刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌及其构建方法和应用

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及三株刺糖多孢菌高产多杀菌素的基因重组工程菌及其构建方法和应用。


背景技术：

2.在过去的半个多世纪，化学杀虫剂一直被作为农作物害虫防治的主要手段,然而在害虫治理中化学杀虫剂抗性和残留等相关问题越来越引起人们的关注，人们对农作物虫害绿色防治的新策略的需求越来越迫切，微生物杀虫剂便是一种可替代化学杀虫剂的极具发展前景的作物病虫害防治的手段。
3.多杀菌素(spinosad)则是一种兼具化学农药的速效性和生物农药的安全性、低残留等优点的新型微生物农药。多杀菌素是由刺糖多孢菌(saccharopolyspora spinosa)产生的胞内次级代谢产物。由于该化合物独特的化学结构和作用机制，多杀菌素对哺乳动物、鸟类等没有毒性，但是其对小菜蛾、甜菜夜蛾等多种鳞翅目害虫具有良好的生物防治作用。在1999获得美国“总统绿色化学品挑战奖”后，2008年其衍生物乙基多杀菌素再一次获得该奖。虽然目前国内多杀菌素仅在少数高经济附加值作物上使用，但2018年国内销售额就已经达到3亿元人民币，预计未来十年多杀菌素在我国的需求将增加20倍以上。
4.然而，野生型刺糖多孢菌的多杀菌素产量偏低，通过遗传改造实现对多杀菌素合成基因簇快速、精确的全面改造，则可极大地提高刺糖多孢菌合成多杀菌素的能力，加快实现多杀菌素在我国的产业化。已有报道通过过表达四个与鼠李糖合成有关的基因(gtt，gdh，kre和epi)，可以明显提高多杀菌素的产量。此外，spng与鼠李糖的附着和甲基化有关,spns则参与福乐糖胺的合成。
5.刺糖多孢菌是公认的难于进行遗传改造的细菌，外源dna转化效率极低，且未开发出能自我复制稳定存在的质粒。但已公开文献中设计的基因过表达方式存在不足且遗传转化效率不高，因此通过理性设计使用强启动子和优化的rbs序列组装鼠李糖合成和下游产物代谢相关基因表达盒，并构建相应的遗传工程菌株，将显著提高刺糖多孢菌多杀菌素产量。


技术实现要素：

6.本发明的目的是优化现有刺糖多孢菌遗传改造技术方法，利用合成生物学手段体外构建基因过表达元件，提供一种显著提高多杀菌素产量的基因工程菌的构建方法。
7.本发明优化其技术问题采用的技术方案是，使用遗传改造方法将强启动子kasop*强启动子和强rbs序列与gtt，gdh，kre，epi，spng和spns组合成两种不同的基因盒，转入到刺糖多孢菌野生型菌株atcc49460菌株中，通过同源重组方式将过表达基因盒整合到刺糖多孢菌基因组中产生，从而获得刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌。
8.本发明提供一种刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
9.s1、将kasop*启动子和rbs序列启动的基因gtt，gdh，kre，epi表达盒重组到大肠杆菌
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刺糖多孢菌穿梭质粒，构建成重组质粒；
10.或者将kasop*强启动子和强rbs序列启动的gtt，gdh，kre，spng和spns表达盒重组到大肠杆菌
‑‑
刺糖多孢菌穿梭质粒，构建成重组质粒；
11.s2、将s1中得到的重组质粒通过结合转移导入到出发刺糖多孢菌株中，重组质粒通过同源重组至基因组，得到多杀菌素高产工程菌。
12.具体地，所述大肠杆菌
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刺糖多孢菌穿梭质粒是大肠杆菌
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刺糖多孢菌穿梭质粒poj260。
13.优选地，所述gtt，gdh，kre，epi表达盒由kasop*启动子，sd1、sd2、sd3构建的rbs序列、gtt基因编码区，gdh基因编码区，kre基因编码区，epi基因编码区组成；
14.所述gtt，gdh，kre，spng和spns表达盒由kasop*启动子，sd1、sd2、sd3、sd4构建的rbs序列、gtt基因编码区，gdh基因编码区，kre基因编码区，epi基因编码区,spng基因编码区,spns基因编码区和bba_b1006终止子组成。
