用于递送抗癌剂的具有改进的治疗指数的组合物和方法与流程

用于递送抗癌剂的具有改进的治疗指数的组合物和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35u.s.c.
§
119(e)要求2020年12月14日提交的美国临时专利申请号63/125,386的优先权，其公开内容通过引用的方式整体纳入本文。
技术领域
3.本公开涉及通过将组合活性药物成分(api)封装在脂质体的双分子层和/或水性核心隔室中来改善癌症治疗的药物制剂和方法。


背景技术：

4.在过去的二十年，由于蛋白激酶家族在信号转导和调节一系列细胞活动中的关键作用，它们已经成为治疗各种类型的人类疾病的最重要药物靶点之一。美国食品和药品管理局(fda)已经批准了60多种小分子蛋白激酶抑制剂作为治疗剂，这些治疗剂靶向大约二十多种与癌症相关的不同蛋白激酶，在药代动力学特性、成本、患者依从性和药物储存方面具有优势。许多基于蛋白激酶抑制剂的候选药物目前正处于临床前或临床开发阶段。然而，蛋白激酶抑制剂在临床使用一段时间后迅速产生耐药性，以及其毒性、严重的副作用和受到影响的疗效，这些都是临床和实验肿瘤学面临的关键挑战，并且仍然是主要问题。为了在临床评估中克服这些挑战，结合两种或更多种蛋白激酶抑制剂的联合疗法是癌症治疗的基石，特别是希望能避开与治疗有关的耐药性，并比单一疗法的方法提高疗效。蛋白激酶抑制剂的耐药性是一个常见的问题，尤其是在患者通常已经接触过多线前期治疗后的转移阶段。由于耐药性的产生，患者在治疗期间或治疗结束后不久可能会经历疾病的快速进展。这种耐药性导致患者的治疗选择数量有限。因此，为了尽量减少耐药性的影响，已尝试同时联合使用两种或更多种具有不相关作用机制和不同耐药性模式的抗癌药物。
5.靶向疗法相对化疗的优势在于其能够主动靶向特异性细胞受体。传统的化疗不能有效地区分肿瘤细胞，但会快速分裂正常细胞，从而导致非特异性的不良反应。相比之下，靶标特异性抗癌疗法干扰了在肿瘤生长或进展中具有不同于正常细胞的重要作用的分子靶标。此外，这些药剂中的一些可作为多重耐药性(mdr)相关蛋白的抑制剂，从而提高反应速率。总的来说，与传统化疗相比，靶向疗法提供了一个更广泛的治疗窗口，毒性更小，反应速率更高。
6.近年来，蛋白激酶抑制剂的组合在临床上被广泛利用以增强癌症治疗。然而，传统的鸡尾酒式的联合施用方案经常受到不同药物之间的差异性药代动力学的影响。在常见的临床前和临床实践中，蛋白激酶抑制剂的联合药物疗法以不同的数量和/或不同的给药计划单一地施用，而没有设计药物制剂来控制药物的递送或半衰期。这些施用方法有各种缺点，限制了联合药物治疗的治疗用途。通常，这类方案的组分首先是单独开发的，没有考虑到它们在联合使用时可能出现的许多问题，如靶标拮抗(on-target antagonism)和不良事件的增强。虽然考虑到各种抗癌药物理论上不重叠的作用机制，联合治疗带来的有益治疗效果是很有希望的，但上述临床癌症治疗中常见的组合远非完美，通常具有适度增强的疗
效和加和的毒性。因此，通过将纳米技术与联合抗癌治疗相结合，基于以下假设研究了各种方法：通过使用载体介导的药物递送系统同时递送两种或更多种药物，药物递送系统的组合可以产生协同的抗癌作用，减少单个药物的相关毒性，控制药物释放，和/或统一每种药物的药代动力学。近年来，脂质体、树枝状大分子、聚合物纳米颗粒和水溶性聚合物-药物缀合物已被报道为递送多种药物组合的载体(markman,j.l.,et al.,adv.drug delivery rev.2013,65,1866-1879)。
7.在纳米载体中，脂基的纳米颗粒通过克服p-gp介导的外排、经由增强的通透性和滞留(epr)效应将药物隔绝在肿瘤部位并在一旦内化后逃脱内体的清除，基于脂质的显示出良好的效果。例如，cpx-351是一种基于阿糖胞苷和柔红霉素封装的双药脂质体制剂，经合理设计，比传统的7+3阿糖胞苷/柔红霉素化疗方案对急性髓系白血病(aml)患者的疗效有所提高(lawrence d mayer,et al.,international journal of nanomedicine 2019:14,3819-3830)。为了实现多种蛋白激酶抑制剂在癌症治疗中的有效递送，一些研究试图将此类药物封装在基于脂质体的递送载体中，所述递送载体被设计为庇护药物使其免于从血流中快速清除的机制。然而，仍然非常需要创新的基于脂质体的用于组合的蛋白激酶抑制剂递送的递送系统，以提高药物递送的特异性，实现协同治疗效果，减少耐药性和药物相关的不良反应，并全面提高药物治疗指数。


技术实现要素：

8.本公开提供了作为基于脂质体的药物递送系统的药物组合物，以及使用基于脂质体的药物递送系统向患者施用有效量的一种、两种或更多种蛋白激酶抑制剂(例如，阿法替尼(afatinib)、尼达尼布(nintedanib)、阿贝西利(abemaciclib)、舒尼替尼(sunitinib)、克唑替尼(crizotinib)、达沙替尼(dasatinib)、色瑞替尼(ceritinib)、奥希替尼(osimertinib)、帕纳替尼(ponatinib)、鲁索利替尼(ruxolitinib)或其他)的方法。两种或更多种蛋白激酶抑制剂可以被封装在脂质体的水性核心隔室(例如，对于亲水性、水溶性抑制剂)或脂质体的脂质双分子层(例如，对于亲脂性、水溶性差的抑制剂)中。
9.在一些实施方案中，一个单一的脂质体载体可以同时携带亲脂性和亲水性蛋白激酶抑制剂，其中亲水性抑制剂在水性核心中，亲脂性抑制剂在脂质双分子层中。这些组合物允许两种或更多种蛋白激酶抑制剂以协调的方式递送到疾病部位，从而确保蛋白激酶抑制剂可以以所需的数量或比例出现在疾病部位。两种或更多种蛋白激酶抑制剂的联合递送可以通过如上所述的将它们共封装在一个基于脂质的递送载体内，或通过将每种抑制剂封装在单一的基于脂质的递送载体中来实现。在后一种情况下，组合物的药代动力学(pk)由基于脂质的递送囊泡本身控制，从而实现协调递送(前提是递送系统的pk是相当的)。
10.在一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含悬浮在液体介质中的脂质体，所述液体介质包含水和缓冲剂以维持ph。脂质体包含由外部脂质双层膜围住的内部水性隔室。脂质双层膜包含形成内部隔室的亲水性内表面、亲脂性双层膜和与组合物的液体介质接触的亲水性外表面。关于蛋白激酶抑制剂在脂质体制剂中的位置，有三种主要情形值得注意。情形一：内部水性隔室含有一种、两种或更多种亲水性蛋白激酶抑制剂。情形二：亲脂性双分子层含有一种、两种或更多种亲脂性蛋白激酶抑制剂。情形三：内部水性隔室含有一种或多种亲水性蛋白激酶抑制剂，并且在同一个脂质体中，亲脂性双分子层含有一种或多
种亲脂性蛋白激酶抑制剂。对于上述所有三种情形，共封装的蛋白激酶抑制剂可以从脂质体中释放，并引起协同治疗效果。
11.在另一个方面，本公开提供了一种用于肠胃外施用的脂质体组合物，其包含以治疗有效的比例封装在脂质体内的一种、两种或更多种蛋白激酶抑制剂，特别是非拮抗性的蛋白激酶抑制剂。
12.在另一个方面，本公开提供了一种根据本文公开的任何实施方案所述的药物组合物，用于治疗癌症，或需要治疗的受试者中癌症药物的耐药性和副作用，其中癌症选自乳腺癌、黑色素瘤、胃肠癌、肺癌、结直肠癌、尤文氏肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、甲状腺癌、子宫癌和胃肠道间质瘤等，其中蛋白激酶抑制剂通过脂质体递送，对癌细胞具有协同的细胞毒性或细胞抑制作用。
13.在另一个方面，本公开提供了一种治疗癌症或癌症耐药性并减少癌症药物的毒性和副作用的方法。本公开包括通过治疗有效量的根据本文公开的任何实施方案所述的药物组合物向需要治疗的受试者施用。
14.在另一个方面，本公开提供了一种制备脂质体药物组合物的方法，其中脂质体通过包括主动载药或被动载药、或通过将被动载药和之后的主动载药耦合在一起的依次载药的过程制成。
15.在另一个方面，本公开提供了一种治疗试剂盒，其包含容器和容器中多个根据本文公开的任何实施方案的载药脂质体，其中载药脂质体可以悬浮在准备向需要治疗的受试者施用的无菌稀释液中。
16.在另一个实施方案中，脂质体组合物包含两种或更多种蛋白激酶抑制剂，其中组合蛋白激酶抑制剂的摩尔比对培养中的相关细胞物和肿瘤匀浆表现出所需的生物效应。优选地，所述摩尔比是这些药剂非拮抗时的摩尔比。
17.在另一个实施方案中，本公开提供了一种通过施用本发明的组合物向所需的靶标(例如，肿瘤部位)递送治疗有效量的组合蛋白激酶抑制剂(例如，阿法替尼/尼达尼布、阿法替尼/达沙替尼、阿法替尼/色瑞替尼、阿贝西利/舒尼替尼、奥希替尼/阿法替尼、奥希替尼/克唑替尼、色瑞替尼/达沙替尼或其他)的方法。
18.在另一个实施方案中，本公开提供了一种通过施用与第一递送载体稳定相关的蛋白激酶抑制剂和与第二递送载体稳定相关的另一种激酶抑制剂来递送治疗有效量的蛋白激酶抑制剂组合的方法。第一和第二递送载体可以包含在不同的小瓶中，小瓶中的内容物同时或依次向患者施用。在一个实施方案中，组合蛋白激酶抑制剂的摩尔比是非拮抗性的。
19.在另一个实施方案中，本公开提供了一种制备治疗组合物的方法，所述组合物包含含有两种或更多种蛋白激酶抑制剂的比例的脂质体，以达到所需的治疗效果。所述方法包括：(a)提供由两种或更多种蛋白激酶抑制剂组成的小组，其中所述小组包含至少一种，但优选多种比例的药物；(b)测试所述小组的成员在一定浓度范围内对相关细胞培养物或肿瘤匀浆发挥生物效应的能力；(c)选择所述小组的一个成员，其中所述比例在适当的浓度范围内对细胞培养物和肿瘤匀浆提供了所需的治疗效果；和(d)将所述小组中成功的成员所代表的药物比例稳定地关联到基于脂质的药物递送载体中。在一些实施方案中，有时优选地，上述所需的治疗效果是非拮抗性的。
20.如下进一步所述，在按照上述方法设计适当的组合时，有时优选选择非拮抗比为
组合指数ci≤1.1(等于或小于1.1)。具体来说，ci《0.9表示药物组合的协同作用，其中0.9≤ci≤1.1的范围被认为是加和作用，而ci》1.1被认为是药物组合的拮抗作用。
21.在其他的实施方案中，合适的脂质体制剂被设计成使其稳定地结合有效量的两种或更多种蛋白激酶抑制剂的组合，并允许组合药物在体内持续释放。有时优选地，所述制剂含有peg化的dspe或至少一种带负电荷的脂质，如磷脂酰甘油(dspg)。
22.在其他的实施方案中，可以采用主动载药、被动载药或被动再主动载药过程的依次组合，由天然磷脂和合成的类似物如电荷两性离子的磷脂酰胆碱等制备脂质体。可以加入较小比例的阴离子磷脂，如磷脂酰甘油，以产生净负的表面电荷来稳定胶体。对于主动载药方法，根据共载药物的物理特性，使用各种捕获剂(例如，硫酸铵、过渡金属离子，以及以下的铵盐或取代的铵盐：多阴离子化硫酸化环糊精、磺丁基醚环糊精、多阴离子化硫酸化糖、多磷酸盐等)。
23.将两种或更多种基于激酶抑制剂的抗癌药物封装在脂质体中是一种新的方法，可以刺激导致肿瘤生长和发展的多种信号传导通路之间的交互作用。由于激酶抑制剂在信号转导和调节一系列细胞活动中的关键作用，激酶抑制剂组合是治疗各种类型的人类疾病的有用治疗方法。
24.在另一个实施方案中，本公开提供了如本文任何实施方案或实施例所公开的脂质体和/或根据本文公开的任何实施方案或实施例所述的方法制备的脂质体。
25.根据以下具体实施方式、实施例和权利要求，将更好地理解本公开的其他方面或优点。
附图说明
26.图1示出了一些实例蛋白激酶抑制剂的化学结构。a：双马来酸阿法替尼；b：乙磺酸尼达尼布；c：甲磺酸阿贝西利；d：苹果酸舒尼替尼；e：克唑替尼；f：甲磺酸奥希替尼；g：达沙替尼一水合物；h：色瑞替尼。
27.图2示出了药物与脂质的比例(w/w，总脂质浓度固定为8mg/ml)对以硫酸铵(as)、tea-sbe-β-cd和tea-sos作为捕获剂的peg化afa-l的封装效率(ee％)的影响。
28.图3示出了药物与脂质的比例(w/w，总脂质浓度固定为8mg/ml)对以硫酸铵(as)、tea-sbe-β-cd和tea-sos作为捕获剂的peg化nin-l的封装效率(ee％)的影响。
29.图4示出了捕获剂tea-sbe-β-cd和tea-sos的结构。
30.图5示出了在peg化的脂质体内共载的组合抗癌蛋白激酶抑制剂的实例。图中共示出了抗癌抑制剂在脂质体内的位置的三种情形：情形一：两种亲水性(水溶性)抗癌抑制剂都载于脂质体的水性核心内；情形二：一种亲水性(水溶性)抗癌抑制剂载于水性核心中，另一种亲脂性(水溶性差的)抗癌抑制剂被封装在脂质双分子层中；情形三：两种亲脂性(水溶性差的)抗癌抑制剂都载于脂质体的脂质双分子层内。
31.图6示出了peg化的afa-l、nin-l和afa/nin-l在1:10、1:5、1:1的afa与nin摩尔比下的粒径分布(强度％)。(nh4)2so4用作上述所有脂质体药物产品的捕获剂。
32.图7示出了peg化的afa-l、nin-l和afa/nin-l在1:10、1:5、1:1的afa与nin摩尔比下的粒径分布(强度％)。tea-sbe-β-cd用作上述所有脂质体药物产品的捕获剂。
33.图8示出了a：afa/nin-l；b：osi/afa-l和c：das/cer-l的冷冻透射电子显微镜
(cryo-tem)图像。afa/nin-l和osi/afa-l都是以tea-sos作为捕获剂的peg化脂质体。das/cer-l是基于dspg脂质体的。脂质体中使用的afa/nin、osi/afa和das/cer的摩尔比分别为1:5、1:1和1.8:1。
34.图9a、图9b和图9c(统称为图9)示出了载有蛋白激酶抑制剂的脂质体的体外溶出曲线。溶出研究是在45℃的加速条件下进行的。a：载有afa和/或nin的peg化脂质体的溶出曲线。研究了以下脂质体药物产品：(1)仅载有afa的脂质体，以硫酸铵(as)作为捕获剂(afa-l-as，实心正方形)；(2)仅载有nin的脂质体，以as作为捕获剂(nin-l-as，空心三角形)；(3)afa和nin共载脂质体，以as作为捕获剂(afa/nin-l-as，afa为实心三角形，nin为空心菱形)；和(4)afa和nin共载脂质体，以tea-sbe-β-cd作为捕获剂(afa/nin-l-cd，afa为实心圆形，nin为空心正方形)。对于共载脂质体，afa与nin的摩尔比制备为1:5。b：abe和sun(摩尔比为1:5)共载的peg化脂质体的溶出曲线。研究了以下药物产品：(1)使用tea-sbe-β-cd作为捕获剂的共载abe/sun(sun为实心圆形，abe为实心正方形)；(2)使用tris-sbe-β-cd作为捕获剂的共载abe/sun(sun为实心三角形，abe为实心棱形)。c：使用tea-sbe-β-cd作为捕获剂的共载peg化脂质体的afa和cri(摩尔比为1:1)的溶出曲线。研究了以下两种脂质体药物产品：(1)共载的afa/cri脂质体，其脂质组合物含有74wt％的dspc(afa为实心正方形，cri为实心三角形)；(2)共载的afa/cri脂质体，其脂质组合物含有68wt％的dspc(afa为空心正方形，cri为空心三角形)。
35.图10示出了通过动态光散射分析的afa/das共载脂质体的物理稳定性。样品储存在2-8℃，在预先确定的时间点测量平均粒径(nm)和多分散性(pdi)。tea-sbe-β-cd用作捕获剂，以主动负载afa。脂质体中afa与das的摩尔比为3:1。
36.图11示出了通过动态光散射分析的cer/das共载脂质体的物理稳定性。样品储存在2-8℃，在预先确定的时间点测量平均粒径和多分散性(pdi)。
37.图12a和图12b(统称为图12)示出了阿法替尼(afa)和尼达尼布(nin)在ht-29结直肠细胞中的协同模式的体外评估。a：作为阿法替尼/尼达尼布比例和药物浓度的函数的阿法替尼和尼达尼布在ht-29结直肠细胞中的协同模式的体外评估。固定的阿法替尼/尼达尼布摩尔比的浓度被设计为提供广泛的细胞生长抑制(用fa表示)范围。显示了组合指数(ci)值作为固定药物比例下细胞生长抑制的函数的代表性图，其中ci值《1、～1和》1分别表示协同作用、加和作用和拮抗作用。b：作为阿法替尼/尼达尼布摩尔比的函数在ed
75
(黑色柱，fa＝0.75)和ed
90
(灰色柱，fa＝0.90)下绘制的来自ht-29结直肠细胞的ci体外评估(n＝3次独立重复)。
38.图13a和图13b(统称为图13)示出了阿法替尼(afa)和尼达尼布(nin)在h1975非小细胞肺癌(nsclc)细胞中的协同模式的体外评估。a：组合指数(ci)值作为不同afa与nin摩尔比下的细胞生长抑制(用fa表示)的函数的代表性图，其中ci值《1、～1和》1分别表示协同作用、加和作用和拮抗作用。b：作为不同afa/nin摩尔比的函数在ed
75
(黑色柱，fa＝0.75)和ed
90
(白色柱，fa＝0.90)下绘制的基于h1975 nsclc的ci体外评估(n＝3次独立重复)。
39.图14a和图14b(统称为图14)示出了阿贝西利(abe)和舒尼替尼(sun)在786-o肾癌细胞中的协同模式的体外评估。a：组合指数(ci)值作为不同abe与sun摩尔比下的细胞生长抑制(用fa表示)的函数的代表性图，其中ci值《1、～1和》1分别表示协同作用、加和作用和拮抗作用。b：作为不同abe/sun摩尔比的函数在ed
75
(黑色柱，fa＝0.75)和ed
90
(白色柱，fa
＝0.90)下绘制的基于786-o肾癌细胞的ci体外评估(n＝3次独立重复)。
40.图15a和图15b(统称为图15)示出了阿贝西利(abe)和舒尼替尼(sun)在caki-1肾癌细胞中的协同模式的体外评估。a：组合指数(ci)值作为不同abe与sun摩尔比下的细胞生长抑制(用fa表示)的函数的代表性图，其中ci值《1、～1和》1分别表示协同作用、加和作用和拮抗作用。b：作为不同abe/sun摩尔比的函数在ed
75
(黑色柱，fa＝0.75)和ed
90
(白色柱，fa＝0.90)下绘制的基于caki-1肾癌细胞的ci体外评估(n＝3次独立重复)。
41.图16a和图16b(统称为图16)示出了阿法替尼(afa)和克唑替尼(cri)在msto-211h间皮瘤细胞中的协同模式的体外评估。a：组合指数(ci)值作为不同afa与cri摩尔比下的细胞生长抑制(用fa表示)的函数的代表性图，其中ci值《1、～1和》1分别表示协同作用、加和作用和拮抗作用。b：作为不同afa/cri摩尔比的函数在ed
75
(黑色柱，fa＝0.75)和ed
