巯基DNA与金纳米簇键合的反应液及反应方法

巯基dna与金纳米簇键合的反应液及反应方法
技术领域
1.本发明属于纳米材料技术领域，尤其适用于巯基dna与金纳米簇键合的反应液及反应方法。


背景技术：

2.金纳米簇(auncs)是一种具有类分子结构的超小纳米材料，具有比表面积高、制备简单、水溶性好、毒性低、生物相容性好等独特的物理化学性质，广泛应用于催化、生物成像、防腐等领域。dna与金纳米簇相结合是纳米科技领域的一个热点，由于作为遗传信息载体的dna序列可精确调控且可人工设计合成，因此，dna不仅可以驱动auncs的组装，构建具有不同结构和特殊性质的纳米复合材料，而且，由于dna有特定的序列识别作用和优良的生物相容性，构建的纳米复合物可以用于疾病检测及治疗。
3.由于巯基与金元素可以形成稳定的共价键(au-s)，共价键合反应是将dna键合在金纳米簇表面的重要途经。但是，dna分子一般比较大，而金纳米簇表面通常覆盖一层由配体(ligands)形成的紧密保护层，因此，空间阻碍的作用导致au-s键合反应一般比较慢，通常需要过夜反应，有的甚至需要数天(acs nano,2009.3(2):p.418-424.)；而且，键合的效率一般也比较低(nano letters,2004.4(4):p.737-740.)。因此，快速、高效的巯基dna与金纳米簇键合技术是dna-金纳米簇复合物构建过程中一个亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

4.本发明解决的技术问题在于提供一种巯基dna与金纳米簇键合的反应液及反应方法，实现巯基dna与金纳米簇的快速、高效键合。
5.有鉴于此，本技术提供了一种巯基dna与金纳米簇键合的反应液，包括酸碱缓冲溶液与键合辅助剂；所述反应液的ph值为6～10。
6.优选的，所述酸碱缓冲溶液为磷酸盐、磷酸、醋酸、金属氢氧化物、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、硼酸和硼酸盐中的一种或多种。
7.优选的，所述辅助剂为氰基硼氢化物、三(2-羧乙基)膦和含三(2-羧乙基)膦盐类的一种或多种。
8.优选的，所述酸碱缓冲溶液浓度为2～20mm。
9.优选的，所述反应液的ph值为7～8.5。
10.本技术还提供了一种巯基dna与金纳米簇键合的方法，包括：将含金纳米簇的纳米材料、巯基dna和反应液混合后反应；所述反应液包括酸碱缓冲溶液与键合辅助剂；所述反应液的ph值为6～10。
11.优选的，所述反应时间为1～2小时。
12.优选的，所述键合辅助剂的浓度为1mm～1m。
13.优选的，所述巯基dna与所述金纳米簇的摩尔数之比为(3～100):1。
14.采用本发明提供的巯基dna与金纳米簇键合的反应液及反应方法可以显著提高巯
基dna与金纳米簇之间的键合效率，相比于常用的需要至少8小时巯基交换法，本发明的反应最短只需要1小时，表面键合dna量提高了10倍。所制得的巯基dna-金纳米簇复合材料用于相应的microrna检测，无论从检测限还是线性范围较目前报导的方法都有明显的优势。
附图说明
15.图1auncs的表征结果：(a)hrtem图像，(b)粒径分布图。注：该粒径分布图由digital micrograph软件对hrtem图像中纳米簇直径进行计算处理所得。
16.图2auncs的荧光发射图谱。测量条件：(激发波长为468nm，发射波长为528nm)。
17.图3fe3o4nps的电镜图。
18.图4氨基化fe3o4nps@sio2的tem图。
19.图5fe3o4nps@sio2(1)、fe3o4nps@sio2@auncs(2)以及auncs(3)的荧光发射光谱。
20.图6不同反应条件下所得fe3o4nps@sio2@auncs@h1的荧光光谱。1.空白对照；2.反应过程中不加三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep)；3.反应过程中加入tcep。
21.图7tcep的浓度对h1负载量的影响。(激发波长358nm，发射波长450nm)。
