174或177中存在的开放阅读框(orf)定义的或与其同源的基因。
132.根据一些实施方式，第一eps基因簇包括基因epsd、epse、epsf、epsg、epsb、epsl、epsh、epsi、epsj和epss，或其直系同源物。
133.根据一些实施方式，第一eps基因簇包括基因epsd、epse、epsf和epsg，或其直系同源物。
134.根据一些实施方式，第一eps基因簇包括与seq id no:174或177的核苷酸序列具有至少50％，例如至少55％序列同一性的核苷酸序列。
135.根据一些实施方式，第一eps基因簇包括与seq id no:174或177的核苷酸序列具有至少60％，例如至少65％序列同一性的核苷酸序列。
136.根据一些实施方式，第一eps基因簇包括与seq id no:174或177的核苷酸序列具有至少70％，例如至少75％序列同一性的核苷酸序列。
137.根据一些实施方式，第一eps基因簇包括与seq id no:174或177的核苷酸序列具有至少80％，例如至少85％序列同一性的核苷酸序列。
138.根据一些实施方式，第一eps基因簇包括与seq id no:174或177的核苷酸序列具有至少90％，例如至少93％序列同一性的核苷酸序列。
139.根据一些实施方式，第一eps基因簇包括与seq id no:174或177的核苷酸序列具有至少95％，例如至少97％序列同一性的核苷酸序列。
140.根据一些实施方式，第一eps基因簇包括与seq id no:174的核苷酸序列具有至少50％，如至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列。
141.根据一些实施方式，第一eps基因簇包括与seq id no:177的核苷酸序列具有至少50％，如至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、
至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列。
142.根据一些实施方式，第二eps基因簇包括由seq id no:175或179中存在的开放阅读框(orf)定义的或与其同源的基因。
143.根据一些实施方式，第二eps基因簇包括与seq id no:175或179的核苷酸序列具有至少50％，如至少55％序列同一性的核苷酸序列。
144.根据一些实施方式，第二eps基因簇包括与seq id no:175或179的核苷酸序列具有至少60％，如至少65％序列同一性的核苷酸序列。
145.根据一些实施方式，第二eps基因簇包括与seq id no:175或179的核苷酸序列具有至少70％，如至少75％序列同一性的核苷酸序列。
146.根据一些实施方式，第二eps基因簇包括与seq id no:175或179的核苷酸序列具有至少80％，如至少85％序列同一性的核苷酸序列。
147.根据一些实施方式，第二eps基因簇包括与seq id no:175或179的核苷酸序列具有至少90％，如至少95％序列同一性的核苷酸序列。
148.根据一些实施方式，第二eps基因簇包括与seq id no:175的核苷酸序列具有至少50％，如至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列。
149.根据一些实施方式，第二eps基因簇包括与seq id no:179的核苷酸序列具有至少50％，如至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列。
150.根据一些实施方式，第一eps基因簇中的至少一个基因，通过例如部分或整个基因序列的缺失而被灭活。
151.根据一些实施方式，所述至少一个基因选自epsd、epse、epsf、epsg、epsb、epsl、epsh、epsi、epsj和epss，或其直系同源物。
152.根据一些实施方式，所述至少一个基因选自epsd、epse、epsf和epsg，或其直系同源物。
153.根据一些实施方式，基因epsd、epse、epsf和epsg或其直系同源物通过例如部分或整个基因序列缺失而被灭活。
154.根据一些实施方式，基因epsd编码包含与seq id no:6具有至少70％，如至少75％序列同一性的氨基酸序列的多肽，基因epse编码包含与seq id no:7具有至少70％，如至少75％序列同一性的氨基酸序列的多肽，基因epsf编码包含与seq id no:8具有至少70％，如至少75％序列同一性的氨基酸序列的多肽，而基因epsg编码包含与seq id no:9具有至少70％，如至少75％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
155.根据一些实施方式，基因epsd编码包含与seq id no:6具有至少80％，如至少85％序列同一性的氨基酸序列的多肽，基因epse编码包含与seq id no:7具有至少80％，如至少85％序列同一性的氨基酸序列的多肽，基因epsf编码包含与seq id no:8具有至少80％，如至少85％序列同一性的氨基酸序列的多肽，而基因epsg编码包含与seq id no:9具有至少80％，如至少85％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
156.根据一些实施方式，基因epsd编码包含与seq id no:6具有至少90％，如至少95％序列同一性的氨基酸序列的多肽，基因epse编码包含与seq id no:7具有至少90％，如至少95％序列同一性的氨基酸序列的多肽，基因epsf编码包含与seq id no:8具有至少90％，如至少95％序列同一性的氨基酸序列的多肽，而基因epsg编码包含与seq id no:9具有至少90％，如至少95％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
