融合蛋白增强细胞疗法的制作方法

融合蛋白增强细胞疗法
相关申请的交叉引用
1.本技术要求于2020年12月30日提交的美国临时申请no.63/132,057；2020年9月22日提交的美国临时申请no.63/081,675；2020年9月10日提交的美国临时申请no.63/076,707；以及于2020年8月28日提交的美国临时申请no.63/071,785的优先权，并将其全文引入参考。序列表信息
2.2021年7月26日或前后创建的名为“st25.txt”的计算机可读文本文件，文件大小约为333kb，包含本技术的序列列表，并在此通过引用整体并入。


背景技术：

3.t细胞疗法在癌症中具有良好的临床疗效，例如b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)，慢性淋巴细胞白血病(cll)和淋巴瘤。然而，对于实体瘤的治疗进展相对较慢。需要进一步修饰t细胞以治疗实体瘤。


技术实现要素：

4.实施方案涉及增强t细胞应答的方法，该方法包括将编码嵌合抗原受体(car)的多核苷酸和编码cd40胞外域的多核苷酸导入到t细胞中，获得修饰的t细胞；将修饰的t细胞与结合car的抗原和cd40激动剂接触，从而诱导t细胞应答，其中t细胞应答水平大于在不存在cd40激动剂情况下将修饰的t细胞与结合car的抗原接触而诱导的t细胞的应答水平。
5.实施方案涉及包含car的修饰细胞，所述car包含胞外域、跨膜域和胞内域，修饰细胞可以进一步包含干扰功能性的信号调节蛋白α(sirpα)和cd47之间相互作用的修饰的sirpα。在实施方案中，修饰的sirpα是显性失活形式的信号调节蛋白α(dn-sirpα)。在实施方案中，显性失活形式的信号调节蛋白α(dn-sirpα)是功能性sirpα缺乏其胞内结构域后所形成的信号调节蛋白α。
6.实施方案涉及包含car的修饰细胞，所述car包含胞外域、跨膜域和胞内域，和显性失活形式的siglec-10。
7.本发明内容不旨在标识所要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。
附图说明
8.参照附图描述具体实施方式。在不同附图中使用相同的参考数字表示类似或相同的项目。
9.图1是示例性car分子和融合蛋白的示意图。
10.图2显示car表达率和细胞表型。
11.图3显示了引入t细胞的各种载体的示意图。
12.图4显示了cd4阳性t细胞上cd137表达的流式细胞术分析结果。
13.图5显示了cd8阳性t细胞上cd137表达的流式细胞术分析结果。
14.图6显示了cd40在cd4阳性t细胞上过表达的流式细胞术分析结果。
15.图7显示cd8阳性t细胞上cd40过表达的流式细胞术分析结果。
16.图8显示cd40在cd4阳性t细胞上的过表达。
17.图9显示cd8阳性t细胞上cd40的过表达。
18.图10显示了与没有cd40l刺激的t细胞相比，在接受cd40l刺激后下调cd40表达的包括编码cd40的载体的t细胞的流式细胞术分析结果。
19.图11显示了cd40在接受cd40l刺激后下调pd-1表达的t细胞上过表达的流式细胞术分析结果。
20.图12显示了过表达共刺激分子的各种修饰细胞的实施方案。
21.图13显示了过表达共刺激分子的各种修饰细胞的实施方案。
22.图14显示了过表达共刺激分子的各种修饰细胞的实施方案。
23.图15显示了与宽型淋巴细胞相比具有较少由cd47诱导的免疫抑制的修饰淋巴细胞的实例的示意图。
24.图16显示了显示表达一种或多种治疗剂的修饰淋巴细胞的实例的示意图。
25.图17显示说明使用hre的免疫疗法的实施方案的示意图。
26.图18显示了靶向自身疾病(ad)相关t细胞的多特异性结合分子的示意性结构。
27.图19显示靶向ad相关b细胞的多特异性结合分子的示意性结构。
28.图20显示cldn18.2与gucy2c在晚期胃癌患者中的表达之间的关系。
29.图21显示晚期胃癌患者样品中cldn18.2和gucy2c的免疫化学染色。
30.图22显示晚期胃癌患者样品中cldn18.2和gucy2c的免疫化学染色。cldn18.2和gucy2c的染色是互补和重叠的。
31.图23显示包含双特异性(tan(串联))car分子的细胞膜的示例性部分的示意图。
32.图24显示了用于治疗癌症的混合t细胞的实施方案。
33.图25显示了用于治疗癌症的混合t细胞的实施方案。
34.图26显示了用于治疗癌症的多特异性结合分子(pbm)的一个实施方案。
35.图27显示了用于治疗癌症的多特异性结合分子(pbm)的实施方案。
36.图28显示了包含双特异性car分子的细胞膜的示例性部分的示意图。
37.图29显示了双特异性car的构建体和表达测定的结果。
38.图30显示表达双特异性car的t细胞释放ifnγ(ifng)。
39.图31显示表达双特异性car的t细胞和相应靶细胞的共培养测定的结果。
40.图32显示了双特异性car的构建体和表达测定的结果。
41.图33显示表达双特异性car的t细胞和相应靶细胞(肿瘤细胞)的共培养测定结果。
42.图34显示了双特异性car的构建体和表达测定的结果。
43.图35显示了在图35的测定中使用的双特异性car的表达测定的结果。34.
44.图36显示了与肿瘤细胞共培养的car t细胞的ifnγ(ifng)释放的结果。
45.图37显示了流式细胞术结果，描绘了用于共培养car t细胞和肿瘤细胞的cd137表达。
46.图38显示使用流式细胞术分析在car t细胞和tancar t(双特异性car t)细胞上
几种标志物(即，cd137、cd25和cd40l)的表达。表6提供了有关细胞的信息。
47.图39显示了car t细胞和tancar t细胞的细胞因子释放。
48.图40显示了car t细胞和tancar t细胞的细胞因子释放。
49.图41显示了car t细胞和tancar t细胞的细胞因子释放。
50.图42显示了在用相应的底物细胞刺激5天后每组中细胞的扩增。
51.图43显示了杀伤测定的结果。6917抑制mcf-7，6921抑制pc3-acpp。
52.图44显示了几种标志物(即，cd137和cd40l)在car t细胞和tancar t细胞上的表达；表6提供了有关细胞的信息。
53.图45显示了使用流式细胞术分析测量的car t细胞和tancar t细胞的细胞因子释放。
54.图46显示响应于底物细胞的各种car t细胞和tancar t细胞的细胞因子释放。
55.图47显示响应于底物细胞的各种car t细胞和tancar t细胞的细胞因子释放。
具体实施方式
56.除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管可以在本公开的实践或测试中使用与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料，但是描述了优选的方法和材料。出于本公开的目的，以下术语定义如下。
57.本文使用的冠词“一(a)”和“一个(an)”指的是一个或多于一个(即，指的是至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“元件”表示一个元件或多于一个元件。
[0058]“大约”是指质量，水平，值，数字，频率，百分比，尺寸，大小，数量，重量或长度的变化范围在参考的质量，水平，值，数字，频率，百分比，尺寸，大小，数量，重量或长度的20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％的范围内变化。
[0059]
如本文所用，术语“活化”是指已经充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的细胞的状态。活化还可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关联。术语“活化的t细胞”特别指正在进行细胞分裂的t细胞。
[0060]
术语“抗体”以最广泛的含义使用，指单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性或功能。本公开中的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体；单克隆抗体；fv、fab、fab'和f(ab')2片段；以及单链抗体和人源化抗体(harlow等，1999，在：使用抗体：实验室手册，冷泉港实验室出版社，纽约；harlow等，1989，在：抗体：实验室手册，冷spring harbor，纽约；houston等，1988，proc.natl.acad.sci.usa 85：5879-5883；bird等，1988，science 242：423-426)。
[0061]
术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，例如抗体的抗原结合区(域)或可变区。抗体片段的其他实例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；双体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0062]
术语“fv”是指包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由一个重链和一个轻链可变区紧密非共价结合的二聚体组成。这两个结构域的折叠产生了六个高变环(h链和l链各有3个环)，它们为抗原结合提供氨基酸残基，并赋予抗体抗原结合特异性。然
而，即使是单个可变域(或仅包含三个对抗原特异的互补决定区(cdr)的fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点(二聚体)。
[0063]
如本文所用，“抗体重链”是指以天然存在的构型存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中的较大者。如本文所用，“抗体轻链”是指以天然存在的构型存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中的较小者。κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
[0064]
术语“合成抗体”是指使用重组dna技术产生的抗体，例如由噬菌体表达的抗体。该术语还包括通过合成编码抗体的dna分子和表达dna分子以获得抗体或获得编码抗体的氨基酸而产生的抗体。合成dna是使用本领域已知的可用技术获得的。
[0065]
术语“抗原”是指激发免疫反应的分子，其可能涉及抗体产生或特定免疫活性细胞的活化，或两者。抗原包括任何大分子，包括源自重组或基因组dna的所有蛋白质或肽或分子。例如，包括编码蛋白质或肽的核苷酸序列或部分核苷酸序列的dna，该蛋白质或肽引发免疫反应，并因此编码本文所用术语“抗原”。抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。抗原可以从生物样品产生、合成或衍生，包括组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
[0066]
如本文所用，术语“抗肿瘤效应”是指与肿瘤体积减少、肿瘤细胞数量减少、转移数量减少、肿瘤细胞转移减少、肿瘤细胞增殖减少相关的生物学效应。在肿瘤细胞存活方面，具有肿瘤细胞的受试者的预期寿命增加，或与癌症状况相关的各种生理症状的改善。“抗肿瘤作用”还可以体现在肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防肿瘤发生的能力。
[0067]
术语“自身抗原”是指被免疫系统错误地识别为外源的内源性抗原。自身抗原包括细胞蛋白，磷蛋白，细胞表面蛋白，细胞脂质，核酸，糖蛋白，包括细胞表面受体。
[0068]
术语“自体”用于描述来自同一受试者的材料，稍后将其重新引入受试者。
[0069]
术语“同种异体”用于描述源自同一物种的不同受试者的移植物。例如，供体受试者可能与受体受试者相关或不相关，但供体受试者具有与受体受试者相似的免疫系统标记。
[0070]
术语“异种”用于描述源自不同物种的受试者的移植物。例如，供体受试者来自与受体受试者不同的物种，供体受试者和受体受试者可以在遗传上和免疫学上不相容。
[0071]
术语“癌症”用于指以异常细胞的快速和不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。各种癌症的实例包括乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，宫颈癌，皮肤癌，胰腺癌，结肠直肠癌，肾癌，肝癌，脑癌，淋巴瘤，白血病，肺癌等。
[0072]
在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“组成”，“包括”将被理解为包括陈述的单个步骤或单个元件或多个步骤或多个元件，但不排除其他任何步骤或元件。
[0073]
短语“由...组成”意味着包括并且限于在短语“由...组成”之后的任何事物。因此，短语“由...组成”表示列出的元素是必需的或强制性的，并且不存在其它元素可以存在。
[0074]
短语“基本上由
……
组成”是指包括在短语之后列出的任何要素，并且可以包括不干扰或不影响本公开中针对所列要素所指定的活动或动作的其他要素。因此，短语“基本上由
……
组成”表示所列出的要素是必需的或强制性的，但是那些其他要素是可选的并且可以存在或可以不存在，这取决于它们是否影响所列出的要素的活动或动作。
[0075]
术语“互补的”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即核苷酸序
列)。例如，序列“agt”与序列“tca”互补。互补性可以是“部分”，其中仅某些核酸碱基根据碱基配对规则进行匹配，或者可能存在核酸之间的“完全”或“全部”互补。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有重要影响。
[0076]
术语“对应”或“对应于”是指(a)具有与参考多核苷酸序列的全部或一部分基本上相同或互补或编码与氨基酸序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸在肽或蛋白质中；或(b)具有与参考肽或蛋白质中的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的肽或多肽。
[0077]
术语“共刺激配体”是指抗原呈递细胞(例如，apc，树突状细胞，b细胞等)上的分子，其与t细胞上的同源共刺激分子特异性结合，从而提供除了通过例如tcr/cd3复合物与载有肽的mhc分子结合提供的主要信号外，还介导t细胞反应的信号，包括至少一种增殖，活化，分化和其他细胞反应。共刺激配体可以包括b7-1(cd80)，b7-2(cd86)，pd-l1，pd-l2、4-1bbl，ox40l，诱导型共刺激配体(icos-l)，细胞间粘附分子(icam)，cd30l，cd40，cd70，cd83，hla-g，mica，micb，hvem，淋巴毒素β受体，3/tr6，ilt3，ilt4，hvem，cd7的配体，与toll配体受体结合的激动剂或抗体，与b7-h3特异性结合的配体。共刺激配体还特别包括与存在于t细胞上的共刺激分子如cd27，cd28、4-1bb，ox40，cd30，cd40，pd-1，icos，淋巴细胞功能相关抗原1(lfa-1)，cd2，cd7，light，nkg2c，b7-h3特异性结合的激动剂或抗体，以及与cd83特异性结合的配体。
[0078]
术语“共刺激分子”是指t细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，由此介导t细胞的共刺激反应，例如增殖。共刺激分子包括mhc i类分子，btla和toll样受体。
[0079]
术语“共刺激信号”是指信号，其与主要信号(例如tcr/cd3连接)组合导致t细胞增殖和/或关键分子的上调或下调。
[0080]
术语“疾病”和“病症”可以互换使用，也可以不同，因为特定的疾病或病症可能没有已知的致病因素(因此病因尚未确定)，因此尚未得到认可作为一种疾病，但只是作为一种不受欢迎的病症或综合征，其中临床医生或多或少地确定了一组特定的症状。术语“病症”是受试者的健康状态，其中受试者不能维持体内平衡并且其中如果疾病没有改善，则受试者的健康继续恶化。相比之下，受试者的“疾病”是一种健康状态，其中动物能够维持体内平衡，但动物的健康状态不如没有疾病时的健康状态。如果不加以治疗，疾病不一定会导致动物健康状况进一步下降。
[0081]
术语“有效”是指足以实现期望的，预期的或预期的结果。例如，治疗中的“有效量”可以是足以产生治疗或预防益处的化合物的量。
[0082]
术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因，cdna或mrna，以用作模板，用于在生物学过程中合成具有特定结构的其他聚合物和大分子。核苷酸序列(即rrna，trna和mrna)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性。因此，如果对应于该基因的mrna的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生该蛋白质，则该基因编码蛋白质。核苷酸序列与mrna序列相同的编码链(除了用“u”代替“t”以外)通常都在序列表中提供，非编码链均用作模板用于基因或cdna转录的“蛋白质”可以称为编码该基因或cdna的蛋白质或其他产物。