22.图8(a)不同浓度microrna-21的荧光响应情况，(b)microrna-21的标准曲线。
23.图9(a)不同浓度microrna-141的荧光光谱，(b)microrna-141的标准曲线。
具体实施方式
24.本技术提供了一种巯基dna与金纳米簇键合的反应液，包括磷酸盐、磷酸、醋酸、金属氢氧化物、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、硼酸和硼酸盐中的一种或多种成分组成的酸碱缓冲溶液以及氰基硼氢化物、三(2-羧乙基)膦和含三(2-羧乙基)膦盐类的一种或多种物质组成的键合辅助剂；缓冲溶液浓度为5～100mm；所述反应液的ph值为7～8.5。
25.本技术还提供了一种巯基dna与金纳米簇键合的方法，包括：将含金纳米簇的纳米材料、巯基dna和上述反应液混合后反应；反应液中键合辅助剂的浓度为1mm～1m，巯基dna与金纳米簇的摩尔数之比为(3～100):1；反应时间为1～2小时。
26.为进一步理解本发明，本技术采用本领域的技术人员通常采用的方式，首先将金纳米簇共价键合在磁性材料的表面，经过与巯基dna反应之后，通过磁场收集磁性复合材料，分析表面结合的巯基dna的量来评价性能，并将材料应用于microrna检测来检验其效果。
27.下面结合实施例对本发明提供的方法进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
28.下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径购得。
29.本发明涉及的dna及microrna由上海生工公司合成，序列见表1。
30.表1发夹dna及microrna序列
[0031][0032]
实施例1
[0033]
本实施例合成金纳米簇；然后合成二氧化硅包裹的磁性纳米材料，并将其表面功能化，通过化学键合的方式将纳米簇固定在磁性材料表面。
[0034]
1.1金纳米簇的合成
[0035]
参照以往文献(chemistry of materials,2017.29(3):p.1362-1369)并作适当优化，一定量的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶(att)溶解在15ml naoh(0.2m)溶液中，最终浓度为80mm，将其加入到15ml 25.4mm的haucl4水溶液中，常温避光搅拌反应1h，50kda超滤膜超滤除去未反应的att，得到的初始纳米簇重新分散在30ml高纯水中，避光保存于4℃冰箱。将2ml 80mm l-精氨酸(ph＝10)加入到18ml初始纳米簇溶液中，混合溶液在37℃下避光连续搅拌24h，最后将合成的最终金纳米簇(auncs)避光储存在4℃冰箱中。
[0036]
高分辨透射电镜图图1a证实所合成auncs是单分散的，同时表明了金纳米簇高度晶化，晶格间距为0.230nm，这与面心立方(fcc)金的晶面(111)的晶格间距刚好匹配。由图1(b)au ncs的粒径分布图可知，平均粒径为2.18
±
0.24nm。金纳米簇的平均半径为1.09nm。
[0037]
经原子发射光谱检测到au元素的含量为3.63mm，用下列文献报道的方程式(acs applied nano materials,2021.4(1):p.305-312)计算auncs的浓度：
[0038][0039]
其中c是auncs(m)的浓度，cm代表haucl 4
·
4h2o的摩尔浓度，m
au
是au的摩尔质量，r是auncs的平均半径，ρ是au的密度(19.32g
·
cm-3
)，n0是阿伏伽德罗常数。
[0040]
计算可得auncs的浓度为11.21μm。
[0041]
图2的发射光谱显示auncs的荧光最大发射波长为528nm。
[0042]
1.2磁性纳米材料(fe3o4nps)的制备
[0043]
将1.9875g fecl2·
4h2o、5.4060g fecl3·
6h2o、100ml除氧水加入到250ml的三颈烧瓶中，持续机械搅拌，整个实验过程在氮气气氛下进行。当温度升高到80℃时，逐滴加入25％氨水，待反应2小时后加入一定量的柠檬酸，使得其最终浓度为0.1mol/l。合成的裸磁性纳米颗粒用磁铁收集，并分别用除氧水和乙醇洗涤6次，最后将其分散在无水乙醇中。