90
(白色柱，fa＝0.90)下绘制的基于msto-211h细胞的ci体外评估(n＝3次独立重复)。
42.图17a和图17b(统称为图17)示出了阿法替尼(afa)和克唑替尼(cri)在h1975 nsclc细胞中的协同模式的体外评估。a：组合指数(ci)值作为不同afa与cri摩尔比下的细胞生长抑制(用fa表示)的函数的代表性图，其中ci值《1、～1和》1分别表示协同作用、加和作用和拮抗作用。b：作为不同afa/cri摩尔比的函数在ed
75
(黑色柱，fa＝0.75)和ed
90
(白色柱，fa＝0.90)下绘制的基于h1975 nsclc细胞的ci体外评估(n＝3次独立重复)。
43.图18a和图18b(统称为图18)示出了奥希替尼(osi)和阿法替尼(afa)在h1975 nsclc细胞中的协同模式的体外评估。a：组合指数(ci)值作为不同osi与afa摩尔比下的细胞生长抑制(用fa表示)的函数的代表性图，其中ci值《1、～1和》1分别表示协同作用、加和作用和拮抗作用。b：作为不同osi/afa摩尔比的函数在ed
75
(黑色柱，fa＝0.75)和ed
90
(白色柱，fa＝0.90)下绘制的基于h1975 nsclc细胞的ci体外评估(n＝3次独立重复)。
44.图19a和图19b(统称为图19)示出了奥希替尼(osi)和阿法替尼(afa)在hcc827 nsclc细胞中的协同模式的体外评估。a：组合指数(ci)值作为不同osi与afa摩尔比下的细胞生长抑制(用fa表示)的函数的代表性图，其中ci值《1、～1和》1分别表示协同作用、加和作用和拮抗作用。b：作为不同osi/afa摩尔比的函数在ed
75
(黑色柱，fa＝0.75)和ed
90
(白色柱，fa＝0.90)下绘制的基于hcc827 nsclc细胞的ci体外评估(n＝3次独立重复)。
45.图20a和图20b(统称为图20)示出了克唑替尼(cri)和奥希替尼(osi)在h1975 nsclc细胞中的协同模式的体外评估。a：组合指数(ci)值作为不同cri与osi摩尔比下的细胞生长抑制(用fa表示)的函数的代表性图，其中ci值《1、～1和》1分别表示协同作用、加和作用和拮抗作用。b：作为不同cri/osi摩尔比的函数在ed
75
(黑色柱，fa＝0.75)和ed
90
(白色柱，fa＝0.90)下绘制的基于h1975 nsclc细胞的ci体外评估(n＝3次独立重复)。
46.图21a和图21b(统称为图21)示出了克唑替尼(cri)和奥希替尼(osi)在hcc827 nsclc细胞中的协同模式的体外评估。a：组合指数(ci)值作为不同cri与osi摩尔比下的细胞生长抑制(用fa表示)的函数的代表性图，其中ci值《1、～1和》1分别表示协同作用、加和作用和拮抗作用。b：作为不同cri/osi摩尔比的函数在ed
75
(黑色柱，fa＝0.75)和ed
90
(白色柱，fa＝0.90)下绘制的基于hcc827 nsclc细胞的ci体外评估(n＝3次独立重复)。
47.图22a和图22b(统称为图22)示出了阿法替尼(afa)和达沙替尼(das)在h1975 nsclc细胞中的协同模式的体外评估。a：组合指数(ci)值作为不同afa与das摩尔比下的细胞生长抑制(用fa表示)的函数的代表性图，其中ci值《1、～1和》1分别表示协同作用、加和
作用和拮抗作用。b：作为不同afa/das摩尔比的函数在ed
75
(黑色柱，fa＝0.75)和ed
90
(白色柱，fa＝0.90)下绘制的基于h1975 nsclc细胞的ci体外评估(n＝3次独立重复)。
48.图23a和图23b(统称为图23)示出了阿法替尼(afa)和达沙替尼(das)在hcc827 nsclc细胞中的协同模式的体外评估。a：组合指数(ci)值作为不同afa与das摩尔比下的细胞生长抑制(用fa表示)的函数的代表性图，其中ci值《1、～1和》1分别表示协同作用、加和作用和拮抗作用。b：作为不同afa/das摩尔比的函数在ed
75
(黑色柱，fa＝0.75)和ed
90
(白色柱，fa＝0.90)下绘制的基于hcc827 nsclc细胞的ci体外评估(n＝3次独立重复)。
49.图24a和图24b(统称为图24)示出了达沙替尼(das)和色瑞替尼(cer)在h1975 nsclc细胞中的协同模式的体外评估。a：组合指数(ci)值作为不同das与cer摩尔比下的细胞生长抑制(用fa表示)的函数的代表性图，其中ci值《1、～1和》1分别表示协同作用、加和作用和拮抗作用。b：作为不同das/cer摩尔比的函数在ed
75
(黑色柱，fa＝0.75)和ed
90
(白色柱，fa＝0.90)下绘制的基于h1975 nsclc细胞的ci体外评估(n＝3次独立重复)。
50.图25a和图25b(统称为图25)示出了达沙替尼(das)和色瑞替尼(cer)在hcc827 nsclc细胞中的协同模式的体外评估。a：组合指数(ci)值作为不同das与cer摩尔比下的细胞生长抑制(用fa表示)的函数的代表性图，其中ci值《1、～1和》1分别表示协同作用、加和作用和拮抗作用。b：作为不同das/cer摩尔比的函数在ed
75
(黑色柱，fa＝0.75)和ed
90
(白色柱，fa＝0.90)下绘制的基于hcc827 nsclc细胞的ci体外评估(n＝3次独立重复)。
51.图26a和图26b(统称为图26)示出了对与afa/nin共载的(afa/nin摩尔比为1:5)脂质体的药代动力学研究。以7.0(afa游离碱)/38.9(nin游离碱)mg/kg的剂量经静脉注射向balb/c雌性裸鼠(每个时间点n＝3)施用afa/nin-l。药物产品含有tea-sos作为捕获剂。每个时间点的循环血浆afa与nin的摩尔比是根据血浆绝对浓度计算的。a：随时间的血浆药物浓度。b：随时间的血浆中afa与nin的摩尔药物比。
52.图27a、27b和27c(统称为图27)示出了通过脂质体共同递送的阿法替尼(afa)和尼达尼布(nin)对基于h1975 nsclc细胞的细胞系衍生异种移植模型的体内疗效。a：随时间的肿瘤体积变化。插图：对于用游离的afa/nin混合物、nin-l和afa/nin-l治疗的小鼠随时间的肿瘤生长。b：随时间的体重变化。c：研究结束时解剖的各组中代表性的肿瘤异种移植的照片。携带肿瘤的雌性balb/c裸鼠(每组n＝6)每两天静脉治疗一次，共20天。各治疗组的信息描述如下：盐水(空心三角形)；游离的afa溶液(7.0mg/kg，空心菱形)；游离的afa和nin组合(7.0mg/kg afa和38.9mg/kg nin，空心正方形)；脂质体afa-l(7.0mg/kg，实心菱形)；脂质体nin-l(38.9mg/kg，实心圆形)和脂质体afa/nin-l组合(7.0mg/kg afa和38.9mg/kg nin，实心正方形)。对于所有的脂质体药物产品，tea-sos用作脂质体内的捕获剂。对于afa/nin-l，afa与nin的摩尔药物比为1:5。
53.图28a、28b和28c(统称为图28)示出了通过脂质体共同递送的阿法替尼(afa)和尼达尼布(nin)对基于ht-29结直肠癌细胞的细胞系衍生异种移植模型的体内疗效。a：随时间的肿瘤体积变化。插图：对于用游离的afa/nin混合物、nin-l和afa/nin-l治疗的小鼠随时间的肿瘤生长。b：随时间的体重变化。c：研究结束时解剖的各组中代表性的肿瘤异种移植的照片。携带肿瘤的雌性balb/c裸鼠(每组6只)每两天静脉治疗一次，共19天。每个治疗组的信息描述如下：盐水(空心三角形)；游离的afa溶液(7.0mg/kg，空心菱形)；游离的afa和nin组合(7.0mg/kg afa和38.9mg/kg nin，空心正方形)；脂质体afa-l(7.0mg/kg，实心菱
形)；脂质体nin-l(38.9mg/kg，实心圆形)和脂质体afa/nin-l组合(7.0mg/kg afa和38.9mg/kg nin，实心正方形)。对于所有的脂质体药物产品，tea-sos用作脂质体内的捕获剂。对于游离的afa/nin混合物溶液和afa/nin-l，afa与nin的摩尔药物比为1:5。
具体实施方式
54.采用联合药物疗法的理由是协同的药物相互作用。首先，当应用具有不同分子靶标的多种药物时，可以延缓癌症的适应过程，如癌细胞突变。其次，当多种药物靶向不同的细胞通路时，它们可以发挥协同作用，以获得更高的治疗疗效和更高的靶标选择性。目前在临床研究中，针对多种癌症的可用联合方案在很大程度上局限于施用两种或更多种抗癌剂的物理混合物。临床研究中常用的临床上的联合方案一般可根据其作用机制进行分类，包括：(1)非特异性小分子化疗剂的联合，(2)特异性细胞受体靶向剂和化疗剂的联合，和(3)特异性细胞受体靶向剂(例如小分子蛋白激酶抑制剂、大分子抗体、核酸等)的联合。
55.在本公开中，我们已经确定了容纳用于癌症治疗和癌症耐药性预防的一种、两种或更多种蛋白激酶抑制剂(例如，阿法替尼、尼达尼布、阿贝西利、舒尼替尼、克唑替尼、达沙替尼、奥希替尼、色瑞替尼、鲁索利替尼等)所需的药物递送制剂。这种含有药物组合的制剂可提高治疗指数，减少耐药性和副作用，在载体中具有优越的药物滞留性，从而延长血液循环时间和持续释放每种药剂。我们进一步证明，当封装在脂质体中时，这些药物的协同比例可以成功地在血液隔室中长期保持，这与药物在其传统剂型(例如片剂或简单注射剂)中的组合相比，疗效得到增强。
56.本公开提供了包含封装一种、两种或更多种蛋白激酶抑制剂的脂质体的组合物，其中所选蛋白激酶抑制剂的组合以对相关细胞物或肿瘤匀浆表现出所需的细胞毒性、细胞抑制或生物效应的摩尔比存在。有时优选地，本文提供的脂质体组合物包括以对相关细胞或肿瘤匀浆表现出非拮抗作用的摩尔比载有两种激酶抑制剂的脂质体。
57.在一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含悬浮在液体介质中的脂质体，其中液体介质包含水和ph缓冲剂；其中脂质体包含由外部脂质双层膜围住的内部隔室，其中内部水性隔室包含水性介质中的亲水性蛋白激酶抑制剂；其中脂质双层膜包含形成内部隔室的亲水性内表面、亲脂性双分子层和与组合物的液体介质接触的亲水性外表面；以及其中脂质双层膜包含疏水性蛋白激酶抑制剂，脂质体内部封装的多种蛋白激酶抑制剂可以以协同或加和的模式释放。
58.在一个实施方案中，在药物组合物中，脂质体的水性内部隔室还包含捕获剂。捕获剂选自硫酸铵、多阴离子化磺丁基醚环糊精的铵盐或取代的铵盐(例如tea-sbe-α-环糊精、tea-sbe-β-环糊精、tea-sbe-γ-环糊精、tris-sbe-α-环糊精、tris-sbe-β-环糊精和tris-sbe-γ-环糊精)；多阴离子化硫酸化碳水化合物的铵盐或取代的铵盐(例如tea-sos和tris-sos)；多磷酸盐的铵盐或取代的铵盐(例如肌醇六磷酸三乙胺和肌醇六磷酸三羟甲基氨基甲烷)；过渡金属盐(例如铜、锌、锰、镍、钴等与卤化物、硫酸或葡萄糖酸反离子的盐)；季铵化合物(例如苯扎氯铵、苄索氯铵、西曲溴铵、硬脂酰二甲基苄基氯化铵)、聚氧乙烯(即聚乙二醇)和椰油胺。
59.在另一个实施方案中，在药物组合物中，两种激酶抑制剂以约60:1至约1:60摩尔/摩尔的范围内的摩尔比封装，有时优选地约30:1至约1:30，有时更优选地约10:1至约1:10、
约5:1至约1:5、约3:1至约1:3、约2:1至约1:2、或约1:1。
60.在另一个实施方案中，在药物组合物中，(a)外部双层膜包含一种或多种磷脂；并且(b)双层膜的外表面被选自聚乙二醇、带电荷的脂类及其组合的表面改性剂改性。
61.在另一个实施方案中，在药物组合物中，脂质体悬浮液的ph在约5-8的范围内。水性介质还包含以下一种或多种：水、缓冲剂、分散介质，并任选地包含等渗剂，例如蔗糖、甘露醇、氯化钠等。
62.在另一个实施方案中，在药物组合物中，脂质体包含选自磷脂(例如hspc、dspc、ddpc、depc、dlpc、dmpc、dppc、pspc、smpc、sopc、sppc、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、甘油糖脂、鞘糖脂)、甾醇及其衍生物的脂质。
63.在另一个实施方案中，在药物组合物中，甾醇占总脂质的约0-60摩尔％。
64.在另一个实施方案中，在药物组合物中，脂质体的平均粒径(直径)在4.5nm至450nm之间，有时优选地25nm至300nm之间，有时更优选地50nm至200nm之间。
65.在另一个实施方案中，在药物组合物中，脂质体的脂质双层膜包含(a)占总脂质的至少10摩尔％的磷脂，所述磷脂选自磷脂酰胆碱(占总脂质的0-80摩尔％，例如hspc、dspc、dppc、dmpc)、磷脂酰甘油(占总脂质的0-70摩尔％，例如dspg)、磷脂酰肌醇、甘油糖脂、鞘糖脂(例如鞘磷脂)及其组合；(b)占总脂质的0-60摩尔％的甾醇，优选胆固醇或其衍生物；和(c)任选地，用聚乙二醇衍化的带电荷的磷脂，占总脂质的0-10摩尔％(例如mpeg-2000-dspe)。
66.在另一个实施方案中，在药物组合物中，脂质体的脂质双层膜的外表面包含表面带负电荷的脂质(例如dspg)或含有聚乙二醇的表面改性剂(例如mpeg-2000-dspe)，其中总脂质与封装的总激酶抑制剂的摩尔比是至少相当的(1:1)。
67.在另一个实施方案中，在药物组合物中，蛋白激酶抑制剂选自阿卡替尼(acalabrutinib)、阿贝西利、阿法替尼、阿柏西普(aflibercept)、阿来替尼(alectinib)、阿瓦普利替尼(avapritinib)、阿昔替尼(axitinib)、巴瑞替尼(baricitinib)、布加替尼(brigatinib)、比美替尼(binimetinib)、博舒替尼(bosutinib)、卡博替尼(cabozantinib)、卡马替尼(capmatinib)、色瑞替尼、考比替尼(cobimetinib)、克唑替尼、达拉非尼(dabrafenib)、达克替尼(dacomitinib)、达沙替尼、康奈非尼(encorafenib)、恩曲替尼(entrectinib)、厄达替尼(erdafitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、依维莫司(everolimus)、菲卓替尼(fedratinib)、福他替尼(fostamatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉瑞替尼(gilteritinib)、依鲁替尼(ibrutinib)、埃克替尼(icotinib)、伊马替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、拉罗替尼(larotrectinib)、乐伐替尼(lenvatinib)、劳拉替尼(lorlatinib)、米哚妥林(midostaurin)、来那替尼(neratinib)、尼罗替尼(nilotinib)、尼达尼布、奈妥舒迪(netarsudil)、奥希替尼、帕克替尼(pacritinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、培西达替尼(pexidartinib)、培米替尼(pemigatinib)、帕博西尼(palbociclib)、帕纳替尼、培西达替尼、帕纳替尼、普拉替尼(pralsetinib)、奎扎替尼(quizartinib)、瑞格菲尼(regorafenib)、瑞博西尼(ribociclib)、瑞派替尼(ripretinib)、鲁索利替尼、塞尔帕替尼(selpercatinib)、司美替尼(selumetinib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼、替西罗莫司(temsirolimus)、托法替尼(tofacitinib)、曲美替尼(trametinib)、图卡替尼(tucatinib)、乌帕替尼(upadacitinib)、凡德他尼
(vandetanib)、维莫非尼(vemurafenib)、泽布替尼(zanubrutinib)和阿柏西普(ziv-aflibercept)等，或其组合。
68.在另一个实施方案中，在药物组合物中，脂质体包含选自以下的示例蛋白激酶抑制剂：
69.(a)单独封装的阿法替尼或尼达尼布；
70.(b)共封装的阿法替尼和尼达尼布；
71.(c)单独封装的阿贝西利或舒尼替尼；
72.(d)共封装的阿贝西利和舒尼替尼；
73.(e)单独封装的达沙替尼或阿法替尼；
74.(f)共封装的达沙替尼和阿法替尼；
75.(g)单独封装的色瑞替尼或阿法替尼；
76.(h)共封装的色瑞替尼和阿法替尼；
77.(i)单独的奥希替尼或阿法替尼；
78.(j)共封装的奥希替尼和阿法替尼；
79.(k)单独的奥希替尼或克唑替尼；
80.(l)共封装的奥希替尼和克唑替尼；
81.(m)单独封装的达沙替尼或色瑞替尼；
82.(n)共封装的达沙替尼和色瑞替尼；
83.(o)单独的阿法替尼或克唑替尼；
84.(p)共封装的阿法替尼和克唑替尼；
85.(q)约30:1至约1:30的摩尔比的阿法替尼和尼达尼布；
86.(r)约30:1至约1:30的摩尔比的阿贝西利和舒尼替尼；
87.(s)约30:1至约1:30的摩尔比的达沙替尼和阿法替尼；
88.(t)约30:1至约1:30的摩尔比的色瑞替尼和阿法替尼；
89.(u)约30:1至约1:30的摩尔比的奥希替尼和阿法替尼；
90.(v)约30:1至约1:30的摩尔比的奥希替尼和克唑替尼；
91.(w)约30:1至约1:30的摩尔比的色瑞替尼和达沙替尼；和
92.(x)约30:1至约1:30的摩尔比的阿法替尼和克唑替尼。
93.在另一个实施方案中，在药物组合物中，组合激酶抑制剂可以在施用后以协同模式顺序释放。
94.在另一个实施方案中，在药物组合物中，共封装的药剂(例如蛋白激酶抑制剂)的摩尔比使得，当在受影响细胞分数为约0.20至0.80的浓度范围内在体外测定中向与癌症相关的癌细胞提供所述比时，在所述范围的至少20％上表现出协同作用。
95.在另一个实施方案中，在药物组合物中，封装有组合蛋白激酶抑制剂的脂质体在体内施用后在血液中保持至少一小时的协同摩尔药物比。
96.在其他实施方案中，跨膜ph梯度是由铵离子的浓度梯度，或具有铵衍生物或取代的铵离子的有机化合物的浓度梯度形成的。
97.在另一个方面，本公开提供了一种利用跨膜ph梯度或过渡金属作为驱动力，通过主动载药过程制备脂质体药物组合物的方法，其中脂质体是通过包括以下步骤的方法制成