[0083]
术语“外源的”是指不是天然存在于野生型细胞或生物体中但通常通过分子生物学技术引入细胞的分子。外源多核苷酸的实例包括编码所需蛋白质的载体、质粒和/或人造
核酸构建体。关于多核苷酸和蛋白质，术语“内源的”或“天然的”是指可以在给定的野生型细胞或生物体中发现的天然存在的多核苷酸或氨基酸序列。此外，从第一种生物体分离并通过分子生物学技术转移到第二种生物体的特定多核苷酸序列通常被认为是关于第二种生物体的“外源”多核苷酸或氨基酸序列。在特定的实施方案中，多核苷酸序列可以通过分子生物学技术“引入”到已经含有这种多核苷酸序列的微生物中，例如，以产生一个或多个另外的天然存在的多核苷酸序列的拷贝，从而促进编码的多肽。
[0084]
术语“表达”是指由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
[0085]
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制(调控)序列。表达载体包括足够的顺式作用元件用于表达。其他表达元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有载体，例如粘粒，质粒(例如裸露或包含在脂质体中)和掺入重组多核苷酸的病毒(例如慢病毒，逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒)。
[0086]
术语“同源”是指当两个比较序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，两个多肽之间或两个多核苷酸之间的序列相似性或序列同一性，例如，如果两个多肽中的每一个中的一个位置dna分子被腺嘌呤占据，那么这些分子在那个位置是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共享的匹配或同源位置数除以与100相比的位置数的函数。例如，如果两个序列中10个位置中有6个匹配或同源，那么这两个序列有60％的同源性。例如，dna序列attgcc和tatggc具有50％的同源性。当两个序列比对以获得最大同源性时进行比较。
[0087]
术语“免疫球蛋白”或“ig”是指充当抗体的一类蛋白质。此类蛋白质中包含的五个成员是iga，igg，igm，igd和ige。iga是存在于身体分泌物中的一抗，例如唾液，眼泪，母乳，胃肠道分泌物以及呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌。igg是最常见的循环抗体。igm是大多数受试者在初次免疫反应中产生的主要免疫球蛋白，它是凝集，补体固定和其他抗体反应中最有效的免疫球蛋白，对于防御细菌和病毒很重要。igd是没有已知抗体功能但可以充当抗原受体的免疫球蛋白。ige是一种免疫球蛋白，通过暴露于变应原引起肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介体，从而介导立即超敏反应。
[0088]
术语“分离的”是指基本上或基本上不含在其天然状态下通常伴随的组分的材料。该材料可以是细胞或大分子，例如蛋白质或核酸。例如，如本文所用，“分离的多核苷酸”是指多核苷酸，其已从天然存在状态下其侧翼的序列中纯化，例如已从通常dna片段去除相邻的序列中得到片得段。或者，如本文所用，“分离的肽”或“分离的多肽”等是指肽或多肽分子从其天然细胞环境和与细胞的其他组分的结合体外分离和/或纯化。
[0089]
术语“基本上纯化的”是指基本上不含通常与其天然状态相关的组分的物质。例如，基本上纯化的细胞是指已经与其通常以其天然存在或天然状态相关联的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同源的细胞群。在其他情况下，该术语仅指已经与天然状态下天然相关的细胞分离的细胞。在实施方案中，细胞在体外培养。在实施方案中，细胞不在体外培养。
[0090]
在本公开的上下文中，使用下列普遍存在的核酸碱基的缩写。“a”指的是腺苷，“c”指的是胞嘧啶，“g”指的是鸟苷，“t”指的是胸苷，以及“u”指的是尿苷。
[0091]
除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此简并形式并编码相同氨
基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质的核苷酸或rna序列也可以包括内含子，其程度使得编码蛋白质的核苷酸序列在一些版本中可以包含一个或多个内含子。
[0092]
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独一无二的，它能够感染非分裂细胞；它们可以将大量遗传信息传递到宿主细胞的dna中，因此它们是最有效的基因传递载体方法之一。此外，慢病毒的使用能够将遗传信息整合到宿主染色体中，从而稳定转导遗传信息。hiv、siv和fiv都是慢病毒的例子。源自慢病毒的载体提供了在体内实现显着水平的基因转移的手段。
[0093]
术语“调节”是指与没有治疗相比，受试者的应答水平或应答时产生的化合物可检测地增加或减少。在其他相同但未经治疗的受试者中该术语包括干扰和/或影响天然信号或反应，从而在受试者，尤其是人类中介导有益的治疗反应。
[0094]
当核酸被置于与另一种核酸的功能关系中时，核酸被“有效连接”。例如，如果前序列或分泌前导序列的dna表达为参与多肽分泌的前蛋白，则它与多肽的dna可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列可操作地连接，或者如果核糖体结合位点的位置便于翻译，则其与编码序列可操作地连接。
[0095]
术语“在转录控制下”是指与多核苷酸可操作地连接并且在与多核苷酸相关的正确位置和方向上的启动子，以控制(调节)rna聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。
[0096]
术语“过表达”的肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”意在表示来自患者特定组织或器官内的诸如实体瘤的疾病区域的细胞中肿瘤抗原的异常表达水平，达到该组织或器官在正常细胞中的表达水平。可以通过本领域已知的标准测定来确定具有以肿瘤抗原的过表达为特征的实体瘤或血液系统恶性肿瘤的患者。
[0097]
实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(例如肉瘤，癌和淋巴瘤)。实体瘤如肉瘤和癌的实例包括纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤文氏瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，淋巴恶性肿瘤，胰腺癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，肝细胞癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，甲状腺髓样癌，乳头状甲状腺癌，嗜铬细胞瘤皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝细胞癌，胆管癌，绒毛膜癌，肾母细胞瘤，宫颈癌，睾丸肿瘤，精原细胞瘤，膀胱癌，黑色素瘤和中枢神经系统肿瘤(如脑胶质瘤(如脑干胶质瘤和混合胶质瘤)，胶质母细胞瘤(又称多形性胶质母细胞瘤))，星形细胞瘤，中枢神经系统淋巴瘤，生殖细胞瘤，成神经管细胞瘤，神经鞘瘤opharyogioma，室管膜瘤，松果体，血管母细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，menangioma，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤和脑转移瘤。
[0098]
实体瘤抗原是在实体瘤上表达的抗原。在实施方案中，实体瘤抗原也在健康组织上以低水平表达。表1中提供了实体瘤抗原及其相关疾病肿瘤的实例。表1
[0099]
术语“肠胃外给药”包括例如皮下(sc)、静脉内(iv)、肌肉内(im)、胸骨内注射或输注技术。
[0100]
术语“患者”、“受试者”和“个体”等在本文中可互换使用，是指任何人或动物，适用
于本文所述的方法。在实施方案中，患者、受试者或个体是人或动物。在实施方案中，术语“受试者”旨在包括其中可以引发免疫反应的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人和动物，例如狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。
[0101]
需要治疗或有此需要的受试者包括患有需要治疗的疾病，病症或紊乱的受试者。有此需要的受试者还包括需要治疗以预防疾病，病症或紊乱的受试者。
[0102]
术语“多核苷酸”或“核酸”是指mrna，rna，crna，rrna，cdna或dna。该术语通常是指长度至少为10个碱基的核苷酸的聚合形式，即核糖核苷酸或脱氧核苷酸，或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括所有形式的核酸，包括单链和双链形式的核酸。
[0103]
术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指与参考多核苷酸序列显示基本序列同一性的多核苷酸或在下文定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语还涵盖通过添加，缺失或取代至少一个核苷酸而与参考多核苷酸区分开的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中一个或多个核苷酸已被添加或缺失或被不同核苷酸取代的多核苷酸。就这一点而言，本领域众所周知，可以对参考多核苷酸进行某些改变，包括突变，添加，缺失和取代，从而改变后的多核苷酸保留了参考多核苷酸的生物学功能或活性或具有增加的活性。与参考多核苷酸的关系(即优化的)。多核苷酸变体包括，例如，与参考多核苷酸序列具有至少50％(和至少51％至至少99％以及在例如90％，95％或98％之间的所有整数百分比)序列同一性的多核苷酸。本文所述的术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然存在的等位基因变体和直系同源物。
[0104]
术语“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，例如相应天然存在的氨基酸的化学类似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。在实施例中，多肽可包括酶促多肽或“酶”，其通常催化(即，增加速率)各种化学反应。
[0105]
术语“多肽变体”是指通过添加，缺失或取代至少一个氨基酸残基而与参考多肽序列区分开的多肽。在实施方案中，多肽变体通过一个或多个取代而与参考多肽区别开，所述取代可以是保守的或非保守的。在实施方案中，多肽变体包含保守取代，并且就这一点而言，在本领域中众所周知，可以将一些氨基酸改变为具有广泛相似性质的其他氨基酸而不改变多肽活性的性质。多肽变体还涵盖其中一个或多个氨基酸以添加或缺失，或被不同氨基酸残基取代的多肽。
[0106]
术语“启动子”是指被细胞的合成机器识别或被引入的启动多核苷酸序列特异性转录所需的合成机器的dna序列。术语“表达控制(调节)序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的dna序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
[0107]
术语“结合”、“结合”或“与
……
相互作用”是指分子识别并粘附到样品或生物体中的第二分子，但基本上不识别或粘附到样品中的其他结构不相关的分子。如本文所用的关于抗体的术语“特异性结合”是指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一种物种的抗原的抗体也可以结合来自一种或多种物种的抗原。但是，这种跨物种反应性本身不会改变抗体的特异性分类。在另一个例子中，特异性
结合抗原的抗体也可以结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应本身不会改变抗体的特异性分类。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性结合”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，以表示相互作用取决于以下物质的存在：化学物种的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构而不是任何蛋白质。如果抗体对表位“a”具有特异性，存在含有表位a(或游离的、未标记的a)的分子，抗体会与含有表位a(或游离的、未标记的a)的分子反应，减少与抗体结合的表位a的数量.
[0108]“统计上显著”是指结果不太可能是偶然发生的。统计显著性可以通过本领域已知的任何方法确定。常用的显着性度量包括p值，它是在原假设为真时观察到的事件发生的频率或概率。如果获得的p值小于显著性水平，则拒绝原假设。在简单的情况下，显著性水平定义为0.05或更小的p值。“降低的”或“减少的”或“较小的”量通常是“统计上显著的”或生理上显著的量并且可以包括约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50倍或更多倍(例如，100、500、1000倍)(包括所有1之间和之上的整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)于描述的数量或水平。
[0109]
术语“刺激”是指由刺激分子(例如tcr/cd3复合物)与其同源配体结合而诱导的初级应答，由此介导信号转导事件，例如经由tcr/cd3复合物的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达，例如tgf-β的下调和/或细胞骨架结构的重组。
[0110]
术语“刺激性分子”是指t细胞上与存在于抗原呈递细胞上的同源刺激性配体特异性结合的分子。例如，源自刺激分子的功能性信号传导域是与t细胞受体复合物相关的ζ链。刺激分子包括负责信号转导的结构域。
[0111]
术语“刺激性配体”是指当存在于抗原呈递细胞(例如，apc，树突状细胞，b细胞等)上时可以与同源结合伴侣(称为“刺激性分子”)特异性结合的配体。在本文中称为“刺激性分子”在细胞例如t细胞上，从而介导t细胞的初级应答，包括活化，免疫应答的起始，增殖和类似过程。刺激性配体在本领域中是众所周知的，并且尤其包括装载有肽，抗cd3抗体，超激动剂抗cd28抗体和超激动剂抗cd2抗体的mhc i类分子。
[0112]
术语“治疗的”是指治疗和/或预防。通过抑制，减轻或消除疾病状态或减轻疾病状态的症状可获得治疗效果。
[0113]
术语“治疗有效量”是指将引起研究人员、兽医、医生或其他临床医生正在寻找的组织、系统或受试者的生物学或医学反应的主题化合物的量。术语“治疗有效量”包括化合物的量，该量在施用时足以预防所治疗的病症或疾病的一种或多种体征或症状的发展或在一定程度上减轻一种或多种体征或症状。治疗有效量将根据化合物、疾病及其严重程度以及待治疗受试者的年龄、体重等而变化。
[0114]
术语“治疗疾病”是指降低受试者经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重程度。
[0115]
术语“转染”或“转化”或“转导”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是用外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原始受试者细胞及其后代。
[0116]
术语“载体”是指包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的多核苷酸。许多载体是本领域已知的，包括线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还包括促进核酸转
移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的例子包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。例如，慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还包含其他具有调节或结构功能的基因。慢病毒载体是本领域众所周知的。慢病毒的一些例子包括人类免疫缺陷病毒：hiv-1、hiv-2和猿猴免疫缺陷病毒：siv。慢病毒载体是通过多重减毒hiv毒力基因产生的，例如删除env、vif、vpr、vpu和nef基因，使载体具有生物学安全性。
[0117]