[0044]
用tem表征所制备的产品的形貌，如图3所示，裸fe3o4nps形貌呈球形，形状规则，大小均匀，平均粒径约为15nm，符合超顺磁体的要求。
[0045]
1.3硅烷化磁性纳米颗粒(fe3o4nps@sio2)的合成
[0046]
将fe3o4nps超声分散在100ml含有17％氨水的乙醇溶液中，机械搅拌下用加样器逐滴加入6.5ml正硅酸乙酯(teos)，2小时后，用磁铁收集fe3o4nps@sio2，并分别用甲醇、除氧水和乙醇洗涤六次，保存在无水甲醇中。
[0047]
1.4氨基化fe3o4nps@sio2的合成
[0048]
将30ml fe3o4nps@sio2超声分散在100ml甲醇中，在氮气保护下逐滴滴入15ml 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(aptes)，60℃下搅拌回流8小时，磁分离并用无水甲醇洗涤6次。
[0049]
图4显示了制备的氨基化fe3o4nps@sio2的扫描电子显微镜(tem)图像，可以观察到样品是核-壳结构，壳层均匀，厚度约为14nm。这表明磁性纳米颗粒表面成功涂覆了sio2层。从高分辨tem(hrtem)可以清晰的观察到fe3o4的晶格条纹，其中0.484nm的晶格间距对应的是铁的(111)晶面，证明了单个的氨基化fe3o4nps@sio2具有良好的结晶性能，有利于增强饱和磁通密度。
[0050]
1.5羧基化fe3o4nps@sio2的合成
[0051]
对文献方法(colloids and surfaces a:physicochemical and engineering aspects,2019.572:p.58-66)稍作修改后合成。在100ml三颈瓶中加入0.5g丁二酸酐和35ml n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，混合均匀后，0.1mg氨基化fe3o4nps@sio2溶解于15ml dmf并将其逐滴加入到烧瓶中。随后通氮气25℃反应8h后，再反应过夜。所得磁性纳米颗粒用乙醇洗涤6次，真空干燥箱60℃烘干备用。
[0052]
1.6fe3o4nps@sio2@auncs的组装
[0053]
取5mg羧基化fe3o4nps@sio2分散到2ml100 mm 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)与4ml100 mm n-羟基丁二酰亚胺(nhs)的混合溶液(ph＝6.0的mes缓冲配制)，30℃振荡反应1h以活化磁性纳米颗粒表面的羧基，然后用20mm磷酸盐缓冲溶液(pbs,ph＝7.2)洗涤四次后加入800μl auncs，于30℃振荡反应3.5h后，用20mm三羟甲基氨基甲烷(tris)溶液封闭1小时，用ph＝7.2的pbs缓冲溶液洗涤7次，将产品分散到10ml缓冲溶液，配成0.5mg/ml溶液备用。
[0054]
图5的荧光光谱图显示，在468nm的激发波长下，fe3o4nps@sio2没有荧光发射，而其表面键合了auncs之后的fe3o4nps@sio2@auncs显示明显的荧光，其波长相较于auncs的荧光发射峰蓝移了3nm，说明将auncs键合在fe3o4nps@sio2表面的化学反应没有显著影响auncs的外部环境，更没有改变其内核结构。
[0055]
根据图5中fe3o4nps@sio2@auncs与auncs的荧光强度及两种材料的用量，推算出fe3o4nps@sio2@auncs表面auncs的含量为4.66
×
10-11
mole/mg。
[0056]
实施例2
[0057]
本实施例通过向反应溶液中加入三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep)，将巯基修饰的带有荧光基团(amca)的发夹dna h1键合在fe3o4nps@sio2@auncs的表面。
[0058]