的：
98.(a)在包含水、脂质和捕获剂的溶液中形成多层脂质体囊泡；
99.(b)在高温下(例如在40-75℃的范围内)通过聚碳酸酯膜(例如尺寸为50nm或100nm)多次挤压多层脂质体囊泡，以形成单层脂质体；
100.(c)通过渗滤或尺寸排除色谱或其他缓冲液交换方法基本上去除脂质体外的捕获剂；
101.(d)在高温(例如40-75℃)下在包含一种或多种活性药物成分(api，例如亲水性和水溶性激酶抑制剂)的水溶液中加热未负载的脂质体，从而形成封装药物的脂质体；和
102.(e)将组合物的ph调整到约5-8；和
103.(f)任选地，通过冷冻干燥形成产品的干燥形式。
104.图5(i)示出了通过上述主动载药方法制备的载药脂质体的结构。
105.在另一个方面，本公开提供了一种以其被动负载制备脂质体药物组合物的方法；其中被动负载方法包括以下步骤：
106.(a)在一种类型的有机溶剂或有机溶剂的混合物中形成包含至少一种或多种api(例如亲脂性和水溶性差的蛋白激酶抑制剂)的脂质溶液；
107.(b)蒸发有机溶剂，并将水溶液中的脂质/api混合物水合，以形成脂质体囊泡；
108.(c)通过在高温(例如40-75℃)下对脂质分散体进行挤压、超声处理或均质化来减少粒径，从而形成单层脂质体；
109.(d)将组合物的ph调整到约5-8；和
110.(e)任选地，通过冷冻干燥形成产品的干燥形式。
111.图5(iii)示出了通过上述被动载药方法制备的载药脂质体的结构。
112.在另一个方面，本公开提供了一种制备脂质体药物组合物的方法，所述方法按顺序首先进行被动负载，然后进行其主动负载；其中耦合的被动/主动负载包括以下步骤：
113.(a)在一种类型的有机溶剂或有机溶剂的混合物中形成包含至少一种亲脂性蛋白激酶抑制剂的脂质溶液；
114.(b)蒸发有机溶剂，并在包含至少一种类型的捕获剂的水溶液中使脂质/药物混合物水合，以形成多层脂质体；
115.(c)通过在高温(例如40-75℃)下对脂质分散体进行挤压、超声处理或均质化来减少粒径，以形成单层脂质体；
116.(d)通过渗滤、尺寸排除色谱或其他方法除去从步骤(a)和(b)引入的额外的脂质体亲脂性蛋白激酶抑制剂和捕获剂；
117.(e)在高温(例如40-75℃)下在包含一种或多种亲水性蛋白激酶抑制剂的水溶液中加热脂质体以载药；
118.(f)将组合物的ph调整到约5-8；和
119.(g)任选地，通过冷冻干燥形成产品的干燥形式。
120.图5(ii)示出了通过上述耦合的被动/主动载药方法制备的载药脂质体的结构。
121.在一些实施方案中，api是蛋白激酶抑制剂或蛋白激酶抑制剂的组合。
122.在另一个方面，本公开提供了一种根据本文公开的任何实施方案的药物组合物，用于治疗需要治疗的受试者的癌症、癌症耐药性和副作用，其中癌症任选地选自乳腺癌、黑
色素瘤、胃肠癌、肺癌、结直肠癌、尤文氏肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、甲状腺癌、子宫癌和胃肠道间质瘤等。其中，共封装的激酶抑制剂可以通过脂质体递送，对癌细胞具有协同的细胞毒性或细胞抑制作用。
123.在另一个方面，本公开提供了一种治疗癌症的方法，其包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的根据本文公开的任何实施方案的药物组合物。
124.在一些实施方案中，使用脂质体药物组合物的治疗方法与施用游离形式如片剂、胶囊、不含脂质体的注射剂或类似形式的激酶抑制剂相比，药物副作用减少。
125.在一个实施方案中，癌症是非小细胞肺癌。
126.在另一个实施方案中，癌症是结直肠癌或肾细胞癌。
127.在另一个实施方案中，癌症是结直肠癌或肺癌，其中肺癌是由野生型egfr的高水平磷酸化或egfr氨基酸序列内的突变引起的。
128.在另一个实施方案中，癌症是结直肠癌或肺癌，其中肺癌是由vegfa或vegfa氨基酸序列内的突变引起的。
129.在另一个实施方案中，治疗是耐药性相关癌症。
130.在一个实施方案中，受试者是人类。
131.在另一个实施方案中，受试者是非人类的哺乳动物或鸟类。
132.在本公开的一些实施方案中，上述基于脂质的递送载体包含第三或第四药剂。可以包含任何治疗性、诊断性或美容性药剂。
133.在另一个方面，本公开提供了如本文任何实施方案或实施例所公开的多个载药脂质体和/或根据本文公开的任何实施方案或实施例的方法制备的多个载药脂质体。
134.在另一个方面，本公开提供了一种治疗试剂盒，其包含容器和容器中多个根据本文公开的任何实施方案的载药脂质体，其中载药脂质体悬浮在或可以悬浮在准备向需要治疗的受试者施用的无菌稀释液中。
135.本公开的基于脂质的递送载体不仅可通过肠胃外施用使用，还可通过局部、鼻腔、皮下、腹腔内、肌肉内、气雾剂或口服递送使用，或通过将递送载体应用于靶标部位处或附近的天然或合成的可植入装置上或可植入装置中使用，用于治疗目的或医学成像等。在一个实施方案中，本公开的基于脂质的递送载体通过肠胃外施用使用，有时优选地通过静脉施用使用。
136.正如本领域技术人员所理解的那样，所有载药脂质体和由其制备的药物组合物都必须在向需要治疗的受试者施用中使用的任何材料和过程所要求的无菌条件下制成。因此，虽然本公开没有如此限制，但本文公开或声称并旨在用于治疗受试者的所有脂质体和药物组合物都是无菌的。
137.本文描述的一些优选实施方案并不意味着详尽无遗，也不意味着将本发明的范围限制在所公开的精确形式。选择和描述它们是为了解释本发明的原理及其应用和实际用途，以使本领域的其他技术人员能够理解其教义。
138.1.组合物
139.a.治疗剂：蛋白激酶抑制剂
140.i.酪氨酸激酶抑制剂(tki)
141.抑制酪氨酸激酶途径的化合物可能是有用的。研究中描述的一些优选化合物列举
如下。
142.alk药物靶点：阿瓦普利替尼、阿来替尼、布加替尼、克唑替尼、色瑞替尼、劳拉替尼等；
143.bcr-abl药物靶点：博舒替尼、达沙替尼、伊马替尼、尼罗替尼、帕纳替尼等；
144.btk药物靶点：依鲁替尼、阿卡替尼、泽布替尼等；
145.c-met药物靶点：克唑替尼、卡博替尼、卡马替尼等；
146.egfr家族药物靶点：阿法替尼、达科米替尼、吉非替尼、厄洛替尼、伊科替尼、拉帕替尼、尼拉替尼、凡德他尼、奥希替尼、图卡替尼等；
147.jak家族药物靶点：巴瑞替尼、菲卓替尼、鲁索利替尼、托法替尼等；
148.pdgfrα/β药物靶点：阿昔替尼、阿瓦普利替尼、吉非替尼、伊马替尼、乐伐替尼、尼达尼布、帕唑帕尼、瑞格菲尼、瑞派替尼、索拉非尼、舒尼替尼、乌帕替尼等；
149.ret药物靶点：阿来替尼、卡博替尼、普拉替尼、塞尔帕替尼、凡德他尼等；
150.src家族药物靶点：博舒替尼、达沙替尼、帕纳替尼、凡德他尼等；
151.vegfr家族药物靶点：阿昔替尼、卡博替尼、乐伐替尼、尼达尼布、瑞格菲尼、帕唑帕尼、索拉非尼、舒尼替尼、凡德他尼等。
152.例如，阿法替尼是一种口服的不可逆的erbb家族阻断剂，可抑制所有egfr家族的酪氨酸激酶受体egfr(erbb1/her1)、her 2(erb2)和her 4(erb4)的信号传导。开发这种小分子化合物的目的是为了延迟获得性耐药，以改善与第一代egfr抑制剂相比的临床结果。事实上，在一系列的治疗领域和适应症中，阿法替尼单药疗法已经显示出持久的临床活性，与其他靶向疗法相比似乎更有优势。基于在关键的iii期研究中阿法替尼口服片与标准的基于铂的化疗相比在pfs方面有明显的改善，2013年在美国、欧盟和日本被获准用于治疗携带不同类型egfr突变的非小细胞肺癌(nsclc)患者。然而，在所有的临床研究中，阿法替尼具有明确的安全性问题，主要是胃肠道和皮肤的不良事件(ae)。阿法替尼最常见的治疗相关的≥3级ae是腹泻(5.4-14.4％)、皮疹/痤疮(9.7-16.2％)和口腔炎/粘膜炎(5.4-8.7％)(solca f,et al.(2012),j pharmacol exp ther 343:342
–
350)。
153.尼达尼布是一种小分子抑制剂，被批准用于晚期肺腺癌患者化疗失败后联合细胞毒性多西他赛(docetaxel)的二线治疗。尼达尼布能竞争性地与vegfr受体(vegfr)1-3、pdgfr a/b、fgfr 1-4的激酶结构域内的atp结合位点结合，并抑制src家族酪氨酸激酶(src、lck、lyn)、flt-3和ret。此外，尼达尼布通过减少肿瘤生长和转移而表现出进一步的抗癌作用，并被批准用于治疗特发性肺纤维化(ipf)患者。口服尼达尼布(胶囊)在欧盟被批准与多西他赛联合用于腺癌组织学的晚期nsclc患者的二线治疗(2015年)，并在美国和欧盟被批准用于特发性肺纤维化患者的治疗(2014年)。然而，尽管特异性地靶向依赖致癌基因的细胞，但与经典化疗相比，严重副作用的发生和快速的耐药性发展是临床研究中使用激酶抑制剂成功治疗的主要限制(hilberg f,et al.,cancer res.,2008,68:4774
–
4782)。
154.另一种优选的tki抑制剂舒尼替尼是一种多靶点的酪氨酸激酶抑制剂，可抑制pdgfr(a和b)、vegfr1、vegfr2、flt3r、c-kit和ret介导的信号传导。2017年，fda批准辉瑞公司的苹果酸舒尼替尼作为作为辅助疗法，用于治疗肾切除术后具有复发肾细胞癌(rcc)的高风险、甲磺酸伊马替尼治疗后疾病进展或对甲磺酸伊马替尼不耐受的胃肠道间质瘤(gist)、晚期肾细胞癌的成年患者。不可切除的局部晚期或转移性疾病患者中的
进展性的、分化良好的胰腺神经内分泌肿瘤(pnet)。
155.ii.其他激酶抑制剂
156.其他靶向癌症治疗的激酶抑制剂可能是有用的。研究中描述的一些优选化合物列举如下。
157.b-raf丝氨酸/苏氨酸药物靶点：达拉非尼、康奈非尼、维莫非尼等；
158.cdk家族药物靶点：阿贝西利、帕博西尼、索拉非尼、瑞博西尼等；
159.csf1r药物靶点：培西达替尼等；
160.fgfr1/2/3/4药物靶点：厄达替尼、培米替尼等；
161.fkbp12/mtor药物靶点：依维莫司、西罗莫司(sirolimus)、替西罗莫司等；
162.flt3药物靶点：吉瑞替尼、米哚妥林、奎扎替尼等；
163.mek1/2药物靶点：比美替尼、考比替尼、司美替尼、曲美替尼等；
164.rock1/2药物靶点：奈妥舒迪等；
165.ros1药物靶点：恩崔替尼等；
166.syk药物靶点：福他替尼等；
167.stk1药物靶点：奎扎替尼等；
168.trka/b/c药物靶点：恩曲替尼、拉罗替尼等。
169.b.肠胃外制剂
170.本文所述的化合物可以配制用于肠胃外施用。本文使用的“肠胃外施用”是指通过消化道或非侵入性局部或区域途径以外的任何方法施用。例如，肠胃外施用可以包括向患者静脉内、皮内、动脉内、腹腔内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸腔内、气管内、玻璃体内、瘤内、肌肉内、皮下、结膜下、囊内、心包内、脐带内通过注射和输注施用。
171.肠胃外制剂可以用本领域已知的技术制备成水性组合物。通常，这种组合物可以制备成可注射的制剂，例如溶液或悬浮液；适合用于在注射前加入重构介质后制备溶液或悬浮液的固体形式；乳剂，例如油包水(w/o)乳剂、水包油(o/w)乳剂及其微乳剂、脂质体或乳脂体(emulsome)。
172.载体可以是含有例如水、缓冲剂和等渗剂的溶剂或分散介质，例如糖类、hepes缓冲剂或氯化钠等。
173.作为游离酸或碱的活性化合物或其药学上可接受的盐的溶液和分散体可以在水或另一种溶剂或分散介质中制备，适当地与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合，所述赋形剂包括但不限于表面活性剂、分散剂、乳化剂、ph调节剂、粘度调节剂及其组合。
174.所述制剂可以包含防腐剂以防止微生物生长。合适的防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸和硫柳汞。所述制剂还可以包含抗氧化剂以防止活性剂降解。
175.所述制剂通常被缓冲至ph为3-8，以便在重构时进行肠胃外施用。合适的缓冲剂包括但不限于hepes缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂和柠檬酸盐缓冲剂。
176.水溶性聚合物常被用于肠胃外施用的制剂中。合适的水溶性聚合物包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、羧甲基纤维素和聚乙二醇。
177.通过将所需量的活性化合物与上文所列的一种或多种赋形剂按要求加入适当的溶剂或分散介质中，然后进行过滤灭菌来制备无菌注射液。一般来说，通过将各种灭菌的活
性成分加入含有基本的分散介质和上文所列的其他所需成分的无菌载体中来制备分散体。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，制备方法包括真空干燥和冷冷冻干燥燥技术，该技术从先前无菌过滤的溶液中得到活性成分和任何另外的所需成分的粉末。可以以使颗粒具有多孔性的方式来制备粉末，这可以增加颗粒的溶出。制作多孔颗粒的方法在本领域中是众所周知的。
178.2.控释制剂
179.本文所述的肠胃外制剂可以配制用于控释，包括立即释放、延迟释放、延长释放、脉冲式释放及其组合。
180.对于肠胃外施用，一种或多种化合物以及任选地一种或多种另外的活性剂可以被并入微颗粒、纳米颗粒或其组合，其提供化合物和/或一种或多种另外的活性剂的控释。在所述制剂包含两种或更多种药物的实施方案中，药物可以配制成相同的控释类型(例如延迟、延长、立即或脉冲式)，或者药物可以独立配制成不同的释放类型(例如立即和延迟、立即和延长、延迟和延长、延迟和脉冲式等)。
181.例如，化合物和/或一种或多种另外的活性剂可以被纳入提供药物控释的纳米颗粒和微颗粒。药物的释放是通过药物从纳米颗粒和微颗粒中的扩散和/或聚合物颗粒的水解和/或酶促降解来控制的。合适的聚合物包括脂质和其他天然或合成的脂质衍生物。
182.不溶于水的蛋白质如玉米蛋白也可以用作形成含有药物的纳米颗粒和微颗粒的材料。此外，可溶于水的蛋白质、多糖及其组合可以与药物配制成微颗粒，随后交联形成不溶性网络。例如，环糊精可以与单个药物分子复合并随后交联。
183.通过已知的药物制剂技术，可以实现将药物封装或并入载体材料以生产含有药物的纳米颗粒和微颗粒。在磷脂或磷脂类材料中的制剂的情况下，通常将载体材料加热到其熔化温度以上，加入药物以形成包含悬浮在载体材料中的药物颗粒、溶解在载体材料中的药物或其混合物的混合物。随后可以通过几种方法配制纳米颗粒和微颗粒，包括但不限于凝固、挤压、喷雾冷却或水分散等过程。在一些优选的过程中，脂质被加热到其熔化温度以上，在水溶液中重新水合，挤压，并载药。这些过程在本领域是已知的。
184.3.确定体外非拮抗性组合药物比例
185.在本发明的另一个实施方案中，蛋白激酶抑制剂可以以协同或加和(即非拮抗)的比例被封装到脂质体中。蛋白激酶抑制剂的治疗有效的非拮抗比例是通过评估药剂在一定浓度范围内对相关细胞培养物和/或来自单个患者活检的肿瘤匀浆的生物活性或作用来确定的。可以使用任何确定保持所需的治疗效果的蛋白激酶抑制剂比例的方法。例如，除非另有说明，在本技术公开的实施例中使用了chou-talay中位效应法(chou,t.c.,j.theor.biol.,1976,39:253-276)。
186.基本的实验数据一般是在体外使用培养中的细胞确定的。有时优选地，如上所述，绘制为受影响细胞分数(fa)的函数的组合指数(ci)是浓度范围的代用参数。优选的药剂组合是那些在相当大的fa值范围内显示协同作用或加和作用的药剂。如果在至少约5％的浓度范围内无拮抗作用，其中大于1％的细胞受到影响，即fa范围大于0.01，则可选择药剂组合。有时优选地，总体浓度的较大部分表现出有利的ci；例如，5％的0.2-1.0的fa范围。有时更优选地，该范围的约10％表现出有利的ci。有时甚至更优选地，在组合物中使用约20％的fa范围，超过约50％，或超过至少约70％的0.2至1.0的fa范围。在相当大的fa值范围内显示
出协同作用的组合可以在各种药剂比例下重新评估，以确定最佳比例，以增强非拮抗相互作用的强度，并增加观察到协同作用的fa范围。
187.尽管希望在细胞受到影响的整个浓度范围内具有协同作用，但据观察，在许多情况下，当使用分光光度法如mtt测定时，结果在0.2-0.8的fa范围内可靠得多。因此，尽管本发明的组合所表现出的协同作用是在0.01或更大的宽泛范围内存在的，但有时优选地在0.2-0.8的fa范围内建立协同作用。然而，其他更敏感的测定可用于评估fa值大于0.8时的协同作用，例如生物发光或克隆形成测定。
188.最佳组合比例可进一步作为单一的制药单位，以确定与第三种药剂的协同或加和的相互作用。此外，三种药剂组合可作为一个单元来确定与第四种药剂的非拮抗相互作用，依此类推。
189.如上所述，对细胞培养物的体外研究将用“相关”细胞进行。细胞的选择将取决于该药剂的预期治疗用途。只有一个相关的细胞系或细胞培养类型需要表现出所需的非拮抗作用，以便为组合物进入本发明的范围提供基础。
190.例如，在本发明的一个优选实施方案中，药剂的组合旨在用于抗癌治疗。在一个经常的实施方案中，药剂的组合旨在用于多种癌症，例如白血病或淋巴瘤治疗、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胃肠癌、结直肠癌、rcc和肺癌。然后将对要测试的细胞和测试的性质做出适当的选择。特别是，肿瘤细胞系是合适的对象，并且细胞死亡或细胞停滞的测量是合适的终点。正如下文将进一步讨论的那样，在试图为其他适应症寻找合适的非拮抗性组合的情况下，可以采用其他靶细胞和除细胞毒性或细胞停滞以外的标准。
191.对于涉及抗肿瘤药物的测定，细胞系可以从标准细胞系库(例如nci或atcc)、学术机构或包括商业来源在内的其他组织获得。有时优选的细胞系将包括一个或多个选自nci/nih的开发治疗计划所确定的细胞系。该计划使用的肿瘤细胞系筛选目前确定了代表白血病、黑色素瘤和肺癌、结肠癌、脑癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌和肾癌等的约60种不同的肿瘤细胞系。在所需浓度范围内的所需的非拮抗作用只需要在单一细胞类型上显示；然而，有时优选地至少两个细胞系，有时更优选地三个细胞系、五个细胞系或甚至十个细胞系显示这种作用。这些细胞系可以是已建立的肿瘤细胞系或从患者样品中获得的原代培养物。细胞系可以来自任何物种，但优选来源是哺乳动物，特别是人类。细胞系可以通过在各种实验室条件下的选择进行基因改变。
