一种生物结合化学法制备D-脯氨酸的方法与流程

一种生物结合化学法制备d-脯氨酸的方法
技术领域
1.本发明属于生物技术和化工领域，涉及一种生物结合化学法制备d-脯氨酸的方法，更具体的是一种基因工程重组菌株e.coli bl21/petduet-race-dglucy的构建，以及利用其催化产物结合化学合成d-脯氨酸的方法。


背景技术：

2.d-脯氨酸(d-proline，分子式：c5h9no2，cas号：344-2532)是一类重要的手性试剂和手性中间体。既可用作拆分试剂和手性试剂，也可以作为合成某些手性药物的手性中间体，如可以作为抗偏头痛药物依来曲普坦的关键手性中间体。依来曲普坦(eletriptan)是由辉瑞公司开发的于2001年首次在澳大利亚上市，后续在多个国家上市，市场需求量较大，其作用原理主要是通过激活人体内5-ht1相关受体抑制神经肽释放，收缩颅内血管丙抑制神经性炎症发挥抗偏头痛效应；此外，d-脯氨酸还是合成一叶萩型生物碱(-)-securinine a的关键前体，该生物碱用于临床治疗小儿麻痹症、肌萎缩侧索硬化症和慢性再生障碍性贫血等疾病；并且，d-脯氨酸还是合成(r)-harmicine的关键前体，该物质是一种具有多重药理活性的β-咔啉生物碱。而作为不对称的有机催化剂是由于d-脯氨酸具有刚性构象，可以作为不对称有机催化剂催化多个反应如不对称mannich反应、aldol反应、mannich
–
aza michael反应、morita-bayllis-hillman反应、heck交叉偶联反应、多组分反应，用于合成各种结构的手性分子。综上，d-脯氨酸无论是作为手性试剂还是作为医药中间体都具有重要的价值，具有广阔的市场前景。
3.目前，d-脯氨酸的制备方法可以分为化学法和生物法两种。化学法目前工业上主要是通过采用化学不对称转化技术制备，该技术是以l-脯氨酸为原料，正丁醛为催化剂，在正丁酸溶剂中与l-酒石酸反应制备d-脯氨酸-l-酒石酸盐，然后在甲醇中用氨水处理得到d-脯氨酸，该方法主要存在生产成本偏高、环境污染大等问题；另一种化学方法制备d-脯氨酸是以吡咯烷-2-甲醛为原料，不对称还原为d-脯氨醇，然后氧化为d-脯氨酸，但是该方法需要采用昂贵的原料和手性金属催化剂，d-脯氨酸的对映体过量(enantiomeric excess，ee)值也不高。
4.生物法制d-脯氨酸的方法主要有生物不对称合成法制备、生物拆分法制备、对映选择性降解法制备d-脯氨酸。其中，生物不对称合成法主要是以l-精氨酸为原料，化学合成l-cl-精氨酸，利用微生物菌体将其水解为(s)-5-氨基-2-氯戊酸，然后自动反转、关环为d-脯氨酸，该路线成本非常高，不适合工业化应用；生物拆分法主要是利用一种特异性的酶去作用于dl-脯氨酸衍生物中的l-脯氨酸衍生物，而d-脯氨酸衍生物得到保留。l-脯氨酸衍生物被酶催化后还原为l-脯氨酸，分离出的l-脯氨酸可作为制备dl-脯氨酸的原料；对映体选择降解法制备主要是以dl-脯氨酸为原料，通过特定微生物在培养基中生长的同时降解dl-脯氨酸中的l-脯氨酸，d-脯氨酸得到保留。该法的优点是环境污染较轻，但是制备的产量较低，依赖于底物dl-脯氨酸原材料，所制备d-脯氨酸的成本高，无法工业化应用。
5.由于生物法制备d-脯氨酸的技术和成本问题，市场上现有技术为化学法生产，因
脯氨酸。
23.进一步包括：
24.将步骤1)反应液超滤除去酶液后，加入甲醇溶液进行酯化反应，在搅拌下缓慢滴加98％硫酸，保持温度65-70℃反应，至反应液全部变清，低温冷却至5-10℃，调节ph＝7.5-8.0，收集沉淀；将沉淀溶解后用光气进行酰氯化反应，待反应完成后，向体系中加入盐酸溶液，后用醇溶结晶后，得到目的产物d-脯氨酸。