157.根据一些实施方式，epsd基因包含与seq id no:92具有至少70％，如至少75％序列同一性的核苷酸序列，基因epse包含与seq id no:93具有至少70％，如至少75％序列同一性的核苷酸序列，基因epsf包含与seq id no:94具有至少70％，如至少75％序列同一性的核苷酸序列，而基因epsg包含与seq id no:95具有至少70％，如至少75％序列同一性的核苷酸序列。
158.根据一些实施方式，epsd基因包含与seq id no:92具有至少80％，如至少85％序列同一性的核苷酸序列，基因epse包含与seq id no:93具有至少80％，如至少85％序列同一性的核苷酸序列，基因epsf包含与seq id no:94具有至少80％，如至少85％序列同一性的核苷酸序列，而基因epsg包含与seq id no:95具有至少80％，如至少85％序列同一性的核苷酸序列。
159.根据一些实施方式，epsd基因包含与seq id no:92具有至少90％，如至少95％序列同一性的核苷酸序列，基因epse包含与seq id no:93具有至少90％，如至少95％序列同一性的核苷酸序列，基因epsf包含与seq id no:94具有至少90％，如至少95％序列同一性的核苷酸序列，而基因epsg包含与seq id no:95具有至少90％，如至少95％序列同一性的核苷酸序列。
160.根据一些实施方式，基因epsd编码包含与seq id no:42具有至少70％，如至少75％序列同一性的氨基酸序列的多肽，基因epse编码包含与seq id no:43具有至少70％，如至少75％序列同一性的氨基酸序列的多肽，基因epsf编码包含与seq id no:44具有至少70％，如至少75％序列同一性的氨基酸序列的多肽，而基因epsg编码包含与seq id no:45具有至少70％，如至少75％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
161.根据一些实施方式，基因epsd编码包含与seq id no:42具有至少80％，如至少85％序列同一性的氨基酸序列的多肽，基因epse编码包含与seq id no:43具有至少80％，
如至少85％序列同一性的氨基酸序列的多肽，基因epsf编码包含与seq id no:44具有至少80％，如至少85％序列同一性的氨基酸序列的多肽，而基因epsg编码包含与seq id no:45具有至少80％，如至少85％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
162.根据一些实施方式，基因epsd编码包含与seq id no:42具有至少90％，如至少95％序列同一性的氨基酸序列的多肽，基因epse编码包含与seq id no:43具有至少90％，如至少95％序列同一性的氨基酸序列，基因epsf编码包含与seq id no:44具有至少90％，如至少95％序列同一性的氨基酸序列的多肽，而基因epsg编码包含与seq id no:45具有至少90％，如至少95％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
163.根据一些实施方式，基因epsd包含与seq id no:128具有至少70％，如至少75％序列同一性的核苷酸序列，基因epse包含与seq id no:129具有至少70％，如至少75％序列同一性的核苷酸序列，基因epsf包含与seq id no:130具有至少70％，如至少75％序列同一性的核苷酸序列，而基因epsg包含与seq id no:131具有至少70％，如至少75％序列同一性的核苷酸序列。
164.根据一些实施方式，基因epsd包含与seq id no:128具有至少80％，如至少85％序列同一性的核苷酸序列，基因epse包含与seq id no:129具有至少80％，如至少85％序列同一性的核苷酸序列，基因epsf包含与seq id no:130具有至少80％，如至少85％序列同一性的核苷酸序列，而基因epsg包含与seq id no:131具有至少80％，如至少85％序列同一性的核苷酸序列。
165.根据一些实施方式，基因epsd包含与seq id no:128具有至少90％，如至少95％序列同一性的核苷酸序列，基因epse包含与seq id no:129具有至少90％，如至少95％序列同一性的核苷酸序列，基因epsf包含与seq id no:130具有至少90％，如至少95％序列同一性的核苷酸序列，而基因epsg包含与seq id no:131具有至少90％，如至少95％序列同一性的核苷酸序列。
166.根据一些实施方式，本发明的基因工程化的细菌修饰为使第一eps基因簇失活。
167.根据一些实施方式，本发明的基因工程化的细菌(进一步)修饰为使第二eps基因簇失活。
168.根据一些实施方式，本发明的基因工程化的细菌修饰为使第一eps基因簇和第二eps基因簇失活。
169.根据一些实施方式，第一eps基因簇通过所述簇的部分或整个序列缺失而灭活。
170.根据一些实施方式，第一eps基因簇通过所述簇的整个编码序列缺失而灭活。
171.根据一些实施方式，第一eps基因簇通过所述簇的整个序列缺失而灭活。
172.根据一些实施方式，第一eps基因簇通过启动子和/或核糖体结合位点区域的修饰(例如，通过引入至少一个突变)导致基因表达缺乏而被灭活。
173.根据一些实施方式，第二eps基因簇通过所述簇的部分或整序列缺失而灭活。
174.根据一些实施方式，第二eps基因簇通过所述簇的整个编码序列缺失而灭活。
175.根据一些实施方式，第二eps基因簇通过所述簇的整个序列缺失而被灭活。
176.根据一些实施方式，第二eps基因簇通过启动子和/或核糖体结合位点区域的修饰(例如，引入至少一个突变)导致基因表达缺乏而被灭活。
177.根据一些实施方式，本发明的基因工程化的细菌修饰为缺失与seq id no:181或