192.在一个优选的实施方案中，给定的效果(fa)是指在向细胞培养物施加细胞毒性剂后的细胞死亡或细胞停滞。在本发明中，细胞死亡或细胞活率可以通过mtt测定来测量。可以确定两种或更多种药剂的非拮抗比例，以用于癌症以外的疾病适应症，这些信息可用于制备治疗这些疾病的两种或更多种药物的治疗制剂。关于体外测定，可以选择多个可测量的终点来确定药物的协同作用，只要这些终点与特定疾病在治疗上相关。如上所述，对细胞培养物的体外研究将用“相关”细胞进行。细胞的选择将取决于药剂的预期治疗用途。对单个患者活检或整个肿瘤的体外研究可以用“肿瘤匀浆”来进行，所述“肿瘤匀浆”是通过将肿瘤样品均质化为单个细胞产生的。在一个优选的实施方案中，给定的效果(fa)是指在向“相关”细胞培养物施加细胞毒性剂后的细胞死亡或细胞停滞。细胞死亡或细胞活率可以使用本领域中已知的一些方法来测量。
193.4.基于脂质的递送载体的制备
194.在纳米颗粒递送系统中，脂质体是最广泛使用的药物载体之一，具有几个独特的特点，包括：(1)由载体介导的药物循环半衰期延长，(2)非特异性摄取减少，(3)通过被动的增强的通透性和滞留(epr)效应和/或通过纳入靶向配体的主动靶向而在肿瘤部位的积累增加，(4)占主导地位的内吞作用摄取，有可能绕过多重耐药机制，和(5)能够根据每一种药剂的药理处置来调整其相对比例，(6)在同一平台上携带多种药物(亲水性和亲脂性药物)的单一递送系统可以使每种药物的药代动力学得到同步和控制，从而提高药物疗效，和(7)药物溶解度和生物利用度改善(mamot,c.,et al.,drug resist.updates 2003,6,271-279)。
195.有时优选地，用于本发明的优选脂质载体是脂质体。用于本发明的合适的脂质体包括大型单层囊泡(luv)、多层囊泡(mlv)、小型单层囊泡(suv)和交错融合的脂质体。用于本发明的脂质体可以被制备为含有磷脂酰胆碱脂质或磷脂样物质，例如二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)或氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)。
196.本发明的脂质体还可以包含甾醇，例如胆固醇。脂质体还可以包含治疗性脂质，其实例包括醚类脂质、磷脂酸、膦酸酯、神经酰胺和神经酰胺类似物、鞘氨醇和鞘氨醇类似物以及含丝氨酸的脂质。
197.脂质体也可以用表面稳定的亲水性聚合物-脂质缀合物如聚乙二醇-dspe来制备，以提高循环寿命。带负电荷的脂质如磷脂酰甘油(pg)和磷脂酰肌醇(pi)也可以被添加到脂质体制剂中，以增加载体的循环寿命。可以采用这些脂质来取代亲水性聚合物-脂质缀合物作为表面稳定剂。有时优选地，脂质体可以包含磷脂酰甘油(pg)和/或磷脂酰肌醇(pi)来防止聚集，从而增加载体的血液停留时间。
198.在一个实施方案中，根据本发明的脂质体组合物用于治疗癌症和感染性疾病。通过施用本发明的脂质体，实现了将封装的药物递送到肿瘤部位。有时优选地，脂质体的粒径的平均直径小于300nm。有时更优选地，脂质体的粒径的平均直径小于200nm。肿瘤血管通常比正常的血管更容易渗漏，这是因为内皮细胞中存在裂隙或间隙。这使得200nm或更小(平均直径)的递送载体能够穿透不连续的内皮细胞层和围绕向肿瘤供血的血管的底层基底膜。外渗后，递送载体选择性积聚到肿瘤部位，从而增强抗癌药物的递送和治疗效果。
199.可以利用各种方法将活性剂封装在脂质体中。“封装”包括药剂与基于脂质的递送载体的共价或非共价结合。例如，通过药剂与脂质体的一个外层或多个外层相互作用或将药剂夹在脂质体内，可以在脂质体的不同部分之间实现平衡。因此，药剂的封装可以是通过药剂与脂质组分的共价或非共价相互作用，或将药剂夹在脂质体的水性内部，使药剂与脂质体的双分子层结合，或在内部水相和双分子层之间达到平衡。“负载”是指将一种或多种药剂封装到递送载体中的行为。
200.所需组合的封装可以通过封装在单独的递送载体中或在同一递送载体中实现。在需要封装到单独的脂质体中时，每个脂质体的脂质组成可以有很大的不同，以使药代动力学得到协调。通过改变脂质体载体的组成，可以匹配封装药物的释放速率，以便将所需比例的药物递送到肿瘤部位。改变释放速率的方法包括增加形成囊泡的脂质的酰基链长度以改善药物的保留，控制表面接枝的亲水性聚合物如mpeg-dspe上的聚乙二醇基团从脂质体膜中的交换，以及将膜固定剂如甾醇或鞘氨醇并入膜中。对于本领域技术人员来说明显的是，如果希望以特定的药物比例施用第一和第二药物，并且如果第二药物在第一药物的脂质体
组合物(例如dmpc/chol)中保留得很差，那么可通过将第二药物封装在具有酰基链长度增加的脂质的脂质体组合物(例如dspc/chol)中来实现药代动力学改善。当封装在单独的脂质体中时，应该很容易接受的是，通过在施用前组合适当数量的每种脂质体封装的药物，可以为个体患者产生已经在特定患者基础上确定的提供最佳治疗活性的两种药物的比例。另外，两种或更多种药剂可以被封装在同一个脂质体中。
201.封装技术取决于治疗剂和递送载体的性质。例如，可以使用被动和主动负载方法将治疗剂载于脂质体中。将活性剂封装在脂质体中的被动方法涉及在制备脂质体期间将药剂封装起来。这种技术的结果是形成多层囊泡(mlv)，在挤压时其可以转化为大型单层囊泡(luv)或小型单层囊泡(suv)。此外，另一种合适的被动封装方法涉及脂质体形成后的被动平衡。该过程涉及在改变的或非环境(基于温度、压力等)条件下孵育预先形成的脂质体，并在脂质体的外部加入治疗剂(例如蛋白激酶抑制剂)。然后，治疗剂通过穿过脂质体膜来平衡到脂质体的内部。然后将脂质体返回到环境条件下，如果存在未封装的治疗剂，则其通过透析或其他合适的方法去除。图5(iii)说明了通过上述被动载药方法制备的载药脂质体的实例。
202.药物封装的主动负载方法包括ph梯度负载法和主动过渡金属负载技术。基于跨膜ph梯度的负载方法利用单阳离子或多阳离子的铵盐或取代的铵盐作为捕获剂，这些捕获剂在封装治疗剂之前被预先载于脂质体中。这些捕获剂建立了跨膜ph梯度，也可能与治疗剂形成沉淀、聚集或凝胶，二者均作为将药剂主动负载到脂质体中的驱动力。关于ph梯度，一般认为，脂质体内外环境之间的ph值差异至少大于一个单位。为建立和维持跨越脂质体的ph梯度所采用的其他方法包括使用可插入脂质体膜的离子载体和跨膜运输以交换质子。其中，基于过渡金属的主动负载技术利用过渡金属通过络合或配位来驱动药剂在脂质体中的摄取。图5(i)说明了通过上述主动载药方法制备的载药脂质体的实例。
203.合适的捕获剂可以是阴离子、阳离子、两性或非离子活性剂，包括但不限于含有羧酸盐、多磷酸盐、磺酸盐(包括长链烷基磺酸盐和烷基芳基磺酸盐)和硫酸盐的那些。阳离子捕获剂包括季铵化合物，例如苯扎氯铵、苄索氯铵、十六烷基三甲基溴化铵、硬脂基二甲基苄基氯化铵、聚氧乙烯和椰油胺等。
204.捕获剂的更具体的实例包括硫酸铵、过渡金属和以下的铵盐或取代的铵盐：多阴离子化硫酸化环糊精、磺丁基醚环糊精、多阴离子化硫酸化糖、多磷酸盐等。
205.具体来说，捕获剂包括以下多阴离子化硫酸化糖的铵盐或取代的铵盐：八硫酸蔗糖、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白、硫酸肝素和硫酸化透明质酸、岩藻多糖、半乳聚糖、卡拉胶、硫酸鼠李糖、半乳岩藻多糖、mannoglucuronofucan、硫酸阿拉伯半乳聚糖、硫酸甘露聚糖、硫酸化杂鼠李糖和硫酸木甘聚糖等。
206.具体来说，捕获剂包括以下形式的磺丁基醚环糊精的铵盐或取代的铵盐：磺丁基醚-α-环糊精、磺丁基醚-β-环糊精和磺丁基醚-γ-环糊精等。
207.具体来说，捕获剂包括以下多磷酸盐的铵盐或取代的铵盐：植酸、三磷酸、多磷酸和环三偏磷酸盐。
208.具体来说，上述多聚物的反离子包括铵和取代的铵，其还包括以下物质的质子化形式：三乙胺、三乙醇胺、三(羟甲基)氨基甲烷或氨丁三醇、二乙醇胺、乙二胺、三丁胺、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷、二乙基乙醇胺、二乙醇乙胺(diethanolethylamine)、乙醇胺、吗
啉等。
[0209]
基于过渡金属离子的捕获剂包括以下物质的盐形式：铜、锌、锰、镍和钴的离子。金属的反离子包括硫酸根、氯离子、葡萄糖酸根、溴离子和氢氧根。
[0210]
更具体地说，用于在脂质体中负载药物的捕获剂包括以下：硫酸铵、三乙胺八硫酸蔗糖(tea-sos)、三乙胺磺酰丁醚-β-环糊精(tea-sbe-β-cd)、磺酰丁醚-β-环糊精的三(羟甲基)氨基甲烷盐(tris-sbe-β-cd)、植酸或六磷酸肌醇的三乙胺盐(tea-ip6)、葡萄糖酸铜、硫酸铜、氯化铜和硫酸锌。
[0211]
被动和主动载药的夹带方法也可以耦合起来，以制备包含亲脂性和亲水性药物的脂质体制剂，并将其纳入单一的递送载体。具体来说，可以先通过被动负载将亲脂性药物载于脂质体中，然后再通过主动负载方法用同一脂质体负载亲水性药物。图5(ii)说明了通过上述耦合的被动/主动载药方法制备的载药脂质体的实例。
[0212]
5.在体内施用本发明的组合物
[0213]
如上所述，本发明的递送载体组合物可以被施用于温血动物，包括人类以及家养禽类。对于人类疾病的治疗，有资格的医生将确定应当如何根据既定的方案使用本发明的组合物，包括剂量、计划和施用途径。如果封装在本发明的递送载体组合物中的药剂对受试者的健康组织的毒性降低，此类应用也可以利用剂量递增。
[0214]
在一个实施方案中，本发明的药物组合物肠胃外施用，即动脉内、静脉内、腹腔内、皮下或肌肉内施用。有时优选地，所述药物组合物通过大剂量(bolus)或输注注射在静脉内或腹腔内施用。
[0215]
在其他方法中，本发明的药物或化妆品制剂可以通过将制剂直接应用于组织而与靶组织接触。这种应用可以通过局部、“开放式”或“封闭式”手术进行。所谓“局部”是指将多药制剂直接应用于暴露在环境中的组织，如皮肤、口咽、外耳道等。“开放式”手术是指那些包括切开患者的皮肤并直接观察到应用药物制剂的底层组织的手术。这通常是通过外科手术完成的，例如通过开胸手术进入肺部，通过开腹手术进入腹部内脏，或通过其他直接手术方法进入靶组织。“封闭式”手术是一种侵入性手术，其中内部靶组织不能直接看到，而是通过在皮肤上的小伤口插入器械而进入。例如，可以通过针头灌洗向腹膜施用制剂。替代地，可以通过内窥镜装置施用制剂。
[0216]
包含本发明的递送载体的药物组合物按照标准技术制备，可以包含水、缓冲液、0.9％盐水、0.3％甘氨酸、5％葡聚糖、等渗蔗糖溶液等，包括用于增强稳定性的糖蛋白，如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。这些组合物可以通过常规的、众所周知的灭菌技术进行灭菌。得到的水溶液可以包装使用或在无菌条件下过滤并冻干，冻干的制剂在施用前与无菌水溶液混合。所述组合物可以根据需要含有药学上可接受的辅助物质，以接近生理条件，例如ph调节剂和缓冲剂、紧张性调节剂等，例如，乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。此外，递送载体悬浮液可以包括脂质保护剂，它可以保护脂质在储存时免受自由基和脂质过氧化损伤。亲脂性的自由基淬灭剂(如α-生育酚)和水溶性的铁特异性螯合剂(如铁氧胺(ferrioxamine))都是合适的。
[0217]
药物制剂中的递送载体的浓度可以有很大的变化，例如从低于约0.05重量％，通常为或至少约2重量％-5重量％，到多达10重量％-30重量％，并将主要根据所选择的特定施用方式，通过流体体积、粘度等来选择。例如，可以增加浓度以降低与治疗有关的液体负
荷。另外，由刺激性脂质组成的递送载体可以稀释到低浓度，以减轻施用部位的炎症。对于诊断来说，递送载体的量将取决于所使用的特定标记、被诊断的疾病状态和临床医生的判断来施用。
[0218]
递送载体制剂的剂量将取决于药物与脂质的比例，以及用药医生根据患者的年龄、体重和状况的意见。
[0219]
除药物组合物外，还可以制备用于兽医使用的合适制剂，并以适合受试者的方式施用。优选的兽医受试者包括哺乳动物物种，例如，非人灵长类动物、狗、猫、牛、马、羊和家养的禽类。受试者也可以包括实验动物，例如，特别是大鼠、兔子、小鼠和豚鼠。
[0220]
6.包装试剂盒
[0221]
本发明组合物中的治疗剂可以分别配制成单独的组合物，其中适当地，每种治疗剂都与合适的递送载体稳定地合。只要递送载体的药代动力学配合使施用的比例的治疗剂保持在治疗靶点，就可以将这些组合物分别施用于受试者。因此，构建试剂盒是有用的，它包括在单独的容器中的第一组合物，所述第一组合物包括与至少第一治疗剂稳定合的递送载体，以及在第二容器中的第二组合物，所述第二组合物包括与至少一种第二治疗剂稳定结合的递送载体。然后，这些容器可以被包装成包装试剂盒。
[0222]
所述试剂盒还将包括关于向受试者施用组合物的方式的说明，至少包括对要施用的每种组合物的数量比例的描述。替代地，或者另外，试剂盒被构造成使得每个容器中的组合物的量是预先测量的，以便一个容器的内容物与另一个容器的内容物相结合，代表正确的比例。替代地，或者另外，容器上可以标有测量标尺，允许根据可见的标尺分配适当的数量。容器本身可以用于施用；例如，所述试剂盒可以在单独的注射器中包含每种组合物的适当数量。包括预先配制的正确比例的治疗剂的制剂也可以用这种方式包装，以便从预先包装在试剂盒中的注射器直接施用所述制剂。
[0223]
定义
[0224]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在一些情况下，为了明确和/或便于参考，本文对具有普遍理解含义的术语进行了定义，本文包含此类定义并不一定解释为与本领域普遍理解的内容存在实质性差异。本文所描述或引用的许多技术和程序都是本领域技术人员所熟知的，并且通常采用常规方法。在适当的情况下，除非另有说明，否则涉及使用市售试剂盒和试剂的程序通常是按照制造商定义的方案和/或参数进行的。本文提到的所有专利、申请、公开申请和其他出版物都通过引用的方式整体并入本文。如果本部分中阐明的定义与通过引用的方式并入本文的专利、申请、公开申请和其他出版物中阐明的定义相反或不一致，则本部分中阐明的定义优先于通过引用的方式并入本文的定义。
[0225]
如本文所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“该/所述(the)”包括复数指代，反之亦然，任何复数形式包括单数指代。
[0226]
除非另有定义，否则术语“约”或“大约”通常包括不超过指定数字的正负10％。例如，“约10％”可以表示9％至11％的范围，而“约20”可以表示18至22。有时优选的是，“约”包括不超过指定值的正负5％。替代地，“约”包括不超过指定值的正负5％。当“约”用在范围之前时，它既适用于范围的下限，也适用于范围的上限。
[0227]
如本文所用，术语“基本上”是指“大部分”或“本质上”，正如本领域普通技术人员
所理解的那样，如果可以定量测量，是指至少90％，优选至少95％，更优选至少98％。
[0228]
除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”或类似术语应被理解为开放式术语(即表示“包括但不限于”)。
[0229]
如本文所用，术语“协同作用”是指两种或更多种药物之间的相互作用，导致药物的总效果大于每种药物的单独效果之和。
[0230]
所谓“协同比”是指两种或更多种药物联合使用时可获得协同作用的摩尔比。
[0231]
如本文所用，术语“协同细胞毒性作用”是指两种或更多种药物之间的相互作用，导致药物的总作用大于每种药物的单独作用之和。这种总作用导致细胞被杀死并最终使肿瘤缩小。
[0232]
如本文所用，术语“协同细胞抑制作用”是指两种或更多种药物之间的相互作用，导致药物的总作用大于每种药物的单独作用之和。这种总作用导致肿瘤生长的抑制，而没有直接杀死细胞。
[0233]
术语“加和作用”是指由两种或更多种药物作用产生的联合作用，等于其单独作用之和。
[0234]
所谓“加和比”是指两种或更多种药物联合使用时可获得加和作用的摩尔比。
[0235]
术语“非拮抗比”是指协同比和加和比两者。
[0236]
如本文所用，术语“拮抗作用”是指对接触两种或更多种药物的治疗反应低于如果将单个药物的已知作用加在一起时的预期。
[0237]
如本文所用，术语“拮抗比”是指两种或更多种药物联合使用时可获得拮抗作用的摩尔比。
[0238]
术语“组合指数”是指用于确定药物相互作用程度的参数。组合指数(ci)可以根据chou和talalay(t.c.chou and p.talalay,adv.enzyme reg.,1984,22:27-55)所述的中位效应分析算法计算。ci值《0.9表示协同药物相互作用；0.9≤ci≤1.1反映了加和作用，ci》1.1表示拮抗作用。
[0239]
术语“受影响分数”是指在体外测定中，其生长受特定药物剂量影响的细胞的比例。如chou和talalay程序所述，受影响分数用于计算组合指数。
[0240]
所谓“相关”细胞是指至少一种适合测试所需生物效应的细胞培养物或细胞系。由于这些药剂被用作抗肿瘤药物，“相关”细胞是那些被美国国家癌症研究所(nci)/美国国立卫生研究院(nih)的发展治疗计划(dtp)鉴定为对其抗癌药物发现计划有用的细胞系。目前，dtp筛选利用了60种不同的人类肿瘤细胞系。需要证明对这些细胞系中的至少一个有理想活性。
[0241]
所谓“肿瘤匀浆”是指从患者活检或肿瘤的均质化中产生的细胞。整个肿瘤或肿瘤活检的提取可以由有资格的医生通过标准医疗技术实现，并且将组织均质化为单细胞可以在实验室中使用本领域中熟知的多种方法进行。
[0242]
如本文所用，术语“捕获剂”是指在脂质体的水性隔室中存在的化合物，用于将一种或多种药物捕获并保留在脂质体内部的同一位置。
[0243]
术语“脂质体”是指由一个或多个磷脂双分子层组成的球形囊泡，它与细胞膜的结构非常相似。
[0244]
如本文所用，短语“单层囊泡”是指由一个脂质双层膜组成的球形囊泡，它限定了