15.更优选地，基因gtt的编码氨基酸序列由seq id no.1所示核苷酸序列所编码；gdh的编码氨基酸序列由seq id no.2所示核苷酸序列所编码；kre的编码氨基酸序列由seq id no.3所示核苷酸序列所编码；epi的编码氨基酸序列由seq id no.4所示核苷酸序列所编码；spng的编码氨基酸序列由seq id no.5所示核苷酸序列所编码；spns的编码氨基酸序列由seq id no.6所示核苷酸序列所编码；优选地，基因gtt的核苷酸酸序列由seq id no.1所示核苷酸序列所编码；gdh的核苷酸序列是seq id no.2所示；kre的核苷酸是seq id no.3所示；epi的核苷酸是seq id no.4所示；spng的核苷酸是seq id no.5所示；spns的核苷酸是seq id no.6所示。
16.另外优选地，kasop*启动子的核苷酸序列是seq id no.7所示；rbs的核苷酸序列sd1序列是seq id no.8所示；rbs的核苷酸序列sd2序列是seq id no.9所示；rbs的核苷酸序列sd3序列是seq id no.10所示；rbs的核苷酸序列sd3序列是seq id no.11所示；bba_b1006终止子的核苷酸序列是seq id no.12所示；
17.本发明也提供所述的构建方法构建的刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株。
18.本发明进一步提供所述的刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株在发酵生产多杀菌素中的应用。
19.相应本发明提供一种利用所述的刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株在发酵生产多杀菌素的方法。
20.具体地，所述方法包括将所述刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株发酵以产生多杀菌素，以收集所产生的多杀菌素的步骤；具体地，将多杀菌素接种于tsb培养液中发酵培养，优选地在30℃震荡220rpm培养；发酵培养基组成:按1l计，葡萄糖60g,麦芽糖10g,棉籽蛋白20g，玉米浆10g
·
酵母膏10g.k,hpo,0.5g.nacl 0.5g.mgs0,2g.caco,5g,灭菌前调整ph7.5，以上培养基均在115℃，灭菌25min；所述收集多杀菌素的方法是取发酵液﹐加入乙腈超声处理，4℃以下避光提取后，离心取上清液经微孔滤膜过滤后即得。
21.本发明的方法具有较高的遗传转化效率，构建的基因重组工程菌多杀菌素的产量显著提高，具有较大应用价值。
附图说明
22.图1：本发明中的xc-032和xc-200质粒图谱。
23.图2：本发明中刺糖多孢菌野生型菌株与基因工程菌株多杀菌素发酵结果。
具体实施方式
24.结合实施例对本发明作进一步详细说明。
25.实施例中所用的实验方法、材料、试剂等，如无特殊说明，实验方法均为常见的实验方法，材料和试剂均可从商业途径获得。
26.实施例1、基因克隆和穿梭质粒构建
27.使用细菌基因组dna快速提取试剂盒(北京艾德莱生物技术有限公司，货号：dn1101)提取刺糖多孢菌atcc49460的基因组dna。使用高保真dna聚合酶kod one
tm pcr master mix以刺糖多孢菌的基因组dna为模板分别扩增gtt(seq id no.1)，gdh(seq id no.2)，kre(seq id no.3)，epi(seq id no.4)，spng(seq id no.5)和spns(seq id no.6)这6个基因。kasop*强启动子(seq id no.7),rbs序列sd1序列(seq id no.8),rbs序列sd2(seq id no.9),rbs序列sd3(seq id no.10)序列，rbs序列sd4(seq id no.11)序列和bba_b1006(seq id no.12)通过引物设计引入到质粒的正确位置。
28.通过gibson assembly将上述序列片段gtt(seq id no.1)，gdh(seq id no.2)，kre(seq id no.3)和epi(seq id no.4)进行组装获得质粒xc-032；