范围：在整个本公开中，本公开的各个方面可以以范围格式给出。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对本公开的范围的硬性限制。因此，范围的描述应被认为具有具体公开的所有可能的子范围以及处于那个范围内的单个数值。例如，范围的描述诸如从1至6应被认为具有具体公开的子范围诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及那个范围内的单个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，这一点都是适用的。
[0118]“嵌合抗原受体”(car)分子是至少包括细胞外结构域，跨膜结构域和细胞质结构域或细胞内结构域的重组多肽。在实施方案中，car的结构域在相同的多肽链上，例如，嵌合融合蛋白。在实施方案中，结构域在不同的多肽链上，例如，结构域不连续。
[0119]
car分子的胞外域包括抗原结合域。抗原结合域用于扩增和/或维持修饰的细胞，例如car t细胞，或用于杀死肿瘤细胞，例如实体瘤。在实施方案中，用于扩增和/或维持修饰的细胞的抗原结合结构域结合wbc表面上的抗原，例如细胞表面分子或标志物。在实施方案中，wbc是粒细胞、单核细胞和/或淋巴细胞。在实施方案中，wbc是淋巴细胞，例如b细胞。在实施例中，wbc是b细胞。在实施方案中，b细胞的细胞表面分子包括cd19、cd22、cd20、bcma、cd5、cd7、cd2、cd16、cd56、cd30、cd14、cd68、cd11b、cd18、cd169、cd1c、cd33、cd38、cd138或cd13。在实施方案中，b细胞的细胞表面分子是cd19、cd20、cd22或bcma。在实施方案中，b细胞的细胞表面分子是cd19。
[0120]
在实施方案中，用于杀死肿瘤的抗原结合结构域结合肿瘤表面上的抗原，例如，肿瘤抗原或肿瘤标志物。肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白质，可引发免疫反应，尤其是t细胞介导的免疫反应。肿瘤抗原是本领域众所周知的，包括例如肿瘤相关muc1(tmuc1)、神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(cea)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(afp)、凝集素反应性afp、甲状腺球蛋白、rage-1、mn-ca ix、人端粒酶逆转录酶、ru1、ru2(as)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、m-csf、前列腺酶、前列腺特异性抗原(psa)、pap、ny-eso-1、lage-1a、p53、前列腺素、psma、her2/neu、存活、端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(pcta-1)、mage、elf2m、中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinb2、cd22、胰岛素生长因子(igf)-i、igf-ii、igf-i受体、cd19和间皮素。例如，当肿瘤抗原为cd19时，其car可称为cd19 car，即包含与cd19结合的抗原结合域的car分子。
[0121]
在实施方案中，car的胞外抗原结合域包括至少一种scfv或至少一种单域抗体。例如，一个car上可以有两个scfv。scfv包括通过柔性接头连接的靶抗原特异性单克隆抗体的轻链可变(vl)区和重链可变(vh)区。可以通过使用短连接肽连接轻链和/或重链可变区来制备单链可变区片段(bird等，science 242：423-426，1988)。连接肽的实例是具有氨基酸序列的gs接头，其在一个可变区的羧基末端和另一可变区的氨基末端之间桥接约3.5nm。已经设计并使用了其他序列的接头(bird等，1988，同上)。通常，接头可以是短的、柔性的多肽
并且优选地由约20个或更少的氨基酸残基组成。单链变体可以重组或合成产生。对于scfv的合成生产，可以使用自动合成仪。对于scfv的重组生产，可以将含有编码scfv的多核苷酸的合适的质粒引入合适的宿主细胞中，所述宿主细胞可以是真核细胞，例如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞，也可以是原核细胞，例如大肠杆菌。编码目的scfv的多核苷酸可以通过常规操作例如多核苷酸的连接来制备。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离得到的scfv。
[0122]
本文描述的car分子的细胞质结构域包括一个或多个共刺激结构域和一个或多个信号结构域。共刺激和信号传导结构域用于响应抗原结合而传递信号并激活分子，例如t细胞。一个或多个共刺激结构域衍生自刺激分子和/或共刺激分子，并且信号结构域衍生自主要信号传导结构域，例如cd3ζ结构域。在实施方案中，信号传导结构域还包括衍生自共刺激分子的一个或多个功能信号传导结构域。在实施方案中，共刺激分子是激活对抗原的细胞应答所需的细胞表面分子(抗原受体或其配体除外)。
[0123]
在实施方案中，共刺激结构域包括cd27，cd28，4-1bb，ox40，cd30，cd40，pd-1，icos，淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)，cd2，cd7的细胞内结构域，light，nkg2c，b7-h3，与cd83特异性结合的配体，或其任何组合。在实施方案中，信号传导结构域包括衍生自t细胞受体的cd3ζ结构域。
[0124]
本文描述的car分子还包括跨膜结构域。在car分子中掺入跨膜结构域使分子稳定。在实施方案中，car分子的跨膜结构域是cd28或4-1bb分子的跨膜结构域。
[0125]
在细胞外结构域和car的跨膜结构域之间，可以掺入间隔结构域。如本文所用，术语“间隔结构域”通常是指用于将跨膜结构域连接至多肽链上的细胞外结构域和/或细胞质结构域的任何寡聚体或多肽。间隔结构域可包括至多300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，最优选25至50个氨基酸。
[0126]
如本文所用，“激动剂抗体”是激活其结合的抗原的生物活性的抗体。在实施方案中，在激动剂抗体激活期间，抗体的部分解离允许单个抗体的抗原结合片段(fab)臂以动态方式与两个以上的受体相互作用，导致多个受体单体募集到受体寡聚体中，其中可以触发信号激活。在实施方案中，抗原呈递细胞(apc)充当支架以交联与受体(例如共刺激受体)结合的激动剂抗体，导致受体超簇形成和激动剂信号传导增加。一些蛋白质(如cd28家族和tnf受体家族)具有用于肿瘤治疗的激动剂抗体。关于激动剂抗体和共刺激分子的更多信息可以在nature reviews drug discovery第17卷，第509-527页(2018年)中找到，其全文并入本文。
[0127]
实施方案涉及可被这些激动剂抗体激活以执行特定所需功能的融合蛋白。在过表达的融合蛋白中，胞外域是可以被激动剂抗体结合的蛋白质序列(即针对该抗体的抗原的胞外域)，胞内是另一种跨膜蛋白的胞内域。使用激动剂抗体时，融合蛋白的胞外域是交联的(因为激动剂抗体通常会将它们交联)，融合蛋白的胞内域形成一个簇，激活下游途径。在实施方案中，胞外域的实例包括ox40、cd40、4-1bb、her2、gitr、icos、egfr、cd27、cd28、crcx4、il-10r、il-12r、il-18r1、il-23r、gp130或il-15ra的胞外域。例如，plerixafor，又名amd3100，是cxcr4的可逆拮抗剂，可以中断cxcr4与sdf-1的结合，从而使hsc释放到外周血中。在实施方案中，跨膜结构域可包含notch结构域，且胞内结构域可包含转录因子或线粒体蛋白。一旦通过激动剂抗体或notch诱导，这些转录因子和/或线粒体蛋白就可以发挥
其功能。
[0128]
实施方案涉及编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含氨基酸seq id no：8、18、19、20、21、22、23或24。实施方案涉及包含多核苷酸的修饰细胞。在实施方案中，修饰的细胞是淋巴细胞，例如t细胞、nk细胞、巨噬细胞或树突细胞。在实施方案中，修饰的细胞包含car或修饰的tcr。
[0129]
实施方案涉及编码包含氨基酸seq id no：14、15、16或17的修饰蛋白的多核苷酸。实施方案涉及包含多核苷酸和/或显性失活形式的siglec-10的修饰细胞。在实施方案中，修饰的细胞是淋巴细胞，例如t或nk细胞。在实施方案中，修饰的细胞包含car或修饰的tcr。关于蛋白质显性失活形式的更多信息可以在pct公开号：wo2020086989中找到，其全文并入本文。
[0130]
实施方案涉及编码包含氨基酸seq id no：10或12的修饰蛋白质的多核苷酸。实施方案涉及包含多核苷酸和/或显性失活形式的sirpα的修饰细胞。在实施方案中，修饰的细胞是淋巴细胞，例如t或nk细胞。在实施方案中，修饰的细胞包含car或修饰的tcr。
[0131]
实施方案涉及增强t细胞应答的方法，该方法包括：将编码嵌合抗原受体(car)的多核苷酸和编码cd40胞外域的多核苷酸引入t细胞以获得修饰的t细胞；将修饰的t细胞与结合car的抗原和cd40激活剂接触，从而诱导t细胞应答，其中t细胞应答的水平大于不存在cd40激活剂情况下将修饰的t细胞与结合car的抗原接触而诱导的t细胞应答的水平。
[0132]
据报道，cd40激活促进肿瘤细胞凋亡和免疫反应的刺激，如cd40在癌细胞系上的存在可能表明它参与产生肿瘤特异性t细胞应答，有助于抑制肿瘤细胞生长或杀死肿瘤细胞。cd40激活由cd40激活剂介导，例如cd40配体(cd40l)和cd40抗体。cd40l，也称为cd154，是cd40的天然配体。cd40和cd40l的相互作用是t细胞与apc细胞相互作用的主要组成部分。cd40抗体已被证明可以模拟信号cd40l。
[0133]
实施方案涉及一种减少在car-t细胞上表达pd-1的方法，该方法包括：将编码car的多核苷酸和编码cd40胞外域的多核苷酸引入t细胞中以获得修饰的t细胞；将修饰的t细胞与结合car的抗原和cd40激活剂接触，从而诱导pd-1表达，其中pd-1的表达水平低于在不含cd40激活剂情况下将修饰的t细胞与结合car的抗原接触时pd-1的表达水平。
[0134]
实施方案涉及维持和/或延长幼稚t细胞状态的方法，该方法包括：将编码car的多核苷酸和编码cd40胞外域的多核苷酸引入t细胞以获得修饰的t细胞；将修饰的t细胞与结合car的抗原和cd40激活剂接触，从而诱导从幼稚t细胞向效应t细胞的分化，其中分化水平低于在不含cd40激活剂情况下将修饰的t细胞与结合car的抗原接触时的分化水平。
[0135]
实施方案涉及包含编码car的多核苷酸和编码cd40胞外域的多核苷酸的修饰的t细胞的t细胞群。
[0136]
实施方案涉及增强t细胞应答的方法，该方法包括：将编码tcr的多核苷酸和编码cd40胞外域的多核苷酸引入t细胞以获得修饰的t细胞；将修饰的t细胞与tcr结合的抗原和cd40激活剂接触，从而诱导t细胞应答，其中t细胞应答的水平大于不存在cd40激活剂情况下将修饰的t细胞与结合car的抗原接触而诱导的t细胞应答的水平。
[0137]
实施方案涉及一种减少t细胞上表达的pd-1的方法，该方法包括：将编码tcr的多核苷酸和编码cd40胞外域的多核苷酸引入t细胞中以获得修饰的t细胞；将修饰的t细胞与tcr结合的抗原和cd40激活剂接触，从而诱导pd-1表达，其中pd-1的表达水平低于在不含
cd40激活剂情况下将修饰的t细胞与与抗原接触时pd-1的表达水平。
[0138]
实施方案涉及维持和/或延长幼稚t细胞状态的方法，该方法包括：将编码tcr的多核苷酸和编码cd40胞外域的多核苷酸引入t细胞以获得修饰的t细胞；将修饰的t细胞与tcr结合的抗原和cd40激活剂接触，从而诱导从幼稚t细胞向效应t细胞的分化，其中分化水平低于在不含cd40激活剂情况下将修饰的t细胞与结合car的抗原接触时的分化水平。
[0139]
实施方案涉及包含编码tcr的多核苷酸和编码cd40胞外域的多核苷酸的修饰的t细胞的t细胞群。
[0140]
在实施方案中，修饰的细胞包括修饰的t细胞受体(tcr)。在实施方案中，tcr源自患者中自发发生的肿瘤特异性t细胞。在实施方案中，tcr结合肿瘤抗原。在实施方案中，肿瘤抗原包括cea、gp100、mart-1、p53、mage-a3或ny-eso-1。在实施方案中，tcr包括tcrγ和tcrδ链、tcrα和tcrβ链，或其组合。在实施方案中，修饰的细胞源自肿瘤浸润淋巴细胞(til)。
[0141]
在实施方案中，cd40激活剂是cd40配体或cd40激动剂。在实施方案中，编码cd40胞外域的多核苷酸包含seq id no:7。
[0142]
在实施方案中，t细胞应答包括t细胞扩增和/或t细胞活化。
[0143]
在实施方案中，car包含抗原结合域、跨膜域和细胞内信号域。在实施方案中，抗原结合域结合选自由以下肿瘤抗原：tshr、cd19、cd123、cd22、cd30、cd171、cs-1、cll-1、cd33、egfrviii、gd2、gd3、bcma、tn ag、psma、ror1、flt3、fap、tag72、cd38、cd44v6、cea、epcam、b7h3、kit、il-13ra2、间皮素、il-11ra、psca、prss21、vegfr2、lewisy、cd24、pdgfr-beta、ssea-4、cd20、叶酸受体α、erbb2(her2/neu)、muc1、egfr、ncam、prostase、pap、elf2m、ephrin b2、igf-i受体、caix、lmp2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、epha2、fucosyl gm1、sle、gm3、tgs5、hmwmaa、o-乙酰基-gd2、叶酸受体β、tem1/cd248、tem7r、cldn6、gprc5d、cxorf61、cd97、cd179a、alk、聚唾液酸、plac1、globoh、ny-br-upk2、havcr1、adrb3、panx3、gpr20、ly6k、or51e2、tarp、wt1、ny-eso-1、lage-1a、mage-a1、legumain、hpv e6、e7、mage a1、etv6-aml、精子蛋白17、xage1、tie 2、mad-ct-1、mad-ct-2、fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺素、存活蛋白和端粒酶、pcta-1/半乳糖凝集素8、melana/mart1、ras突变体、htert、肉瘤转移断点、ml-iap、erg(tmprss2 ets融合基因)、na17、pax3、雄激素受体、细胞周期蛋白b1、mycn、rhoc、trp-2、cyp1b1、boris、sart3、pax5、oy-tes1、lck、akap-4、ssx2、rage-1、人端粒酶逆转录酶、ru1、ru2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、cd79a、cd79b、cd72、lair1、fcar、lilra2、cd300lf、clec12a、bst2、emrpc、ly75、grl、和igll1。
[0144]
在实施方案中，细胞内信号传导域包含共刺激信号传导域，或初级信号传导域和共刺激信号传导域，其中共刺激信号传导域包含选自由以下组成的组的蛋白质的功能性信号传导域：cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、cd83、cds、icam-1、gitr、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、cd160、cd19、cd4、cd8alpha、cd8beta、il-2r beta、il-2r gamma、il-7r特异性结合α、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgad、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、
cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、sellpg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、nkp44、nkp30、nkp46和nkg2d。
[0145]
在实施方案中，修饰的细胞包括编码氨基酸seq id:10、12或14-17之一的多核苷酸。
[0146]
在实施方案中，多核苷酸是未整合到修饰细胞的基因组中的mrna。在实施方案中，多核苷酸与氧敏感多肽结构域相关联。在实施方案中，氧敏感多肽域包含hif1a vhl结合域。
[0147]
在实施方案中，多核苷酸由包含转录调节剂的结合位点的启动子调节，所述转录调节剂调节细胞中治疗剂的表达和/或分泌。在实施方案中，转录调节剂是或包括hifla、nfat、foxp3和/或nfkb。
[0148]
在实施方案中，修饰的细胞包含编码显性失活形式的抑制性免疫检查点分子或其受体的多核苷酸。在实施方案中，抑制性免疫检查点分子选自由以下组成的组：程序性死亡1(pd-1)、细胞毒性t淋巴细胞抗原-4(ctla-4)、b-和t-淋巴细胞衰减剂(btla)、t细胞免疫球蛋白组成的组粘蛋白-3(tim-3)、淋巴细胞激活蛋白3(lag-3)、具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体(tigit)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(lair1)、自然杀伤细胞受体2b4(2b4)和cd160。