183具有至少70％，如至少75％序列同一性的核苷酸序列。根据一些实施方式，本发明的基因工程化的细菌修饰为缺失与seq id no:181或183具有至少80％，如至少85％序列同一性的核苷酸序列。根据一些实施方式，本发明的基因工程化的细菌修饰为缺失与seq id no:181或183具有至少90％，如至少95％序列同一性的核苷酸序列。
178.根据一些实施方式，本发明的基因工程化的细菌修饰为缺失与seq id no:182或184具有至少70％，如至少75％序列同一性的核苷酸序列。根据一些实施方式，本发明的基因工程化的细菌修饰为缺失与seq id no:182或184具有至少80％，如至少85％序列同一性的核苷酸序列。根据一些实施方式，本发明的基因工程化的细菌修饰为缺失与seq id no:182或184具有至少90％，如至少95％序列同一性的核苷酸序列。
179.根据一些实施方式，本发明的基因工程化的细菌修饰为缺失与seq id no:181具有至少70％，如至少75％序列同一性的核苷酸序列，且缺失与seq id no:182具有至少70％，如至少75％序列同一性的核苷酸序列。根据一些实施方式，本发明的基因工程化的细菌修饰为缺失与seq id no:181具有至少80％，如至少85％序列同一性的核苷酸序列，且缺失与seq id no:182具有至少80％，如至少85％序列同一性的核苷酸序列。根据一些实施方式，本发明的基因工程化的细菌修饰为缺失与seq id no:181具有至少90％，如至少95％序列同一性的核苷酸序列，且缺失与seq id no:182具有至少90％，如至少95％序列同一性的核苷酸序列。
180.根据一些实施方式，本发明的基因工程化的细菌修饰为缺失与seq id no:183具有至少70％，如至少75％序列同一性的核苷酸序列，且缺失与seq id no:184具有至少70％，如至少75％序列同一性的核苷酸序列。根据一些实施方式，本发明的基因工程化的细菌修饰为缺失与seq id no:183具有至少80％，如至少85％序列同一性的核苷酸序列，且缺失与seq id no:184具有至少80％，如至少85％序列同一性的核苷酸序列。根据一些实施方式，本发明的基因工程化的细菌修饰为缺失与seq id no:183具有至少90％，如至少95％序列同一性的核苷酸序列，且缺失与seq id no:184具有至少90％，如至少95％序列同一性的核苷酸序列。
181.根据一些实施方式，本发明的基因工程化的细菌修饰为缺失编码参与所述细菌中胞外多糖(eps)生产的多肽的所有内源性基因。
182.根据本发明的细菌可以由任何合适的甲基菌属细菌生产。甲基菌属是革兰氏阴性甲基营养细菌属。
183.根据一些实施方式，本发明的细菌选自鞭毛甲基菌、糖原甲基菌、草原甲基菌(methylobacillus pratensis)和根际甲基菌(methylobacillus rhizosphaerae)。
184.根据一些实施方式，本发明的细菌选自鞭毛甲基菌和糖原甲基菌。
185.根据一些实施方式，本发明的细菌是鞭毛甲基菌。
186.根据一些实施方式，本发明的细菌是糖原甲基菌。
187.本发明的方法
188.本发明还提供了生产生物化学化合物的方法，包括在合适的培养条件下，在包含还原的单碳化合物如甲醇或不含碳-碳键的多碳化合物如二甲胺的培养基中培养本发明的细菌。
189.使用的培养基可以是适合培养所关注的细菌细胞的任何常规培养基，并且可以根
据现有技术的原理进行构成。该培养基通常含有相应细菌生长和存活所需的所有营养物质，如碳源和氮源以及其他无机盐。合适的培养基，例如，最小或复杂的培养基可以从商业供应商处商购获得，或可以根据公开的配方制备，例如美国典型培养物保藏中心(atcc)菌株目录(american type culture collection(atcc)catalogue of strains)。本领域技术人员熟知的非限制性标准培养基包括luria bertani(lb)肉汤、sabouraud dextrose(sd)肉汤、ms肉汤、酵母蛋白胨-葡聚糖(yeast peptone dextrose)、bmmy、gmmy或酵母麦芽提取物(yeast malt extract)(ym)肉汤，这些都可以商购获得。用于培养细菌细胞如大肠杆菌细胞的合适培养基的非限制性实例，包括最小培养基和富培养基，如luria肉汤(lb)、m9培养基、m17培养基、sa培养基、mops培养基、terrific肉汤、yt等。
190.碳源可以是本领域已知的任何合适的碳底物，特别是通常用于甲基营养细菌培养和/或发酵的任何碳底物。特别感兴趣的碳源是还原的单碳化合物，如甲醇或甲胺，或不含碳-碳键的多碳化合物，如二甲胺。因此，根据一些实施方式，该培养基包含甲醇作为碳源。该培养基中甲醇的浓度通常可以为约0.5％w/v-约4％w/v，如约2％w/v-4％w/v。根据一些实施方式，该培养基中甲醇的浓度范围为约2.5％w/v-约3.5％w/v。
191.作为氮源，可以使用各种铵盐如氨和硫酸铵，其他氮化合物如胺类，天然氮源如蛋白胨、大豆水解物和消化的发酵微生物。作为矿物，可以使用单磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙等。
192.培养可以优选在有氧条件下进行，如通过摇动培养、通过搅拌培养或在具有曝气的生物反应器中，在约20-约45℃，如约30-38℃，优选约37℃的温度下进行。培养物的ph通常高于5，如约6-约8，优选约6.5-约7.5，更优选约6.8-约7.2的范围内。培养物的ph可以用氨、碳酸钙、各种酸、各种碱和缓冲液进行调节。该培养可以进行10-70小时，优选24-60小时，更优选36-50小时的时间段。
193.培养后，通过离心或膜过滤可以从培养基中去除如细胞的固体。生物化学化合物可以通过从培养基中分离和纯化化学化合物的常规方法收集。众所周知的纯化方案包括但不限于，离心或过滤、沉淀、离子交换、色谱法如离子交换色谱法或凝胶过滤色谱法，以及结晶方法。该方法可以还包括从培养基中收集生物化学化合物。