单一的封闭水性隔室。双层膜由两层脂质组成：一个内层和一个外层。外层中的脂质分子的方向是，其亲水的头部部分朝向外部水性环境，其疏水的尾部向下指向脂质体的内部。脂质的内层直接放置在外层下面，脂质的方向是它们的头部面向脂质体的水性内部，它们的尾部朝向脂质外层的尾部。
[0245]
如本文所用，“多层囊泡”是指由一个以上的脂质双层膜组成的脂质体，这些膜限定了一个以上的封闭水性隔室。这些膜是同心排列的，因此不同的膜被水性隔室隔开，很像一个洋葱。
[0246]
所谓“蛋白激酶抑制剂”是指一大组独特而有效的抗肿瘤药物，它们专门针对在癌细胞中发生改变并导致癌细胞的一些异常生长的蛋白激酶。蛋白激酶抑制剂的作用通常是细胞抑制的，这意味着肿瘤的生长被抑制，而不直接杀死细胞。因此，蛋白激酶抑制剂的毒性较小，在合适的患者群体中，蛋白激酶抑制剂比传统化疗剂更有效。
[0247]
所谓“释放”是指封装在脂质体中的药物通过构成脂质体的脂质膜，然后流出到脂质体的外部。
[0248]
如本文所用，术语“封装”是指围住内部相，通常导致内部空腔与外部介质分离。因此，如本文所述，内部相/内部空腔的组分被“封装”。如本文所述，被围住或封装的内部相是脂质双分子层和水相。装入脂质体内部空腔并且在脂质体被触发释放之前不能进入外部介质的治疗药物的数量将被认为是“封装”在脂质体内。
[0249]
如本文所用，短语“共封装”和“共封装的”是指两种或更多种治疗剂被封装在脂质体内的情况。
[0250]
如本文所用，术语“被动负载”是指脂质体药物产品制备中使用的载药技术。在一种情况下，可以通过在脂质体形成过程中封装治疗剂来实现被动负载。在另一种情况下，被动负载涉及脂质体形成后的被动药物平衡。
[0251]
如本文所用，短语“主动负载”是指脂质体药物产品制备中使用的载药技术。本领域中常用的主动负载方法包括跨膜ph梯度负载技术和过渡金属负载技术。前者利用单阴离子或多阴离子的铵盐或取代的铵盐作为捕获剂，在封装治疗剂之前预先装入脂质体中。基于由ph梯度确定的平衡，治疗剂可以“主动”扩散到脂质体的水性隔室中，通过形成沉淀、聚集或凝胶化与预装的捕获剂相互作用，所述形成沉淀、聚集或凝胶化作为另一种驱动力将治疗剂封装在脂质体内部。基于过渡金属的负载技术利用过渡金属通过络合或配位来驱动药剂被摄取到脂质体中。总的来说，与被动负载技术相比，使用主动负载技术可以获得高得多的治疗剂封装效率(例如，》90％)。
[0252]
术语“平均粒径”是指脂质体的平均直径。这可以通过基于动态光散射的仪器来测量。
[0253]
术语“取代的铵”是指铵离子中的氢原子被一个或多个烷基或其他一些有机基团取代以形成取代的铵离子。
[0254]
术语“三阴性乳腺癌”是指一种类型的乳腺癌，其癌细胞没有雌激素或孕激素受体，也没有制造足够的称为人类表皮生长因子受体2(her2)的蛋白质。也就是说，这些细胞在上述受体的所有三项测试中均为“阴性”。
[0255]
术语“非小细胞肺癌”(nsclc)是指除小细胞肺癌(sclc)以外的任何类型的上皮性肺癌。最常见的nsclc类型是鳞状细胞癌、大细胞癌和腺癌，但还有其他几种发生率较低的
类型，并且所有类型都可以出现不寻常的组织学变体。
[0256]
术语“肾细胞癌”(rcc)是指起源于近曲小管内壁的肾癌类型，曲小管是肾脏中非常小的管道的一部分，用于输送原尿。rcc是成年人中最常见的肾癌类型，约占90-95％的病例。
[0257]
术语“耐药性癌症”是指对给定的治疗剂表现出耐药性的癌症类型。当癌细胞对通常能够杀死或削弱它们的药物没有反应时，就会出现耐药性。耐药性可能在治疗前就存在(内在耐药性)，也可能在用药物治疗期间或之后发生(获得性耐药性)。在癌症治疗中，有许多事情可能导致对抗癌药物的耐药性。例如，dna变化或其他基因变化可能改变药物进入癌细胞的方式或药物在癌细胞内分解的方式。耐药性可能导致癌症治疗无效或癌症复发。
[0258]
术语“有效量”是指实现预期生物或治疗效果所必需或足够的量。
[0259]
术语“治疗有效量”是指为延迟正在治疗的特定疾病、病症或病况的发生、抑制其发展或使其完全停止，或为在其他方面对被治疗的受试者产生预期效果所需要递送的治疗有效量的活性剂的量。正如本领域普通技术人员所理解的，治疗有效量随患者的年龄、状况和性别以及患者疾病、病症或病况的性质和程度而变化，剂量可由私人医生(或兽医)调整。
[0260]
术语“药学上可接受的”描述了一种并非在生物学上或其他方面不合需要的材料，即不会导致不可接受的不良生物效应水平或以有害的方式相互作用。
[0261]
术语“治疗”或类似术语是指逆转、缓解、抑制或减缓这些术语所适用的疾病、病症或病况的进展，或这些疾病、病症或病况的一个或多个症状。
[0262]
如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指人类患者或哺乳动物，例如猫、狗、牛、马、猴子或类似动物。
[0263]
术语“总脂质”是指制剂中使用的所有脂质和脂质衍生物，其包括磷脂(例如hspc、dspc、dppc、dmpc和dspg)、甾醇(例如胆固醇)和与聚乙二醇缀合的磷脂(例如mpeg-dspe)。
[0264]
本发明通过以下实施例进一步描述。提供这些实施例仅仅是为了通过参考具体的实施方案来说明本发明的某些方面。这些实施例虽然说明了本发明的某些具体实施方案，但并不描绘公开的本发明的局限性，也不限定公开的本发明的范围。
[0265]
本技术中使用了以下缩写：
[0266]
abe：阿贝西利
[0267]
abe-l：封装阿贝西利的脂质体
[0268]
abe/sun-l：共封装阿贝西利和舒尼替尼的脂质体
[0269]
ae：不良事件
[0270]
afa：阿法替尼
[0271]
afa-l：封装阿法替尼的脂质体
[0272]
afa/cer-l：共封装阿法替尼和色瑞替尼的脂质体
[0273]
afa/das-l：共封装阿法替尼和达沙替尼的脂质体
[0274]
afa/nin-l：共封装阿法替尼和尼达尼布的脂质体
[0275]
api：活性药物成分
[0276]
cer：色瑞替尼
[0277]
cer-l：封装色瑞替尼的脂质体
[0278]
chol：胆固醇
[0279]
ci：组合指数
[0280]
cri：克唑替尼
[0281]
cri-l：封装克唑替尼的脂质体
[0282]
das：达沙替尼
[0283]
das-l：封装达沙替尼的脂质体
[0284]
das/cer-l：共封装达沙替尼和色瑞替尼的脂质体
[0285]
ddpc：1,2-二癸酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱
[0286]
depc：1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱
[0287]
dlpc：1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱
[0288]
dmpc：1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱
[0289]
dppc：1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱
[0290]
dspc：1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱
[0291]
dspg:1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸甘油
[0292]
edta：乙二胺四乙酸
[0293]
ed
75
和ed
90
：影响细胞培养中75％和90％的细胞所需的有效剂量
[0294]
fa：受影响分数
[0295]
gist：胃肠道间质瘤
[0296]
hbs：hepes缓冲盐水(20mm hepes，150mm nacl，ph7.4)
[0297]
hepes：n-2-羟乙基-哌嗪-n-2-乙磺酸
[0298]
hspc：l-α-磷脂酰胆碱，氢化的luv：大型单层囊泡
[0299]
mlv：多层囊泡
[0300]
mpeg-2000-dspe，钠盐：n-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐
[0301]
mtt：3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2-h溴化四唑
[0302]
nin：尼达尼布
[0303]
nin-l：封装尼达尼布的脂质体
[0304]
nsclc：非小细胞肺癌
[0305]
osi：奥希替尼
[0306]
osi-l：共封装奥希替尼的脂质体
[0307]
osi/afa-l：共封装奥希替尼和阿法替尼的脂质体
[0308]
osi/cri-l：共封装奥希替尼和克唑替尼的脂质体
[0309]
pg：磷脂酰甘油
[0310]
pspc：1-棕榈酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱
[0311]
rcc：肾细胞癌
[0312]
sbe-α-cd：磺丁基醚-α-环糊精
[0313]
sbe-β-cd：磺丁基醚-β-环糊精
[0314]
sbe-γ-cd：磺丁基醚-γ-环糊精
[0315]
smpc：1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱
[0316]
sopc：1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱
[0317]
sppc：1-硬脂酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱
[0318]
sun：舒尼替尼
[0319]
sun-l：封装舒尼替尼的脂质体
[0320]
suv：小型单层囊泡
[0321]
tea：三乙胺
[0322]
tea-sos：三乙胺八硫酸蔗糖
[0323]
tea-sbe-β-cd：三乙胺磺丁基醚-β-环糊精
[0324]
tris-sbe-β-cd：三(羟甲基)氨基甲烷磺丁基醚-β-环糊精
[0325]
实验方法
[0326]
材料
[0327]
所有蛋白激酶抑制剂均购自sigma-aldrich公司(st louis,mo,usa)，例如双马来酸盐阿法替尼(afa)、乙磺酸尼达尼布(nin)、甲磺酸阿贝西利(abe)、苹果酸舒尼替尼(sun)、克唑替尼(cri)、达沙替尼一水合物(das)、色瑞替尼(cer)、甲磺酸奥希替尼(osi)和其他。氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)、二硬脂酰磷脂酰甘油(dspg)、n-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(mpeg-2000-dspe，钠盐)和胆固醇均购自德国lipoid gmbh。其他试剂从sigma-aldrich公司(st louis,mo,usa)获得。研究过程中使用的所有其他化学品都是试剂级的，使用时没有经过进一步纯化。
[0328]
癌细胞系
[0329]
包括ht-29(结直肠癌细胞系)、h1975(非小细胞肺癌，nsclc细胞系)、msto-211h(间皮瘤细胞系)、hcc827(nsclc细胞系)、786-o(肾细胞癌细胞系)、caki-1(肾细胞癌细胞系)和其他在内的所有细胞系均从美国典型培养物保藏中心(atcc)(manassas va,usa)获得。细胞按照供应商的建议进行培养。培养基补充有10％胎牛血清(fbs)、100u/ml青霉素g钠和100μg/ml硫酸链霉素。所有细胞都在37℃下在5％二氧化碳气氛中孵育。
[0330]
脂质体制备
[0331]
通用的药物脂质体制备方法列举如下。
[0332]
主动载药方法：通过主动负载制备载药脂质体的通用步骤如下：(1)脂质水合和尺寸缩减，(2)透析/缓冲液交换，(3)通过跨膜ph梯度或过渡金属螯合来载药，最后(4)调整最终载药脂质体悬浮液的ph。例如，将mpeg-2000-dspe(总脂质的0-10％摩尔/摩尔)或dspg(总脂质的0-50％摩尔/摩尔)、胆固醇(总脂质的0-60％摩尔/摩尔)和dspc/hspc(总脂质的0-80％)溶解在乙醇中，并在约50-70℃下在含有下列捕获剂之一的水溶液中水合：硫酸铵、多磷酸盐(n＝5-18)、tea-sos、tea-sbe-β-cd、tris-sbe-β-cd或过渡金属盐(例如葡萄糖酸铜和硫酸铜)。含有mpeg-2000-dspe作为稳定剂的脂质体被称为“peg化脂质体”。含有dspg用于稳定的脂质体被称为“dspg脂质体”。随后，将有机相和水相在剧烈搅拌下混合约30分钟，以便进行乳化。在约50-70℃下，使用聚碳酸酯膜(50-100nm)对乳液进行尺寸缩减(例如挤压)，以获得所需的脂质体粒径和粒径分布(pdi)，然后迅速冷却，得到未负载的脂质体。之后，脂质体外的外部捕获剂通过透析膜的扩散被洗掉。为了将药物载于脂质体中，用所需的缓冲溶液稀释未负载的脂质体悬浮液。将一种或两种药物(例如阿法替尼、尼达尼布、克唑替尼、阿贝西利、舒尼替尼、奥希替尼)加入上述未负载的脂质体悬浮液中，在高温(50-70
℃)下轻轻搅拌，允许载药进行30-45分钟。这种主动负载方法通常会使药物的封装效率高于95％。图5(i)说明了通过主动负载方法载有化合物的脂质体的结构。
[0333]
顺序被动和主动载药方法：亲水性(水溶性)药物和亲脂性(水溶性差的)药物都可以通过顺序被动和主动负载方法共载到脂质体中。具体来说，首先被动地将亲脂性化合物封装在脂质体的脂质双分子层内。随后，通过主动负载方法将亲水性药物载于脂质体的水性核心中。制备过程的实例描述如下。首先制备脂质(例如dspg：0-70％摩尔/摩尔，胆固醇：0-50％摩尔/摩尔，dspc：0-50％摩尔/摩尔)与亲脂性蛋白激酶抑制剂(例如达沙替尼一水合物、色瑞替尼和其他)的有机溶液。以下有机溶剂可用于此目的，如甲醇、乙醇或甲醇/氯仿的混合物和其他。然后，在50-60℃的水浴中通过旋转蒸发去除溶剂，将有机脂质/药物混合物溶液干燥形成薄膜。之后，用含有下列捕获剂之一的水溶液对干燥的脂质膜进行水合，如硫酸铵、tea-sos、tris-sbe-β-cd和tea-sbe-β-cd。让水合过程在50-70℃下在剧烈搅拌下进行数小时，以形成多层囊泡(mlv)。然后在50-70℃下对浑浊的mlv悬浮液进行挤压或均质化，以获得所需的脂质体粒径和粒径分布。通过经透析的扩散或其他分离方法将脂质体外的外部捕获剂和未封装的药物去除。然后用选定的缓冲溶液稀释这种脂质体悬浮液，并加热到约50-70℃。随后将水溶性激酶抑制剂(例如阿法替尼、克唑替尼和奥希替尼等)按规定的药物与脂质的比例加入到温热的脂质体悬浮液中，并在50-70℃下让载药过程进行30-60分钟，以得到共载药物脂质体。图5(ii)说明了基于顺序载药方法的含有亲水性和亲脂性化合物两者的这种脂质体的结构。
[0334]
被动载药方法：一种或多种亲脂性(水溶性差的)化合物可以通过被动载药方法载于脂质体中。例如，首先制备脂质(例如dspg：0-50％摩尔/摩尔，胆固醇：0-60％摩尔/摩尔，dspc：0-50％摩尔/摩尔)与亲脂性蛋白激酶抑制剂(例如达沙替尼一水合物、色瑞替尼和其他)的有机溶液。以下有机溶剂可用于此目的，如甲醇、乙醇或甲醇/氯仿的混合物及其他。然后，在50-60℃的水浴中，通过旋转蒸发去除溶剂，将脂质/药物溶液干燥形成薄膜。之后，用所需的缓冲溶液对脂质膜进行水合，让水合过程在50-70℃下在剧烈搅拌下进行数小时，形成多层囊泡(mlv)。然后在50-70℃下对浑浊的mlv悬浮液进行挤压或均质化，以获得所需的脂质体粒径和粒径分布。通过经透析的扩散或其他方法可以将脂质体外的外部捕获剂和未封装的药物去除。图5(iii)说明了与亲脂性化合物共载的这种脂质体的结构。
[0335]
脂质体的表征
[0336]
粒径和zeta(ζ)电位。使用nano-s90 zetasizer(malvern instruments,uk)测量脂质体药物产品的流体动力学粒径、多分散指数(pdi)和ζ-电位。每个样品用蒸馏水充分稀释后测量。
[0337]
形态学表征。使用低温透射电子显微镜(cryo-tem)，即titan krios 80/300kev透射电子显微镜(thermofisher scientific)来检查共载脂质体的大小和形态。
[0338]
载药和封装。脂质体产品的药物含量(测定)是通过将已知数量的负载脂质体溶解在triton-x100水溶液中来测定的，药物含量通过hplc-uv分析进行量化。游离药物含量是先通过尺寸排除色谱(sec)将游离药物从脂质体中分离出来，然后通过hplc-uv分析对未负载的药物含量进行定量来测定的。封装效率(ee％)的计算方法是从总药物含量减去游离药物含量再除以总药物含量。
[0339]
体外药物释放研究。载药脂质体的体外释放可以通过基于透析的方法进行评估。
例如，首先将规定体积的脂质体产品(约1-2ml)加入透析袋(分子量截留为10kda)，所述透析袋在ph 7.4的磷酸盐缓冲盐水(pbs)缓冲液中预水合过夜。然后将透析袋放入含有150ml pbs(ph 7.4)的玻璃贮器中。溶出研究在37℃下在温和搅拌下进行。在预定的时间间隔对释放介质的等分试样(约1ml)进行取样，然后用等体积的新鲜介质补充贮器。通过hplc-uv方法测定特定化合物的药物含量。然后根据每个时间点释放的药物含量生成累积的药物释放曲线。
[0340]
用于确定药物协同作用的体外细胞毒性研究
[0341]
对于联合药物方案，参与组合的两个或更多个化合物可以表现出协同、加和或拮抗的相互作用，这取决于摩尔药物比。为了以定量的方式研究这些药物之间的相互作用，本研究采用了基于组合指数(ci)的方法，按照以前报道的程序(chou,t.c.,j.theor.biol.(1976)39:253-276)进行。
[0342]
细胞培养和脂质体药物疗效评估的通用方案简述如下。使用标准的细胞培养技术，在对数生长期收集粘附的癌细胞系。用血细胞仪测定细胞浓度，然后用其各自的培养基稀释到目标细胞浓度。然后将细胞接种到96孔板上。板上的图谱被设计为包括治疗组、纯细胞对照(无药物处理)和纯培养基对照(无细胞且无药物处理)。优化了细胞接种浓度，以便在细胞铺板后48小时，对未处理的对照细胞进行的mtt测定将在590nm处产生大约1.0的吸光度值。
[0343]