具体步骤如下：首先，向0.5ml无菌离心管中加入100μl fe3o4nps@sio2@auncs(0.5mg/ml)，磁吸去掉上清液，分别加入20μl 5mm edta，10μl 2mm tcep，2μl 5μm h1，8μl pbs(10mm,ph＝7.0)。总反应体积40μl，此溶液中tcep的最终浓度为1mm，缓冲溶液的浓度为2mm，h1与fe3o4nps@sio2@auncs表面auncs的摩尔比为2.85：1。30℃孵育1.0h之后缓冲溶液洗涤4次，再分散于200μl pb测量fe3o4nps@sio2@auncs@h1表面荧光基团amca在450nm处的荧光，从而评估h1的键合效率。
[0059]
图6显示，在反应溶液中加入tcep反应1.0小时之后，在450nm处的荧光强度(曲线3)相比于基底材料(曲线1)显著提高，荧光计数从1.07
×
104提高到3.75
×
104，提高了2.68
×
104，说明h1成功键合在fe3o4nps@sio2@auncs的表面。
[0060]
对比例1
[0061]
本对比例采用文献报道的方法(nano letters.4(2004)737
–
740)将h1键合在fe3o4nps@sio2@auncs的表面。所有步骤与实施例2相同，不同之处在于，本对比例中没有加入tcep，且孵育时间增加为8小时。
[0062]
具体操作步骤如下：首先，向0.5ml无菌离心管中加入100μl fe3o4nps@sio2@auncs(0.5mg/ml)，磁吸去掉上清液，分别加入20μl 5mm edta，10μl三次蒸馏水，2μl 5μmh1，8μl pbs(10mm,ph＝7.0)。总反应体积40μl。30℃孵育8h之后缓冲溶液洗涤4次，再分散于200μl pb测量荧光。
[0063]
图6显示，反应溶液中不含tcep反应8小时之后，在450nm处的荧光强度(曲线2)相比于基底材料(曲线1)并没有明显提高，荧光发射计数为1.34
×
104，相对于空白增加了2.7
×
103；这个增量只有实施例2的十分之一，说明在此条件下，h1在fe3o4nps@sio2@auncs表面键合效率很低。
[0064]
通过以上的实验可知，在反应液中加入tcep之后，反应1.0小时测得纳米材料表面的荧光增量是传统方法反应8小时获得荧光增量的大约10倍，说明采用本发明的方法在纳米簇表面结合h1的量大大提高。
[0065]
实施例3
[0066]
本实施例探究反应过程中tcep浓度的影响。
[0067]
具体操作步骤如下：向0.5ml无菌离心管中加入100μl fe3o4nps@sio2@auncs(0.5mg/ml)，磁吸去掉上清液，分别加入20μl 5mm edta，10μl不同浓度的tcep，2μl 175μm h1，8μl tris-盐酸缓冲溶液(100mm,ph＝8.5)。总反应体积40μl，此溶液中tcep的最终浓度分别为1μm、10μm、100μm、1mm、10mm、100mm和1m，缓冲溶液的浓度为20mm，h1与fe3o4nps@sio2@auncs表面auncs的摩尔比为100：1。30℃孵育2h之后缓冲溶液洗涤4次，再分散于200μl pb测量荧光。
[0068]
图7显示，在358nm激发下，fe3o4nps@sio2@auncs@h1在450nm处的发射波长先随着tcep浓度的增大而增加，在10mm处达到最大值，随后随着浓度的增大而逐渐减小。设定3
×
104为荧光发射计数的阈值，则tcep最终浓度为10mm～1m时都能满足要求。
[0069]
实施例4
[0070]
本实施例以氰基硼氢化物为辅助剂组装fe3o4nps@sio2@auncs@h1，并研究其对microrna-21的检测。
[0071]
fe3o4nps@sio2@auncs@h1的组装：向0.5ml无菌离心管中加入100μlfe3o4nps@sio2@auncs(0.5mg/ml)，磁吸去掉上清液，分别加入20μl 5mm edta，10μl2mm氰基硼氢化钠，2μl 5μm h1，8μl磷酸-硼酸盐(10mm,ph＝7.0)。总反应体积40μl，此溶液中氰基硼氢化钠的最终浓度为1mm，缓冲溶液的浓度为2mm，h1与fe3o4nps@sio2@auncs表面auncs的摩尔比为2.85：1。30℃孵育2.0h之后缓冲溶液洗涤4次备用。