194.通过本发明的方法生产的生物化学化合物可以是通过培养本发明的细菌获得的任何所需化合物。非限制性实例包括有机酸、氨基酸、脂肪酸及其衍生物。有机酸的非限制性实例包括富马酸、乙醇酸、琥珀酸、苹果酸、丙二酸、乳酸及其衍生物。氨基酸的非限制性实例包括谷氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸及其衍生物。
195.因此，本发明提供了可以通过本文详述的方法获得的生物化学化合物。
196.某些其他定义
[0197]“多肽”和“蛋白质”在本文中可以互换使用，表示通过酰胺键共价连接的至少两个氨基酸的聚合物，无论其长度或翻译后修饰(如糖基化、磷酸化、脂化、肉豆蔻化、泛素化等)如何。该定义包括d-和l-氨基酸，以及d-和l-氨基的混合物。
[0198]“核酸”或“多核苷酸”在本文中可以互换使用，而表示通过磷酸二酯键共价连接的至少两个核酸单体单元或碱基(例如，腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶)的聚合物，而无论其长度或碱基修饰。
[0199]
当涉及例如宿主细胞、核酸或多肽使用时，“重组”或“非天然的”是指一种材料，或
与该材料的自然或天然形式相对应的材料，以自然界中不存在的方式进行了修饰，或与之相同，但由合成材料和/或通过使用重组技术的操纵而产生或进行衍生化。非限制性实例包括例如表达细胞天然(非重组)形式中未发现的基因或表达以不同水平以其他方式表达的天然基因的重组细菌细胞。
[0200]
本文在基因或核酸分子上下文中使用的“异源”或“外源”是指不作为其存在于其中的细菌基因组的一部分天然出现的基因或核酸(即dna或rna分子)，或在基因组中存在或发现于与其在自然界中不同的位置或位点上的基因或核酸分子。因此，“异源”或“外源”基因或核酸分子不是细菌内源性的，而是外源性引入微生物的。“异源”基因或核酸分子dna分子可能来自不同生物体、不同物种、不同属或不同生物界，作为宿主dna。
[0201]
本文在多肽上下文中使用的“异源”是指多肽通常在宿主微生物中并未发现或并非由宿主微生物制造(即，表达)，而是来源于不同生物体、不同物种、不同属或不同生物界。
[0202]
如本文所用，术语“直系同源物”或“直系物”是指衍生自共同祖先基因而却存在于不同物种中的基因、由此编码的核酸分子(即，mrna)或由此编码的蛋白质。
[0203]
基因的“降低的表达”是指与不携带所述修饰的其他相同的细菌相比，由经过修饰的细菌产生的所述基因编码的转录产物的量，相应地多肽(例如酶)的量减少。更具体地，对于基因的“降低的表达”，是指由经过修饰的细菌产生的基因编码的多肽(例如酶)的量，相应地转录产物的量，与不携带所述修饰的其他相同的细菌相比降低了至少10％，如至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少100％。基因的表达水平可以通过众所周知的方法确定，包括pcr、southern蛋白印迹法等。此外，通过使用各种众所周知的方法(包括northern蛋白印迹法、定量rt-pcr法等)测量可以从基因转录的mrna量而估算基因表达水平。该基因编码的多肽量可以通过众所周知的方法，包括elisa、免疫组织化学法或western蛋白印迹法等。
[0204]
通过将突变引入细菌基因组中的基因中可以降低基因的表达，从而与不携带所述突变的其他相同的细菌相比，由该基因编码的多肽的细胞内活性降低。导致基因表达降低的突变包括一个或多个核苷酸的替换而引起由基因编码的多肽中的氨基酸替换(错义突变)、终止密码子的引入(无义突变)、核苷酸缺失或插入而引起框移、抗药性基因插入，或部分或整基因缺失(qiu and goodman，1997；kwon et al，2000)。表达也可以通过修饰表达调节序列如启动子、shine-dalgarno(sd)序列等而降低。基因的表达也可以由基因替代而降低(datsenko and wanner，2000)，如“λ红介导的基因替代”。λ红介导的基因替代是使本文所述的一个或多个基因灭活的特别合适的方法。
[0205]“灭活(inactivating)”、“灭活(inactivation)”和“灭活的(inactivated)”，当用于基因或基因簇时，是指所讨论的基因或基因簇不再表达功能蛋白。由于基因或基因簇的部分或全序列缺失、基因或基因簇的阅读框移位、错义/无义突变引入或基因或基因簇调控区修饰，所修饰的dna区域有可能不能自然表达该基因或基因簇，包括控制基因表达的序列，如启动子、增强子、减毒子、核糖体结合位点等。优选通过基因或基因簇的部分或整序列缺失，如通过基因替代，使所关注的基因或基因簇灭活。灭活也可以通过引入或表达可以通过dna切割，优选通过双链断裂，选择性灭活所关注的基因或基因簇的稀切核酸内切酶实现。本发明上下文中的“稀切核酸内切酶”包括转录激活子样效应器(tale)核酸酶、巨核酸酶、锌指核酸酶(zfn)和rna-引导核酸内切酶。
[0206]
细菌基因组中基因或基因簇的存在或不存在可以通过众所周知的方法检测，包括pcr、southern蛋白印迹法等。此外，通过使用各种众所周知的方法，包括northern蛋白印迹法、定量rt-pcr等，测量从该基因或基因簇转录的mrna量而估算基因表达水平。基因或基因簇编码的多肽的量可以通过众所周知的方法进行测量，包括sds-page，然后进行免疫印迹分析测试(western蛋白印迹分析)等。
[0207]