在药物处理前，将接种细胞的板在标准细胞培养箱中在37℃和5％co2下孵育24小时。第二天，使用各自的细胞培养基制备限定摩尔药物比的单独药物或药物组合的药物稀释液。然后用含有药物或药物组合的新鲜培养基替换96孔板中的细胞培养基。再经过24小时的孵育后，按照制造商的方案，通过mtt测定来评估细胞活率。相对存活率百分比是通过药物处理孔的吸光度值减去纯培养基孔的吸光度值，然后与无药物对照孔(仅细胞对照)进行归一化来确定的。随后计算每个孔中的受影响细胞分数(fa)，或每个药物浓度下的细胞生长抑制(％)。然后计算药物组合的效果，并由compusyn软件处理，进行药物协同作用分析。该程序采用中位效应分析算法，其产生组合指数值作为协同作用程度的定量指标。基于这种分析方法，ci《0.9表示协同作用，范围0.9≤ci≤1.1表示加和作用，ci》1.1表示拮抗作用。ci图的表示方法一般是，y轴代表ci，x轴代表受影响细胞的比例或受影响分数(fa)。确定药物组合的协同作用比例，然后用于未来的研究。
[0344]
载药脂质体的体外肿瘤细胞生长抑制
[0345]
为了研究脂质体药物产品对细胞生长的抑制，用组合载药脂质体(包含协同的药物与药物摩尔比)和相应的单一载药脂质体处理癌细胞。简要的实验过程陈述如下。将癌细胞以适当的接种密度接种到96孔板上。在标准细胞培养箱中将接种细胞的板在37℃和5％co2下孵育24小时后，进行药物处理。第二天，用各自的细胞培养基制备脂质体药物产品的连续稀释液。然后将96孔板中的细胞培养基替换成含有脂质体封装药物的新鲜培养基。在总共48小时的孵育后，按照制造商的方案，通过mtt测定来评估细胞活率。相对存活率百分比是通过药物处理孔的吸光度值减去纯培养基孔的吸光度值，然后与无药物对照孔(仅细胞对照)进行归一化来确定的。细胞生长抑制的百分比是通过从100％减去细胞活率百分比来计算的。
[0346]
体内疗效研究
[0347]
ht-29和h1975异种移植模型的开发。在6周龄雌性balb/c裸鼠的右侧区域皮下注射分散在100μl的pbs缓冲液中的约1
×
107个ht-29结直肠癌或h1975 nsclc细胞。当肿瘤大小达到约150-200mm3时，将小鼠随机分为6组，每组6只小鼠(n＝6)。在整个研究期间，小鼠被保持在20
±
2℃和50-60％的相对湿度下。所有的动物处理程序都符合机构动物伦理委员会批准的方案。
[0348]
药物施用和肿瘤大小测量。当肿瘤大小达到上述所需的大小时，然后通过尾静脉注射(iv)向荷瘤小鼠施用以下样品：(1)盐水对照(2)游离afa溶液(3)游离afa/nin组合溶液(4)脂质体afa(afa-l)(5)脂质体nin(nin-l)和(6)组合afa/nin-l。对于每种药物制剂，采用以下剂量：游离碱形式的afa为7.0mg/kg，游离碱形式的nin为38.9mg/kg。疗效研究进行了大约20天，每两天施用一次药物制剂(q2d)。每周用卡尺测量两次肿瘤大小的两个维度，体积用以下公式表示为mm3：v＝0.5*(a)*(b2)，其中a和b分别为肿瘤的长直径和短直径。
[0349]
统计数据分析。在mtt测定和体内抗肿瘤研究过程中，通过单因素anova联合dunnett检验来确定共载药物脂质体处理的组与其他处理组之间的统计学差异，显著水平为p《0.05。所有观察值均以平均值
±
sd表示(n＝6)。
[0350]
实施例
[0351]
下面的实施例是为了说明所公开的发明，而不是为了对其进行限制。
[0352]
实施例1
[0353]
阿法替尼脂质体的制备和物理表征
[0354]
阿法替尼脂质体(afa-l)是通过实验方法中描述的主动载药方法制备的。双马来酸阿法替尼的结构如图1a所示。进行了系统的实验，以确定和优化制剂和生产工艺条件中影响脂质体的理化性质(例如脂质体粒径、粒径分布、封装效率、脂质体稳定性、药物释放曲线和其他)的主要因素(例如脂质的选择、脂质体的组成、药物与脂质的比例、捕获剂和工艺条件等)。
[0355]
具体来说，afa-l是根据hspc/mpeg-2000-dspe/胆固醇的脂质成分制备的，使用以下捕获剂将化合物主动负载到脂质体中：硫酸铵、tea-sos或tea-sbe-β-cd。总的来说，peg化的afa-l表现出以下物理特性：平均粒径约90nm，pdi《0.100，封装效率(ee％)》95.0％，ζ-电位(表面电荷)《-40mv。使用不同捕获剂的阿法替尼脂质体的ee％显示在图2中。结果反映出药物与脂质的比例对有效载荷的ee％具有显著影响。也就是说，当比例为1:8或1:4(w/w)时，在所有三种捕获剂中，afa-l的ee％接近99％。然而，当药物与脂质重量比为1:2时，观察到所有脂质体的阿法替尼ee％急剧下降，与使用的捕获剂无关。脂质与药物的比例会影响脂质体的容量以及内部捕获剂的可用性，结果表明，足够数量的脂质对于确保获得高的药物封装效率至关重要。
[0356]
此外，带负电荷的dspg脂质也被用来制备封装阿法替尼的脂质体。脂质体的制造过程在实验方法中提到。具体来说，载有阿法替尼的dspg脂质体是用以下捕获剂将有效载荷主动封装在脂质体中而配制的，即硫酸铵、tea-sos和tea-sbe-β-cd。典型的载有阿法替尼的dspg脂质体具有以下物理参数：平均粒径约110nm，pdi《0.100，封装效率(％)》95.0％，ζ-电位《-30mv。
[0357]
实施例2
[0358]
尼达尼布脂质体的制备和表征
[0359]
进行了系统的研究，以确定和优化制剂和生产工艺中能够影响载药脂质体的理化性质的主要因素。尼达尼布脂质体(nin-l)是通过实验方法中描述的主动负载方法制备的。乙磺酸尼达尼布的结构如图1b所示。图3显示了捕获剂和药物与脂质重量比对药物封装效率(ee％)的影响。当使用tea-sbe-β-cd作为捕获剂时，所有测试的药物与脂质的比例都获得了高的ee％(接近100％)。相比之下，当使用tea-sos和硫酸铵作为捕获剂时，只有在药物与脂质的比例(w/w)为1:16和1:8时才能观察到高ee％。当药物与脂质的比例增加到1:4时，使用tea-sos和硫酸铵的脂质体的ee％明显下降。上述结果反映出，在所有评估的捕获剂中，tea-sbe-β-cd在封装尼达尼布方面显示出优越的特性。
[0360]
此外，带负电荷的dspg也被用来制备脂质体以封装尼达尼布。实验部分提到了脂质体的制造过程。具体来说，载有尼达尼布的dspg脂质体是用以下捕获剂以主动封装有效载荷而配制的，即硫酸铵、tea-sos、tea-sbe-β-cd，。典型的载有尼达尼布的dspg脂质体具有以下物理参数：平均粒径约120nm，pdi《0.100，封装效率(％)》95.0％，ζ-电位《-30mv。
[0361]
实施例3
[0362]
tea-sos和tea-sbe-β-cd捕获剂的制备
[0363]
已知参与主动负载的捕获剂对有效载荷的封装、保留以及其溶出曲线起着关键作用。除了常用的硫酸铵外，本文还探讨了基于多阴离子的捕获剂对激酶抑制剂的封装。图4显示了本工作中所涉及的两种多阴离子的结构，即tea-sos和tea-sbe-β-cd。
[0364]
tea-sos和tea-sbe-β-cd的制备：首先用基于磺化的聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的阳离子交换树脂珠填充离子交换柱。然后，用约1n盐酸平衡所述树脂，随后用去离子水清洗，直到洗脱液的ph接近中性。之后，将八硫酸蔗糖(sos)的钠盐或sbe-β-环糊精的溶液加入到柱中，并用去离子水洗脱。然后用三乙胺滴定洗脱液至ph为4.0-6.0。在一些情况下，用三(羟甲基)氨基甲烷(tris)作为滴定的碱，以生成多阴离子的tris盐，例如tris-seb-β-环糊精或tris-sos。
[0365]
实施例4
[0366]
阿法替尼和尼达尼布共载脂质体的制备
[0367]
共载的peg化脂质体(peg化的afa/nin-l)是通过实验方法中描述的借由跨膜ph梯度进行的主动负载方法制备的。脂质成分基于mpeg-2000-dspe/胆固醇/dspc或mpeg-2000-dspe/胆固醇/hspc。多种类型的捕获剂被用于制备这种双重载药脂质体，即硫酸铵、tea-sbe-β-cd、tris-sbe-β-cd、tea-sos、葡萄糖酸铜/teoa。在载药步骤中，将afa和nin以规定的摩尔比(例如afa:nin为1:10、1:5或1:1)引入脂质体悬浮液中。peg化的afa/nin-l的方案如图5(i)所示。进行了系统的实验，以确定和优化制剂和生产过程条件中影响脂质体的理化性质(例如脂质体粒径、粒径分布、封装效率、脂质体稳定性、药物释放曲线和其他)的主要因素(例如脂质的选择、脂质体的组成、药物与脂质的比例、药物与药物摩尔比、捕获剂和工艺条件等)。
[0368]
除了peg化的脂质体外，dspg脂质体也被开发出来用于封装蛋白激酶抑制剂。在这种情况下，脂质成分基于dspg、胆固醇和dspc或hspc。不同类型的捕获剂如硫酸铵可用于封装主动负载的药物。详细的脂质体制备方法在实验方法部分(主动载药方法)进行了描述。如图5(i)所示，两种抑制剂都位于脂质体的水性核心隔室内。
[0369]
实施例5
[0370]
afa/nin脂质体的理化表征
[0371]
对afa/nin共载脂质体进行了理化表征。使用上述捕获剂(实施例4)的脂质体产品的药物封装效率总结在以下表1中。从结果中可以反映出，除了葡萄糖酸铜/teoa外，所有的捕获剂在测试的所有三种药物摩尔比下，对afa和nin都有非常高的ee％(～99％)。当使用葡萄糖酸铜/teoa作为捕获剂时，ee％明显较低。因此，对于afa和nin的共封装，结果表明，在药物封装方面，基于ph梯度的负载方法优于基于过渡金属的方法。使用硫酸铵和tea-sbe-β-cd作为捕获剂的afa/nin共载的peg化脂质体的粒径和大小分布分别如图6和图7所示。所有的组合药物脂质体都表现出平均粒径在100nm左右，多分散性(pdi)《0.100，这表明大小分布很窄。
[0372]
表1.药物摩尔比和捕获剂对afa/nin共载的peg化脂质体的理化特性的影响
[0373][0374][0375]
脂质与药物摩尔比对药物封装效率(ee％)和粒径的影响如下表2所示。结果发现，随着脂质与药物摩尔比的降低，afa和nin的ee％都略有下降。但在所有研究条件下，总体上获得了高于95％的ee％(表2)。另外，据观察，随着制剂中脂质与药物摩尔比的降低，脂质体的粒径也随之降低。
[0376]
表2.脂质与药物重量比对具有tea-sbe-β-cd捕获剂的afa和nin共载的peg化脂质体的封装效率(ee％)和粒径的影响
[0377][0378]
进行cryo-tem以观察使用tea-sos作为捕获剂的afa/nin共载脂质体的形态，afa与nin的摩尔比为1:5。如图8a所示，结果显示，脂质体是球形的，在脂质体的水性核心内观察到深色条纹状结构。据认为，这些深色沉淀物是药物和捕获剂形成的复合物。平均而言，tem所显示的粒径(80-100nm)与动态光散射发现的结果一致。这些结果证明，药物以沉淀的状态被很好地封装在脂质体的水性核心隔室内。
[0379]
与peg化的afa/nin-l脂质体相比，dspg-afa/nin-l脂质体的平均粒径为137nm左右，在afa：nin药物摩尔比为1:1时，捕获剂硫酸铵的pdi为0.099。阿法替尼和尼达尼布在dspg-afa/nin-l中的封装效率(％)分别为68％和85％。结果反映出，所有有效载荷都可以获得可接受的ee％水平，两种共载脂质体的粒径都小于150nm，多分散性较窄。然而，dspg-afa/nin-l的ee％不如peg化的afa/nin-l脂质体好。
[0380]
实施例6
[0381]
afa/nin-l体外释放和稳定性研究
[0382]
在ph 7.4的pbs缓冲溶液中，通过透析在45℃的加速条件下对afa/nin共载的peg化脂质体(afa/nin-l的摩尔药物比为1:5，使用硫酸铵或tea-sbe-β-cd作为捕获剂)进行药物释放研究，同时对peg化的afa-l和nin-l进行研究。总的来说，如图9a所示，获得了afa和nin从脂质体的持续释放曲线，并且afa的释放速率比nin快。有效载荷从共载脂质体的释放速率与使用相同类型的捕获剂从单一载药脂质体释放相应api的速率相当，这表明将afa和nin共封装在一个脂质体中并不改变它们的溶出曲线。另外，图9a中的结果反映出，与使用硫酸铵的脂质体相比，使用tea-sbe-β-cd作为捕获剂的脂质体对afa表现出更好的保留。这表明，afa可能与tea-sbe-β-cd有更强的相互作用，从而导致药物释放曲线变慢。
[0383]
通过记录在4℃(长期储存条件)和25℃(加速条件)下储存45天的粒径、粒径分布(pdi)和封装效率(ee％)的变化，评估使用硫酸铵作为捕获剂的peg化的afa/nin共载脂质体的物理稳定性。在储存的最初、1、4、8和16周时取样品的试样，通过动态光散射和hplc分析分别测定粒径特征和ee％。表3显示的结果表明，在4℃和25℃的储存条件下，afa/nin共载脂质体在45天内具有物理稳定性。
[0384]
表3.peg化的afa/nin-l(硫酸铵作为捕获剂)在4℃(长期储存)和25℃(加速)的储存条件下的物理稳定性
[0385][0386][0387]
实施例7
[0388]
阿贝西利和舒尼替尼共载脂质体的制备和表征
[0389]
根据实验方法(主动载药方法)中提到的程序，制备了共载阿贝西利(abe，cdk家族抑制剂)和舒尼替尼(sun，pdgfrα/β抑制剂)的脂质体。甲磺酸阿贝西利和苹果酸舒尼替尼的结构描述于图1(c，d)。peg化脂质体(mpeg-2000-dspe/胆固醇/dspc)和dspg脂质体(dspg/胆固醇/dspc)都被用于主动载药(见实验方法)。不同类型的捕获剂被用于双药封装，即tea-sos、tea-sbe-β-cd和tri-sbe-β-cd。在载药步骤中，abe和sun都以规定的摩尔比(例如1:5)被引入到脂质体悬浮液中进行主动载药。图5(i)显示了与这两种抑制剂共载的peg化脂质体的方案。如该方案所示，这两种药物都位于脂质体的水性核心隔室内。表4显示了使用不同类型捕获剂的单一载药脂质体和abe/sun共载脂质体的理化表征。所有药物产品都获得了高的药物封装效率(》99％)。所有类型的脂质体都观察到100nm左右的粒径，粒径分布较窄(pdi《0.1)(表4)。
[0390]
表4.abe-l、sun-l和abe/sun-l的peg化脂质体的理化表征
[0391][0392][0393]
还研究了abe/sun共载的peg化脂质体的溶出曲线。如图9b所示，无论采用何种捕
获剂，abe的释放速率都比sun的释放速率慢。另外，对于相同的药物，使用tea-sbe-β-cd作为捕获剂的脂质体与使用tris-sbe-β-cd的脂质体相比，表现出较慢的药物释放速率。结果表明，捕获剂中多阴离子的反离子在控制药物释放速率方面起着重要作用，并且对于将药物保留在脂质体内tea优于tris。
[0394]
除了peg化脂质体外，dspg脂质体也被开发出来用于封装蛋白激酶抑制剂。在这种情况下，脂质成分基于dspg、胆固醇和dspc或hspc。不同类型的捕获剂如硫酸铵可用于封装主动负载的药物。详细的脂质体制备方法在实验方法部分(主动载药方法)进行了描述。如图5(i)所示，两种抑制剂都位于脂质体的水性核心隔室内。与peg化的abe/sun-l脂质体相比，具有捕获剂硫酸铵的1:1的abe:sun药物摩尔比的dspg-abe/sun-l脂质体的平均粒径在149nm左右，pdi为0.166。阿贝西利和舒尼替尼在dspg-abe/sun-l中的封装效率(％)分别为91％和85％。结果反映出，所有有效载荷都可以获得可接受的ee％水平，两种共载脂质体的平均粒径在150nm左右，多分散性较窄。然而，dspg-abe/sun-l的ee％不如peg化的afa/nin-l脂质体好。
[0395]
实施例8
[0396]
阿法替尼和克唑替尼共载脂质体的制备和表征
[0397]
根据实验方法(主动载药方法)中提到的程序，制备了共载阿法替尼(afa，egfr抑制剂)和克唑替尼(cri，alk抑制剂)的脂质体。双马来酸阿法替尼和克唑替尼的结构在图1(a和e)中描述。peg化脂质体(mpeg-2000-dspe/胆固醇/dspc)和dspg脂质体(dspg/胆固醇/dspc)都被用于双重药物的主动负载(见实验方法)。不同类型的捕获剂被用于双药封装，即tea-sos、tea-sbe-β-cd和tri-sbe-β-cd。在载药步骤中，将afa和cri以规定的摩尔比(例如1:1)引入脂质体悬浮液中进行主动载药。图1(i)中显示了与这两种抑制剂共载的peg化脂质体的方案。如该方案所示，这两种抑制剂都位于脂质体的水性核心隔室内。表5总结了对单一载药脂质体和afa/cri共载的peg化脂质体的理化表征的结果。数据反映出，对于所有评估的捕获剂，两种抑制剂都被有效地封装在脂质体中(》99％ee％)。afa/cri共载脂质体的平均粒径在100nm左右，并获得了较窄的粒径分布(pd i《0.1)。
[0398]
表5.afa-l、cri-l和afa/cri-l的peg化脂质体的理化表征
[0399][0400]
还研究了afa/cri共载的peg化脂质体的溶出曲线。如图9c所示，数据反映出在固定的脂质成分下，afa和cri表现出相似的释放速率。对于相同的药物，与dspc含量为68％(w)的脂质组合物相比，包括高dspc含量74％(w)的脂质组合物明显减慢了药物释放速率。结果表明，形成双分子层的脂质dspc的含量对药物在脂质体内的保留起着重要作用。
[0401]
实施例9
[0402]
奥希替尼和阿法替尼共载的peg化脂质体的制备和表征
[0403]
根据实验方法(主动载药方法)中提到的程序，制备了共载两种egfr靶向激酶抑制剂奥希替尼(osi)和阿法替尼(afa)的脂质体。甲磺酸奥希替尼和双马来酸阿法替尼的化学结构分别如图1f和图1a所示。peg化脂质体制剂(mpeg-2000-dspe/胆固醇/dspc)被用于制备脂质体。图1(i)中显示了与这两种抑制剂共载的peg化脂质体的方案。每个共载脂质体都使用了四种不同类型的捕获剂，包括硫酸铵、tris-sbe-β-cd、tea-sbe-β-cd和tea-sos。在载药步骤中，osi和afa都以规定的摩尔比(例如1:1)被引入脂质体悬浮液中进行主动载药。如方案所示，这两种抑制剂都位于脂质体的水性核心隔室内。两种共载脂质体及其相应的单一载药脂质体的理化特性如表6所示。从结果中反映出，对所有采用的捕获剂，osi/afa共载脂质体的两种有效载荷都表现出非常高的封装效率。载药脂质体的粒径在100nm左右的范围内，所有脂质体的多分散指数较低(pdi《0.1)。