29.通过gibson assembly将上述序列片段gtt(seq id no.1)，gdh(seq id no.2)，kre(seq id no.3)，spng(seq id no.5)和spns(seq id no.6)进行组装获得质粒xc-200。
30.基因克隆的pcr体系如下：基因组dna 10ng，加入25μl 2
×
kod one
tm pcr master mix，正向引物1.5μl(15pmoles)，反向引物1.5μl(15pmoles)，补充蒸馏水至50μl。三步法pcr循环反应条件如下：98℃10sec，(tm-5)℃5sec，68℃10sec/kb，30cycles。pcr扩增产物进行凝胶电泳，将正确条带切胶回收，使用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒(北京艾德莱生物技术有限公司，货号：dr0103)进行胶回收。gibson assembly(北京艾德莱生物技术有限公司，货号：cv1201)反应体系：10μl 2
×
conling master mix，不同dna片段以1:1的摩尔比加入，补充蒸馏水至20μl，50℃下反应60min。重组质粒的转化：取10μlgibson assembly反应体系至100μltop10化学感受态细胞(北京艾德莱生物技术有限公司，货号：cc0103)中，置于冰上30min，水浴锅42℃热激60sec，冰上放置2min，加入800μl液体lb复苏，37℃震荡培养1h，涂布于含安普霉素的固体lb平板上，37℃过夜培养。挑单菌落于含安普霉素液体lb中37℃震荡培养12h，使用高纯度质粒小量快速提取试剂盒(北京艾德莱生物技术有限公司，货号：pl0303)进行质粒提取，将质粒送至北京擎科生物科技股份有限公司进行桑格测序，从而获得正确质粒。
31.实施例2、刺糖多孢菌多杀菌素高产菌株sas-004，sas-007和sas-009的构建：
32.所构建的质粒xc-032通过结合转移从大肠杆菌e.coli et12567(puz8002)导入刺糖多胞菌，并通过同源重组整合到染色体中,具体步骤如下：
33.将实验室保藏的大肠杆菌et12567(puz8002)在含有卡那霉素(50μg/ml)和氯霉素(25μg/ml)的lb平板上行划线活化37℃过夜培养。挑大肠杆菌et12567(puz8002)单菌落于1ml lb(50μg/ml卡那霉素和25μg/ml氯霉素)37℃过夜振荡培养。将过夜培养菌液以1:100
比例转接到含有50ml lb(50μg/ml卡那霉素和25μg/ml氯霉素)的锥形瓶中，37℃振荡培养至od600＝0.4—0.6之间，将50ml菌液置于冰上30min，在4℃下以4200rpm进行离心5min，去除上清，使用50ml预冷的无菌水洗涤重悬菌体2次，在4℃下以4200rpm进行离心5min，去除上清，使用50ml预冷的10％甘油洗涤重悬菌体2次，最后使用1ml10％甘油重悬，取100μl于电击杯中，加入50ng质粒xc-032以2.5kv电压进行电转，迅速加入液体1ml lb进行复苏，37℃振荡培养1h后，涂布于含卡那霉素(50μg/ml)，氯霉素(25μg/ml)和安普霉素抗性(50μg/ml)的lb平板上37℃过夜培养，获得供体菌大肠杆菌et12567(puz8002，xc-032)。
34.结合转移实验中的刺糖多孢菌atcc49460菌丝体的准备。实验开始第一天，在tsb平板上挑产孢的单菌落于液体5ml tsb中，在30℃震荡220rpm培养48h。第三天，将上述菌液以1:10转接到5ml tsb中，在30℃振荡220rpm培养16h。第四天，将上述菌液以1:4转接到5ml tsb，在30℃下振荡220rpm培养4h，将5ml菌液4200rpm离心5min后，移除3ml上清,剩下2ml菌液待用。
35.结合转移实验中的大肠杆菌的准备。实验开始第三天，将供体菌et12567(puz8002，xc-032)挑单菌落lb中37℃培养。实验开始第四天，将供体菌et12567(puz8002，xc-032)过夜培养菌液分别以1:50转接到5ml lb中，37℃震荡培养4h。将上述大肠杆菌5500rpm离心3min，使用液体lb将菌体洗涤两次，最终重悬在2ml lb中。将准备好的刺糖多孢菌atcc49460菌丝体与et12567(puz8002，xc-032)以500μl(109/ml)：500μl(108孢子/ml)混合，在混合菌液中加入20mmol/l mg2+，然后取混合菌液平铺在r6平板上，在超净工作台中晾干平板，将平板置于30℃培养大约16h。
