铁皮石斛叶的发酵方法及其组合物与流程

1.本发明属于中药技术领域，涉及一种干燥铁皮石斛叶的发酵方法，以及由该方法获得的发酵液，还涉及包含该方法的组合物。


背景技术：

2.铁皮石斛(dendrobium officinale kimura et migo)为兰科珍稀名贵药用植物，又名：黑节草、云南铁皮、铁皮斗枫，属微子目，兰科多年生附生草本植物。
3.铁皮石斛是石斛中的上品，是石斛中药用价值最高的品种，被称为“中国九大仙草”之首，具有很高的药用价值。铁皮石斛适宜在温暖、湿润、半阴半阳的环境中生长。因其表皮呈铁绿色而得名，主要分布于云南、广西、广东、贵州、江西等地，民间素有“救命仙草”、“药中黄金”之美称。虽然铁皮石斛的药用部位是其茎，在花和叶方面的研究较少，有文献资料研究表明，铁皮石斛茎和叶具有相同的功效成分，叶的多糖含量约为茎的三分之一。现代医学表明，
4.中药发酵技术初始记载于《神农本草经》，是指在一定环境条件(如温度、湿度)下，依靠微生物的作用进行发酵，以此改变中药原有性能、增强药效或产生新功效的方法，进而可扩大用药范围，契合临床用药需求。中药发酵优点在于：促进中药有效成分的释放，达到增强药效的目的；降低不良反应；为修饰中药活性成分提供新途径；减失药材资源浪费，充分利用了中药的生物资源以及保护环境等。而且生物发酵比化学反应转化率更高、专属性更强，且安全无毒等。
5.铁皮石斛富含石斛多糖、生物碱、酚类、类黄酮、氨基酸和多种微量元素，具有增强免疫力、抗肿瘤、降血脂、降低血糖、抗氧化、延缓衰老等功能，其显著的生理活性为发展功能食品提供良好的原料来源。随着生活水平的日益提高，在高强度、高节奏的生活状态下，越来越多的人出现亚健康状态，新型高效保健食品有待研发，保健功能极佳的铁皮石斛拥有广阔的发展前景。
6.为此，本领域技术人员期待提供一种具有优良性能的铁皮石斛加工制成品，例如提供一种具有优良性能的铁皮石斛叶发酵方法及其制成品和组合物。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种具有优良性能的铁皮石斛加工制成品，例如提供一种具有优良性能的铁皮石斛叶发酵方法及其制成品和组合物。已经发现，使用本发明方法制得的铁皮石斛叶组合物呈现至少一种优良的效果。
8.为此，本发明第一方面提供了一种铁皮石斛叶发酵液，其是通过包括如下步骤和投料比例的方法制备得到的：
9.(1)菌种活化：将植物乳杆菌加至10倍重量的37℃无菌蒸馏水中使溶解，再置于37℃恒温箱中活化30min，得到植物乳杆菌液，备用；
10.(2)铁皮石斛叶酶解液的制备：将200g铁皮石斛干叶加至1.2l去离子水中，破壁处
理至细胞破壁率达到75％以上，接着于90℃煮沸15min，然后迅速降温至50℃，调节料液的ph至4.5
±
0.2，加入果胶酶和纤维素酶，置于50℃水浴锅中，酶解2h后灭酶，加水至1.8l，得到铁皮石斛叶酶解液；
11.(3)铁皮石斛叶发酵液的制备：向步骤(2)所得铁皮石斛叶酶解液中加入葡萄糖使溶解后，于95℃灭菌5min，迅速冷却至37℃；接着加入活化后的植物乳杆菌100ml，在37℃下无氧发酵48～72h至发酵液的ph达到3.5～4.0时，立即迅速降温至2～4℃使发酵停止，200目筛过滤，滤液补加水适量使发酵液体积至2l，95℃灭菌5min，得到铁皮石斛叶发酵液。
12.根据本发明第一方面的铁皮石斛叶发酵液，其中的植物乳杆菌是浓度50～500亿cfu/g的菌粉，例如是100亿cfu/g的菌粉。
13.根据本发明第一方面的铁皮石斛叶发酵液，其中果胶酶的加入量是0.5～5万u，例如是0.5～2万u，例如1万u。根据本发明第一方面的铁皮石斛叶发酵液，其中的果胶酶是1～10万的粉末，例如是2万u/g的粉末。