[0404]
表6.osi-l、afa-l和osi/afa-l的peg化脂质体的理化表征
[0405][0406]
进行cryo-tem以观察osi/afa共载的peg化脂质体的形态，osi与afa的摩尔比为1:1。tea-sos被用作该脂质体药物产品的捕获剂。正如tem图像(图8b)所揭示的，在脂质体的水性核心中形成了圆形和明显的药物沉淀。tem表征的结果表明，抑制剂被成功地封装在脂质体内。
[0407]
实施例10
[0408]
奥希替尼和克唑替尼共载的peg化脂质体的制备和表征
[0409]
根据实验方法(主动载药方法)中提到的程序，制备了共载egfr抑制剂奥希替尼(osi)和atk抑制剂克唑替尼(cri)的脂质体。脂质成分为mpeg-2000-dspe/胆固醇/dspc的peg化脂质体制剂被用于制备脂质体。使用四种不同类型的捕获剂用于主动载药，包括硫酸铵、tris-sbe-β-cd、tea-sbe-β-cd和tea-sos。在载药步骤中，osi和cri都以规定的摩尔比(例如1:1)被引入到脂质体悬浮液中进行主动载药。图5(i)中说明了与这两种抑制剂共载的peg化脂质体的方案。如该方案所示，这两种抑制剂都位于脂质体的水性核心隔室内。这些共载药物脂质体的理化特性如表7所示。从结果中反映出，对除tris-sbe-β-cd以外的所有捕获剂，osi/cri共载脂质体都对两种有效载荷表现出非常高的封装效率。对于所有共载脂质体，载药脂质体的粒径在100nm左右的范围内，具有低的多分散指数(pdi《0.1)。
[0410]
表7.osi-l、cri-l和osi/cri-l的peg化脂质体的理化表征
[0411][0412][0413]
实施例11
[0414]
达沙替尼和阿法替尼共载dspg脂质体的制备和表征
[0415]
如图5(ii)所示的双药封装的情形ii所示，首先可以通过被动负载将一种水溶性差的亲脂性蛋白激酶抑制剂封装在脂质双分子层内，随后将另一种水溶性(亲水性)蛋白激酶抑制剂主动载于脂质体的水性核心内。当前的实施例描述了基于依次被动和主动负载方法将达沙替尼(das，水溶性差)和阿法替尼(afa，水溶性)载于脂质体中。详细的制备过程见实验方法(依次被动和主动载药方法)。表8中的结果显示了所得到的afa/das脂质体的理化特性。脂质体的组成基于dspg/胆固醇/dspc。在最终的载药脂质体中，das与afa的摩尔比为3.0。将样品储存在2-8℃以监测短期稳定性研究，结果如图10所示。数据反映出afa/das-l脂质体产品在冷藏条件下具有物理稳定性。
[0416]
表8.afa-l、das-l和afa/das-l的dspg脂质体的理化特性
[0417][0418]
实施例12
[0419]
达沙替尼和色瑞替尼dspg共载脂质体的制备和表征
[0420]
如图5(iii)所示的双药封装的情形iii所示，可以通过被动载药方法将两种水溶性差的(亲脂性)蛋白激酶抑制剂共载到脂质体的脂质双分子层中。当前的实施例描述了根据实验方法(被动载药方法)中提到的程序，将色瑞替尼(cer)和达沙替尼(das)封装到脂质体中。das/cer共载脂质体的理化特性如表9所示。在共载脂质体中，封装的das与封装的cer的最终比例为1.8:1(mol:mol)。样品被储存在冰箱中以监测短期稳定性研究。如图11所示，在研究的时间范围内，das/cer共载脂质体在2-8℃具有物理稳定性。
[0421]
表9.与das/cer共载的dspg脂质体的理化特性
[0422][0423]
使用cryotem观察与1.8:1的摩尔药物比的das/cer共载的dspg脂质体的形态。如图8c所示，观察到具有单层结构的脂质体，而脂质体的中心水性核心是空的。结果表明，两种水溶性差的化合物(das和cer)都被封装在脂质体的脂质层内。
[0424]
实施例13
[0425]
对阿法替尼和尼达尼布组合在癌细胞中的协同作用的体外评估
[0426]
对于药物组合方案，两种或更多种组合药物可能表现出协同、加和或拮抗的相互作用。为了确定具有协同作用的阿法替尼和尼达尼布的摩尔比(afa/nin)，对afa/nin的各种药物比在癌细胞系中的细胞毒性作用进行了体外测试。使用10:1、5:1、2.5:1、1:1、1:2.5、1:5和1:10的摩尔比的afa/nin在下列癌细胞系中进行了细胞毒性作用的测量：ht-29结直肠癌、a-549非小细胞系癌症(nsclc)、mcf-7乳腺癌、h1975 nsclc和hcc827 nsclc。在相应的细胞系中单独使用afa和单独使用nin进行处理的细胞毒性作用被包括作为对照。
[0427]
在实验方法部分(用于确定药物协同作用的体外细胞毒性研究)描述了用于细胞毒性测量的细胞培养、药物处理、mtt测定的详细过程。根据体外疗效结果，然后使用基于chou和talalay的剂量-效应分析理论的compusyn软件，确定每个阿法替尼/尼达尼布剂量的组合指数。在该理论中，“中位效应等式”被用来计算本领域广泛使用的一些生化等式。该等式的推导产生了高阶等式，如用于计算组合指数(ci)的等式。如前所述，ci可用于确定不同比例的一种以上药物的组合是否具有拮抗作用(ci》1.1)、加和作用(0.9≤ci≤1.1)或协同作用(ci《0.9)。表10显示了通过ci方法确定的每个测试的癌细胞系的协同afa/nin摩尔比。图12和图13分别显示了在ht-29结直肠癌和h1975 nsclc细胞中评估的afa/nin组合的ci值作为细胞生长抑制(％)的函数的代表性图。然后将那些协同药物比用于脂质体药物产品制剂，以靶向特定的癌细胞。
211h间皮瘤和h1975 nsclc。在相应的细胞系中单独使用afa和单独使用cri进行处理的细胞毒性作用被包括对照。
[0439]
在实验方法部分(用于确定药物协同作用的体外细胞毒性研究)描述了用于细胞毒性测量和ci值计算的细胞培养、药物处理、mtt测定的详细过程。表12显示了通过ci方法确定的每个测试的癌细胞系的协同afa/cri摩尔比。图16和图17分别显示了在msto-211h间皮瘤和h1975 nsclc细胞系中评估的afa/cri组合的ci值作为细胞生长抑制(％)的函数的代表性图。然后将那些确定的协同药物比用于脂质体药物产品制剂，以靶向特定的癌细胞。
[0440]
表12.所确定的阿法替尼和克唑替尼组合对各种类型的癌细胞系的协同药物摩尔比
[0441][0442]
实施例16
[0443]
对奥希替尼和阿法替尼组合在癌细胞中的协同作用的体外评估
[0444]
为了确定具有协同作用的奥希替尼和阿法替尼的摩尔比(osi/afa)，对osi/afa的各种药物比在癌细胞系中的细胞毒性作用进行了体外测试。使用10:1、5:1、2.5:1、1:1、1:2.5、1:5和1:10的摩尔比的osi/afa在下列癌细胞系中进行了细胞毒性作用的测量：h1975 nsclc和hcc827 nsclc。在相应的细胞系中单独使用osi和单独使用afa进行处理的细胞毒性作用被包括作为对照。
[0445]
在实验方法部分(用于确定药物协同作用的体外细胞毒性研究)描述了用于细胞毒性测量和ci值计算的细胞培养、药物处理、mtt测定的详细过程。表13显示了通过ci方法确定的每个测试的癌细胞系的协同osi/afa摩尔比。图18和图19分别显示了在h1975 nsclc和hcc827细胞系中评估的osi/afa组合的ci值作为细胞生长抑制(％)的函数的代表性图。然后将那些确定的协同药物比用于脂质体药物产品制剂，以靶向特定的癌细胞。
[0446]
表13.所确定的奥希替尼和阿法替尼组合对各种类型的癌细胞系的协同药物摩尔比
[0447][0448]
实施例17
[0449]
对奥希替尼和克唑替尼组合在癌细胞中的协同作用的体外评估
[0450]
为了确定具有协同作用的奥希替尼和克唑替尼的摩尔比(osi/cri)，对osi/cri的各种药物比在癌细胞系中的细胞毒性作用进行了体外测试。使用10:1、5:1、2.5:1、1:1、1:
2.5、1:5和1:10的摩尔比的osi/cri在下列癌细胞系中进行了细胞毒性作用的测量：h1975 nsclc和hcc827 nsclc。在相应的细胞系中单独使用osi和单独使用cri进行处理的细胞毒性作用被包括作为对照。
[0451]
在实验方法部分(用于确定药物协同作用的体外细胞毒性研究)描述了用于细胞毒性测量和ci值计算的细胞培养、药物处理、mtt测定的详细过程。表14显示了通过ci方法确定的每个测试的癌细胞系的协同osi/cri摩尔比。图20和图21分别显示了在h1975 nsclc和hcc827细胞系中评估的osi/cri组合的ci值作为细胞生长抑制(％)的函数的代表性图。然后将那些确定的协同药物比用于脂质体药物产品制剂，以靶向特定的癌细胞。
[0452]
表14.所确定的奥希替尼和克唑替尼组合对各种类型的癌细胞系的协同药物摩尔比
[0453][0454]
实施例18
[0455]
对阿法替尼和达沙替尼组合在癌细胞中的协同作用的体外评估
[0456]
为了确定具有协同作用的阿法替尼和达沙替尼的摩尔比(afa/das)，对afa/das的各种药物比在癌细胞系中的细胞毒性作用进行了体外测试。使用10:1、5:1、2.5:1、1:1、1:2.5、1:5和1:10的摩尔比的afa/das在下列癌细胞系中进行了细胞毒性作用的测量：msto-211h间皮瘤、h1975 nsclc和hcc827nsclc。在相应的细胞系中单独使用afa和单独使用das进行处理的细胞毒性作用被包括作为对照。
[0457]
在实验方法部分(用于确定药物协同作用的体外细胞毒性研究)描述了用于细胞毒性测量和ci值计算的细胞培养、药物处理、mtt测定的详细过程。表15显示了通过ci方法确定的每个测试的癌细胞系的协同afa/das摩尔比。图22和图23分别显示了在h1975 nsclc和hcc827细胞系中评估的afa/das组合的ci值作为细胞生长抑制(％)的函数的代表性图。然后将那些确定的协同药物比用于脂质体药物产品制剂，以靶向特定的癌细胞。
[0458]
表15.所确定的阿法替尼和达沙替尼组合对各种类型的癌细胞系的协同药物摩尔比
[0459][0460]
实施例19
[0461]
对达沙替尼和色瑞替尼组合在癌细胞中的协同作用的体外评估
[0462]
为了确定具有协同作用的达沙替尼和色瑞替尼的摩尔比(das/cer)，对das/cer的各种药物比在癌细胞系中的细胞毒性作用进行了体外测试。使用10:1、5:1、2.5:1、1:1、1:2.5、1:5和1:10的摩尔比的das/cer在下列癌细胞系中进行了细胞毒性作用的测量：h1975 nsclc和hcc827 nsclc。在相应的细胞系中单独使用das和单独使用cer进行处理的细胞毒性作用被包括对照。
[0463]
在实验方法部分(用于确定药物协同作用的体外细胞毒性研究)描述了用于细胞毒性测量和ci值计算的细胞培养、药物处理、mtt测定的详细过程。表16显示了通过ci方法确定的每个测试的癌细胞系的协同das/cer摩尔比。图24和图25分别显示了在h1975 nsclc和hcc827细胞系中评估的das/cer组合的ci值作为细胞生长抑制(％)的函数的代表性图。然后将那些确定的协同药物比用于脂质体药物产品制剂，以靶向特定的癌细胞。
[0464]
表16.所确定的达沙替尼和色瑞替尼组合对各种类型的癌细胞系的协同药物摩尔比
[0465][0466]
实施例20
[0467]
阿法替尼/尼达尼布共载脂质体的体外肿瘤细胞生长抑制
[0468]
在体外研究了与两种激酶抑制剂(例如afa/nin-l)共载的脂质体和相应的单一载药脂质体(例如afa-l和nin-l)对癌细胞生长的抑制。本研究中使用的所有载药脂质体都是peg化的，并且tea-sos被用作所有药物产品的捕获剂。
[0469]
简要的实验过程陈述如下：将癌细胞以适当的接种密度接种到96孔板上。在药物处理之前，在标准细胞培养箱中将接种细胞的板在37℃和5％co2下孵育24小时。第二天，用各自的细胞培养基制备脂质体药物产品的连续稀释液。然后将96孔板中的细胞培养基替换成含有脂质体药物的新鲜培养基。在总共48小时的孵育后，按照制造商的方案，通过mtt测定来评估细胞活率。相对存活率百分比是通过药物处理孔的吸光度值减去纯培养基孔的吸光度值，然后与未处理的对照孔(仅细胞对照)进行归一化来确定的。细胞生长抑制的百分比是通过从100％减去细胞活率百分比来计算的。
[0470]
afa/nin脂质体药物产品的细胞生长抑制如表17所示。总的来说，双重载药脂质体在其协同比例下的细胞生长抑制能力明显大于如果每种封装的药物仅以加和方式贡献其活性而预期的。具体来说，在药物总浓度为2.34μm时，afa/nin-l的细胞生长抑制为59％。相比之下，在0.39μm和1.95μm的浓度下，afa-l和nin-l的相应细胞生长抑制分别为37％和3％，根据加和计算，得出总抑制只有40％。因此，通过药物组合方法，疗效提高了50％。总的来说，上述结果表明，当采用相同的药物比例时，实施例13中显示的基于afa/nin的游离药物组合的协同效应可以很好地转化为双重载药脂质体。
[0471]
表17.afa/nin共载脂质体(afa/nin-l)对h1975 nsclc细胞的体外细胞生长抑制
[0472][0473]
实施例21
[0474]
阿法替尼/达沙替尼共载脂质体的体外肿瘤细胞生长抑制
[0475]
在体外研究了与两种激酶抑制剂(离如afa/das-l)共载的脂质体和相应的单一载药脂质体(例如afa-l和das-l)对癌细胞生长的抑制。本研究中使用的所有载药脂质体都是dspg脂质体，并且tea-sbe-β-cd被用作捕获剂。
[0476]
实施例20中提到了关于细胞培养、脂质体药物产品处理以及通过mtt测定对细胞生长抑制进行定量的方法。afa/das脂质体药物产品的细胞生长抑制如表18所示。总的来说，双重载药脂质体在其协同比例下的细胞生长抑制能力明显大于如果每种封装的药物仅以加和方式贡献其活性而预期的。具体来说，在药物总浓度为34nm时，afa/das-l的细胞生长抑制为88％。相比之下，在24nm和10nm的浓度下，afa-l和das-l的相应细胞生长抑制分别为3％和33％，根据加和计算，得出总抑制只有36％。因此，通过药物组合方法，疗效提高了2.4倍。总的来说，上述结果表明，当采用相同的药物比例时，实施例18中显示的基于afa/das的游离药物组合的协同效应可以很好地转化为双重载药脂质体制剂。
[0477]
表18.共载脂质体(afa/das-l)对hcc827 nsclc细胞的体外细胞生长抑制
[0478][0479]
实施例22
[0480]
共载的peg化afa/nin脂质体的体内药代动力学研究
[0481]
在balb/c裸鼠体内进行游离阿法替尼和尼达尼布组合(数据未显示)以及afa/nin-l(1:5的afa:nin摩尔比)的体内药代动力学研究。用tea-sos作为捕获剂的peg化的afa/nin-l的制备在实验方法部分进行了描述。通过尾静脉向小鼠静脉施用阿法替尼和尼达尼布游离药物的混合物以及摩尔比为1:5的peg化afa/nin-l，并随时间监测afa和nin的血浆浓度。所有药物制剂的剂量为7.0mg/kg的阿法替尼游离碱(10.3mg/kg双马来酸阿法替尼)和38.9mg/kg的尼达尼布游离碱(46.8mg/kg甲磺酸尼达尼布)。静脉施用后，在多个时间
点通过心脏穿刺来采集血液(每个时间点3只小鼠)并放入edta包被的微型容器中。将样品离心以分离血浆，并将血浆转移到另一个管。然后，用lc-ms对afa和nin的血浆水平进行定量。然后根据测得的aaa和nin的血浆水平计算pk参数。
[0482]
pk研究结果揭示，游离afa和游离nin药物溶液在静脉施用后迅速消除，并且游离afa和游离nin的半衰期(t
1/2
)值很难确定。与游离药物溶液相比，peg化的afa/nin-l中的afa和nin的pk曲线显示循环时间延长(图26a)。两种药物在afa/nin-l脂质体中的auc(曲线下面积)比游离药物溶液中的auc增加了超过700倍(afa)和超过350倍(nin)。两种药物在peg化的afa/nin-l脂质体中的mrt(最大保留时间)也比游离药物溶液中的mrt增加了超过4.5倍(afa)和6倍(nin)。这些pk结果表明，与afa和nin的游离药物相比，共载的afa/nin-l脂质体明显延长了药物保留，并显示出afa和nin在小鼠体内的血浆药物水平大幅提高。此外，我们注意到，在这项pk研究中，在上述药物剂量下小鼠对afa/nin-l脂质体药物产品的耐受性良好，并且没有观察到不良事件。
[0483]
此外，还可以在不同的时间点测定血浆中的afa和nin的摩尔比。图26b显示了向小鼠静脉注射后总共48小时内血浆中的afa/nin的摩尔比。结果反映出，在48小时的过程中，来自脂质体制剂的afa和nin的摩尔比非常好地保持在其最初的供给水平。相比之下，观察到游离药物混合物组的药物摩尔比与初始供给(afa:nin＝1:5的摩尔比)有很大的偏差(数据未显示)。如实施例13中所讨论的，在ht-29和h-1975癌细胞系中，afa:nin的摩尔比保持在5:1至1:5的范围内，表现出协同的细胞生长抑制作用。因此，pk研究的结果表明，适当设计的脂质体制剂可以在较长的时间内保持协同药物摩尔比。此外，lc-ms分析表明，循环脂质体药物制剂含有完整的药物，并且对于任一种化合物没有观察到降解以及阿法替尼和尼达尼布之间的交叉相互作用的证据。
[0484]
实施例23
[0485]
携带h1975 nsclc异种移植肿瘤的小鼠的体内肿瘤消退
[0486]
在携带h1975异种移植肿瘤的小鼠中评估了afa/nin-l抑制nsclc癌症的潜力。为了最大限度地提高药物组合的治疗活性，并获得体外细胞系研究中观察到的协同益处，药物组合需要以协同药物比递送到肿瘤部位。为此，开发了含有afa和nin的脂质体制剂，其固定比例已知在h1975 nsclc细胞中具有协同作用(实施例4)。然后在h1975 nsclc模型中对该制剂的抗肿瘤活性进行了体内评估。本研究使用以tea-sos作为捕获剂，协同摩尔比为1:5的afa和nin共封装的peg化脂质体。
[0487]