36.结合转移实验中使用的r6固体培养基组成(1l)：蔗糖200g，糊精10g，酪蛋白氨基酸1g，bhi 13g，k2so40.1g，feso4·
7h2o 0.1g，mncl2·
4h2o 0.001g，znso4·
7h2o 0.001g，琼脂粉12g，加入678ml蒸馏水，定容至1l，121℃灭菌20min；待培养基冷却至50℃加入1mol/l l-谷氨酸65ml，1mol/l cacl2
·
2h2o 48ml和1mol/l丙磺酸5ml，上述三种溶液均经0.22μm滤膜过滤除菌处理。
37.结合转移实验中的抗生素使用。实验开始第五天，将含有50ug/ml安普霉素和25ug/ml萘啶酮酸的无菌水平铺在r6平板上，在超净工作台中晾干平板，置于30℃培养7—14天后出现重组菌落。用引物对cz-277(seq id no.15)和cz-261(seq id no.16)通过pcr扩增验证和桑格测序正确的则为多杀菌素高产基因工程菌sas-042。
38.用质粒xc-200替代质粒xc-032与刺糖多孢菌atcc49460菌丝体进行结合转移实验，其它操作同本实施例，得到多杀菌素高产的基因工程菌sas-140。
39.实施例3、刺糖多孢菌多杀菌素高产菌株sas-042和sas-140的发酵验证。
40.本发明利用上述刺糖多孢菌多杀菌素高产菌株sas-042和sas-140进行发酵的方法：
41.将上述刺糖多孢菌野生型菌株atcc49460和多杀菌素高产工程菌株分别划线接种于tsb培养基平板上，30℃培养5-7天，在tsb平板上挑产孢单菌落于液体5mltsb中，在30℃震荡220rpm培养48h，以体积比10％的接种量接种于装有30ml发酵培养基的250ml摇瓶中，30℃振荡250rpm培养10天。发酵培养基(g/l)组成：葡萄糖60g,麦芽糖10g,棉籽蛋白20g，玉米浆10g，酵母膏10g，k2hpo
4 0.5g，nacl 0.5g，mgs0
4 2g，caco
3 5g,灭菌前调整ph7.5，以上培养基均在115℃，灭菌25min。
42.发酵10天后，取一定体积的发酵液﹐加入2倍体积乙腈,超声处理40min，4℃避光提取24h，2000r/min离心30min取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后进行hplc分析。分析条件为：c18反相柱(伊力特cl8，4.6mm
×
150mm，3.5um)；流动相为乙腈―甲醇—水(45:45:10,水中含0.05％乙酸铵)；进样量为50l；流速为1.5ml/min检测波长为254nm。根据spinosyn a和spinosyn d组份的积分面积,参照标准品计算其质量浓度,两组份之和即为多杀菌素发酵单位。
43.多杀菌素高产工程菌株sas-042，其多杀菌素产量达到174.8mg/l，是野生型菌株atcc49460(37.5mg/l)的4.6倍,见图2。
44.多杀菌素高产工程菌株sas-140，其多杀菌素的产量达到264.4mg/l，是野生型菌株atcc49460(37.5mg/l)的7.1倍，见图2。

技术特征：
1.一种刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、将kasop*启动子和rbs序列启动的基因gtt，gdh，kre，epi表达盒重组到大肠杆菌
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刺糖多孢菌穿梭质粒，构建成重组质粒；或者将kasop*强启动子和强rbs序列启动的gtt，gdh，kre，spng和spns表达盒重组到大肠杆菌
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刺糖多孢菌穿梭质粒，构建成重组质粒；s2、将s1中得到的重组质粒通过结合转移导入到出发刺糖多孢菌株中，重组质粒通过同源重组至基因组，得到多杀菌素高产工程菌。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌
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刺糖多孢菌穿梭质粒是大肠杆菌