[0149]
在实施方案中，经修饰的细胞具有降低的内源trac基因表达。在实施方案中，修饰的细胞包括编码htert的核酸或编码sv40lt的核酸，或其组合。
[0150]
在实施方案中，修饰的细胞包含编码治疗剂的外源多核苷酸，并且治疗剂包含il-1p、il-2、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-10、il-12、il-13、il-15、il-17、il-1ra、il-2r、ifnγ、mip-ln、mip-ip、mcp-1、tnfα、gm-csf、gcsf、cxcl9、cxcl10、cxcr因子、vegf、rantes、eotaxin、egf、hgf、fgf-p和铁蛋白中的至少一种。在实施方案中，治疗剂包含il-6、il-12、il-7和ifnγ中的至少一种。
[0151]
cd47(分化簇47)，也称为整联蛋白相关蛋白(iap)，是一种跨膜蛋白，在人类中由cd47基因编码。cd47属于免疫球蛋白超家族，与膜整合素结合，还结合配体血小板反应蛋白-1(tsp-1)和信号调节蛋白α(sirpα)。cd47与sirpα相互作用，sirpα是一种存在于骨髓细胞上的抑制性跨膜受体。cd47/sirpα相互作用导致双向信号传导，导致不同的细胞间反应，包括抑制吞噬作用、刺激细胞间融合和t细胞活化。据报道，如果正确激活和重定向，巨噬细胞有可能在这种情况下成为强大的细胞免疫治疗剂。因此，需要开发使用t细胞以外的淋巴细胞同时减少与这些淋巴细胞(例如单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)相关的免疫抑制的免疫疗法。
[0152]
实施方案涉及修饰的细胞，其包含编码干扰sirpα和cd47之间相互作用的修饰的信号调节蛋白α(sirpα)的第一核酸，所述修饰的sirpα缺乏功能性sirpa胞内结构域；以及编码包含胞外域、跨膜域和胞内域的嵌合抗原受体(car)的第二核酸，并且其中修饰的sirpα和car表达为作为单独多肽的基因产物。实施方案涉及修饰的细胞，其包含：包含胞外域、跨膜域和胞内域的car；和干扰sirpα和cd47之间相互作用的修饰的sirpα，修饰的sirpα缺乏功能性sirpα细胞内结构域。实施方案涉及包含经修饰细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。实施方案涉及修饰的细胞在制备用于治疗有需要的受试者的肿瘤或癌症的药物中的用途。实施方案涉及治疗受试者的肿瘤的方法，包括向受试者施用治疗有效量的包含
经修饰细胞的药物组合物。
[0153]
实施方案涉及修饰细胞的方法，该方法包括：将car引入细胞中，并且其中所述细胞包含干扰sirpα和cd47之间相互作用的修饰的sirpα，所述修饰的sirpα缺乏功能性sirpα胞内结构域。
[0154]
在实施方案中，细胞是单核细胞、巨噬细胞或树突细胞。在实施方案中，细胞是巨噬细胞。在实施例中，修饰的sirpα的胞内结构域包含氨基酸seq id：10或12，或基本上由氨基酸seq id：10或12组成。在实施例中，与野生型受体相比，修饰的sirpα过表达，如图15所示。
[0155]
在实施方案中，胞外域包含结合抗原的抗原结合域，所述抗原包含表皮生长因子受体(egfr)、表皮生长因子受体的变体iii(egfrv iii)、人表皮生长因子受体2(her2)、间皮素(msln)、前列腺特异性膜抗原(psma)、癌胚抗原(cea)、双唾液酸神经节苷脂2(gd2)、白细胞介素-13ra2(il-13rα2)、glypican-3(gpc3)、碳酸酐酶ix(caix)、l1细胞粘附分子(l1-cam)、癌症抗原125(ca125)、分化簇133(cd133)、成纤维细胞活化蛋白(fap)、癌症/睾丸抗原1b(ctag1b)、粘蛋白1(muc1)、叶酸受体-α(fr-α)、cd19、fzd10、tshr、prlr、muc 17、gucy2c、cd207、cd3、cd5、b细胞成熟抗原(bcma)或cd4。在实施方案中，car的胞内结构域包含共刺激信号传导区，其包含选自cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40、pd-1的共刺激分子的细胞内结构域、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3，以及它们的任何组合。
[0156]
在实施方案中，抗原结合分子是嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)。
[0157]
实施方案涉及制备修饰细胞的体外方法。该方法可以包括从受试者获得细胞样品。例如，样品可以包括t细胞或t细胞祖细胞；该方法还可包括用编码至少car的dna转染细胞，在选择性增强表达car的t细胞增殖的培养基中离体培养car细胞群。
[0158]
在实施例中，样品是冷冻保存的样品。在实施方案中，细胞样品来自脐带血或来自受试者的外周血样品。在实施方案中，细胞样品通过血液分离术或静脉穿刺获得。在实施方案中，细胞样品是t细胞亚群。
[0159]
细胞表面有一个cd47信号，它是一个“不要吃我”的信号。几乎所有的癌细胞表面都有高水平的cd47，cd47通过与巨噬细胞表面和一种叫做sirpα的蛋白质结合来抑制它们杀死癌细胞的能力。阻断cd47是一种很有前景的癌症治疗策略。在癌细胞表面高表达的一种叫做cd24的蛋白质，也会通过抑制性受体siglec-10(唾液酸结合ig样凝集素10)向巨噬细胞发出“不要吃我”的信号，它在肿瘤相关巨噬细胞上高度表达，与siglec-10结合可抑制巨噬细胞的吞噬作用。cd24信号通常似乎是cd47信号的补充途径，例如在血癌中，与其他癌症(例如卵巢癌)相比，血癌似乎对cd47信号非常敏感并且对cd24信号阻断不敏感。这允许通过阻断其中一种信号来攻击大多数癌症。此外，如果停止在肿瘤上发出多个“不要吃我”的信号，癌症可能更容易受到攻击。cd24似乎是“不要吃我”蛋白质中最重要的蛋白质。
[0160]
实施方案涉及表达修饰的siglec-10和/或sirpα分子的修饰细胞，其与癌细胞表面的cd24和cd47分子结合，阻断与巨噬细胞的结合，并增强巨噬细胞对肿瘤的吞噬作用。使用nfat、ap-1、nfkb等诱导表达，修饰细胞包括car-t-nfat/ap-1/nfkb-siglec10/sirpα，如图16所示。
[0161]
修饰的t细胞可以源自干细胞。干细胞可以是成体干细胞、胚胎干细胞，人类干细
胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。修饰的细胞也可以是树突细胞、nk细胞、b细胞或t细胞，包括炎性t淋巴细胞、细胞毒性t淋巴细胞、调节性t淋巴细胞和辅助性t淋巴细胞。在实施方案中，修饰的细胞可来源于cd4+t淋巴细胞和cd8+t淋巴细胞。在对本文描述的细胞进行扩增和遗传修饰之前，可以通过多种非限制性方法从受试者获得细胞来源。t细胞可以从许多非限制性来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在实施方案中，可以使用本领域技术人员可用和已知的任何数量的t细胞系。在实施方案中，修饰的细胞可以源自健康供体、诊断为癌症的患者或诊断为感染的患者。在实施方案中，修饰的细胞是呈现不同表型特征的混合细胞群的一部分。
[0162]
术语“干细胞”是指具有自我更新能力和分化为其他种类细胞的能力的任何类型的细胞。例如，一个干细胞产生两个子代干细胞(如在体外培养胚胎干细胞时发生的那样)或一个干细胞和一个经历分化的细胞(如发生在造血干细胞中，其产生上升到血细胞)。不同类别的干细胞可以根据它们的来源和/或它们分化为其他类型细胞的能力程度进行区分。例如，干细胞可以包括胚胎干(es)细胞(即，多能干细胞)、体细胞干细胞、诱导多能干细胞和任何其他类型的干细胞。
[0163]
多能胚胎干细胞可以在囊胚的内细胞团中找到，并且具有很高的先天分化能力。例如，多能胚胎干细胞有可能在体内形成任何类型的细胞。当在体外长时间生长时，es细胞保持多能性：后代细胞保留多向分化的潜力。
[0164]
体细胞干细胞可以包括胎儿干细胞(来自胎儿)和成体干细胞(存在于各种组织中，例如骨髓)。这些细胞被认为具有低于多能es细胞的分化能力——胎儿干细胞的能力高于成体干细胞的能力。体细胞干细胞显然只分化为有限数量的不同类型的细胞，并被描述为多能细胞。“组织特异性干细胞”通常只产生一种类型的细胞。例如，es细胞可以分化为造血干细胞(例如，造血干细胞(hsc))，其可以进一步分化为各种血细胞(例如，红细胞、血小板、白细胞等)。
[0165]
诱导多能干细胞(即，ips细胞或ipsc)可以包括通过诱导特定基因的表达而人工衍生自非多能细胞(例如，成体细胞)的多能干细胞。诱导多能干细胞在很多方面与天然多能干细胞如胚胎干(es)细胞相似，如某些干细胞基因和蛋白质的表达、染色质甲基化模式、倍增时间、胚状体形成、畸胎瘤形成，可行的嵌合体形成，以及效力和可区分性。诱导多能细胞可以由成人胃细胞、肝脏细胞、皮肤细胞和血细胞制成。
[0166]
实施方案涉及编码一种或多种抑制cd47和/或cd24信号通路的治疗剂的核酸。实施方案涉及包含编码一种或多种抑制cd47和/或cd24信号通路的治疗剂的核酸的修饰细胞。实施方案涉及用于在体外和/或体内增强t细胞应答(例如，扩增和/或活化)的方法，该方法包括：引入编码一种或多种抑制cd47和/或cd24信号通路的治疗剂的核酸获得修饰的细胞；培养修饰细胞以获得修饰细胞群；使修饰细胞群与包含抗原的细胞接触，其与不包含所述核酸的细胞与包含抗原的细胞接触相比，修饰细胞增强t细胞应答。
[0167]
在实施方案中，多核苷酸可以整合到修饰细胞的基因组中，并且修饰细胞的后代将表达多核苷酸，产生稳定转染的修饰细胞。在实施方案中，经修饰细胞表达编码car的多核苷酸，但多核苷酸未整合到经修饰细胞的基因组中，使得经修饰细胞在有限时间段(例如，数天)内表达瞬时转染的多核苷酸，之后多核苷酸通过细胞分裂或其他细胞过程丢失。
例如，多核苷酸以重组dna构建体、mrna或病毒载体的形式存在于修饰细胞中，和/或多核苷酸是未整合到修饰细胞基因组中的mrna。
[0168]
在实施方案中，一种或多种治疗剂包含一种或多种重组蛋白。在实施方案中，一种或多种重组蛋白包括可分泌/可溶性蛋白。在实施方案中，蛋白质可以是显性失活形式(例如，seq no：16和17)。在实施方案中，一种或多种重组蛋白质包含相应蛋白质的显性失活形式。
[0169]
如本文所定义，可分泌或可溶性蛋白质可互换使用，是指不与细胞膜结合的受体或配体多肽。可溶性蛋白是最常见的配体结合多肽，缺乏跨膜和细胞质结构域。可溶性蛋白质可包括额外的氨基酸残基，例如提供多肽纯化或提供多肽与底物或免疫球蛋白恒定区连接的位点的亲和标签。许多细胞表面受体或配体具有通过蛋白水解产生的天然可溶性对应物。当可溶性多肽缺乏足够的跨膜和细胞内多肽片段部分以分别提供膜锚定或信号转导时，它们被称为基本上不含跨膜和细胞内多肽片段。
[0170]
在实施方案中，一种或多种重组蛋白包括siglec10的重组蛋白和/或sirpα的重组蛋白。在实施方案中，一种或多种治疗剂是或包含cd47的配体和/或cd24的配体。重组蛋白的序列见表6。在实施方案中，一种或多种重组蛋白与氧敏感多肽结构域相关。
[0171]
在实施方案中，编码一种或多种重组蛋白的核酸包含转录调节剂的结合位点的启动子，所述转录调节剂调节细胞中治疗剂的表达和/或分泌。在实施方案中，转录调节剂是或包括hifla、nfat、foxp3、ap-1、notch和/或nfkb。
[0172]
在实施方案中，核酸编码结合分子(例如，car或tcr)。在实施方案中，修饰的细胞包含结合分子(例如，car或tcr)。在实施方案中，核酸以重组dna构建体、mrna或病毒载体存在于修饰细胞中。在实施方案中，核酸是未整合到修饰细胞的基因组中的mrna。
[0173]
实施方案涉及多核苷酸的方法或用途，该方法或用途包括：提供包含载体基因组的病毒颗粒(例如，腺相关病毒(aav)、慢病毒或其变体)，该载体基因组包含多核苷酸，其中该多核苷酸可操作地连接至赋予表达控制元件的表达控制元件。多核苷酸的转录，以及向受试者施用一定量的病毒颗粒，使得多核苷酸在受试者中表达。在实施方案中，aav制剂可以包括aav载体颗粒、空衣壳和宿主细胞杂质，从而提供基本上不含aav空衣壳的aav产品。关于病毒颗粒的给药和制备的更多信息可以在美国专利号：us9840719和milani等人，sci.transl.med.11,eaav7325(2019),2019年5月22日，其通过引用并入本文。
[0174]
在实施方案中，核酸包含编码可切割肽(例如，2a或ires)的序列，其位于至少两种细胞因子之间。
[0175]
在实施方案中，一种或多种治疗剂是包含siglec10的可分泌/可溶性蛋白、sirpα的可分泌/可溶性蛋白、siglec10的显性失活形式和/或sirpα的显性失活形式。
[0176]
在实施方案中，核酸编码car，或修饰的细胞包含car。在实施方案中，car包含胞外域、跨膜域和胞内域，胞外域结合抗原。在实施方案中，car结合tmuc 1、prlr、clca1、muc12、gucy2c、gpr35、cr1l、muc 17、tmprss11b、muc21、tmprss11e、cd207、slc30a8、cfc1、slc12apr3、ssiglc6、ssig1、gzhra3、kiss1r、qrfpr、gpr119、cldn6、upk2、adam12、slc45a3、acpp、muc21、muc16、ms4a12、alpp、cea、epha2、fap、gpc3、il-13rα2、间皮素、psma、ror1、vα、erbb2、epcam、egfrviii、psca或egfr。在实施方案中，细胞内结构域包含共刺激结构域，其包含选自以下共刺激分子的细胞内结构域：cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40、pd-1、
icos、功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3及其组合。在实施方案中，抗原是表皮生长因子受体(egfr)、表皮生长因子受体的变体iii(egfrviii)、人表皮生长因子受体2(her2)、间皮素(msln)、前列腺特异性膜抗原(psma)、癌胚抗原(cea)、双唾液酸神经节苷脂2(gd2)、白细胞介素-13ra2(il-13rα2)、glypican-3(gpc3)、碳酸酐酶ix(caix)、l1细胞粘附分子(l1-cam)、癌抗原125(ca125)、分化簇133(cd133)、成纤维细胞活化蛋白(fap)、癌症/睾丸抗原1b(ctag1b)、粘蛋白1(muc1)、叶酸受体-α(fr-α)、cd19、fzd10、tshr、prlr、muc17、gucy2c、cd207、cd3、cd5、b细胞成熟抗原(bcma)或cd4。
[0177]
实施方案涉及用于治疗患有癌症的受试者的组合物，该组合物包含第一细胞群和第二细胞群，其中第一细胞群包含编码结合实体瘤抗原的结合分子的核酸，第二细胞群包含上述编码可切割肽的核酸的细胞。
[0178]
实施方案涉及用于治疗患有癌症的受试者的组合物，该组合物包含第一细胞群和第二细胞群，其中第一细胞群包含编码结合白血抗原的结合分子的核酸、第二细胞群表达和/或分泌本文所述的一种或多种治疗剂的细胞。
[0179]
全身性自身免疫性疾病(sad)可能会危及生命。例如，一种类型的sad，系统性红斑狼疮(sle)的10年生存率为89％。另一方面，与普通人群相比，多发性硬化症(ms)患者的预期寿命缩短了7至14年。此外，生活质量通常会因疾病症状和突发以及对环境诱因的常规避免而受到影响。这些疾病的治疗措施通常是支持性治疗，因为它们无法治愈。传统上，免疫抑制剂的全身给药用于控制疾病的严重程度和降低复发率，但长期使用免疫抑制药物会导致各种副作用，包括疲劳、过敏、带状疱疹、肾脏问题和心脏问题。
[0180]
最近，b淋巴细胞清除疗法已被证明可有效抑制sle和ms活动量，包括发展新的增强病变和复发率。此外，与常规全身性免疫抑制药物(包括过度下调大量免疫活性的药物)不同，靶向cd19、cd20、b细胞成熟抗原(bcma)或baff-r的单克隆抗体特异性消耗b淋巴细胞介导的免疫反应，从而最大限度地减少全身免疫抑制的可能副作用。然而，使用单克隆抗体的治疗方案通常需要每周静脉(iv)给药超过一个月，完全输注后的平均半衰期约为21天(对于)。因此，起效时间仅在初次输注后大约6周开始，并且通常要到第三个月才能完全发挥作用。此外，疾病症状可能在输注后9个月内重新出现。
[0181]
当自身反应性免疫细胞被诱导激活它们对健康自身组织的反应时，就会发生自身免疫性疾病。自身免疫性疾病影响着世界1％的人口，是10大主要死因之一。主要组织相容性复合体(mhc)是许多人类自身免疫疾病的主要易感位点，其中为致病性淋巴细胞提供靶点的自身组织抗原与疾病相关等位基因编码的hla分子结合。
[0182]