14.根据本发明第一方面的铁皮石斛叶发酵液，其中纤维素酶的加入量是0.5～5万u，例如是0.5～2万u，例如1万u。根据本发明第一方面的铁皮石斛叶发酵液，其中的纤维素酶是0.5～5万u/g的粉末，例如是1万u/g的粉末。
15.根据本发明第一方面的铁皮石斛叶发酵液，其中的葡萄糖加入量为20～200g，例如是30～150g，例如是55g。
16.根据本发明第一方面的铁皮石斛叶发酵液，其中与葡萄糖一起还添加烟酰胺，例如添加1～10g烟酰胺，例如添加2～5g烟酰胺，例如添加2～3g烟酰胺，例如添加2.5g烟酰胺。
17.根据本发明第一方面的铁皮石斛叶发酵液，其中与葡萄糖一起还添加肌醇，例如添加0.5～5g肌醇，例如添加0.2～2g肌醇，例如添加1～1.5g肌醇，例如添加1.2g肌醇。
18.进一步的，本发明第二方面提供了一种制备铁皮石斛叶发酵液的方法，其包括如下投料比例的步骤：
19.(1)菌种活化：将植物乳杆菌加至10倍重量的37℃无菌蒸馏水中使溶解，再置于37℃恒温箱中活化30min，得到植物乳杆菌液，备用；
20.(2)铁皮石斛叶酶解液的制备：将200g铁皮石斛干叶加至1.2l去离子水中，破壁处理至细胞破壁率达到75％以上，接着于90℃煮沸15min，然后迅速降温至50℃，调节料液的ph至4.5
±
0.2，加入果胶酶和纤维素酶，置于50℃水浴锅中，酶解2h后灭酶，加水至1.8l，得到铁皮石斛叶酶解液；
21.(3)铁皮石斛叶发酵液的制备：向步骤(2)所得铁皮石斛叶酶解液中加入葡萄糖使溶解后，于95℃灭菌5min，迅速冷却至37℃；接着加入活化后的植物乳杆菌100ml，在37℃下无氧发酵48～72h至发酵液的ph达到3.5～4.0时，立即迅速降温至2～4℃使发酵停止，200目筛过滤，滤液补加水适量使发酵液体积至2l，95℃灭菌5min，得到铁皮石斛叶发酵液。
22.根据本发明第二方面的方法，其中的植物乳杆菌是浓度50～500亿cfu/g的菌粉，例如是100亿cfu/g的菌粉。
23.根据本发明第二方面的方法，其中果胶酶的加入量是0.5～5万u，例如是0.5～2万u，例如1万u。根据本发明第二方面的方法，其中的果胶酶是1～10万的粉末，例如是2万u/g的粉末。
24.根据本发明第二方面的方法，其中纤维素酶的加入量是0.5～5万u，例如是0.5～2万u，例如1万u。根据本发明第二方面的方法，其中的纤维素酶是0.5～5万u/g的粉末，例如是1万u/g的粉末。
25.根据本发明第二方面的方法，其中的葡萄糖加入量为20～200g，例如是30～150g，例如是55g。
26.根据本发明第二方面的方法，其中与葡萄糖一起还添加烟酰胺，例如添加1～10g烟酰胺，例如添加2～5g烟酰胺，例如添加2～3g烟酰胺，例如添加2.5g烟酰胺。
27.根据本发明第二方面的方法，其中与葡萄糖一起还添加肌醇，例如添加0.5～5g肌醇，例如添加0.2～2g肌醇，例如添加1～1.5g肌醇，例如添加1.2g肌醇。
28.进一步的，本发明第三方面提供了一种铁皮石斛叶组合物，其包括铁皮石斛干叶600～700g例如650g制成的浸提液、本发明第一方面所述铁皮石斛叶发酵液0.8～1.2l例如1l、聚葡萄糖16～20kg例如18kg、水适量加至2000l。
29.根据本发明第三方面的铁皮石斛叶组合物，其是通过包括如下步骤和投料比例的方法制备得到的：
30.(1)制备铁皮石斛干叶浸提液：取经筛选、除杂后的铁皮石斛干叶，用水清洗，用60目滤袋装袋后置浸提罐中，加入干叶重量100～250倍例如150～200倍的90～95℃水，浸提30min后滤出，得到一次浸提液；滤渣加至浸提罐中，加入干叶重量100～250倍例如150～200倍的90～95℃水，浸提30min后滤出，得到二次浸提液；混合两次浸提液，用300目筛网过滤，再经过0.45μm膜过滤得到浸提液；