在实验方法部分(体内疗效研究)提及了肿瘤细胞接种和肿瘤异种移植的建立。将小鼠组织成适当的治疗组，包括盐水对照组和药物治疗组，药物治疗组包括(1)游离afa，(2)afa-l，(3)nin-l，(4)afa/nin混合的游离药物混合物溶液(afa:nin摩尔比为1:5)，以及(5)afa/nin-l(afa:nin摩尔比为1:5)。根据每个个体小鼠的体重，每两天向小鼠静脉注射所需体积的样品，以向动物施用目标剂量(7.0mg/kg afa游离碱，38.9mg/kg nin游离碱)，共注射27天。随时间测量和监测肿瘤体积和小鼠体重。
[0488]
如图27a所示，一般来说，与在携带肿瘤的盐水对照组以及包括游离afa药物、afa-l单药疗法、nin-l单药疗法和组合的游离afa/nin混合物溶液在内的其他药物治疗组中观察到的相比，共载脂质体(afa/nin-l)在治疗27天后明显抑制了肿瘤的生长。对于对照组、游离afa组和afa-l组，在整个疗程后，平均肿瘤大小(n＝6)急剧增加(》15倍)。这意味着游
离的阿法替尼在这个特定的细胞系中没有任何抑制作用，这可能是由于它对阿法替尼的抗性。对于游离的afa/nin组合混合物和nin-l组，治疗20天后，平均肿瘤大小分别增加了约170％和47％。相比之下，在经afa/nin-l治疗的小鼠中观察到肿瘤体积明显缩小，这相当于在同一疗程后大小缩小了10％。
[0489]
此外，与对照相比，所有药物治疗组都没有引起小鼠体重的明显下降(图27b)。因此，结果表明，所有药物治疗组都没有普遍的系统毒性。然而，据观察，在经afa/nin游离药物混合物治疗的组中，小鼠尾部的注射部位肿胀和发红。相比之下，脂质体制剂(即afa-l、nin-l和afa/nin-l)没有对注射部位造成任何损害。因此，我们可以推断，脂质体的封装使小鼠在注射部位免受与afa和nin有关的毒性影响。图27c显示了来自对照(未治疗)和所有药物治疗的小鼠的h1975异种移植肿瘤块的解剖照片。在经afa/nin游离药物混合物、nin-l和afa/nin-l治疗的小鼠中观察到肿瘤大小明显缩小，观察到这种缩小的程度为afa/nin-l》nin-l》afa/nin游离药物混合物。相比之下，观察到未治疗的对照组、游离afa组和afa-l治疗组的肿瘤大小明显较大，并且这三组之间没有明显的肿瘤大小差异。这些结果表明，与其他药物制剂相比，afa/nin-l表现出明显改善的抗肿瘤活性。
[0490]
在不受理论束缚的情况下，afa/nin-l对肿瘤生长的这种抑制被认为是由于纳米化脂质体制剂的增强的通透性和滞留(epr)效应，它可以提高药物在肿瘤部位的递送特异性。因此，关于游离药物混合物和脂质体药物组合之间的疗效比较反映出当前脂质体制剂所实现的优越的生物分布可以导致更有效的肿瘤抑制。有趣的是，经afa游离药物和afa-l单药疗法治疗的小鼠的肿瘤生长速率与盐水对照组中观察到的相似，这意味着h1975 nsclc细胞系可能具有内在的阿法替尼耐药特性。另外，与nin-l或afa-l相比，afa/nin组合对肿瘤生长的抑制作用明显更强。该结果表明，从体外研究(实施例13)中发现的afa和nin之间的协同作用可以很好地转化为体内环境中的脂质体制剂。总的来说，上述结果表明，通过将afa和nin封装在脂质体中而固定afa与nin的协同摩尔比，可以极大地改善抗肿瘤活性。
[0491]
实施例24
[0492]
携带ht-29结直肠细胞异种移植肿瘤的小鼠的体内肿瘤消退
[0493]
如实施例15所述，也在携带ht-29结直肠肿瘤的小鼠的肿瘤异种移植模型中评估了afa/nin共载脂质体制剂的抗肿瘤活性。本研究使用以tea-sos作为捕获剂的，协同摩尔比为1:5的afa和nin(afa/nin)共封装的peg化脂质体。
[0494]
在实验方法部分(体内疗效研究)提及了肿瘤细胞接种和肿瘤异种移植的建立。将小鼠组织成适当的治疗组，包括盐水对照组和药物治疗组，药物治疗组包括(1)游离afa，(2)afa-l，(3)nin-l，(4)afa/nin混合的游离药物混合物溶液(afa:nin摩尔比为1:5)，以及(5)afa/nin-l(afa:nin摩尔比为1:5)。根据每个个体小鼠的体重，每两天向小鼠静脉注射所需体积的样品，以向动物施用目标剂量(7.0mg/kg afa游离碱，38.9mg/kg nin游离碱)，共注射4周。随时间测量和监测肿瘤体积和小鼠体重。
[0495]
如图28a所示，总的来说，与在携带肿瘤的盐水对照组以及包括游离afa药物、afa-l单药疗法在内的其他药物治疗组中观察到的相比，共载脂质体(afa/nin-l)在治疗19天后明显抑制了肿瘤的生长。对于对照组、游离afa组和afa-l组，治疗19天后平均肿瘤大小(n＝6)急剧增加(》6倍)。这意味着游离的阿法替尼在这个特定的细胞系中没有任何抑制作用，
这可能是由于它对阿法替尼的抗性。对于游离的afa/nin组合混合物和nin-l组，治疗19天后，平均肿瘤大小分别增加了约95％和64％。相比之下，在相同的治疗时间内，afa/nin-l治疗组的平均肿瘤大小(n＝6)只增加了24％。
[0496]
此外，与对照相比，阿法替尼，作为单药疗法以及与尼达尼布联合使用的游离药物或脂质体形式，没有引起体重的明显下降(图28b)。因此，结果表明，所有药物治疗组都没有普遍的系统毒性。然而，与h1975 nsclc异种移植研究(实施例23)中描述的类似，观察到在经afa/nin游离药物混合物治疗的组中，小鼠尾部的注射部位肿胀和发红。相比之下，afa-l、nin-l和afa/nin-l没有对注射部位造成任何损害。因此，我们可以推断，脂质体制剂使小鼠免受与afa和nin有关的毒性影响。图28c显示了来自对照(未治疗)和所有药物治疗的小鼠的ht-29异种移植肿瘤块的解剖照片。在经afa/nin游离药物混合物、nin-l和afa/nin-l治疗的小鼠中观察到肿瘤大小明显缩小，观察到这种缩小的程度为afa/nin-l》nin-l》afa/nin游离药物混合物。相比之下，观察到未治疗的对照组、游离afa组和afa-l治疗组的肿瘤大小明显较大，并且这三组之间没有明显的肿瘤大小差异。这些结果表明，与其他药物制剂相比，afa/nin-l表现出明显改善的抗肿瘤活性。
[0497]
在不受理论束缚的情况下，afa/nin-l对肿瘤生长的这种抑制被认为是由于纳米化脂质体制剂的增强的通透性和滞留(epr)效应，它可以提高药物在肿瘤部位的递送特异性。因此，关于游离药物混合物和脂质体药物组合之间的疗效比较反映出当前脂质体制剂所实现的优越的生物分布可以导致更有效的肿瘤抑制。有趣的是，经afa游离药物和afa-l单药疗法治疗的小鼠的肿瘤生长速率与盐水对照组中观察到的相似，这意味着ht-29结直肠细胞系可能具有内在的阿法替尼耐药特性。另外，与nin-l或afa-l相比，afa/nin组合对肿瘤生长的抑制作用明显更强。该结果表明，从体外研究(实施例13)中发现的afa和nin之间的协同作用可以很好地转化为体内环境中的脂质体制剂。总的来说，上述结果表明，通过将afa和nin封装在脂质体中而固定afa与nin的协同摩尔比，可以极大地改善抗肿瘤活性。
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上述实施方案和实施例仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。可以有上面描述的那些的许多变化。由于对于本领域技术人员来说，基于本公开对上述实施方案和实施例进行的各种修改和改变是显而易见的，因此这种修改和改变在本发明的精神和范围内。本文引用的所有专利或非专利文献都是通过引用的方式整体并入本文，不承认它们是现有技术。

技术特征：
1.一种药物组合物，其包含脂质体、一种、两种或更多种蛋白激酶抑制剂和液体介质，其中所述脂质体包含水性内部核心和亲脂性外部双层膜，并且其中所述双层膜包含围住内部核心的内表面和与液体介质接触的外表面；其中一种、两种或更多种蛋白激酶抑制剂被封装在水性内部核心或疏水性脂质双层膜或两者中；并且其中封装在脂质体内部的两种或更多种蛋白激酶抑制剂可以从脂质体中释放，以协同模式发挥作用。2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂质双层膜包含：(a)至少10mol％的磷脂，所述磷脂选自磷脂酰胆碱(例如hspc、dspc、dppc、dmpc)、磷脂酰甘油(总脂质的0-70摩尔％，例如dspg)、磷脂酰肌醇、甘油糖脂、鞘糖脂(例如鞘磷脂)及其组合；(b)甾醇；和(c)任选地与聚乙二醇衍化的带电荷的磷脂(总脂质的0-10摩尔％，例如mpeg-2000-dspe)。3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述甾醇占总脂质，例如胆固醇，或其衍生物的约0-60摩尔％。4.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质双层膜的外表面包含带负电荷的脂质(例如dspg)或含有聚乙二醇的表面改性剂(例如mpeg-2000-dspe)，其中总脂质与总蛋白激酶抑制剂的摩尔比是至少相当的(≥1:1)。5.根据权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中两种激酶抑制剂的摩尔比在约60:1至约1:60的范围内，任选地约30:1至约1:30，或约10:1至约1:10。6.根据权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质体的平均粒径在4.5nm至450nm之间，任选地在25nm至300nm之间，或50nm至200nm之间。7.根据权利要求1至6中任一项所述的药物组合物，其中所述蛋白激酶抑制剂独立地选自阿卡替尼、阿贝西利、阿法替尼、阿柏西普、阿来替尼、阿瓦普利替尼、阿昔替尼、巴瑞替尼、布加替尼、比美替尼、博舒替尼、卡博替尼、卡马替尼、色瑞替尼、考比替尼、克唑替尼、达拉非尼、达克替尼、达沙替尼、康奈非尼、恩曲替尼、厄达替尼、厄洛替尼、依维莫司、菲卓替尼、福他替尼、吉非替尼、吉瑞替尼、依鲁替尼、埃克替尼、伊马替尼、拉帕替尼、拉罗替尼、乐伐替尼、劳拉替尼、米哚妥林、来那替尼、尼罗替尼、尼达尼布、奈妥舒迪、奥希替尼、帕克替尼、帕唑帕尼、培西达替尼、培米替尼、帕博西尼、帕纳替尼、培西达替尼、帕纳替尼、普拉替尼、奎扎替尼、瑞格菲尼、瑞博西尼、瑞派替尼、鲁索利替尼、塞尔帕替尼、司美替尼、索拉非尼、舒尼替尼、替西罗莫司、托法替尼、曲美替尼、图卡替尼、乌帕替尼、凡德他尼、维莫非尼、泽布替尼、阿柏西普及其组合。8.根据权利要求1至7中任一项所述的药物组合物，其中所述蛋白激酶抑制剂是以下：a)单独封装的阿法替尼或尼达尼布；b)共封装的阿法替尼和尼达尼布；c)单独封装的阿贝西利或舒尼替尼；d)共封装的阿贝西利和舒尼替尼；e)单独封装的达沙替尼或阿法替尼；f)共封装的达沙替尼和阿法替尼；g)单独封装的色瑞替尼或阿法替尼；h)共封装的色瑞替尼和阿法替尼；i)单独的奥希替尼或阿法替尼；j)共封装的奥希替尼和阿法替尼；
k)单独的奥希替尼或克唑替尼；l)共封装的奥希替尼和克唑替尼；m)单独封装的达沙替尼或色瑞替尼；n)共封装的达沙替尼和色瑞替尼；o)单独的阿法替尼或克唑替尼；p)共封装的阿法替尼和克唑替尼；q)约30:1至约1:30的摩尔比的阿法替尼和尼达尼布；r)约30:1至约1:30的摩尔比的阿贝西利和舒尼替尼；s)约30:1至约1:30的摩尔比的达沙替尼和阿法替尼；t)约30:1至约1:30的摩尔比的色瑞替尼和阿法替尼；u)约30:1至约1:30的摩尔比的奥希替尼和阿法替尼；v)约30:1至约1:30的摩尔比的奥希替尼和克唑替尼；w)约30:1至约1:30的摩尔比的色瑞替尼和达沙替尼；和x)约30:1至约1:30的摩尔比的阿法替尼和克唑替尼。9.根据权利要求1至8中任一项所述的药物组合物，其中脂质体分散液体介质包含水、缓冲剂(例如组氨酸、hepes或其他)和张力改性剂(例如蔗糖、氯化钠或其他)，以及任选地，控释赋形剂。10.根据权利要求1至9中任一项所述的药物组合物，其中所述液体介质的ph在约5-8的范围内。11.根据权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，其中脂质体中共封装的蛋白激酶抑制剂在施用后可被释放以协同模式发挥作用。12.根据权利要求1至11中任一项所述的药物组合物，其中两种或更多种共封装的蛋白激酶抑制剂的摩尔比使得，当在受影响细胞分数为约0.20至0.80(即约20％至80％)的浓度范围内在体外测定中向与癌症相关的癌细胞提供所述比时，在所述范围的至少20％上表现出协同作用。13.根据权利要求1至12中任一项所述的药物组合物，其中封装有两种或更多种蛋白激酶抑制剂的脂质体在体内施用后在血液中保持至少一小时的协同摩尔药物比。14.根据权利要求1至13中任一项所述的药物组合物，其中当蛋白激酶抑制剂被封装在水性内部核心中时，所述脂质体的内部隔室还包含捕获剂。15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述捕获剂选自硫酸铵、多阴离子化磺丁基醚环糊精的铵盐或取代的铵盐(例如tea-sbe-α-环糊精、tea-sbe-β-环糊精、tea-sbe-γ-环糊精、tris-sbe-α-环糊精、tris-sbe-β-环糊精和tris-sbe-γ-环糊精)；多阴离子化硫酸化碳水化合物的铵盐或取代的铵盐(例如tea-sos和tris-sos)；多磷酸盐的铵盐或取代的铵盐(例如肌醇六磷酸三乙胺和肌醇六磷酸三(羟甲基)氨基甲烷)；过渡金属盐(例如铜、锌、锰、镍、钴等与卤化物、硫酸和葡萄糖酸的盐)；季铵化合物(例如苯扎氯铵、苄索氯铵、西曲溴铵、硬脂基二甲基苄基氯化铵)、聚氧乙烯(即聚乙二醇)、椰油胺及其组合。16.一种制备封装有蛋白激酶抑制剂的脂质体的载药方法，所述蛋白激酶抑制剂仅位于脂质体的水性内部核心内，所述方法包括以下步骤：(a)在包含捕获剂的溶液中形成脂质分散体，所述捕获剂选自硫酸铵、多阴离子化磺丁
基醚环糊精的铵盐或取代的铵盐(例如tea-sbe-α-环糊精、tea-sbe-β-环糊精、tea-sbe-γ-环糊精、tris-sbe-α-环糊精、tris-sbe-β-环糊精和tris-sbe-γ-环糊精)；多阴离子化硫酸化碳水化合物的铵盐或取代的铵盐(例如tea-sos和tris-sos)；多磷酸盐的铵盐或取代的铵盐(例如肌醇六磷酸三乙胺和肌醇六磷酸三(羟甲基)氨基甲烷)；过渡金属盐(例如铜、锌、锰、镍、钴等与卤化物、硫酸和葡萄糖酸的盐)；季铵化合物(例如苯扎氯铵、苄索氯铵、西曲溴铵、硬脂基二甲基苄基氯化铵)、聚氧乙烯(即聚乙二醇)、椰油胺及其组合；(b)通过在高温下对脂质分散体进行挤压、超声处理或均质化来减小脂质体的粒径；(c)基本上去除脂质体外的捕获剂；(d)在高温下用包含一种、两种或更多种蛋白激酶抑制剂的溶液加热未负载的脂质体，从而形成载药脂质体；(e)将所述组合物的ph调整到约5-8；和(f)任选地，通过冷冻干燥形成产品的干燥形式。17.一种制备仅在脂质体的疏水性脂质双层膜内封装有蛋白激酶抑制剂的脂质体的载药方法，其包括以下步骤：(a)在有机溶剂中形成包含一种、两种或更多种蛋白激酶抑制剂的脂质溶液；(b)去除有机溶剂，并将脂质/药物混合物在水溶液中水合，以形成脂质体；(c)通过在高温下对脂质分散体进行挤压、超声处理或均质化来减少脂质体的粒径，以形成组合物；(d)将所述组合物的ph调整到约5-8；和(e)任选地，通过冷冻干燥形成产品的干燥形式。18.一种制备在脂质体的水性内部核心和脂质双层膜中都封装有蛋白激酶抑制剂的脂质体的方法，其包括以下步骤：(a)在有机溶剂中形成包含一种或多种蛋白激酶抑制剂的脂质溶液；(b)去除有机溶剂，并将脂质/药物混合物在含有捕获剂的溶液中水合以形成脂质体，其中所述捕获剂选自硫酸铵、多阴离子化磺丁基醚环糊精的铵盐或取代的铵盐(例如tea-sbe-α-环糊精、tea-sbe-β-环糊精、tea-sbe-γ-环糊精、tris-sbe-α-环糊精、tris-sbe-β-环糊精和tris-sbe-γ-环糊精)；多阴离子化硫酸化碳水化合物的铵盐或取代的铵盐(例如tea-sos和tris-sos)；多磷酸盐的铵盐或取代的铵盐(例如肌醇六磷酸三乙胺和肌醇六磷酸三(羟甲基)氨基甲烷)；过渡金属盐(例如铜、锌、锰、镍、钴等与卤化物、硫酸和葡萄糖酸的盐)；季铵化合物(例如苯扎氯铵、苄索氯铵、西曲溴铵、硬脂酰二甲基苄基氯化铵)、聚氧乙烯(即聚乙二醇)、椰油胺及其组合；(c)通过在高温下对脂质分散体进行挤压、超声处理或均质化来减少脂质体的粒径；(d)基本上去除脂质体外的捕获剂；(e)在高温下用包含至少一种蛋白激酶抑制剂的溶液加热上述脂质体分散体；(f)将所述组合物的ph调整到约5-8；和(g)任选地，通过冷冻干燥形成产品的干燥形式。19.一种治疗癌症的方法，其包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至15中任一项所述的药物组合物。20.根据权利要求19所述的方法，与以游离形式如片剂、胶囊、不含脂质体的传统简单
注射剂等施用激酶抑制剂相比，所述方法的药物副作用和耐药性降低。21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌、结直肠癌、肾细胞癌、乳腺癌、胃肠癌、肺癌、结直肠癌、尤文氏肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、甲状腺癌、子宫癌、胃肠道间质瘤或其他。22.一种治疗试剂盒，其包含容器和容器中的多个载药脂质体，其中所述载药脂质体悬浮在或可以悬浮在准备向需要治疗的受试者施用的无菌稀释液中，其中所述载药脂质体包含一种、两种或更多种激酶抑制剂，其中所述脂质体包含水性内部核心和亲脂性外部双层膜，所述双层膜包含围住内部核心的内表面和与液体介质接触的外表面；其中所述一种、两种或更多种蛋白激酶抑制剂被封装在水性内部核心或疏水性脂质双层膜或两者中；并且其中封装在脂质体内部的两种或更多种蛋白激酶抑制剂可以从脂质体中释放，以协同模式发挥作用。

技术总结
公开了脂质体药物组合物，其可以递送两种或更多种蛋白激酶抑制剂，以协同模式发挥治疗癌症的作用。封装在脂质体载体中的蛋白激酶抑制剂的组合有助于实现所需的药物保留、每个治疗性化合物的持续药物释放曲线和协同治疗效果。还公开了制备这些脂质体药物组合物的方法以及其用于治疗癌症的用途。以及其用于治疗癌症的用途。以及其用于治疗癌症的用途。


技术研发人员：刘芳 徐贤
受保护的技术使用者：纳米科技制药公司
技术研发日：2021.12.14
技术公布日：2023/8/24