25.本发明还提供了工程重组菌株，谷氨酸消旋酶基因和d-谷氨酸环化酶基因构建至表达载体；将共表达载体转化至表达菌株中，抗生素筛选后即为含有谷氨酸消旋酶和d谷氨氨酸环化酶基因的工程重组菌株；
26.进一步地：
27.谷氨酸消旋酶基因和d-谷氨酸环化酶基因构建至大肠杆菌原核表达载体petduet-1，其中谷氨酸消旋酶基因构建至petduet-1中的多克隆位点mcs1中，基因5’端带有ncoi酶切位点，基因3’端带有hindiii酶切位点；d-谷氨酸环化酶基因构建至petduet-1的多克隆位点mcs2中，基因5’端带有ndei酶切位点，基因3’端带有xhoi酶切位点；将共表达质粒构建至大肠杆菌表达菌株bl21(de3)中，抗生素筛选后即为含有谷氨酸消旋酶和d谷氨氨酸环化酶基因的工程重组菌株e.coli bl21/petduet-race-dglucy；
28.更进一步地，谷氨酸消旋酶基因race的氨基酸序列如seq id no.1所示；d-谷氨酸环化酶基因dglucy的氨基酸序列如seq id no.2所示。
29.本发明还提供了所述的工程重组菌株在制备d-脯氨酸中的应用。
30.本发明提供了所述的重组菌株用于d-脯氨酸前体5-氧代-d-脯氨酸的催化制备，其中谷氨酸消旋酶race是以l-谷氨酸为底物催化合成d-谷氨酸，d-谷氨酸环化酶dglucy是以d-谷氨酸为底物催化合成5-氧代-d-脯氨酸。
31.本发明采用酶法+化学法相结合的方法生产脯氨酸，摒弃了化学法不对称转化技术的缺点，利用了酶法高效合成的优点，且选择大宗原材料谷氨酸为起始底物，原料的来源简单易获得，不受原材料来源限制，在谷氨酸消旋酶和d-谷氨酸环化酶的作用生成5-氧代-d-脯氨酸，再结合化学方法生成d-脯氨酸，该技术相比现有的化学合成法和生物法技术具有明显优势：原材料易获得、成本更低、谷氨酸的消旋反应结合环化反应，反应向正向发生，转化效率更高，产物手性纯度更高，为一条全新的d-脯氨酸合成路线。
附图说明：
32.图1为本发明基因工程重组菌株催化+化学法合成d-脯氨酸示意图。
具体实施方式：
33.以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
34.实施例1：基因工程重组菌株的构建
35.从ncbi数据库网站中下载l-谷氨酸消旋酶(race登录号：wp_220220798.1)、d-谷氨酸环化酶氨基酸序列(dglucy登录号：np_001347949.1)，分别进行大肠杆菌表达的密码子优化，并进行全基因合成(谷氨酸消旋酶基因：race(优化后的核苷酸序列见seq id no.3)，d-谷氨酸环化酶基因：dglucy(优化后的核苷酸序列见seq id no.4)，基因合成后构
建至大肠杆菌原核表达载体petduet-1，其中谷氨酸消旋酶基因race构建至petduet-1(novagen公司)中的多克隆位点mcs1中，基因5’端带有ncoi酶切位点，基因3’端带有hindiii酶切位点；d-谷氨酸环化酶基因dglucy构建至petduet-1的多克隆位点mcs2中，基因5’端带有ndei酶切位点，基因3’端带有xhoi酶切位点。经酶切和测序检测验证无误后，采用cacl2热激转化的方法将共表达质粒构建至大肠杆菌表达菌株bl21(de3)中，取适量涂布于含有氨苄青霉素抗性的lb固体平板上，37℃过夜培养12-16h，平板上生长出来的即为含有谷氨酸消旋酶和d谷氨氨酸环化酶基因的工程重组菌株e.coli bl21/petduet-race-dglucy。
36.实施例2：基因工程重组菌株的发酵与目的蛋白表达
37.从lb的固体培养基上挑取单菌落接种于lb液体培养基中，200rpm，37℃振荡过夜培养，次日按照2％接种量接种至tb发酵培养基中，200rpm，37℃振荡培养5-6h，待od600nm＝0.6时，添加终浓度为1％的乳糖，200rpm，25℃诱导培养8-12h，收集菌体，以l-谷氨酸为底物进行后续的全细胞的催化合成反应。