31.(2)将聚葡萄糖加水溶解，加入铁皮石斛叶发酵液和步骤(1)所得浸提液，混合均匀，经200目过滤，加水至全量，将料液经0.45μm膜过滤；
32.(3)将滤液经uht灭菌(137～139℃/15～30s)，冷却至液温低于25℃，无菌灌装至pet瓶中，即得铁皮石斛叶组合物。
33.进一步的，本发明第四方面提供了制备铁皮石斛叶组合物的方法，该铁皮石斛叶组合物包括铁皮石斛干叶600～700g例如650g制成的浸提液、本发明第一方面所魔窟铁皮石斛叶发酵液0.8～1.2l例如1l、聚葡萄糖16～20kg例如18kg、水适量加至2000l，该方法包括如下步骤：
34.(1)制备铁皮石斛干叶浸提液：取经筛选、除杂后的铁皮石斛干叶，用水清洗，用60目滤袋装袋后置浸提罐中，加入干叶重量100～250倍例如150～200倍的90～95℃水，浸提30min后滤出，得到一次浸提液；滤渣加至浸提罐中，加入干叶重量100～250倍例如150～200倍的90～95℃水，浸提30min后滤出，得到二次浸提液；混合两次浸提液，用300目筛网过滤，再经过0.45μm膜过滤得到浸提液；
35.(2)将聚葡萄糖加水溶解，加入铁皮石斛叶发酵液和步骤(1)所得浸提液，混合均匀，经200目过滤，加水至全量，将料液经0.45μm膜过滤；
36.(3)将滤液经uht灭菌(137～139℃/15～30s)，冷却至液温低于25℃，无菌灌装至pet瓶中，即得铁皮石斛叶组合物。
37.本发明方法所制得的发酵液和组合物呈现如本发明上下文所述一个或者多个方面的有益效果。
具体实施方式
38.本发明下文各实例所用各物料应符合食用要求，例如白砂糖应符合gbt-317-2018之标准，水或去离子水应为符合要求的反渗透水。下文各实例投料规格为示意性的，可以根据实际需要任意地进行放大。
39.实施例1：铁皮石斛叶发酵液的制备
40.(1)菌种活化：将植物乳杆菌(jylp-002，100亿cfu/g，中科嘉亿)加至10倍重量的37℃无菌蒸馏水中使溶解，再置于37℃恒温箱中活化30min，得到植物乳杆菌液，备用；
41.(2)铁皮石斛叶酶解液的制备：将200g铁皮石斛干叶加至1.2l去离子水中，破壁处理至细胞破壁率达到75％以上，接着于90℃煮沸15min，然后迅速降温至50℃，调节料液的ph至4.5
±
0.2，加入0.5g果胶酶(2万u/g，东恒华道)和1g纤维素酶(1万u/g，东恒华道)，置于50℃水浴锅中，酶解2h后灭酶，加水至1.8l，得到铁皮石斛叶酶解液；
42.(3)铁皮石斛叶发酵液的制备：向步骤(2)所得铁皮石斛叶酶解液中加入55g葡萄糖、2.5g烟酰胺、1.2g肌醇使溶解后，于95℃灭菌5min，迅速冷却至37℃；接着加入活化后的植物乳杆菌100ml，在37℃下无氧发酵48～72h至发酵液的ph达到3.5～4.0时，立即迅速降温至2～4℃使发酵停止，200目筛过滤，滤液补加水适量使发酵液体积至2l，95℃灭菌5min，得到铁皮石斛叶发酵液。
43.实施例2：铁皮石斛叶发酵液的制备
44.(1)菌种活化：将植物乳杆菌(jylp-002，100亿cfu/g，中科嘉亿)加至10倍重量的37℃无菌蒸馏水中使溶解，再置于37℃恒温箱中活化30min，得到植物乳杆菌液，备用；
45.(2)铁皮石斛叶酶解液的制备：将200g铁皮石斛干叶加至1.2l去离子水中，破壁处理至细胞破壁率达到75％以上，接着于90℃煮沸15min，然后迅速降温至50℃，调节料液的ph至4.5
±