有超过80种不同的自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的例子包括1型糖尿病、类风湿性关节炎、银屑病/银屑病关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮(sle)、炎症性肠病、艾迪生病、格雷斯病、干燥综合征、桥本甲状腺炎、重症肌无力、血管炎、自身免疫性疾病恶性贫血和乳糜泻。例如，在1型糖尿病(t1d)中，胰腺会产生激素胰岛素，这有助于调节血糖水平。在1型糖尿病中，免疫系统攻击并破坏胰腺中产生胰岛素的细胞，高血糖结果会导致血管和器官(如心脏、肾脏、眼睛和神经)受损。在类风湿性关节炎(ra)中，免疫系统会攻击关节。这种攻击会导致关节发红、发热、酸痛和僵硬。与通常随着年龄增长而影响人们的骨关节炎不同，ra可以在患者30多岁或更早的时候开始。
[0183]
皮肤细胞通常会生长，然后在不再需要时脱落。牛皮癣(银屑病)会导致皮肤细胞
快速繁殖。多余的细胞会积聚并形成发炎的红色斑块，通常在皮肤上有银白色的斑块。多达30％的银屑病患者还会出现关节肿胀、僵硬和疼痛。这种形式的银屑病称为银屑病关节炎。
[0184]
多发性硬化症(ms)会损害髓鞘，即患者中枢神经系统中神经细胞周围的保护涂层。髓鞘损伤会减慢患者大脑和脊髓与患者身体其他部位之间的信息传输速度。这种损伤会导致麻木、虚弱、平衡问题和行走困难等症状。这种疾病有多种形式，以不同的速度发展。根据2012年的一项研究，大约50％的ms患者在疾病开始后的15年内需要帮助行走。对于sle，虽然医生在1800年代首次将狼疮描述为一种皮肤病，因为它通常会产生皮疹，但最常见的全身性形式实际上会影响许多器官，包括关节、肾脏、大脑和心脏。关节疼痛、疲劳和皮疹是最常见的症状。炎症性肠病(ibd)是一个术语，用于描述导致肠壁内壁发炎的病症。每种类型的ibd都会影响胃肠道的不同部分。克罗恩病可以使胃肠道的任何部分发炎，从口腔到肛门。溃疡性结肠炎仅影响大肠(结肠)和直肠的内壁。阿狄森氏病影响肾上腺，肾上腺产生皮质醇和醛固酮以及雄激素激素。低皮质醇水平会影响身体如何使用和储存碳水化合物和糖(葡萄糖)。醛固酮缺乏会导致血液中钠离子流失和钾离子过多。症状包括虚弱、疲劳、体重减轻和低血糖。
[0185]
格雷夫斯病攻击颈部的甲状腺，导致其产生过多的甲状腺激素。甲状腺激素控制身体的能量使用，称为新陈代谢。这些激素的过度产生会加速身体的新陈代谢，导致紧张、心跳加快、不耐热和体重减轻等症状。这种疾病的一个潜在症状是眼睛凸出，称为眼球突出。它可以作为所谓的格雷夫斯眼病的一部分发生，大约30％的格雷夫斯病患者会发生这种情况。干燥综合征是一种免疫细胞攻击为眼睛和嘴巴提供润滑的腺体的病症。干燥综合征的标志性症状是眼睛干涩和口干，但它也可能影响关节或皮肤。在桥本氏甲状腺炎中，甲状腺激素的产生减慢至缺乏。症状包括体重增加、对寒冷敏感、疲劳、脱发和甲状腺肿胀(甲状腺肿)。重症肌无力会影响帮助大脑控制肌肉的神经冲动，从而削弱神经和肌肉之间的交流。最常见的症状是肌肉无力，活动时加重，休息时好转。控制眼球运动、眼睑张开、吞咽和面部运动的肌肉通常会受到影响。
[0186]
自身免疫性血管炎是一种免疫系统攻击血管引起炎症的疾病，导致动脉和静脉变窄，限制血液流动。恶性贫血是一种由缺乏内因子引起的疾病，内因子是一种由胃壁细胞制造的蛋白质，小肠需要它从食物中吸收维生素b12。缺乏蛋白质会导致维生素b12缺乏，从而导致个体dna合成发生改变。此外，如果没有足够量的维生素b12，个体就会出现贫血。恶性贫血在老年人中更为常见，一般影响0.1％的人，但影响60岁以上人群的近2％。
[0187]
虽然乳糜泻不是自身免疫性疾病，但乳糜泻患者不能食用含有麸质的食物，麸质是一种存在于小麦、黑麦和其他谷物产品中的蛋白质，会引发胃肠道的免疫反应。随着时间的推移，免疫反应会损害肠道内壁并阻止其吸收所需的营养。肠道受损会导致腹泻、疲劳、体重减轻、腹胀、贫血和其他并发症。2015年的一项研究发现，美国约有1％的人患有乳糜泻。乳糜泻无法治愈，但可以通过严格的无麸质饮食来控制病情。
[0188]
实施方案涉及用免疫疗法治疗自身免疫疾病。实施方案包括使用嵌合抗原受体修饰的细胞治疗自身免疫疾病的方法和系统，如图18-19所示。例如，该方法包括施用药学有效量的受试者的t细胞群体，该群体被修饰以表达与b细胞相关抗原结合的car。在实施方案中，自身免疫病是与b细胞增殖和免疫球蛋白分泌相关的自身免疫病。在实施方案中，自身免疫病是sle、ra、t1d、干燥综合征或ms。在实施方案中，抗原是baff、april、cd19、cd20、
cd22、b细胞受体(bcr)、bcma或cd79。在实施方案中，抗原是cd19、cd20或baff。在实施方案中，t细胞群的药学有效量为每千克人类患者体重约104至109个细胞。在实施方案中，t细胞群体的药学有效量为每千克人类患者体重约105至106个细胞。在实施方案中，t细胞群体的药学有效量为每千克人类患者体重约106至107个细胞。在实施方案中，t细胞群体的药学有效量为每千克人类患者体重约104至105个细胞。在实施方案中，t细胞群体的药学有效量为每千克人类患者体重约107至108个细胞。在实施方案中，t细胞群体的药学有效量为每千克人类患者体重约108至109个细胞。
[0189]
实施方案涉及用于治疗自身免疫疾病的组合物和方法。例如，组合物包含对在患者体内扩增和/或维持修饰细胞有效的修饰细胞群，其中修饰细胞群包含至少两种不同的修饰细胞：第一修饰细胞包含用于扩增、维持修饰的细胞和/或杀死b细胞；以及包含用于杀死靶细胞例如引起自身免疫疾病的t细胞的第二抗原结合结构域的第二修饰细胞。在实施方案中，修饰的细胞是修饰的t细胞。在实施方案中，至少两种不同的修饰细胞包括两种不同的修饰t细胞、两种不同的修饰免疫细胞或其组合，和/或其中修饰的免疫细胞包括修饰的t细胞、dc细胞和/或巨噬细胞。
[0190]
hla-肽复合物(hpc)是指受hla复合物限制的淋巴细胞表位或抗原。例如，t细胞表位呈递在抗原呈递细胞的表面，在那里它们与mhc分子结合。在人类中，专职抗原呈递细胞专门呈递mhc ii类肽，而大多数有核体细胞呈递mhc i类肽。mhc i类分子呈递的t细胞表位通常可以包括长度在8到11个氨基酸之间的肽。相比之下，mhc ii类分子呈递更长的肽，长度为13-17个氨基酸，非经典mhc分子也呈递非肽表位，如糖脂。在实施方案中，hpc可以包括α1、α2和α3结构域、β-巨球蛋白和抗原肽(参见图17中的可溶性hla-peptide)。鉴定hpc的方法可在文献zhao l,zhang m,cong h.advances in the study of hla-restricted epitope vaccines.hum vaccin immunother.2013dec；9(12):2566-77.doi:10.4161/hv.26088.epub 2013aug 16.pmid:23955319；pmcid:pmc4162067中找到，其整体并入。
[0191]
本公开的实施方案包括融合蛋白和用于治疗其自身免疫疾病的用途。例如，融合蛋白(例如，多特异性结合分子(例如，多特异性抗体))包含靶向t细胞抗原受体的第一抗原结合结构域；以及靶向adhpc受体的第二抗原结合结构域。adhpc是指与t细胞介导的自身免疫疾病相关的hpc。自身免疫性疾病包括由患者的免疫细胞对这些器官的攻击引起的t细胞介导的自身免疫性疾病(例如，婴儿期1型糖尿病、甲状腺功能减退症和阿狄森氏病)。在实施方案中，adhpc介导t细胞介导的自身免疫疾病。治疗患有自身免疫病的受试者的方法包括施用有效量的包含融合蛋白的组合物。在实施方案中，该方法进一步包括施用有效量的包含额外融合蛋白靶b细胞(例如，cd19-cd3)的组合物。
[0192]
实施方案包括使用异常t细胞识别特定靶标以杀死正常细胞或通过靶标激活自身。在实施方案中，car和/或双特异性结合分子被设计为识别和去除异常免疫细胞，从而去除自身免疫疾病的来源。
[0193]
实施方案描述了基于hpc的免疫疗法的方法和组合物。实施方案涉及编码包含hpc的抗原结合分子(例如，car和多特异性结合分子(例如双特异性结合分子，例如bite))的多核苷酸。实施方案涉及包含第一car t细胞或靶向b细胞抗原的双特异性结合分子和包含hpc作为结合域的第二car细胞或双特异性结合分子的组合物。实施方案涉及包含抗原结合分子并使用所述组合物治疗自身免疫疾病的修饰细胞。
[0194]
如本文所用，多特异性结合分子是指能够结合多于一个靶标的分子。多特异性结合分子的实例包括双特异性结合分子和三特异性结合分子。结合分子的实例可以包括抗体、受体(例如，tcr)、配体、激动剂、细胞因子等。结合分子可以通过各种组合物连接，例如接头、纳米颗粒、珠、表面等。有关双特异性和三特异性结合分子的更多信息，请参见文献runcie et al.molecular medicine(2018)24:50and oates j,hassan nj,jakobsen bk.immtacs for targeted cancer therapy:why,what,how,and which.mol immunol.2015；67(2pta):67-74.doi:10.1016/j.molimm.2015.01.024，其全部内容以引用方式并入。在实施方案中，多特异性结合分子可包括结合t细胞的抗体、接头和结合实体瘤抗原的抗体。在实施方案中，多特异性结合分子包括结合tcr抗原(例如hla限制性肽抗原)的tcr和结合t细胞的抗体。tcr抗原的例子包括cea、gp100、mart-1、p53、mage-a3/4和ny-eso-1。在实施方案中，双特异性结合分子包含第一和第二结合域，其中第一结合域结合实体瘤抗原，并且第二结合域结合例如t细胞cd3受体复合物或cd28。
[0195]
hlaa2-p1-car在体外杀死特异性识别hlaa2-p1的t细胞。car包括专门识别hla-a2呈递的magea4肽的scfv。编码scfv的载体被包装到慢病毒中以感染jurkat细胞(t淋巴瘤细胞系)。hla-a2肽被构建为与4-1bb、cd28的细胞外、细胞内连接。cd40、cd27或其他共刺激信号和cd3z、cd3e或其他激活信号，组装成可特异性识别和杀死jurkat细胞的car t。因此，car t细胞可以特异性识别上述jurkat细胞，激活、释放细胞因子并大量扩增，同时有效杀死jurkat细胞。
[0196]
已知1型糖尿病会特异性杀死t细胞呈递缺陷核糖体产物(drip)的hla-a2胰腺β细胞。在实施方案中，可以产生靶向hla-a2-drip的scfv，并且可以将编码scfv的载体转移到jurkat细胞。这些jurkat细胞可用于测试car t细胞治疗1型糖尿病的功效。car的结合域包括hla-a2-drip，可结合在jurkat细胞上表达的scfv。在实施方案中，细胞毒性t淋巴细胞(ctl)可以从患有1型糖尿病的受试者收集，然后用于检测car t细胞治疗1型糖尿病的功效。在实施方案中，来自患有1型糖尿病的受试者的外周血单核细胞(pbmc)可以与hla-a2-drip一起培养，然后用于检测car t细胞治疗1型糖尿病的功效。实施方案涉及双特异性嵌合抗原受体，其包含：第一抗原结合域、第二抗原结合域、胞质域和跨膜域，其中第一抗原结合域识别第一抗原，第二抗原结合域识别第二抗原，并且第一抗原与第二抗原不同。在实施方案中，第一抗原是cldn18.2，第二抗原是gucy2c。在实施方案中，双特异性car包含氨基酸seq id no:25或26。晚期胃癌患者中cldn18.2与gucy2c表达的人数和比例、晚期胃癌患者样品中cldn18.2和gucy2c的免疫化学染色、晚期胃癌患者样品中cldn18.2和gucy2c的免疫化学染色如图20-22所示。
[0197]
在实施方案中，两个不同的抗原结合结构域可以在相同的结合分子上，例如在双特异性car上，并且由单个核酸编码。在实施方案中，双特异性car可以是通过接头连接在一起的两个不同的scfv分子。表6中提供了双特异性car的示例。如图26-27所示。
[0198]
双特异性car的实例示于图23和图28中。如图28所示，双特异性car(或串联car(tancar))可以包括两个结合域：scfv1和scfv2。在实施方案中，scfv1结合白细胞抗原(例如，cd19)，并且scfv2结合实体瘤抗原(例如，tmuc1)。在实施方案中，scfv1结合实体瘤抗原，并且scfv2结合另一种实体瘤抗原(例如，tmuc1、cldn 18.2)。claudin18.2(cldn 18.2)是claudin-18的胃特异性亚型。cldn 18.2在胃腺癌和胰腺癌中高度表达。在实施方案中，
scfv1结合表达于肿瘤细胞但不表达于正常组织(例如，tmuc1)的抗原；scfv2结合在与实体瘤相关的非必需组织上表达的抗原；并且杀死组织的正常细胞不会对受试者造成危及生命的事件(例如并发症)(例如，tshr、gucy2c)。非必需组织的例子包括器官，例如前列腺、乳房或黑素细胞。在实施方案中，scfv1和scfv2结合在相同非必需组织上表达的不同抗原(例如，针对前列腺癌的acpp和slc45a3，以及针对尿路上皮癌的siglec15和upk2)。
[0199]
实施方案涉及双特异性嵌合抗原受体，包括：第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域、细胞质结构域和跨膜结构域，其中第一抗原结合结构域识别第一抗原，并且第二抗原结合结构域识别第二抗原，且第一抗原与第二抗原不同。实施方案涉及包含双特异性car的细胞。实施方案涉及编码双特异性car的核酸。实施方案涉及增强t细胞应答、增强癌症治疗、治疗受试者的癌症、治疗患有肿瘤的受试者或抑制肿瘤生长的方法，该方法包括：施用有效量的包含car的修饰细胞。在实施方案中，受试者患有癌症。实施方案涉及一种增强与消化道的一个或多个器官相关的肿瘤的治疗的方法，该方法包括：施用有效量的双特异性car的细胞，其中与施用有效量的包含scfv结合cldn18.2或gucy2c之一的car的细胞相比，其t细胞应答得到增强。在实施方案中，第一抗原和第二抗原不在同一细胞上表达。
[0200]
在实施方案中，第一抗原是血液成分的抗原，而第二抗原是实体瘤的抗原。在实施方案中，第一抗原是cldn18.2，第二抗原是gucy2c。在实施方案中，双特异性car包含seq id no:25或26。
[0201]
在实施方案中，第一结合域结合非必需组织的抗原，而第二结合域结合肿瘤组织的抗原。在实施方案中，第一结合域结合tshr或gucy2c。在实施方案中，第二结合域结合tmuc1、mage-e1或上皮肿瘤抗原(eta)。
[0202]
在实施方案中，第一结合域结合组织特异性抗原，并且第二结合域结合在一个以上组织上表达的抗原。在实施方案中，第一结合域结合tshr或prlr。在实施方案中，第二结合域结合tmuc1、mag-e1或eta。
[0203]
在实施方案中，第一结合域结合正常组织的抗原，而第二结合域结合在肿瘤组织上表达的抗原。在实施方案中，第一结合域结合acpp、tshr、gucy2c、upk2、cldn18.2、psma、dpep3、cxcr5、b7-h3、muc16、siglec-15、cldn6、muc17、prlr或fzd10。在实施方案中，第二结合域结合tmuc1、mag-e1或eta。
[0204]
在实施方案中，第一结合域结合在非恶性细胞上表达的抗原，并且第二结合域结合在肿瘤细胞上而不在相应的非恶性细胞上表达的抗原。
[0205]
关于car及其治疗癌症的用途的更多信息可以在pct专利公开wo2020106843和wo2019140100以及pct专利申请号为：pct/us20/13099的文献中找到，它们通过引用整体并入本文。
[0206]
下面结合示例性实施例和示例对本发明作进一步说明。提供这些示例性实施例和示例仅用于说明的目的并且不旨在进行限制，除非另有说明。因此，本公开决不应被解释为限于以下示例性实施例和示例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。示例性实施例
[0207]
以下是示例性实施例：1.融合蛋白，其包含细胞外结构域，跨膜结构域和细胞内结构域，所述细胞外结构