38.实施例3：基因工程重组菌株催化反应
39.(1)收集菌体。取发酵菌体至50ml离心管中，12000r/min离心5min，弃上清；
40.(2)去离子水重悬。向离心管中加入适当去离子水，用枪头充分重悬，重复1-2次；
41.(3)称取l-谷氨酸3.5g，用ph7.5磷酸缓冲液溶解后，称取磷酸吡哆醛(plp)5mg，mncl25 mg于反应杯中，加入50ml水搅拌溶解后，调ph至7.00，加入基因工程重组菌株20ml，定容至100ml，定容后菌浓为400g/l，反应条件：30℃ph7.50，180-220r/min振荡培养，每隔1段时间，取样并进行产物的hplc的分析；
42.(4)产物检测方法
43.hplc检测条件：检测波长210nm，样品进样量：20μl，流速：1.0ml/min柱温：室温，运行时间：25min；
44.色谱柱：shim-pack gist 4.6
×
150mnm 5μm；
45.流动相：磷酸盐溶液(称取13.6g磷酸二氢钾和2.2g庚烷磺酸钠溶于1000ml水中，用磷酸调节ph至2.5，过滤)－乙腈(950∶50)，用孔径0.45μm的水系滤膜过滤后，脱气20min左右备用。
46.表1：5-氧代-d-脯氨酸的合成
[0047][0048]
实施例4：d-脯氨酸的合成
[0049]
按照实施例3方法制备6-7小时的产物5-氧代-d-脯氨酸，将反应液超滤除去酶液后，加入100ml甲醇溶液进行酯化反应，在搅拌下缓慢滴加98％硫酸10ml，保持温度65-70℃，反应2h，至反应液全部变清，低温冷却至5-10℃，用5mol/lnaoh调节ph＝7.5-8.0，收集沉淀；将沉淀用二氯甲烷充分溶解后，转入带有冷阱的三口烧瓶中，降温至-10℃，然后用氮气引流光气至反应瓶中进行反应，当所有光气加入完毕后，在-10℃下继续搅拌1h，然后升温至室温，并在室温下搅拌12h，随后停止反应，用氮气吹干溶液及残留光气，真空浓缩得油状物，将所得油状物加入50ml 3mol/l盐酸，加热回流12h。冷却后，将混合物真空浓缩，再溶于水中，并通过强酸型阳离子交换树脂，用水洗脱产物，直到洗脱液不再呈酸性。收集洗脱液后冷冻干燥后，得d-脯氨酸。
[0050]
表2：本发明的d-脯氨酸制备方法与现有方法对比
[0051][0052]
[1]张小林,漆剑,陶影,高艳,程金星.不对称转换法制备d-脯氨酸的工艺研究[j].南昌大学学报(工科版),006(02):119-121+133.
[0053]
[2]吴法浩,李钢,曲松涛,等.一种d-脯氨酸的合成方法.中国,cn 107827802a[p].2017.
[0054]
[3]production of d-proline from l-arginine using pseudomonas aeruginosa,journal of molecular catalysis b:enzymatic,volume 6,issue 3,1999,pages 359-367.
[0055]
[4]song s,fung kin yuen v,di l,sun q,zhou k,yan n.integrating biomass into the organonitrogen chemical supply chain:production of pyrrole and d-proline from furfural.angew chem int ed engl.2020nov 2；59(45):19846-19850.
[0056]
[5]张凡凡.微生物脯氨酸消旋酶-脯氨酸脱氢酶级联催化制备d-脯氨酸[d].重庆邮电大学,2022.001175.