0.2，加入0.5g果胶酶(2万u/g，东恒华道)和1g纤维素酶(1万u/g，东恒华道)，置于50℃水浴锅中，酶解2h后灭酶，加水至1.8l，得到铁皮石斛叶酶解液；
46.(3)铁皮石斛叶发酵液的制备：向步骤(2)所得铁皮石斛叶酶解液中加入55g葡萄糖、2g烟酰胺、1.5g肌醇使溶解后，于95℃灭菌5min，迅速冷却至37℃；接着加入活化后的植物乳杆菌100ml，在37℃下无氧发酵48～72h至发酵液的ph达到3.5～4.0时，立即迅速降温至2～4℃使发酵停止，200目筛过滤，滤液补加水适量使发酵液体积至2l，95℃灭菌5min，得到铁皮石斛叶发酵液。
47.实施例3：铁皮石斛叶发酵液的制备
48.(1)菌种活化：将植物乳杆菌(jylp-002，100亿cfu/g，中科嘉亿)加至10倍重量的37℃无菌蒸馏水中使溶解，再置于37℃恒温箱中活化30min，得到植物乳杆菌液，备用；
49.(2)铁皮石斛叶酶解液的制备：将200g铁皮石斛干叶加至1.2l去离子水中，破壁处理至细胞破壁率达到75％以上，接着于90℃煮沸15min，然后迅速降温至50℃，调节料液的ph至4.5
±
0.2，加入0.5g果胶酶(2万u/g，东恒华道)和1g纤维素酶(1万u/g，东恒华道)，置于50℃水浴锅中，酶解2h后灭酶，加水至1.8l，得到铁皮石斛叶酶解液；
50.(3)铁皮石斛叶发酵液的制备：向步骤(2)所得铁皮石斛叶酶解液中加入55g葡萄糖、3g烟酰胺、1g肌醇使溶解后，于95℃灭菌5min，迅速冷却至37℃；接着加入活化后的植物乳杆菌100ml，在37℃下无氧发酵48～72h至发酵液的ph达到3.5～4.0时，立即迅速降温至2～4℃使发酵停止，200目筛过滤，滤液补加水适量使发酵液体积至2l，95℃灭菌5min，得到
铁皮石斛叶发酵液。
51.实施例4：铁皮石斛叶发酵液的制备
52.(1)菌种活化：将植物乳杆菌(jylp-002，100亿cfu/g，中科嘉亿)加至10倍重量的37℃无菌蒸馏水中使溶解，再置于37℃恒温箱中活化30min，得到植物乳杆菌液，备用；
53.(2)铁皮石斛叶酶解液的制备：将200g铁皮石斛干叶加至1.2l去离子水中，破壁处理至细胞破壁率达到75％以上，接着于90℃煮沸15min，然后迅速降温至50℃，调节料液的ph至4.5
±
0.2，加入0.5g果胶酶(2万u/g，东恒华道)和1g纤维素酶(1万u/g，东恒华道)，置于50℃水浴锅中，酶解2h后灭酶，加水至1.8l，得到铁皮石斛叶酶解液；
54.(3)铁皮石斛叶发酵液的制备：向步骤(2)所得铁皮石斛叶酶解液中加入55g葡萄糖、2.5g烟酰胺使溶解后，于95℃灭菌5min，迅速冷却至37℃；接着加入活化后的植物乳杆菌100ml，在37℃下无氧发酵48～72h至发酵液的ph达到3.5～4.0时，立即迅速降温至2～4℃使发酵停止，200目筛过滤，滤液补加水适量使发酵液体积至2l，95℃灭菌5min，得到铁皮石斛叶发酵液。
55.实施例5：铁皮石斛叶发酵液的制备
56.(1)菌种活化：将植物乳杆菌(jylp-002，100亿cfu/g，中科嘉亿)加至10倍重量的37℃无菌蒸馏水中使溶解，再置于37℃恒温箱中活化30min，得到植物乳杆菌液，备用；
57.(2)铁皮石斛叶酶解液的制备：将200g铁皮石斛干叶加至1.2l去离子水中，破壁处理至细胞破壁率达到75％以上，接着于90℃煮沸15min，然后迅速降温至50℃，调节料液的ph至4.5
±
0.2，加入0.5g果胶酶(2万u/g，东恒华道)和1g纤维素酶(1万u/g，东恒华道)，置于50℃水浴锅中，酶解2h后灭酶，加水至1.8l，得到铁皮石斛叶酶解液；