域衍生自第一分子，所述细胞内结构域衍生自第二分子，所述第一分子不同于所述第二分子，所述第一分子是共刺激结构域，第二分子是细胞因子受体。2.融合蛋白，其包含细胞外结构域，跨膜结构域和细胞内结构域，所述细胞外结构域衍生自第一分子，所述细胞内结构域衍生自第二分子，所述第一分子不同于所述第二分子。3.编码实施方案1或2的融合蛋白的分离的核酸。4.包含实施方案3的分离核酸或实施方案1或2的融合蛋白的修饰细胞。5.一种药物组合物，其包含实施方案4的细胞群。6.一种在有需要的受试者中引起t细胞应答和/或治疗受试者的肿瘤的方法，该方法包括向受试者施用有效量的实施方案5的组合物。7.实施方案6的方法，进一步包括：施用有效量的结合胞外域的激动剂抗体。8.实施方案7的方法，其中胞外域与激动剂抗体的结合引起多个第一分子激活，促进了第二分子的信号传导、细胞被激活或者激活增强。9.实施方案1-8之一的融合蛋白、分离的核酸、修饰的细胞、药物组合物或方法，其中所述胞外域结合激动剂抗体，并且其中所述激动剂抗体是cdx 1140、sea cd40、ro7009789、jnj 64457107(adc1013)、apx 005m、chi lob 7/4、trx 518、mk 4166、mk 1248、gwn 323、incagn01876、bms 986156、amg 228、tavolimab(medi0562)、pf 04518600、bms 986178、moxr 0916、gsk3174998、incagn01949、utomilumab(pf 05082566)、urelumab(bms663513)、gsk 3359609、jtx2011或theralizumab(tab 08)。10.实施方案1-8之一的融合蛋白、分离的核酸、修饰的细胞、药物组合物或方法，其中所述胞外域是共刺激分子的胞外域。11.实施方案1-8之一的融合蛋白、分离的核酸、修饰的细胞、药物组合物或方法，其中所述胞外域是ox40、cd40、4-1bb、gitr、icos、cd28、cd27、her2或egfr的胞外域。12.实施方案1-8之一的融合蛋白、分离的核酸、修饰的细胞、药物组合物或方法，其中所述胞外域是cd40、gitr、ox40、4-1bb、icos或cd28的胞外域；共刺激分子是选自cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3及其任意组合的共刺激分子；和/或细胞内结构域是细胞因子受体的细胞内结构域。13.实施方案1-8之一的融合蛋白、分离的核酸、修饰的细胞、药物组合物或方法，其中第二分子是ox40、cd40、4-1bb、gitr、icos、cd28、cd27、her2、egfr、il-10r、il-12r、il-18r1、il-23r、gp130或il-15ra。14.实施方案1-8之一的融合蛋白、分离的核酸、修饰的细胞、药物组合物或方法，其中细胞内结构域是il-12r、il-18r1、il-23r、gp130或il-15ra。15.实施方案1-14之一的融合蛋白、分离的核酸、修饰的细胞、药物组合物或方法，其中所述跨膜结构域是ox40、cd40、4-1bb、gitr、icos、cd28、cd27、her2、egfr、il-12r、il-18r1、il-23r、gp130或il-15ra的胞内结构域。16.实施方案4-8之一的修饰细胞、药物组合物或方法，其中所述修饰细胞是淋巴细胞、白细胞或pbmc细胞、或nk细胞、或树突细胞。17.实施方案4-16之一的修饰细胞、药物组合物或方法，其中所述修饰细胞进一步
包含嵌合抗原受体(car)或tcr。18.实施方案17的修饰细胞、药物组合物或方法，其中tcr是修饰的tcr。19.实施方案17的修饰细胞、药物组合物或方法，其中tcr源自患者中自发发生的肿瘤特异性t细胞。20.实施方案17的修饰细胞、药物组合物或方法，其中tcr结合肿瘤抗原。21.实施方案20的修饰细胞、药物组合物或方法，其中所述肿瘤抗原包含cea、gp100、mart-1、p53、mage-a3或ny-eso-1，或tcr包含tcrγ和tcrδ链，或tcrα和tcrβ链，或它们的组合。22.实施方案17的修饰的细胞、药物组合物或方法，其中所述car包含胞外域、跨膜域和胞内域，所述胞外域结合抗原。23.实施方案22的修饰的细胞、药物组合物或方法，其中所述胞内结构域包含共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含选自cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3及其任何组合。24.实施方案23的修饰细胞、药物组合物或方法，其中所述抗原是表皮生长因子受体(egfr)、表皮生长因子受体的变体iii(egfrv iii)、人表皮生长因子受体2(her2)、间皮素(msln)、前列腺特异性膜抗原(psma)、癌胚抗原(cea)、双唾液酸神经节苷脂2(gd2)、白细胞介素-13ra2(il-13rα2)、glypican-3(gpc3)、碳酸酐酶ix(caix)、l1细胞粘附分子(l1-cam)、癌症抗原125(ca125)、分化簇133(cd133)、成纤维细胞活化蛋白(fap)、癌症/睾丸抗原1b(ctag1b)、粘蛋白1(muc1)、叶酸受体-α(fr-α)、cd19、fzd10、tshr、prlr、muc17、gucy2c、cd207、cd3、cd5、b细胞成熟抗原(bcma)或cd4。25.实施方案4-24之一的修饰细胞、药物组合物或方法，其中所述修饰细胞或t细胞中的car结合白细胞抗原；所述修饰细胞或t细胞还包含一个结合实体瘤抗原的额外car。26.实施方案4-24之一的修饰细胞、药物组合物或方法，其中所述修饰细胞或t细胞包含显性失活pd-1。27.实施方案4-24之一的修饰细胞、药物组合物或方法，其中所述修饰细胞或所述t细胞包含缺乏功能性pd-1胞内结构域的修饰pd-1。28.实施方案4-27之一的修饰细胞、药物组合物或方法，其中所述修饰细胞进一步包含编码治疗剂的核酸。29.实施方案28的修饰的细胞、药物组合物或方法，其中所述分离的核酸包含启动子，所述启动子包含转录调节剂的结合位点，所述转录调节剂调节所述治疗剂在所述细胞中的表达和/或分泌。30.实施方案29的修饰细胞、药物组合物或方法，其中转录调节剂是或包括hifla、nfat、foxp3和/或nfkb。31.实施方案30的修饰细胞、药物组合物或方法，其中启动子对转录调节剂有响应。32.实施方案30的修饰的细胞、药物组合物或方法，其中启动子与编码治疗剂的核酸可操作地连接，使得启动子驱动治疗剂在细胞中的表达和/或分泌。33.实施方案30的修饰细胞、药物组合物或方法，其中治疗剂的表达由诱导型基因表达系统调节。
34.实施方案33的修饰细胞、药物组合物或方法，其中所述诱导型基因表达系统包含或为lac系统、四环素系统或半乳糖系统。35.实施方案33或34的修饰细胞、药物组合物或方法，其中所述诱导型基因表达系统包含或为四环素系统。36.实施方案35的修饰细胞、药物组合物或方法，其中所述诱导型基因表达系统包含四环素系统，并且诱导剂为四环素强力霉素或其类似物。37.实施方案4-36之一的修饰细胞、药物组合物或方法，其中所述修饰细胞是源自从人类供体分离的原代人类t细胞的t细胞。38.实施方案37的修饰细胞、药物组合物或方法，其中所述细胞具有降低的内源trac基因表达。39.实施方案4-36之一的修饰细胞、药物组合物或方法，其中所述修饰细胞是源自从患有癌症的受试者分离的原代人t细胞的t细胞。40.实施方案39的修饰细胞、药物组合物或方法，其中所述细胞具有降低的内源trac基因表达。41.一种修饰的细胞，其包含至少编码共刺激分子的胞外域的外源多核苷酸。42.一种包含外源肽的修饰细胞，所述外源肽至少包含共刺激分子的一个胞外域。43.实施方案41或42的修饰细胞，其中所述修饰细胞包含任何前述合适实施方案的融合蛋白。44.实施方案41-43中任一项的修饰细胞，其中共刺激分子包含cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40、gitr、icos、egfr、her2、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3或其组合。45.根据实施方案41-44中任一项所述的修饰细胞，其中所述共刺激分子包含ox40、cd40、4-1bb、gitr、icos、cd27或cd28。46.根据实施方案41-44中任一项所述的修饰细胞，其中所述共刺激分子是cd40。47.根据实施方案41-46中任一项所述的修饰细胞，其中所述修饰细胞源自淋巴细胞。48.根据实施方案41-47中任一项所述的修饰细胞，其中所述修饰细胞源自t细胞或nk细胞。49.根据实施方案41-48中任一项所述的修饰细胞，其中所述外源肽进一步包含或所述外源多核苷酸进一步编码所述共刺激分子的细胞内结构域和/或跨膜结构域。50.根据实施方案41-49中任一项所述的修饰细胞，其中所述修饰细胞进一步包含car或tcr。51.根据实施方案41-49中任一项所述的方法细胞，其中所述修饰细胞进一步包含结合实体瘤抗原的car。52.一种扩增实施方案41-51任一项的修饰细胞或增强实施方案41-51任一项的修饰细胞的t细胞应答的方法，该方法包括：向患有癌症的受试者施用有效量的所述修饰细胞；以及向受试者施用有效量的共刺激分子的激动剂或配体。53.实施方案52的方法，其中与施用没有激动剂或配体的修饰细胞的受试者相比，t细胞应答或细胞扩增得到增强。
54.一种修饰的细胞，包括：编码干扰sirpα和cd47之间相互作用的修饰的信号调节蛋白-α(sirpα)的第一核酸，所述修饰的sirpα缺乏功能性sirpα胞内结构域；和编码包含胞外域、跨膜域和胞内域的嵌合抗原受体(car)的第二核酸，并且其中修饰的sirpα和car表达为作为单独多肽的基因产物。55.一种修饰的细胞，包括：包含胞外域、跨膜域和胞内域的car；和干扰sirpα和cd47之间相互作用的修饰sirpα，修饰的sirpα缺乏功能性sirpα细胞内结构域。56.一种修饰细胞的方法，该方法包括：将car引入细胞中，并且其中该car包含干扰sirpα和cd47之间相互作用的修饰的sirpα，该修饰的sirpα缺乏功能性sirpα胞内结构域。57.根据实施方案54-56中任一项所述的修饰细胞或方法，其中所述细胞是单核细胞、巨噬细胞或树突细胞。58.实施方案57的修饰细胞或方法，其中所述细胞是巨噬细胞。59.实施方案58的修饰细胞或方法，其中修饰sirpα的胞内结构域基本上由seq id:9或11编码的氨基酸序列组成。60.实施方案58的修饰细胞或方法，其中与野生型受体相比，修饰的sirpα过表达。61.实施方案58的修饰细胞或方法，其中所述胞外域包含结合抗原的抗原结合域，所述抗原包含表皮生长因子受体(egfr)、表皮生长因子受体的变体iii(egfrv iii)、人表皮生长因子受体2(her2)、间皮素(msln)、前列腺特异性膜抗原(psma)、癌胚抗原(cea)、双唾液酸神经节苷脂2(gd2)、白细胞介素-13ra2(il-13rα2)、glypican-3(gpc3)、碳酸酐酶ix(caix)、l1细胞粘附分子(l1-cam)、癌症抗原125(ca125)、分化簇133(cd133)、成纤维细胞活化蛋白(fap)、癌症/睾丸抗原1b(ctag1b)、粘蛋白1(muc1)、叶酸受体-α(fr-α)、cd19、fzd10、tshr、prlr、muc17、gucy2c、cd207、cd3、cd5、b细胞成熟抗原(bcma)或cd4。62.实施方案58的修饰细胞或方法，其中car的胞内结构域包含共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含选自cd27、cd28、4-1bb的共刺激分子的胞内结构域、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c或b7-h3，以及它们的任何组合。63.一种药物组合物，其包含实施方案54或55的细胞和药学上可接受的载体。64.实施方案54或55的修饰细胞在制备用于治疗有需要的受试者的肿瘤或癌症的药物中的用途。65.一种治疗受试者的肿瘤的方法，包括向受试者施用治疗有效量的包含实施方案54或55的修饰细胞的药物组合物。66.一种核酸，其包含编码一种或多种抑制cd47和/或cd24信号通路的治疗剂的多核苷酸。67.一种修饰的细胞，其包含编码一种或多种抑制cd47和/或cd24信号通路的治疗剂的核酸。68.一种体外和/或体内增强t细胞应答(例如，扩增和/或活化)的方法，该方法包括：引入编码一种或多种抑制cd47和/或cd24信号通路的治疗剂的核酸以获得一个修饰细胞；培养修饰细胞以获得修饰细胞群；使修饰细胞群与包含抗原的细胞接触，其中与与不包含所述核酸的修饰细胞接触的细胞相比，修饰细胞t细胞应答增强。
69.实施方案66-68之一的核酸、修饰的细胞或方法，其中所述一种或多种治疗剂包含一种或多种重组蛋白。70.实施方案69的核酸、修饰的细胞或方法，其中所述一种或多种重组蛋白包括可分泌/可溶性蛋白。71.实施方案69的核酸、修饰的细胞或方法，其中所述一种或多种重组蛋白质包含显性失活形式的相应蛋白质。72.实施方案69-71中任一项的核酸、修饰的细胞或方法，其中所述一种或多种重组蛋白包含siglec10的重组蛋白和/或sirpα的重组蛋白。73.实施方案69-71中任一项的核酸、修饰的细胞或方法，其中所述一种或多种治疗剂包含cd47的配体和/或cd24的配体。74.实施方案69-73之一的核酸、修饰的细胞或方法，其中所述一种或多种重组蛋白与氧敏感性多肽结构域相关。75.实施方案74的核酸、修饰的细胞或方法，其中氧敏感性多肽结构域包含hif vhl结合结构域。76.实施方案66-75之一的核酸、修饰的细胞或方法，其中编码一种或多种重组蛋白的核酸包含启动子，所述启动子包含调节表达和/或分泌的转录调节剂的结合位点细胞中的治疗剂。77.实施方案76的核酸、修饰的细胞或方法，其中所述转录调节剂是或包括hifla、nfat、foxp3、ap-1、notch和/或nfkb。78.实施方案66-77之一的核酸、修饰的细胞或方法，其中所述核酸编码结合分子。79.实施方案66-77之一的修饰细胞或方法，其中所述修饰细胞包含结合分子。80.实施方案78或79之一的核酸、修饰的细胞或方法，其中所述核酸以重组dna构建体、mrna或病毒载体的形式存在于修饰的细胞中。81.实施方案80的核酸、修饰的细胞或方法，其中所述核酸是未整合到修饰细胞的基因组中的mrna。82.实施方案66-81之一的核酸、修饰的细胞或方法，其中所述核酸包含编码可切割肽(例如2a或ires)的序列，其位于至少两种细胞因子之间。83.实施方案66-81之一的核酸、修饰细胞或方法，其中所述一种或多种治疗剂是或包含siglec10的可分泌/可溶性蛋白、sirpα的可分泌/可溶性蛋白、显性失活形式siglec10和/或显性失活形式的sirpα。84.实施方案66-83中任一项的核酸、修饰的细胞或方法，其中所述核酸编码car，或所述修饰的细胞包含car。85.实施方案84的核酸、修饰的细胞或方法，其中所述car包含胞外域、跨膜域和胞内域，所述胞外域结合抗原。86.实施方案85的核酸、修饰细胞或方法，其中car结合tmuc 1、prlr、clca1、muc12、gucy2c、gpr35、cr1l、muc 17、tmprss11b、muc21、tmprss11e、cd207、slc313lca8、sstr1、gpr27、fzd10、tshr、siglec15、slc6a3、kiss1r、qrfpr、gpr119、cldn6、upk2、adam12、slc45a3、acpp、muc21、muc16、ms4a12、alpp、cea、3r、fil、psma、ror1、vegfr-ii、gd2、fr-α、erbb2、epcam、egfrviii、psca或egfr。
87.实施方案86的核酸、修饰的细胞或方法，其中所述细胞内结构域包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含选自cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c及b7-h3其中一种，或其组合。88.实施方案85-87的核酸、修饰的细胞或方法，其中所述抗原是表皮生长因子受体(egfr)、表皮生长因子受体的变体iii(egfrv iii)、人表皮生长因子受体2(her2)、间皮素(msln)、前列腺特异性膜抗原(psma)、癌胚抗原(cea)、双唾液酸神经节苷脂2(gd2)、白细胞介素-13ra2(il-13rα2)、glypican-3(gpc3)、碳酸酐酶ix(caix)、l1细胞粘附分子(l1-cam)、癌症抗原125(ca125)、分化簇133(cd133)、成纤维细胞活化蛋白(fap)、癌症/睾丸抗原1b(ctag1b)、粘蛋白1(muc1)、叶酸受体-α(fr-α)、cd19、fzd10、tshr、prlr、muc17、gucy2c、cd207、cd3、cd5、b细胞成熟抗原(bcma)或cd4。89.一种用于治疗患有癌症的受试者的组合物，所述组合物包含第一细胞群和第二细胞群，其中所述第一细胞群包含编码结合实体瘤抗原的结合分子的核酸、第二细胞群包含实施方案66-88之一的核酸的细胞。90.一种用于治疗患有癌症的受试者的组合物，所述组合物包含第一细胞群和第二细胞群，其中所述第一细胞群包含编码结合白血抗原的结合分子的核酸、第二细胞群表达和/或分泌实施方案66-89中任一项的一种或多种治疗剂的细胞。91.一种治疗人类患者自身免疫疾病的方法，该方法包括：向人类患者施用药物有效量的人类患者的t细胞群，所述t细胞群表达嵌合抗原受体(car)，所述嵌合抗原受体(car)包含seq id no:9-17中任一项的氨基酸序列。92.一种治疗人类患者自身免疫疾病的方法，该方法包括：人类患者施用药物有效量的人类患者的t细胞群，所述t细胞群表达与b细胞相关的抗原结合的嵌合抗原受体(car)。93.实施方案92的方法，其中所述自身免疫病是与b细胞增殖和免疫球蛋白分泌相关的自身免疫病。94.实施方案92的方法，其中所述自身免疫病是系统性红斑狼疮(sle)、类风湿性关节炎(ra)、1型糖尿病(t1d)、干燥综合征或多发性硬化症(ms)。95.实施方案92的方法，其中所述抗原是baff、april、cd19、cd20、cd22、b细胞受体(bcr)、b细胞成熟抗原(bcma)或cd79。96.实施方案92的方法，其中所述抗原是cd19、cd20或baff。97.实施方案92的方法，其中t细胞群的药学有效量为每kg人类患者体重约104至109个细胞。98.实施方案92的方法，其中t细胞群的药学有效量为每kg人类患者体重约105至106个细胞。99.实施方案92的方法，其中t细胞群的药学有效量为每kg人类患者体重约106至107个细胞。100.实施方案92的方法，其中t细胞群的药学有效量为每kg人类患者体重约104至105个细胞。101.实施方案92的方法，其中t细胞群的药学有效量为每kg人类患者体重约107至108个细胞。