[0057]
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[0058]
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[0074]
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技术特征：
1.一种生物结合化学法制备d-脯氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)含有谷氨酸消旋酶基因和d-谷氨酸环化酶基因共表达载体的基因工程菌作为催化剂，用l-谷氨酸为前体，催化合成d-脯氨酸前体5-氧代-d-脯氨酸；2)以5-氧代-d-脯氨酸化学法合成d-脯氨酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，谷氨酸消旋酶基因和d-谷氨酸环化酶基因构建至表达载体；将共表达载体转化至表达菌株中，抗生素筛选后即为含有谷氨酸消旋酶和d谷氨氨酸环化酶基因的工程重组菌株。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，谷氨酸消旋酶基因和d-谷氨酸环化酶基因构建至大肠杆菌原核表达载体petduet-1，其中谷氨酸消旋酶基因构建至petduet-1中的多克隆位点mcs1中，基因5’端带有ncoi酶切位点，基因3’端带有hindiii酶切位点；d-谷氨酸环化酶基因构建至petduet-1的多克隆位点mcs2中，基因5’端带有ndei酶切位点，基因3’端带有xhoi酶切位点；将共表达质粒构建至大肠杆菌表达菌株bl21(de3)中，抗生素筛选后即为含有谷氨酸消旋酶和d谷氨氨酸环化酶基因的工程重组菌株e.coli bl21/petduet-race-dglucy。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，谷氨酸消旋酶基因race的氨基酸序列如seq id no.1所示；d-谷氨酸环化酶基因dglucy的氨基酸序列如seq id no.2所示。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，工程菌发酵过程为：从lb的固体培养基上挑取单菌落接种于lb液体培养基中，180-220rpm，30-37℃振荡过夜培养，次日按照0.5-2％接种量接种至tb发酵培养基中，180-220rpm，30-37℃振荡培养4-6h，待od
600nm＝
0.4-0.6时，添加终浓度为0.5-1％的乳糖，180-220rpm，25-30℃诱导培养8-12h，收集菌体，进行后续的全细胞催化合成反应。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，催化合成d-脯氨酸前体5-氧代-d-脯氨酸的过程：l-谷氨酸用适量缓冲液溶解后，加入磷酸吡哆醛、mncl2，搅拌溶解后，调ph，加入基因工程重组菌株反应。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，催化合成体系中l-谷氨酸的浓度为3.5-50g/l，反应ph为7.0-8.0，反应温度为30-35℃，180-220r/min，磷酸吡哆醛含量为20-50mg/l，mncl2含量为20-50mg/l，湿菌体浓度为200-400g/l；反应时间3-7h。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，5-氧代-d-脯氨酸经过酯化、酰氯化、水解反应三个步骤最后得到d-脯氨酸；进一步包括：将步骤1)反应液超滤除去酶液后，加入甲醇溶液进行酯化反应，在搅拌下缓慢滴加98％硫酸，保持温度65-70℃反应，至反应液全部变清，低温冷却至5-10℃，调节ph＝7.5-8.0，收集沉淀；将沉淀溶解后用光气进行酰氯化反应，待反应完成后，向体系中加入盐酸溶液，后用醇溶结晶后，得到目的产物d-脯氨酸。9.工程重组菌株，谷氨酸消旋酶基因和d-谷氨酸环化酶基因构建至表达载体；将共表达载体转化至表达菌株中，抗生素筛选后即为含有谷氨酸消旋酶和d谷氨氨酸环化酶基因的工程重组菌株；
进一步地：谷氨酸消旋酶基因和d-谷氨酸环化酶基因构建至大肠杆菌原核表达载体petduet-1，其中谷氨酸消旋酶基因构建至petduet-1中的多克隆位点mcs1中，基因5’端带有ncoi酶切位点，基因3’端带有hindiii酶切位点；d-谷氨酸环化酶基因构建至petduet-1的多克隆位点mcs2中，基因5’端带有ndei酶切位点，基因3’端带有xhoi酶切位点；将共表达质粒构建至大肠杆菌表达菌株bl21(de3)中，抗生素筛选后即为含有谷氨酸消旋酶和d谷氨氨酸环化酶基因的工程重组菌株e.coli bl21/petduet-race-dglucy；更进一步地，谷氨酸消旋酶基因race的氨基酸序列如seq id no.1所示；d-谷氨酸环化酶基因dglucy的氨基酸序列如seq id no.2所示。10.权利要求9所述的工程重组菌株在制备d-脯氨酸中的应用。

技术总结
本发明属于生物技术和化工结合领域，涉及一种生物结合化学法制备D-脯氨酸的方法。通过在工程菌中实现谷氨酸消旋酶和D-谷氨酸环化酶的共表达，以此工程菌株为全细胞催化剂，以L-谷氨酸为底物，结合化学方法实现D-脯氨酸的高效合成。利用本发明的基因工程重组菌株结合化学方法应用于D-脯氨酸的合成，相比现有技术，原料来源简单，成本更低，产物得率更高，手性纯度更好。性纯度更好。性纯度更好。


技术研发人员：周晶辉 许岗 曾红宇 黄毅 赵强 赵士敏
受保护的技术使用者：湖南福来格生物技术有限公司
技术研发日：2023.05.30
技术公布日：2023/8/24