58.(3)铁皮石斛叶发酵液的制备：向步骤(2)所得铁皮石斛叶酶解液中加入55g葡萄糖、1.2g肌醇使溶解后，于95℃灭菌5min，迅速冷却至37℃；接着加入活化后的植物乳杆菌100ml，在37℃下无氧发酵48～72h至发酵液的ph达到3.5～4.0时，立即迅速降温至2～4℃使发酵停止，200目筛过滤，滤液补加水适量使发酵液体积至2l，95℃灭菌5min，得到铁皮石斛叶发酵液。
59.实施例6：铁皮石斛叶发酵液的制备
60.(1)菌种活化：将植物乳杆菌(jylp-002，100亿cfu/g，中科嘉亿)加至10倍重量的37℃无菌蒸馏水中使溶解，再置于37℃恒温箱中活化30min，得到植物乳杆菌液，备用；
61.(2)铁皮石斛叶酶解液的制备：将200g铁皮石斛干叶加至1.2l去离子水中，破壁处理至细胞破壁率达到75％以上，接着于90℃煮沸15min，然后迅速降温至50℃，调节料液的ph至4.5
±
0.2，加入0.5g果胶酶(2万u/g，东恒华道)和1g纤维素酶(1万u/g，东恒华道)，置于50℃水浴锅中，酶解2h后灭酶，加水至1.8l，得到铁皮石斛叶酶解液；
62.(3)铁皮石斛叶发酵液的制备：向步骤(2)所得铁皮石斛叶酶解液中加入55g葡萄糖使溶解后，于95℃灭菌5min，迅速冷却至37℃；接着加入活化后的植物乳杆菌100ml，在37℃下无氧发酵48～72h至发酵液的ph达到3.5～4.0时，立即迅速降温至2～4℃使发酵停止，200目筛过滤，滤液补加水适量使发酵液体积至2l，95℃灭菌5min，得到铁皮石斛叶发酵液。
63.实施例7：铁皮石斛叶发酵液的制备
64.参考实施例1，但是烟酰胺和肌醇在发酵之后添加。
65.(1)菌种活化：将植物乳杆菌(jylp-002，100亿cfu/g，中科嘉亿)加至10倍重量的
37℃无菌蒸馏水中使溶解，再置于37℃恒温箱中活化30min，得到植物乳杆菌液，备用；
66.(2)铁皮石斛叶酶解液的制备：将200g铁皮石斛干叶加至1.2l去离子水中，破壁处理至细胞破壁率达到75％以上，接着于90℃煮沸15min，然后迅速降温至50℃，调节料液的ph至4.5
±
0.2，加入0.5g果胶酶(2万u/g，东恒华道)和1g纤维素酶(1万u/g，东恒华道)，置于50℃水浴锅中，酶解2h后灭酶，加水至1.8l，得到铁皮石斛叶酶解液；
67.(3)铁皮石斛叶发酵液的制备：向步骤(2)所得铁皮石斛叶酶解液中加入55g葡萄糖使溶解后，于95℃灭菌5min，迅速冷却至37℃；接着加入活化后的植物乳杆菌100ml，在37℃下无氧发酵48～72h至发酵液的ph达到3.5～4.0时，立即迅速降温至2～4℃使发酵停止，200目筛过滤，加入2.5g烟酰胺和1.2g肌醇使溶解，补加水适量使发酵液体积至2l，95℃灭菌5min，得到铁皮石斛叶发酵液。
68.实施例8：铁皮石斛叶发酵液的制备
69.本实施例参考中国专利申请号2019111295324实施例1中记载的方法制备铁皮石斛叶发酵液。由于2019111295324使用新鲜采摘的铁皮石斛叶作为原料在实际生产上不如使用干叶更方便，因此本实施例使用干燥的铁皮石斛叶作为原料。
70.(1)菌种活化：将混合菌粉(其中包含副干酪乳杆菌300亿cfu/g、嗜酸乳杆菌150亿cfu/g和植物乳杆菌200亿cfu/g)加至10倍重量的37℃无菌蒸馏水中使溶解，再置于37℃恒温箱中活化30min，得到乳酸菌液备用；
71.(2)铁皮石斛叶酶解液的制备：将200g铁皮石斛干叶加至6倍重量(1.2l)的水中进行细胞破壁处理，使破壁率达到60％以上，接着于90℃预煮20min，然后迅速降温至50℃，调ph至4.5～5.0，以0.06g/l的浓度加入复合酶(该复合酶中包含1.6万u/g果胶酶和3万u/g纤维素酶，东恒华道)，置于50℃水浴锅中，酶解1.5h，灭酶，得到铁皮石斛酶解液；