[0072]
microrna-21的检测：向组装好的fe3o4nps@sio2@auncs@h1中分别加入5μl 0.02u/μl dsn，5μl dsn反应缓冲液(成分为500mm tris-hcl,50mm mgcl2,10mm dtt,ph＝8.0)以及20μl不同浓度的microrna-21，50℃振荡孵育2h后用缓冲液洗涤4次，补加缓冲液至200μl，通过荧光光谱仪测定其在激发波长为358nm处的发射光谱。
[0073]
如图8a所示，随着microrna-21浓度的升高，荧光强度逐渐减弱。以microrna-21浓
度的对数为横坐标对荧光强度作图，如图8b所示，在0.1pm-10nm浓度范围内存在良好的线性关系，线性方程为f
450 nm
＝-1898.0lgc
microrna-21
+31235.8(r2＝0.9669)。通过公式以lod＝3σ/s计算检测限lod，在式中σ为标准曲线斜率，s表示11次空白样在450nm处荧光值的标准偏差，经计算，其检测限可以达到0.020pm。
[0074]
实施例5
[0075]
本实施例以氰基硼氢化物为辅助剂组装fe3o4nps@sio2@auncs@h1，并研究其对microrna-141的检测。
[0076]
5.1fe3o4nps@sio2@auncs@h1的组装
[0077]
fe3o4nps@sio2@auncs@h1的组装步骤同实施例4，不同之处在于所用试剂及浓度不同。具体步骤如下：向0.5ml无菌离心管中加入100μl fe3o4nps@sio2@auncs(0.5mg/ml)，磁吸去掉上清液，分别加入20μl 5mm edta，10μl 4m氰基硼氢化钠，2μl 175μm h1，8μl tris-醋酸(100mm,ph＝8.5)。总反应体积40μl，此溶液中氰基硼氢化钠的最终浓度为1m，缓冲溶液的浓度为20mm，h1与fe3o4nps@sio2@auncs表面auncs的摩尔比为100：1。30℃孵育1.0h之后缓冲溶液洗涤4次备用。
[0078]
5.2microrna-141的检测：
[0079]
(1)向组装好的fe3o4nps@sio2@auncs@h1中加入20μl 100nm的microrna-21，5μl 0.02u/μl dsn，5μl dsn反应缓冲液。50℃振荡孵育2h后，用缓冲液洗涤4次后加入50μl 1％牛血清蛋白(bsa)溶液，30℃振荡孵育1h以封闭未反应的活性位点。之后离心磁吸去掉上清液。
[0080]
(2)2μl h2(5μm)，5μl 0.02u/μl dsn，5μl dsn反应缓冲液与不同浓度microrna-141混合，在50℃振荡孵育1.5h后，加入10μl 10mm edta使酶反应失活。将产物加入到第(1)步的与microrna-21孵育完全的磁性材料中，37℃振荡孵育2h。用缓冲液洗涤4次，将其重新分散到200μl缓冲溶液中。通过荧光光谱仪测定其在激发波长为517nm处的发射光谱。
[0081]
如图9a所示，随着microrna-141浓度的升高，荧光强度逐渐增强。取microrna-141浓度的对数，对572nm处的荧光强度作图，如图9b所示，其在0.1pm-1nm浓度范围内具有良好的线性相关，线性方程为f
572 nm
＝40151.1lgc
microrna-141
+953501.1(r2＝0.9534)。经计算其检测限可以达到0.017pm。
[0082]
实施例4和5与已有文献的对比
[0083]
目前对于microrna-21和microrna-141的多重检测方法已有报道，表2列举了近年来对两种microrna的检测，本章方法无论是从检测限还是线性范围方面，均具有明显的优势
[0084]
表2本发明方法同现行方法检测目标物的比较
[0085][0086]
对比的文献：
[0087]
[1]sensors and actuators b:chemical,2017.252:p.1026-1034.