如本文所用，多肽(如本文所述的酶)表达的“减少(decreased)”、“降低(decreasing)”或“减小(decrease of)”是指与所述多肽在不携带所述修饰的其他相同的细菌(对照)中的表达相比，所述多肽的表达在该经过修饰的细菌中降低。与多肽在不携带所述修饰的其他相同的细菌(对照)中的表达相比，该多肽在该经修饰的细菌中的表达可以降低至少约10％，而优选至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％，至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％，或10％-100％之间的任何全整数百分比(例如，6％、7％、8％等)。更具体地，与不携带所述修饰的其他相同的细菌(对照)中的该多肽的量相比，多肽表达的“降低”、“减小”或“减少”是指所经修饰的细菌中多肽的量降低至少约10％，而优选至少约20％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％，或10％-100％之间的任何全整数百分比(例如6％、7％、8％等)。多肽在细菌中的表达或量可以通过本领域已知的任何合适的手段进行测定，包括诸如elisa、免疫组织化学法、western蛋白印迹法或流式细胞术等技术。
[0208]
如本文所用，多肽(如本文所述的酶)的表达“消除”是指与所述多肽在不携带所述修饰的其他相同的细菌(对照)中的表达相比，所述多肽的表达在该经修饰的细菌中是不可检测的。
[0209]
如本文所用，多肽(如本文所述的酶)活性的“降低”、“减小”或“减弱”是指与所述多肽在不携带所述修饰的其他相同的细菌(对照)中的催化活性相比，该多肽的催化活性在该经修饰的细菌中降低。与该多肽在不携带所述修饰的其他相同的细菌(对照)中的表达相比，该多肽在经修饰的细菌中的活性可以降低至少约10％，而优选至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％，或10％-100％之间的任何全整数百分比(例如，6％、7％、8％等)。多肽在细菌中的活性可以通过任何合适的蛋白质和酶活性分析测试法进行测定。
[0210]“表达”包括参与多肽(如，编码的酶)生产的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
[0211]
如本文所用，基因或基因簇的“调控区”是指影响编码序列进行表达的核酸序列。调节区在本领域内是已知的，包括但不限于启动子、增强子、转录终止子、多腺苷酸化位点、基质附着区和/或调节编码序列表达的其他元件。
[0212]“取代”或“取代的”是指通过用另一个氨基酸残基取代一个氨基酸残基而修饰所述多肽，例如，多肽序列中的丝氨酸残基被甘氨酸或丙氨酸残基取代就是一种氨基酸取代。当涉及多核苷酸进行使用时，“取代”或“取代的”是指通过用另一个核苷酸取代一个核苷酸
而修饰该多核苷酸，例如，在多核苷酸序列中用胸腺嘧啶取代胞嘧啶就是核苷酸取代。
[0213]
当涉及多肽进行使用时，“保守取代”是指用具有相似侧链的不同残基取代一个氨基酸残基，而因此通常涉及用相同或相似类别氨基酸中的氨基酸取代多肽中的氨基酸。作为示例而非限制，具有脂族侧链的氨基酸可以被另一种脂族氨基酸取代，例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有羟基侧链的氨基酸被另一个具有羟基侧链路的氨基酸取代，例如丝氨酸和苏氨酸；具有芳族侧链的氨基酸被另一具有芳族侧链的氨基酸取代，例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸；具有碱性侧链的氨基酸被另一个具有碱性侧链的氨基酸取代，例如赖氨酸和精氨酸；具有酸性侧链的氨基酸被另一个具有酸性侧链的氨基酸取代，例如天冬氨酸或谷氨酸；和疏水性或亲水性氨基酸分别被另一个疏水性或亲水性氨基酸取代。
[0214]
当涉及多肽使用时，“非保守取代”是指用侧链性质显著不同的氨基酸取代多肽中的氨基酸。非保守取代可以使用定义的组之间而不是之内的氨基酸，并影响(a)取代区域中肽骨架的结构(例如，丝氨酸取代甘氨酸)，(b)电荷或疏水性，或(c)侧链的主体(bulk)。作为示例而非限制，示例性非保守取代可以是碱性或脂族氨基酸取代酸性氨基酸；小氨基酸取代芳族氨基酸；和疏水性氨基酸取代亲水性氨基酸。
[0215]
如本文所用，“载体”是指可以运输与其连接的另一核酸分子的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它是指一种其他核酸片段可以连接到其中的环状双链核酸环。某些载体可以指导与其操作性连接的基因的表达。这种载体在本文中被称为“表达载体”。某些其他载体可以促进外源核酸分子插入细菌基因组。这种载体在本文中被称为“变形载体”。通常，在重组核酸技术中有用的载体通常是以质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。大量合适的载体对于本领域技术人员是已知的，并且可以商购获得。
[0216]
如本文所用，“启动子”是指dna序列，通常位于结构基因编码区的上游(5')，通过为rna聚合酶和转录起始所需的其他因子提供识别和结合位点而控制编码区的表达。启动子的选择将取决于所关注的核酸序列。合适的“启动子”通常是可以支撑本发明细菌中转录的启动，从而产生mrna分子的启动子。
[0217]
如本文所用，“可操作地连接”是指一种并置，其中描述的组分处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系中。与编码序列“可操作地连接”的控制序列以此方式连接而使编码序列在与控制序列相容的条件下实现表达。当启动子序列足够接近基因的转录起始位点而调节基因转录时，启动子序列就与该基因“可操作地连接”。
[0218]“序列同一性百分比”、“％序列同一性”和“％同一性”是指核苷酸序列与参考核苷酸序列之间或氨基酸序列与参考氨基酸序列之间的序列同一性。序列同一性可以通过比较每个序列中的位置而确定，这可以为了比较目的而进行比对。当所比较的序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则该分子在该位置是相同的。核苷酸或氨基酸序列之间的相同程度是在核苷酸或氨基酸序列共享位置上相同或匹配的核苷酸或氨基酸的数量的函数。使用各种比对算法和/或程序就可以计算出两个序列之间的同一性，包括fasta或blast，其作为gcg序列分析软件包(university of wisconsin,madison,wis.)的一部分可获得，并且可以采用默认设置进行使用。