72.(3)铁皮石斛叶发酵液的制备：向铁皮石斛叶酶解液中加入3％的营养助剂(葡萄糖)，于95℃灭菌5min，迅速冷却至37℃；接着加入活化后的乳酸菌液(酶解液与乳酸菌液的体积比为100：2.5)，在37℃下无氧发酵16～72h，当发酵液的ph达到3.5～4.0时，立即降温至4℃，停止发酵，200目筛过滤，滤液补加水适量使发酵液体积至2l，95℃灭菌5min，得到铁皮石斛叶发酵液。
73.试验例1：铁皮石斛叶发酵液的降血脂作用
74.本发明人已经发现，本发明制得的一些铁皮石斛叶发酵液具有优良的降血脂作用，参考文献方法进行(徐淑云，等，药理实验方法学[]，第3版，北京：人民卫生出版社，2002)，试验方法和结果如下。
[0075]
1.材料
[0076]
博科bk-600全自动生化分析仪；
[0077]
月见草油(江西恒诚，含棕榈酸5.9％、硬脂酸1.7％、油酸5.8％、亚油酸75.1％、γ-亚麻酸10.6％、α-亚麻酸0.4％、花生酸0.2％)；
[0078]
胆固醇(sigma-aldrich)；
[0079]
总胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白试剂盒
[0080]
高脂饲料：添加1％胆固醇和15％熟猪油的基础饲料；
[0081]
鹌鹑，体量(120
±
20)g，雌雄各半(许可证号：syxk(黑)2021-001，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所)。
[0082]
2.动物分组
[0083]
2月龄鹌鹑，雌雄各半，体重115～130g，随机分成如下各组，每组10～11只：
[0084]
空白对照组，每天喂以普通饲料；
[0085]
高脂模型组，每天喂以高脂饲料；
[0086]
月见草油组，每天喂以高脂饲料加月见草油10ml/kg，ig；
[0087]
实施例1发酵液低剂量组，每天喂以高脂饲料加发酵液40ml/kg，ig；
[0088]
实施例1发酵液中剂量组，每天喂以高脂饲料加发酵液80ml/kg，ig；
[0089]
实施例1发酵液中剂量组，每天喂以高脂饲料加发酵液160ml/kg，ig；
[0090]
实施例2发酵液中剂量组，每天喂以高脂饲料加发酵液80ml/kg，ig；
[0091]
实施例3发酵液中剂量组，每天喂以高脂饲料加发酵液80ml/kg，ig；
[0092]
实施例4发酵液组，每天喂以高脂饲料加发酵液160ml/kg，ig；
[0093]
实施例5发酵液组，每天喂以高脂饲料加发酵液160ml/kg，ig；
[0094]
实施例6发酵液组，每天喂以高脂饲料加发酵液160ml/kg，ig；
[0095]
实施例7发酵液组，每天喂以高脂饲料加发酵液160ml/kg，ig；
[0096]
实施例8发酵液组，每天喂以高脂饲料加发酵液160ml/kg，ig。
[0097]
各组鹌鹑分别在大小相同的笼中饲养，早晚两次喂食物，平均每次10g/只，自由饮水；发酵液每日剂量分2次灌胃给予，月见草油每日剂量1次灌胃给予。
[0098]
3.制备待测样品
[0099]
实验6周的动物禁食10h，断头取血置离心管中，4℃静置30min后，2500rpm离心20min，分取上层血清即为待测样品。
[0100]
4.统计学处理
[0101]
计算数据以均值
±
sd表示，采用t检验作差异显著性分析。
[0102]
5.结果
[0103]
各组动物的血脂结果(均值
±
sd)见下表：
[0104]
[0105][0106]
注：各组与高脂模型组比较，ap《0.05，bp《0.01
[0107]