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刺糖多孢菌穿梭质粒poj260。3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述gtt，gdh，kre，epi表达盒由kasop*启动子，sd1、sd2、sd3构建的rbs序列、gtt基因编码区，gdh基因编码区，kre基因编码区，epi基因编码区组成；所述gtt，gdh，kre，spng和spns表达盒由kasop*启动子，sd1、sd2、sd3、sd4构建的rbs序列、、gtt基因编码区，gdh基因编码区，kre基因编码区，epi基因编码区,spng基因编码区,spns基因编码区和bba_b1006终止子组成。4.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，基因gtt的编码氨基酸序列由seq id no.1所示核苷酸序列所编码；gdh的编码氨基酸序列由seq id no.2所示核苷酸序列所编码；kre的编码氨基酸序列由seq id no.3所示核苷酸序列所编码；epi的编码氨基酸序列由seq id no.4所示核苷酸序列所编码；spng的编码氨基酸序列由seq id no.5所示核苷酸序列所编码；spns的编码氨基酸序列由seq id no.6所示核苷酸序列所编码；优选地，基因gtt的核苷酸酸序列由seq id no.1 所示核苷酸序列所编码；gdh的核苷酸序列是seq id no.2 所示；kre的核苷酸是seq id no.3 所示；epi的核苷酸是seq id no.4 所示；spng的核苷酸是seq id no.5 所示；spns的核苷酸是seq id no.6 所示。5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，kasop*启动子的核苷酸序列是seq id no.7 所示；rbs的核苷酸序列sd1序列是seq id no.8 所示；rbs的核苷酸序列sd2序列是seq id no.9 所示；rbs的核苷酸序列sd3序列是seq id no.10 所示；rbs的核苷酸序列sd3序列是seq id no.11 所示；bba_b1006终止子的核苷酸序列是seq id no.12 所示。6.如权利要求1至5任一项所述的构建方法构建的刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株。7.如权利要求6所述的刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株在发酵生产多杀菌素中的应用。8.一种利用如权利要求8所述的刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株在发酵生产多杀菌素的方法。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，包括将所述刺糖多孢菌多杀菌素高产工程菌株发酵以产生多杀菌素，以收集所产生的多杀菌素的步骤。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，其包括如下步骤：将多杀菌素接种于tsb培养液中发酵培养，优选地在30℃震荡220rpm培养；发酵培养基组成:按1l计，葡萄糖60g,麦芽糖10g,棉籽蛋白20g，玉米浆10g，酵母膏10g，k2hpo
4 0.5g，nacl 0.5g，mgs0
4 2g，caco
3 5g,灭菌前调整ph7.5，以上培养基均在115℃，灭菌25min；所述收集多杀菌素的方法是取发酵液﹐加入乙腈超声处理，4℃以下避光提取后，离心取上清液经微孔滤膜过滤后即得。

技术总结
本发明公开了刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)多杀菌素高产菌株及其构建方法，所述刺糖多孢菌多杀菌素高产菌株构建方法步骤：基于大肠杆菌—刺糖多孢菌的穿梭质粒，构建含有kasOp*强启动子和强RBS序列启动的Gtt，Gdh，Kre，Epi，SpnG和SpnS基因表达盒的重组质粒；将重组质粒通过结合转移导入刺糖多孢菌，得到多杀菌素高产的菌株。本发明的方法具有较高的遗传转化效率，构建的基因重组工程菌多杀菌素的产量显著提高。产量显著提高。


技术研发人员：薛超友 蔡朝辉
受保护的技术使用者：中国科学院天津工业生物技术研究所
技术研发日：2023.05.08
技术公布日：2023/8/24