[0219]
如本文所用，术语“约”是指所使用的数字的数值的
±
10％。
[0220]
如果本文规定了数值限制或范围，则包括端点。此外，数值限制或范围内的所有值和子范围都明确地包括在内，就像明确地写出一样。
[0221]
如本文所用，不定冠词“一个”和“一种”是指“至少一个”或“一个或多个”，除非上下文另有明确规定。
[0222]
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”及其语法变体都应该视为指定所述特征、步骤或组件，而非排除一个或多个其他特征、步骤、组件或组群的添加。
[0223]
在概括描述了本发明之后，通过参考某些具体实例可以获得进一步的理解，这些实例在本文中仅出于举例说明的目的而提供，并且除非另有规定，否则并非旨在限制。
[0224]
实施例
[0225]
实施例1：鞭毛甲基菌和糖原甲基菌中eps生产基因的确定
[0226]
基于生物信息学分析，选择了几个基因组基因座进行破坏。先前已经公开了鞭毛甲基菌中两个eps相关基因簇的遗传位置(chistoserdova etal.，2007)。为了标注出第一甲基菌eps生产基因簇(seq id no:87-112)中的基因，通过ncbi blast蛋白质搜索，使用python编程语言中的自定义脚本，将来自公开的甲基菌12s甲醇烷(methanolan)合成簇(yoshida et al.，2000)的基因同源物与鞭毛甲基菌基因组进行比较。根据由e值、检索覆盖率和序列同一性组成的计算组合得分，选择出最佳选择(top hit)。然后在基因组序列中手动定位每个基因的单个最佳选择并进行注释。这些最佳选择的位置与所发表的第一簇的位置一致。由于没有为每个基因找到明确的同源物，则因此最远同源物之间的所有基因都被认为是该簇的部分。大多数这样的未注释基因都编码糖和多糖相关基因。使用相同的方案确定出糖原甲基菌中完全未注释的eps簇(seq id no:125-146)。
[0227]
在鞭毛甲基菌的基因组序列(seq id no:113-124)中预测第二eps相关簇。进行blast搜索，将这些基因与甲醇烷簇进行比较，没有发现明确的同源物。通过针对所有非冗余蛋白质序列的ncbi蛋白质blast搜索，确定出该簇中每个单独基因的蛋白质产物，并且如上所述选择出每个基因的最佳选择。使用ncbi蛋白质blast在糖原甲基菌基因组中交叉搜索来自该甲基菌蛋白质簇的每个基因的蛋白质序列。找出最佳选择而在糖原甲基菌中构成类似簇(seq id no:147-172)。
[0228]
在每个eps-相关基因簇中的所确定的开放阅读框(orf)显示于下表1-4中。
[0229]
表1：鞭毛甲基菌中eps基因簇1的orf
[0230]
[0231][0232]
表2：鞭毛甲基菌eps基因簇2的orf
[0233][0234]
表3：糖原甲基菌中eps基因簇2的orf
[0235]
[0236][0237]
表4：糖原甲基菌中eps基因簇2的orf
[0238][0239][0240]
表5：各簇的全序列
[0241]
seq id no生物体簇链
173鞭毛甲基菌1顶174鞭毛甲基菌1底175鞭毛甲基菌2顶176鞭毛甲基菌2底177糖原甲基菌1顶178糖原甲基菌1底179糖原甲基菌2顶180糖原甲基菌2底
[0242]
基于与甲基菌属菌株12中eps生产必需基因的相似性，选择出注释为epsd、epse、epsf和epsg的orf(鞭毛甲基菌中的seq id no:6-9，糖原甲基菌中seq id no:42-45)进行缺失(yoshida et al，2003)。由于第二eps簇在其他表征的eps簇中没有明确同源物，因此选择鞭毛甲基菌中的所有12个orf(seq id no:27-38)和糖原甲基菌中的所有26个orf(seq id no:61-86)进行缺失。
[0243]
实施例2：dna缺失
[0244]
制备出的abme5和abme6的修饰菌株中缺失了任一个eps生产簇或两个eps生产簇。基因组编辑通过引入线性dna片段实现，该dna片段由卡那霉素或利福平抗性盒组成，其两侧是整合位点上游和下游的2kb长序列。通过电穿孔将dna片段转化至abme5和abmr6中。转化结果接种到含有20g/l琼脂、50μg/ml卡那霉素或5μg/ml利福平的选择性pm7孔板上长达24-48小时。将abme 5-衍生菌株在30℃下培养。abme 6-衍生菌株在37℃下培养。通过菌落pcr确认克隆正确。表6列出了通过dna缺失制备的菌株。
[0245]
表6：利用基因组整合制备的菌株列表
[0246][0247][0248]
实施例3：鞭毛甲基菌eps基因破坏前后摇瓶培养物中的总eps的测量
[0249]
为了评价abme6中eps生产基因缺失的效果，如实施例3所述制备三种修饰的abme6菌株(abme80、abme82和abme131)，并测试eps生产。
[0250]
将确认的转化体在pm7+50μg/ml卡那霉素琼脂孔板上生长过夜。将单个菌落再悬浮于250ml带挡板摇瓶中的25ml pm7培养基+25μg/ml卡那霉素中，并在200rpm下培养过夜。第二天，用2.5ml过夜培养物接种250ml带挡板摇瓶中的50ml pm7培养基+25μg/ml卡那霉素。所有abme 5衍生菌株在30℃下培养，所有abme 6衍生菌株在37℃下培育。然后将培养物在冰上冷却，将试样等分于2ml eppendorf管中，并在4℃标准台式离心机上以15000rpm离心15分钟。当细胞沉淀上方可见一层eps时，将其混合回上清液中。将培养物上清液储存以用于eps水解。通过加入一半体积的6m tfa(三氟乙酸)上清液进行水解，得到3m最终tfa浓度。各根管置入加热至120℃的热块中，培养6h。水解后，液体(包括tfa)在80℃下蒸发，直至完全干燥。干物质再悬浮于0.5m naoh(体积与原始培养物等分试样相同)中，并在hplc上分析单体糖。