102.实施方案92的方法，其中t细胞群的药学有效量为每kg人类患者体重约108至109个细胞。103.实施方案92的方法，其中car包含seq id no：1-6的氨基酸序列。104.表达与b细胞相关抗原结合的car的t细胞群用于治疗自身免疫疾病的用途。105.实施方案104的用途，自身免疫性疾病是系统性红斑狼疮(sle)、类风湿性关节炎(ra)、1型糖尿病(t1d)、干燥综合征或多发性硬化症(ms)。106.实施方案104或105的用途，其中所述自身免疫病是sle。107.实施方式104-106中任一项的用途，其中t细胞包括seq id no：1-6中任一项的氨基酸序列。108.实施方案104-107中任一项的用途，其中所述抗原是baff、april、cd19、cd20、cd22、b细胞受体(bcr)、b细胞成熟抗原(bcma)或cd79。109.实施方案104-108中任一项的用途，其中所述抗原是cd19、cd20或bcma。110.实施方案104-109中任一项的用途，其中所述t细胞群的药学有效量为每千克人类患者体重约104至109个细胞。111.实施方案104-110中任一项的用途，其中所述t细胞群的药学有效量为每千克人类患者体重约105至106个细胞。112.实施方案104-111中任一项的用途，其中所述t细胞群的药学有效量为每千克人类患者体重约106至107个细胞。113.实施方案104-112中任一项的用途，其中所述t细胞群的药学有效量为每千克人类患者体重约104至105个细胞。114.实施方案104-113中任一项的用途，其中所述t细胞群的药学有效量为每千克人类患者体重约107至108个细胞。115.实施方案104-114中任一项的用途，其中所述t细胞群的药学有效量为每千克人类患者体重约108至109个细胞。116.实施方式104-115中任一项的用途，其中car包含氨基酸序列seq id no：9-17。117.实施方案104-116中任一项的用途，其中所述用途进一步包括测量受试者的尿蛋白、血清抗双链dna抗体、肾损伤和/或皮肤损伤的水平。118.实施方案104-117中任一项的用途，其中受试者的尿蛋白、血清抗双链dna抗体、肾损伤和/或皮肤损伤的水平降低。119.对在患者体内扩增和/或维持修饰细胞有效的修饰细胞群，如图24或25所示，其中所述修饰细胞群包含至少两种不同的修饰细胞：第一修饰细胞包含第一抗原结合结构域，用于扩增、维持所述修饰细胞，和/或杀死b细胞；以及包含用于杀死靶细胞(例如引起自身免疫疾病的t细胞)的第二抗原结合结构域的第二修饰细胞。优选地，其中所述修饰细胞是修饰的t细胞。优选地，其中，所述至少两种不同的修饰细胞包括两种不同的修饰t细胞、两种不同的修饰免疫细胞或其组合，和/或优选地，其中修饰的免疫细胞包括修饰的t细胞、dc细胞和/或巨噬细胞。120.实施方案119的修饰细胞群，其中所述抗原结合结构域结合不同的抗原。121.实施方案119的修饰细胞群，其中所述修饰细胞群进一步包含表达至少两个
不同抗原结合结构域的第三修饰细胞，其中第一抗原结合结构域用于扩增和/或维持修饰细胞，第二抗原结合结构域用于杀死靶细胞，并且其中两个不同的抗原结合域在同一细胞上表达。122.实施方案119的修饰细胞群，其中所述修饰细胞群包含表达用于杀死靶细胞的抗原结合结构域的修饰细胞和至少表达两个抗原结合结构域的修饰细胞，所述两个抗原结合结构域中，第一抗原结合结构域用于扩增和/或维持修饰的细胞，第二抗原结合结构域用于杀死靶细胞，并且其中两个不同的抗原结合结构域在相同的修饰细胞上表达。123.实施方案119的修饰细胞群，其中所述修饰细胞群包括表达用于扩增和/或维持所述修饰细胞的抗原结合结构域的修饰细胞和至少表达两个抗原结合结构域的修饰细胞，所述两个抗原结合结构域中，第一抗原结合结构域用于扩增和/或维持修饰细胞，第二抗原结合结构域用于杀死靶细胞，并且其中两个不同的抗原结合域在相同的修饰细胞上表达。124.实施方案119-123中任一项的修饰细胞群，其中所述修饰细胞是修饰的t细胞、修饰的nk细胞、修饰的巨噬细胞或修饰的树突细胞。125.实施方案119-124中任一项的修饰细胞群，其中用于扩增/或维持修饰细胞的抗原结合结构域结合wbc的表面抗原，并且用于杀死靶细胞的抗原结合结构域结合肿瘤抗原。126.实施方案125的修饰细胞群，其中wbc是b细胞。127.实施方案125的修饰细胞群，其中wbc的细胞表面抗原是cd19、cd22、cd20、bcma、cd5、cd7、cd2、cd16、cd56、cd30、cd14、cd68、cd11b、cd18、cd169、cd1c、cd33、cd38、cd138或cd13。128.实施方案119-127中任一项的修饰细胞群，其中第二抗原是t细胞或多个与hla-肽复合物(hpc)相关的结构域。129.实施方案125的修饰细胞群，其中wbc的细胞表面抗原是cd19、cd20、cd22或bcma，或者其中wbc是b细胞并且b细胞的细胞表面抗原是cd19。130.一种组合物，其包含包含结合第一抗原的第一car的第一细胞群和包含结合第二抗原的第二car的第二细胞群，其中所述第二抗原对应于adhpc，第一抗原和第二抗原是不同的抗原。131.实施方案130的组合物，其中第一细胞群不包含第二car，和/或第二细胞群不包含第一car。132.实施方案131的组合物，其中所述组合物进一步包含含有第一car和第二car的第三细胞群。133.实施方案130的组合物，其中第二细胞群进一步包含第一car且第一细胞群不包含第二car；或第一细胞群进一步包含第二car。134.实施方案130的组合物，其中第二细胞群不包含第一car，并且第一细胞群包含第二car。135.一种增强第二细胞群扩增的方法，其中第二细胞群是包含adhpc的细胞，该方法包括将有效量的实施方案130-134中任一项的组合物施予具有与adhpc相关的癌症形式的受试者。
136.一种增强受试者的t细胞应答或治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向患有与adhpc相关的自身免疫疾病形式的受试者施用有效量的实施方案130-134中任一项的组合物。137.一种增强受试者中细胞扩增的方法，该方法包括：将细胞与包含编码第一car的第一核酸序列的第一载体和包含编码第二car的第二核酸序列的第二载体接触以获得所述130-134中任一项的组合物；并且向患有与adhpc相关的自身免疫疾病形式的受试者施用有效量的组合物。138.一种在有需要的受试者中增强t细胞应答或治疗患有自身免疫病的受试者的方法，该方法包括：将细胞与包含编码第一car的第一核酸序列的第一载体和包含编码第二car的第二核酸序列的第二载体接触以获得实施方案130-134中任一项的组合物；并且向患有与adhpc相关的自身免疫疾病形式的受试者施用有效量的组合物。139.一种增强受试者细胞扩增的方法，该方法包括：施用有效量实施方案130-134中任一项的组合物的第一细胞群；并且施用有效量的第二细胞群。140.实施方案137-139中任一项的方法，其中第一载体和第二载体包括慢病毒载体。141.实施方案130-140中任一项的组合物或方法，其中第一抗原是或包含白细胞的表面分子，例如wbc。142.实施方案130-141中任一项的组合物或方法，其中所述细胞是修饰的t细胞、修饰的nk细胞、修饰的巨噬细胞或修饰的树突细胞。143.实施方案141的组合物或方法，其中wbc是粒细胞、单核细胞或淋巴细胞。144.实施方案143的组合物或方法，其中wbc是b细胞。145.实施方案144的组合物或方法，其中wbc的细胞表面抗原是cd19、cd22、cd20、bcma、cd5、cd7、cd2、cd16、cd79a/b、cd56、cd30、cd14、cd68、cd11b、cd18、cd169、cd1c、cd33、cd38、cd138或cd13。146.实施方案143的组合物或方法，其中wbc的细胞表面抗原是cd19、cd20、cd22或bcma。147.实施方案143的组合物或方法，其中wbc的细胞表面抗原是cd19。148.实施方案143的组合物或方法，其中第一抗原对应于adhpc。149.实施方案148的组合物或方法，其中adhpc是天然hla-肽或人工hla-肽。150.一种融合蛋白，例如多特异性结合分子，例如多特异性抗体，其包含：靶向t细胞抗原受体的第一抗原结合结构域；和靶向adhpc受体的第二抗原结合结构域。151.实施方案150的融合蛋白，其中所述受体包括cd3、cd28、41bb和/或ox40。152.包含实施方案150或151的融合蛋白的组合物。153.编码任何前述合适实施方案的融合蛋白的多核苷酸。154.一种宿主细胞，其包含任何前述合适实施方案的融合蛋白。155.一种修饰的细胞，其包含任何前述实施方案的融合蛋白。156.一种包含实施方案155的修饰细胞的组合物。157.一种治疗或引起或诱导患有自身免疫病的受试者的t细胞应答的方法，该方法包括施用有效量的包含实施方案156的修饰细胞的组合物。158.一种用于治疗癌症、在患有癌症的受试者中引起或诱导t细胞应答、或增强t
细胞反应的方法，该方法包括施用有效量的实施方案152的组合物。159.一种治疗或引起或诱导患有自身免疫病的受试者的t细胞应答的方法，该方法包括施用有效量的包含任何前述合适实施方案的融合蛋白的组合物。160.一种用于治疗癌症、在患有自身免疫病的受试者中引起或诱导t细胞应答或增强t细胞应答的方法，该方法包括施用有效量的包含任何前述合适实施方案的融合蛋白的组合物。161.任何合适的前述实施方案的方法，其中所述多特异性结合分子，例如多特异性抗体，包含双特异性结合分子(例如bite)，所述双特异性结合分子包含结合wbc、白血抗原(例如cd19)抗原和结合域结合cd3。162.任何合适的前述实施方案的方法或组合物，其中多特异性结合分子或car包含表6中列出的序列中的至少一个。163.一种从受试者体内去除t细胞的方法，该方法包括向受试者施用有效量的包含任何合适的前述实施方案的修饰细胞或融合蛋白的组合物。164.一种包含car结合的抗原和cd40激活剂的组合物，其中所述car在修饰的t细胞中。165.实施方案164的组合物，其中cd40激活剂是cd40配体或cd40激动剂。166.实施方案164或165的组合物用于增强修饰的t细胞的t细胞应答，其包含编码car的核酸和编码cd40胞外域的核酸。167.实施方案164-166中任一项的组合物，用于增强t细胞应答的方法，该方法包括：编码嵌合抗原受体(car)的核酸和编码cd40胞外域的多核苷酸导入t细胞，获得修饰的t细胞；和使修饰的t细胞与实施方案164-166中任一项的组合物接触，从而诱导t细胞应答，其中t细胞应答大于通过将修饰的t细胞与包含无cd40激活剂的抗原的组合物接触而诱导的t细胞应答。168.实施方案166或167的组合物，其中编码cd40胞外域的核酸包含核酸序列seq id no:7,或实施方案166或167的组合物，其中cd40胞外域包含氨基酸序列seq id no:8。169.如实施方案166-168中任一项所述的组合物，其中该t细胞应答包括t细胞扩增和/或t细胞活化。170.实施方案164-169中任一项的组合物，其中所述car包含抗原结合域、跨膜域和细胞内信号传导域。171.如实施方案164-170中任一项所述的组合物，其中所述抗原结合域结合肿瘤抗原，所述肿瘤抗原包含tshr、cd19、cd123、cd22、cd30、cd171、cs-1、cll-1、cd33、egfrviii、gd2、gd3、bcma、tn ag、psma、ror1、flt3、fap、tag72、cd38、cd44v6、cea、epcam、b7h3、kit、il-13ra2、mesothelin、il-11ra、psca、prss21、vegfr2、lewisy、cd24、pdgfr-β、ssea-4、cd20、叶酸受体α、erbb2(her2/neu)、muc1、egfr、ncam、前列腺酶、pap、elf2m、ephrin b2、igf-i受体、caix、lmp2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、epha2、岩藻糖基gm1、sle、gm3、tgs5、hmwmaa、o-乙酰基-gd2、叶酸受体β、tem1/cd248、tem7r、cldn6、gprc5d、cxorf61、cd97、cd179a、聚乳酸、alk、globoh、ny-br-1、upk2、havcr1、adrb3、panx3、gpr20、ly6k、or51e2、tarp、wt1、ny-eso-1、lage-1a、mage-a1、legumain、hpv e6、e7、mage a1、etv6-aml、精子蛋白17、xage1、tie 2、mad-ct-1、mad-ct-2、fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、
survivin和端粒酶、pcta-1/galectin8,米elana/mart1、ras突变体、htert、肉瘤易位断点、ml-iap、erg(tmprss2 ets融合基因)、na17、pax3、雄激素受体、细胞周期蛋白b1、mycn、rhoc、trp-2、cyp1b1、boris、sart3、pax5、oy-tes1、lck、akap-4、ssx2、rage-1、人端粒酶逆转录酶、ru1、ru2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、cd79a、cd79b、cd72、lair1、fcar、lilra2、cd300lf、clec12a、bst2、emr2、ly75、gpc3、fcrl5或igll1。172.根据实施方案164-171中任一项所述的组合物，其中所述car包含包含共刺激信号域或初级信号域和共刺激信号域的胞内信号域，并且其中所述共刺激信号域包含cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3，一种与cd83、cds、icam-1、gitr、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、cd160、cd19、cd4、cd8alpha、cd8beta、il-2r beta、il-2rγ特异性结合的配体、il-7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cdax11b、itg、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、sellpg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、nkp44、nkp30、nkp46或nkg2d。173.如实施方案164-172中任一项所述的组合物，其中该car包含包含cd3 zeta信号传导域的胞内域。174.实施方案166-173中任一项的组合物，其中所述核酸是未整合到经修饰细胞的基因组中的mrna。175.实施方案166-174中任一项的组合物，其中编码cd40的核酸与氧敏感多肽域相关，并且任选地其中氧敏感多肽域包含hifla vhl结合域。176.实施方案166-175中任一项的组合物，其中所述核酸由包含转录调节剂的结合位点的启动子调节，所述转录调节剂调节所述治疗剂在所述细胞中的表达和/或分泌，并且任选地其中所述转录调节剂包括hif1a、nfat、foxp3和nfkb中的一种或多种。177.如实施方案164-176中任一项所述的组合物，其中所述修饰的t细胞包含编码显性失活形式的抑制性免疫检查点分子或其受体的核酸，并且任选地其中所述抑制性免疫检查点分子包含程序性死亡1(pd-1)、细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla-4)、b和t淋巴细胞衰减剂(btla)、t细胞免疫球蛋白粘蛋白3(tim-3)、淋巴细胞活化蛋白3(lag-3))、具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体(tigit)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(lair1)、自然杀伤细胞受体2b4(2b4)或cd160。178.实施方案164-177中任一项的组合物，其中所述修饰的t细胞具有降低的内源trac基因的表达。179.实施方案164-178中任一项的组合物，其中所述修饰的t细胞包含编码htert的核酸或编码sv40lt的核酸，或其组合。180.如实施方案164-179中任一项所述的组合物，其中所述修饰的t细胞包含编码治疗剂的外源核酸，并且所述治疗剂包含il-1p、il-2、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-10、il-12、il-13、il-15、il-17、il-1ra、il-2r、ifnγ、mip-ln、mip-ip、mcp-1、tnfα、gm-csf、gcsf、cxcl9、cxcl10、cxcr因子、vegf、rantes、eotaxin、egf、hgf、fgf-p和铁蛋白中的一种或多种。181.如实施方案164-180中任一项所述的组合物，其中所述修饰的t细胞包含下列
的至少一种：1)修饰的t细胞，所述修饰的t细胞包含结合白细胞表面分子的第一car和结合实体瘤抗原的第二car，2)修饰的t细胞，所述修饰的t细胞包含第一car但不包含第二car，和3)修饰的t细胞，所述修饰的t细胞包含第二car但不包含第一个car。182.实施方案164-181中任一项的组合物，其中所述t细胞源自患有癌症的受试者或健康供体。实例