从上表结果可见，空白对照组与高脂模型组比较差异有极显著性，说明实验造模成功。阳性对照月见草油组有良好的降tc、tg、hdl-ch和ldl-ch作用。实施例1发酵液低剂量组具有良好的降tc、tg、hdl-ch和ldl-ch作用，并且随着剂量的增加发酵液降tc、tg、hdl-ch和ldl-ch作用增加，以发酵液高剂量组效果最好。实施例4～8组对降tc、tg、hdl-ch和ldl-ch有明显的作用，但是比同剂量实施例1发酵液的效果显著更差(均呈p《0.01)，效果基本上相同于实施例1发酵液低至中剂量的相当，这表明，在发酵过程中同时使用烟酰胺和肌醇对于获得实施例1发酵液优良降血脂效果是有必要的。
[0108]
虽然已知铁皮石斛叶具有一定的降血脂作用，然而通过特别的发酵处理能够显著提高这种降血脂效果，这一发现是现有技术不曾教导的，并且预期使用该发酵液配制铁皮石斛叶组合物将呈现更优良的生物学效果。
[0109]
使用铁皮石斛叶制备的组合物对于人体健康是有益的，本技术人的研究团队长期致力于使用铁皮石斛叶制备健康产品的研究和开发，下面的一些实施例提供使用上文所得发酵液制备铁皮石斛叶组合物的方法。
[0110]
试验例2：铁皮石斛叶发酵液中的黄酮含量测定
[0111]
铁皮石斛中富含队有降血脂作用的黄酮类化合物，本试验例以柚皮素为特征指标成分，参考周桂芬文献(周桂芬，等，高效液相色谱法测定铁皮石斛中柚皮素的含量，中国中药杂志，2013，38(4):520)方法，测定实施例1～8所得铁皮石斛叶发酵液中的柚皮素含量以及它们所用铁皮石斛干叶(8个实施例的发酵液使用同一批混合干叶制成)中的柚皮素含量。
[0112]
色谱条件与系统适用性实验：迪马c18色谱柱(4.6mm，250mm，5μm)；柱温30℃；流动相0.2％磷酸(a)-甲醇(b)，梯度洗脱(0～5min，25％b；5～10min，25％～30％b；10～25min，30～40％b；25～45min，40％～55％b；45～50min，55％～60％b)；检测波长290nm；流速1.0ml/min；柚皮素理论塔板数8400，柚皮素与最相邻色谱峰之间分离度大于2.2。
[0113]
铁皮石斛干叶供试品溶液制备和测定：取铁皮石斛干叶，粉碎，过3号筛，取约1g，精密称定，置50ml的圆底烧瓶中，精密加入甲醇-20％盐酸(4：1)的混合溶液25ml，称重，置水浴中加热回流1h，放冷，再称重，用甲醇补足减失重，摇匀，静置，取上清液经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，进样10μl。经测定，每1g铁皮石斛干叶中含2.326mg柚皮素。
[0114]
铁皮石斛叶发酵液的测定：取实施例1～8所得各铁皮石斛叶发酵液，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，进样10μl。经测定，实施例1～3发酵液中柚皮素含量分别为0.216mg/ml、0.221mg/ml、0.209mg/ml，实施例4～8发酵液中柚皮素含量分别为0.141mg/ml、0.126mg/ml、0.113mg/ml、0.130mg/ml、0.117mg/ml。据此数据，表明实施例1～3方法所得发酵液中柚皮素显著高于其它实例，由此反映实施例1～3发酵液总体化学成分区别于其它实例，进而导致它们如试验例1所述明显的生物学差异。
[0115]
实施例11：铁皮石斛叶组合物的制备
[0116]
配方：铁皮石斛干叶650g、(实施例1所得)铁皮石斛叶发酵液1l、聚葡萄糖18kg、水适量加至2000l。
[0117]