[0251]
表7：用于摇瓶实验的pm7培养基的组成
[0252][0253][0254]
abme 6离心后在细胞颗粒顶部产生可见的黏液层，水解后总单体糖为约1g/l。单
簇破坏(abme 80和abme 82)没有可见的黏液层，但仍产生约500mg/l总糖。感兴趣的是，取决于哪个基因簇被破坏，葡萄糖与总糖的比例是颠倒的，这很可能是由于产生了两种不同类型的eps。当两个簇都被破坏时(菌株abme 131)，糖低于检测限。
[0255]
实施例4：eps基因破坏前后鞭毛甲基菌反应器培养物中的粘度测量
[0256]
为了评价eps生产破坏前后发酵液粘度的变化，比较了氧气限制之下的5升生物反应器发酵菌株。生物反应器接种培养物总是按如下方式制备。将250ml带挡板摇瓶中的25ml pm7培养基用250μl菌株冷冻原液接种，原液od调整为5，以产生0.05的起始od。将培养物在37℃下以200rpm培养过夜。早上，将2l带挡板摇瓶中的200ml pm7培养基接种10％(20ml)过夜培养物，并生长直至od～1(+/-0.2)。然后使用该培养物在5l生物反应器中接种2.5l起始体积的无菌pm3培养基(8％接种物)。通过自动添加nh4oh将ph保持于7，并将温度保持于37℃。
[0257]
对于氧限制过程，甲醇自动进料以保持浓度于3-6g/l。反应器曝气和搅拌保持最大，但在此过程期间氧气浓度总降至0％。肉汤定期取样进行od、矿物质和代谢产物测量。在过程结束时测量粘度，结果汇总于图2中。野生型鞭毛甲基菌发酵液取样时具有400厘泊高粘度。还测量了不同种类的甲基菌abme 145，并产生了422厘泊的类似粘度的肉汤。双簇破坏产生了明显粘度较低的肉汤，其可以使用标准台式设备进行离心和过滤，这在以前的样品中是不可能的。粘度计证实了这个评价，测量到35cp粘度或粘度降低近10倍。还测量了大肠杆菌发酵液的代表性样品以进行比较。
[0258]
实施例5：鞭毛甲基菌中eps基因消除前后摇瓶中起泡减少的测量
[0259]
我们观察到，eps缺乏的菌株显示出起泡明显较少。为了比较abme 6相对于eps缺乏突变菌株(abme 82和abme 131)的泡沫形成，如实施例3所述培养各菌株。
[0260]
为了测量泡沫形成，将摇瓶从振荡器上取下，并使液体沉降5分钟。用卷尺测量液体顶部的泡沫层(图3)。野生型培养物在液体顶部产生0.5-1cm的泡沫层，而单簇破坏仅在液体弯月面处积累约1mm泡沫。在双簇破坏培养物中完全看不到泡沫。
[0261]
实施例6：鞭毛甲基菌中eps基因破坏前后生物反应器培养中起泡减少的测量
[0262]
为了评价eps生产破坏前后发酵液起泡的变化，在5l生物反应器发酵中对各菌株进行了比较。泡沫形成量近似于添加消泡剂的量(sag 5693)。发酵在限碳条件下进行。
[0263]
如实施例5中所述对反应器进行接种。为了实现限碳，将50％甲醇以在最高曝气和搅拌设置下将po2值保持于约30％的动态计算速率自动加入反应器。添加的甲醇立即消耗并保持于检测水平以下。当泡沫到达放置于发酵液弯液面上方的检测器时，自动添加消泡剂。以这种方式测试abme 6和abme 131。在abme 131的情况下，5小时后开始添加消泡剂。abme 131发酵中添加的消泡剂减少了约60％，具体取决于发酵时间(图4)。
[0264]
实施例7：eps基因破坏前后鞭毛甲基菌细胞聚结体的显微镜图像
[0265]
为了评价eps生产破坏前后细胞聚集起泡的变化，如实施例3所述，在限氧下5l生物反应器发酵中培养各菌株。
[0266]
通过zeiss axioplan 2显微镜上的相位对比显微，凭借zeiss ph2 plan neofluar 40x物镜(na 0.75)观察肉汤样品，并在scmos相机上记录。abme 6细胞形成大团块，并固定于eps基质中(图5)。在双簇破坏菌株abme 131的情况下，细胞各自漂浮于溶液中，聚结程度极低。
[0267]
实施例8：无eps的鞭毛甲基菌的甲醇耐受性改善
[0268]
高甲醇浓度耐受性是高效生物过程的关键参数。为了证实不能生产eps的菌株的甲醇耐受性没有降低，在abme 6及其产eps衍生菌株abme 131中测试了甲醇浓度增加时的生长。
[0269]
如实施例4中所述，在摇瓶中测试各菌株。为了测试甲醇耐受性，将初始甲醇浓度提高到4.5％。24小时后测定od600。
[0270]
出乎意料的是，与abme 6相比，abme 131的甲醇耐受性更高。例如，在2.75％的初始甲醇浓度下，无eps的abme 131生长到1.6的od600，而野生型abme 6仅生长到0.3的od600。2.75％下的生长差异最显著。然而，与abme 6相比，abme 131的生长改善在所有甲醇浓度下都是明显的(图6)。
[0271]
说明书中引述的参考文献列表
[0272]
chistoserdova,l.et al.(2007)
‘
genome of methylobacillus flagellatus,molecular basis for obligate methylotrophy,and polyphyletic origin of methylotrophy’,journal of bacteriology.american society for microbiology journals,189(11):4020
–
4027.
[0273]
hattori,m.et al.(2020)methylobacillus glycogenes jcm 2850,whole genome shotgun sequencing p-nucleotide-ncbi.