[0088]
[2]talanta,2023,259:124480.
[0089]
[3]analyst,2022.147(2):p.262-267.
[0090]
[4]acs sens,2019.4(2):p.326-334.
[0091]
[5]analytical chemistry,2019.91(3):p.2120-2127.
[0092]
实施例6
[0093]
将采用本发明的方法组装的fe3o4nps@sio2@auncs@h1应用于样品中microrna的检测，验证本发明所属方法的应用价值。
[0094]
为了验证该方法在多重microrna分析中的可行性，选择10％的人血清作为样品来检测目标microrna-21和microrna-141。通过将三种不同浓度的microrna-21(最终检测浓度为100pm、500pm和1nm)和microrna-141(最终检测浓度为50pm、100pm和500pm)加入到人血清中制备标准样品。所用的fe3o4nps@sio2@auncs@h1分别由实施例4和5制得，且采用上述实施例中的检测方法和校正曲线，将所测得的荧光强度带入线性方程，计算回收率和相对标准偏差(rsd)。
[0095]
实验结果如表3所示，血清中各浓度的microrna的回收率介于90.4～106.0％，相对标准偏差值均在误差允许范围内。以上结果表明，该生物传感系统可以检测患者血清中的microrna-21和microrna-141。
[0096]
表3加标回收检测10％人血清中的microrna-21和microrna-141(n＝3)
[0097][0098]
上述实施例说明，采用本发明提供的巯基dna与金纳米簇键合的反应液及反应方法可以显著提高巯基dna与金纳米簇之间的键合效率，相比于常用的巯基交换法，本技术的方法键合时间大大缩短，且表面键合dna量提高了10倍。所制得的fe3o4nps@sio2@auncs@h1对相应的microrna检测无论从检测限还是线性范围都有明显的优势，充分说明了本发明先进性和应用价值。
[0099]
以上实施例只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的专业技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

技术特征：
1.一种巯基dna与金纳米簇键合的反应液，包括酸碱缓冲溶液与键合辅助剂；所述反应液的ph值为6～10。2.根据权利要求1所述的反应液，其特征在于，所述酸碱缓冲溶液为磷酸盐、磷酸、醋酸、金属氢氧化物、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、硼酸和硼酸盐中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的反应液，其特征在于，所述辅助剂为氰基硼氢化物、三(2-羧乙基)膦和含三(2-羧乙基)膦盐类的一种或多种。4.根据权利要求1所述的反应液，其特征在于，所述酸碱缓冲溶液浓度为2～20mm。5.根据权利要求1所述的反应液，其特征在于，所述反应液的ph值为7～8.5。6.一种巯基dna与金纳米簇键合的方法，包括：将含金纳米簇的纳米材料、巯基dna和反应液混合后反应；所述反应液包括酸碱缓冲溶液与键合辅助剂；所述反应液的ph值为6～10。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反应时间为1～2小时。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述键合辅助剂的浓度为1mm～1m。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述巯基dna与所述金纳米簇的摩尔数之比为(3～100):1。

技术总结
本发明提供一种巯基DNA与金纳米簇键合的反应液，包括酸碱缓冲溶液与键合辅助剂；所述键合辅助剂为氰基硼氢化物、三(2-羧乙基)膦和含三(2-羧乙基)膦盐类的一种或多种，所述反应液的pH值为6～10。本申请反应液中的键合辅助剂与金纳米簇相互作用，促进了巯基DNA与金纳米簇之间的化学键合，缩短了键合时间，提高了键合效率。本申请还提供了将上述反应液用于巯基DNA与金纳米簇键合的方法。基DNA与金纳米簇键合的方法。基DNA与金纳米簇键合的方法。


技术研发人员：秦卫东 王俊华
受保护的技术使用者：北京师范大学
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/8/24