[0208]
下文中所述的生成编码单个car分子的慢病毒载体并用t细胞转染、与细胞培养相关的技术、细胞毒性t淋巴细胞检测的构建可以在文献“control of large,established tumor xenografts with genetically retargeted human t cells containing cd28 and cd137 domains,”pnas,march 3,2009,vol.106no.9,3360
–
3365”和“chimeric receptors containing cd137 signal transduction domains mediate enhanced survival of t cells and increased antileukemic efficacy in vivo,”molecular therapy,aug.2009,vol.17no.8,1453
–
1464”中找到，其全部内容通过引用并入本文。
[0209]
图2显示了使用流式细胞术测定的car表达率和细胞表型。图3显示了转导到t细胞中的各种载体的示意图。有关载体和细胞的信息在表2中提供，实验设计在表3中提供。表2
细胞id构造1234h19car(人源化cd19 car)7429h19bbz(人源化cd19+4-1bb)-2a-cd40(细胞外)-cd28(tm)-cd28(细胞内)7430h19bbz-2a-cd40(全长)
[0210]
取健康志愿者外周血，用pan t细胞分离试剂盒分选cd3+t细胞。然后将分离的cd3+t细胞与100ul/1x10
7 t细胞混合。在第1天，用编码h19 car的慢病毒载体(moi＝10.00)、编码h19bbz-2a-cd40(细胞外)-cd28(tm)-cd28(细胞内)car(moi＝60.17)和编码h19bbz-2a-cd40 car(moi＝60.35)的慢病毒载体转导活化的cd3+t细胞。对照组细胞未转染载体。由于cd19 car的scfv来自人源化抗体，因此它们是用人car抗体检测到的。在第6天进行流式细胞术测定的car表达率和细胞表型，结果如图2所示。表3
[0211]
图4和图5显示了cd137表达的流式细胞术分析结果，表明k562-cd40l可以显着激
活7429和7430。与1234相比，7429和7430显示出显着激活。图6和7显示了cd40在被k562-cd40l刺激以从记忆细胞分化为效应细胞的t细胞上过表达的流式细胞术分析结果。与1234相比，7429和7430显示出更多处于分化状态的细胞。图8和图9显示了在被k562-cd40l刺激后显着增殖的t细胞上cd40的过表达。celltrace
tm
用于测量扩增水平。与1234相比，7429和7430显示出更高的扩增水平。图10和11显示了与没有cd40l刺激的t细胞相比，在接受cd40l刺激后下调cd40表达和pd-1表达的包括编码cd40的载体的t细胞的流式细胞术分析结果。下调提高了细胞治疗的安全性。与1234相比，7429和7430均未显示pd1表达的显着上调。此外，与表达cd40l的k562共培养表明，car t细胞上的cd40表达下调，进一步确保了car t治疗临床使用的安全性。
[0212]
这些结果表明，cd40l的刺激可以增强表达car和cd40胞外域的t细胞的活化和扩增。此外，cd40激动剂可以替代cd40l来增强激活和扩增。各种cd40激动剂是可商购的。cd40激动剂具有一定的半衰期，使其可控且安全。
[0213]
在第0天，从健康志愿者中抽取外周血并分选以收集cd3+t细胞。cd3/cd28 dynabeads以1:1的比例添加到收集的cd3+t细胞中。在第1天，用各种载体转染活化的cd3+t细胞，图29中提供了cd19 car，tshr car以及tshr-cd19 tancar构建体的结构和序列信息。在第2天，更换培养基；移除慢病毒；并将细胞重新悬浮在新鲜培养基中。在第5天，对car表达进行流式细胞术分析。
[0214]
将car t细胞与nalm6或b-cpab-b肿瘤细胞共培养24小时，收集上清液，检测ifnγ释放，其中nalm6是cd19阳性肿瘤细胞，b-cpab-b是tshr阳性肿瘤细胞，结果如图30所示。如图30左图所示，与响应b-cpab-b释放的ifnγ相比，cd19 car t细胞响应nalm6释放更多ifnγ。如图30中图所示，与响应nalm6释放的ifnγ相比，tshr car t细胞响应b-cpab-b释放更多ifnγ。如图30右图所示，双特异性car t细胞均释放大量ifnγ以响应nalm6和b-cpab-b。这些结果表明双特异性car t细胞可以被cd19阳性或tshr阳性肿瘤细胞刺激。进行了类似的细胞因子释放测定并显示双特异性car t(cldn18.2-cd19双特异性car或cldn18.2-19tan car)细胞被nalm6和表达cldn18.2的细胞激活(图36)。
[0215]
在第0天，从健康志愿者中抽取外周血并用pan t cell isolation试剂盒分选以收集cd3+t细胞，cd3/cd28 dynabeads以3:1的比例添加到收集的cd3+t细胞中。在第1天，用各种载体转染活化的cd3+t细胞得到表4所示的car t细胞，剩余的细胞用作nt(未转染)。在第2天，移除慢病毒和dynabeads，并更换培养基。在第6天，使用流式细胞术测定各组中car比率和car t细胞的细胞表型。由于抗acpp抗体是人源化抗体，抗muc1抗体是鼠源抗体，因此分别使用兔抗人car抗体和兔抗小鼠car抗体检测这两种scfv的表达。在第7天，根据表5进行实验。在完全活化24小时后对样品进行流动染色。收集上清液进行细胞计数微珠阵列(cba)检测，羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)染色观察增殖情况。将细胞与荧光底物细胞共培养，观察荧光底物细胞的存活情况，以确定杀伤效果。表4：car t细胞和底物细胞
表5：用于共培养测定的细胞
[0216]
几种标志物(即，cd137、cd25和cd40l)在car t细胞和tancar t细胞上的表达的流式细胞术测定结果显示在图38中。nt、6917、6921、2529、2530、2533、2534和底物细胞(mcf-7、pc3-acpp、293t细胞)共培养24小时。在第8天进行流式细胞术检测。将car t细胞和三种底物细胞(293t、mcf-7、pc3-acpp)共培养24小时。car t细胞活化后进行流式细胞术检测。如图38所示，纵坐标分别为car+cd137+细胞(car+细胞总数)和car+cd25+(car+细胞总数)。从cd137和cd25的表达来看，四种类型的tancar细胞被相应的底物细胞有效激活。在car t细胞与底物细胞(293t、mcf-7和pc3-acpp)共培养24小时后，通过流式细胞术对cd40l的表达进行统计分析。四种类型的tancar细胞表达cd40l，可激活cd40+和免疫系统的其他免疫细胞，如b细胞、激活的单核细胞、dcs等。
[0217]
图39-41则显示了car t细胞和tancar t细胞的细胞因子释放。nt、6917、6921、6921、2529、2530、2533、2534和底物细胞(mcf-7、pc3-acpp、293t细胞)共培养24小时，并在第8天测量细胞因子的释放。
[0218]
图42显示了在用相应的底物细胞刺激5天后每组中细胞的扩增。与对照组相比，
tancar组对两种底物细胞均表现出明显的扩增。在与底物细胞(mcf-7、pc3-acpp、293t细胞)共培养5天后，在第12天测量6917、6921、2529、2530、2533、2534和nt的增殖。。
[0219]
图43显示杀伤测定结果。结果表明6917抑制mcf-7，6921抑制pc3-acpp。四组tancar t细胞杀死了两种底物细胞。nt为实验阴性。对照(肿瘤)仅包含肿瘤细胞。在与底物细胞共培养五天后，对6917、6921、2529、2530、2533、2534和nt细胞进行了杀伤测定。
[0220]
图44显示了car t细胞和tancar t细胞上标志物的表达。图45显示使用流式细胞术测定的细胞因子释放。在第8天，将2407、163和2517与mcf-7、kato3+和293t细胞共培养24小时，并进行细胞因子释放测定。tancar 2517被mcf-7和kato3+底物细胞激活，tan car 2517的激活表达与具有单个car的细胞相当。相应的car t细胞与底物细胞(293t、mcf-7和kato3+)共培养24小时，流式细胞仪检测cd40l的表达。
[0221]
图46和47显示了响应于底物细胞的各种car t细胞和tancar t细胞的细胞因子释放。实验过程与上述实验相似。表6
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本说明书中引用的所有出版物，专利和专利申请均通过引用整体并入本文，如同每个单独的出版物，专利或专利申请被具体和单独地指示为通过引用并入。虽然已经根据各种实施例描述了前述内容，但是本领域技术人员将认识到，在不脱离其精神的情况下可以进行各种修改，替换，省略和改变。

技术特征：
1.一种增强t细胞响应的方法，所述方法包括：将编码嵌合抗原受体(car)的核酸和编码cd40的胞外结构域的核酸导入t细胞以获得修饰的t细胞；以及使所述修饰的t细胞与所述car结合的抗原和cd 40活化剂接触，从而诱导t细胞应答，其中所述t细胞应答大于通过使所述修饰的t细胞与所述抗原而无所述cd 40活化剂接触而诱导的t细胞应答。2.根据权利要求1的方法，其中所述cd 40活化剂是cd 40配体或cd 40激动剂。3.根据权利要求1的方法，其中编码cd 40胞外结构域的核酸包含核酸序列seq id no：36所示。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述t细胞响应包括t细胞扩增和/或t细胞激活。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述car包含抗原结合结构域，跨膜结构域和胞内信号传导结构域。6.根据权利要求5所述的方法，所述抗原结合域结合肿瘤抗原，所述肿瘤抗原包括tshr、cd19、cd123、cd22、cd30、cd171、cs-1、cll-1、cd33、egfrviii、gd2、gd3、bcma、tn ag、psma、ror1、flt3、fap、tag72、cd38、cd44v6、cea、epcam、b7h3、kit、il-13ra2、间皮素、il-11ra、psca、prss21、vegfr2、lewisy、cd24、pdgfr-beta、ssea-4、cd20、叶酸受体α、erbb2(her2/neu)、muc1、egfr、ncam、prostase、pap、elf2m、ephrin b2、igf-i受体、caix、lmp2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、epha2、fucosyl gm1、sle、gm3、tgs5、hmwmaa、o-乙酰基-gd2、叶酸受体β、tem1/cd248、tem7r、cldn6、gprc5d、cxorf61、cd97、cd179a、alk、聚唾液酸、plac1、globoh、ny-br-upk2、havcr1、adrb3、panx3、gpr20、ly6k、or51e2、tarp、wt1、ny-eso-1、lage-1a、mage-a1、legumain、hpv e6、e7、mage a1、etv6-aml、精子蛋白17、xage1、tie 2、mad-ct-1、mad-ct-2、fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺素、存活蛋白和端粒酶、pcta-1/半乳糖凝集素8、melana/mart1、ras突变体、htert、肉瘤转移断点、ml-iap、erg(tmprss2 ets融合基因)、na17、pax3、雄激素受体、细胞周期蛋白b1、mycn、rhoc、trp-2、cyp1b1、boris、sart3、pax5、oy-tes1、lck、akap-4、ssx2、rage-1、人端粒酶逆转录酶、ru1、ru2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、cd79a、cd79b、cd72、lair1、fcar、lilra2、cd300lf、clec12a、bst2、emrpc、ly75、grl和igll1中一种或多种。7.根据权利要求5所述的方法，所述细胞内信号域包括共刺激信号域，或初级信号域和共刺激信号域，其中共刺激信号传导域包含选自由以下组成的组的蛋白质的功能性信号传导域：cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、cd83、cds、icam-1、gitr、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、cd160、cd19、cd4、cd8alpha、cd8beta、il-2r beta、il-2r gamma、il-7r特异性结合α、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgad、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、sellpg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、nkp44、nkp30、nkp46和nkg2d中一种或多种。8.根据权利要求5所述的方法，述胞内结构域包括cd 3ζ信号传导结构域。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸是不整合到所述修饰细胞的基因组中的mrna。
10.根据权利要求1的方法，其中编码cd 40胞外结构域的核酸与氧敏感多肽结构域相关。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述氧敏感多肽结构域包括hif 1a vhl结合结构域。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸由启动子调节，所述启动子包括用于转录调节剂的结合位点，所述转录调节剂调节所述细胞中治疗剂的表达和/或分泌。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述转录调节剂包括hifla，nfat，foxp 3和nfkb中的一种或多种。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述经修饰的t细胞包含编码抑制性免疫检查点分子或其受体的显性阴性形式的核酸。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述抑制性免疫检查点分子包括程序性死亡1(pd-1)，细胞毒性t淋巴细胞抗原-4(ctla-4)，b-和t淋巴细胞衰减器(btla)，t细胞免疫球蛋白mucin-3(tim-3)，淋巴细胞活化蛋白3(lag-3)，具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体(tigit)，白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(lairi)，自然杀伤细胞受体2b 4(2b4)或cd160。16.根据权利要求1所述的方法，其中所述经修饰的t细胞具有降低的内源性trac基因的表达。17.根据权利要求1所述的方法，其中所述经修饰的t细胞包含编码htert或编码sv 40lt的核酸或其组合的核酸。18.权利要求1的方法，其中所述修饰的t细胞包括编码治疗剂的外源核酸，并且所述治疗剂包括il-1p，il-2，il-4，il-5，il-12，il-13，il-15，il-17，il-1ra，il-2r，ifn y，mip-ln，mip-ip，mcp-1，tnfα，gm-csf，gcsf，cxcl 9，cxcl 10，cxcr因子，vegf，rantes，eotaxin，egf，hgf，fgf-p和铁蛋白中的一种或多种。19.根据权利要求1所述的方法，其中所述经修饰的t细胞包括以下中的至少一种：1)经修饰的t细胞，所述经修饰的t细胞包括结合白细胞表面分子的第一car和结合固体肿瘤抗原的第二car，2)修饰的t细胞，所述修饰的t细胞包括没有所述第二car的所述第一car，以及3)修饰的t细胞，所述修饰的t细胞包括所述第二car而无所述第一car。20.根据权利要求1所述的方法，其中所述t细胞衍生自具有癌症或健康供体的受试者。

技术总结
本公开涉及融合蛋白及其用途。例如，融合蛋白包括胞外结构域，跨膜结构域和胞内结构域。细胞外结构域来源于第一分子，细胞内结构域衍生自第二分子，第一分子不同于第二分子，第二分子包含OX 40，CD 40，4-1BB，GITR，ICOS，CD 28，CD 27，HER2，EGFR，IL-10R，IL-12R，IL-18R 1，IL-23R，GP 130或IL-15Ra。15Ra。15Ra。


技术研发人员：蒲程飞 沈晓钢 曹志远 肖磊 贾贝贝 田乐
受保护的技术使用者：创新细胞治疗公司
技术研发日：2021.08.24
技术公布日：2023/8/24