[0274]
yoshida,t.et al.(2000)
‘
saccharide production from methanol by transposon 5mutants derived from the extracellular polysaccharide-producing bacterium methylobacillus sp.strain 12s’,applied microbiology and biotechnology.doi:10.1007/s002530000407.
[0275]
yoshida,t.et al.(2003)
‘
genes involved in the synthesis of the exopolysaccharide methanolan by the obligate methylotroph methylobacillus sp.strain 12s’,microbiology.microbiology society,pp.431
–
444.doi:10.1099/mic.0.25913-0.
[0276]
qui z and goodman mf:the escherichia coli polb locus is identical to dina,the structural gene for dna polymerase ii.characterization of pol ii purified from a polb mutant.j biol chem.1997,272(13):8611-8617.
[0277]
kwon dh,ja,osato ms,fox jg,graham dy,versalovic j:frameshift mutations in rdxa and metronidazole resistance in north american helicobacter pylori isolates.j antimicrob chemother 2000,46(5):793-796
[0278]
datsenko ka,wanner bl:one-step inactivation of chromosomal genes in escherichia coli k-12using pcr products.proc natl acad sci u s a 2000,97:6640-6645。

技术特征：
1.一种基因工程化的甲基菌(methylobacillus)属的细菌，所述细菌修饰为灭活第一eps基因簇和/或第二eps基因簇；其中所述第一eps基因簇包括由seq id no:174或177中存在的开放阅读框(orf)定义的或与其直系同源的基因；并且其中所述第二eps基因簇包括由seq id no:175或179中存在的开放阅读框(orf)定义的或与其直系同源的基因。2.根据权利要求1所述的基因工程化的细菌，其中，灭活所述第一eps基因簇。3.根据权利要求1或2所述的基因工程化的细菌，其中，灭活所述第二eps基因簇。4.根据权利要求1-3中任一项所述的基因工程化的细菌，其中，灭活所述第一eps基因簇和所述第二eps基因簇。5.根据权利要求1-4中任一项所述的细菌，其中，所述第一eps基因簇包括基因epsd、epse、epsf、epsg、epsb、epsl、epsh、epsi、epsj和epss，或其直系同源物。6.根据权利要求1-5中任一项所述的细菌，其中，所述第一eps基因簇包括基因epsd、epse、epsf和epsg或其直系同源物。7.根据权利要求1-6中任一项所述的细菌，其中，所述第一eps基因簇包括与seq id no:174或177的核苷酸序列具有至少50％序列同一性的核苷酸序列。8.根据权利要求1-6中任一项所述的细菌，其中，所述第一eps基因簇包括与seq id no:174的核苷酸序列具有至少50％序列同一性的核苷酸序列。9.根据权利要求1-8中任一项所述的细菌，其中，所述第一eps基因簇通过所述簇的部分或整个序列的缺失而灭活。10.根据权利要求1-8中任一项所述的细菌，其中，所述第一eps基因簇通过修饰启动子和/或核糖体结合位点区域导致缺乏基因表达而灭活。11.根据权利要求1-10中任一项所述的细菌，其中，所述第二eps基因簇包括与seq id no:175或179的核苷酸序列具有至少50％序列同一性的核苷酸序列。12.根据权利要求1-10中任一项所述的细菌，其中，所述第二eps基因簇包括与seq id no:175的核苷酸序列具有至少50％序列同一性的核苷酸序列。13.根据权利要求1-12中任一项所述的细菌，其中，所述第二eps基因簇通过所述簇的部分或整个序列的缺失而灭活。14.根据权利要求1-12中任一项所述的细菌，其中，所述第二eps基因簇通过修饰启动子和/或核糖体结合位点区域导致缺乏基因表达而灭活。15.根据权利要求1-14中任一项所述的细菌，其中，编码涉及所述细菌中胞外多糖(eps)生产的酶的所有内源基因被灭活，例如被删除。16.根据权利要求1-15中任一项所述的细菌，其中，所述细菌选自鞭毛甲基菌(methylobacillus flagellatus)、糖原甲基菌(methylobacillusglycogenes)、草原甲基菌(methylobacillus pratensis)、根际甲基菌(methylobacillus rhizosphaerae)、草状甲基菌(methylobacillusgramineus)、树状甲基菌(methylobacillus arboreus)、隆凸甲基菌(methylobacillus caricics)、食甲基甲基菌(methylobacillusmethilovorans)和甲基菌属(methylobacillus sp)。17.根据权利要求1-15中任一项所述的细菌，其中，所述细菌选自鞭毛甲基菌和糖原甲基菌。18.根据权利要求1-15中任一项所述的细菌，其中，所述细菌是鞭毛甲基菌。
19.根据权利要求1-15中任一项所述的细菌，其中，所述细菌是糖原甲基菌。20.一种用于生产生物化学化合物的方法，包括：在合适的培养条件下，在包含还原的单碳化合物如甲醇，或不含碳-碳键的多碳化合物如二甲胺的培养基中培养根据权利要求1-19中任一项所述的细菌。21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述培养基包含甲醇。22.根据权利要求20或21所述的方法，其中，所述培养在生物反应器中进行。

技术总结
本发明总体涉及生物技术工程，并且特别涉及基因修饰的甲基菌属的细菌，其具有改进的性能，使其在大规模甲醇发酵中特别有用。更具体地，本发明提供了一种甲基菌属的细菌，该细菌与不携带所述修饰的其他相同的细菌相比，修饰为具有降低的胞外多糖(EPS)的生产。本发明还提供了一种使用本发明的基因修饰的细菌生产生物化学化合物的方法。生物化学化合物的方法。


技术研发人员：亚历山大
受保护的技术使用者：阿西耶斯生物公司
技术研发日：2021.09.30
技术公布日：2023/8/24