(1)制备铁皮石斛干叶浸提液：取经筛选、除杂后的铁皮石斛干叶，用水清洗，用60目滤袋装袋后置浸提罐中，加入干叶重量200倍的90～95℃水，浸提30min后滤出，得到一次浸提液；滤渣加至浸提罐中，加入干叶重量150倍的90～95℃水，浸提30min后滤出，得到二次浸提液；混合两次浸提液，用300目筛网过滤，再经过0.45μm膜过滤得到浸提液；
[0118]
(2)将聚葡萄糖加水溶解，加入铁皮石斛叶发酵液和步骤(1)所得浸提液，混合均匀，经200目过滤，加水至全量，将料液经0.45μm膜过滤；
[0119]
(3)将滤液经uht灭菌(137～139℃/15～30s)，冷却至液温低于25℃，无菌灌装至pet瓶中，每瓶500ml，即得铁皮石斛叶组合物。
[0120]
实施例12：铁皮石斛叶组合物的制备
[0121]
配方：铁皮石斛干叶700g、(实施例1所得)铁皮石斛叶发酵液0.8l、聚葡萄糖16kg、水适量加至2000l。
[0122]
(1)制备铁皮石斛干叶浸提液：取经筛选、除杂后的铁皮石斛干叶，用水清洗，用60目滤袋装袋后置浸提罐中，加入干叶重量150倍的90～95℃水，浸提30min后滤出，得到一次浸提液；滤渣加至浸提罐中，加入干叶重量200倍的90～95℃水，浸提30min后滤出，得到二次浸提液；混合两次浸提液，用300目筛网过滤，再经过0.45μm膜过滤得到浸提液；
[0123]
(2)将聚葡萄糖加水溶解，加入铁皮石斛叶发酵液和步骤(1)所得浸提液，混合均匀，经200目过滤，加水至全量，将料液经0.45μm膜过滤；
[0124]
(3)将滤液经uht灭菌(137～139℃/15～30s)，冷却至液温低于25℃，无菌灌装至pet瓶中，每瓶500ml，即得铁皮石斛叶组合物。
[0125]
实施例13：铁皮石斛叶组合物的制备
[0126]
配方：铁皮石斛干叶600g、(实施例1所得)铁皮石斛叶发酵液1.2l、聚葡萄糖20kg、水适量加至2000l。
[0127]
(1)制备铁皮石斛干叶浸提液：取经筛选、除杂后的铁皮石斛干叶，用水清洗，用60目滤袋装袋后置浸提罐中，加入干叶重量150倍的90～95℃水，浸提30min后滤出，得到一次浸提液；滤渣加至浸提罐中，加入干叶重量150倍的90～95℃水，浸提30min后滤出，得到二次浸提液；混合两次浸提液，用300目筛网过滤，再经过0.45μm膜过滤得到浸提液；
[0128]
(2)将聚葡萄糖加水溶解，加入铁皮石斛叶发酵液和步骤(1)所得浸提液，混合均匀，经200目过滤，加水至全量，将料液经0.45μm膜过滤；
[0129]
(3)将滤液经uht灭菌(137～139℃/15～30s)，冷却至液温低于25℃，无菌灌装至pet瓶中，每瓶500ml，即得铁皮石斛叶组合物。实施例11～13所得组合物均为呈饮料状态的液体。
[0130]
试验例3：组合物的质量检测
[0131]
针对实施例11～13所得三种铁皮石斛叶组合物，对其进行质量检测，方法和结果如下：
[0132]
1.色泽
[0133]
将实施例11～13制得的各铁皮石斛叶组合物摇匀后置于无色透明的比色管中，在自然光下肉眼观察饮料的色泽。结果，显示全部组合物均为浅黄色液体。
[0134]
2.滋味及气味
[0135]
对实施例11～13制得的各铁皮石斛叶组合物鉴别气味，用温开水漱口，品尝滋味。结果，显示全部组合物均具有清新的铁皮石斛叶香气，无异味。
[0136]
3.外观状态
[0137]
实施例11～13制得的各铁皮石斛叶组合物均呈现澄清黎明液体，静置2天以上后底部有少量天然成分沉淀，振摇后能够立即均匀分散；无正常视力可见外来杂质。
[0138]
4.ph值
[0139]
照gb5009.237检测，实施例11～13制得的各铁皮石斛叶组合物ph值均在5.6～6.1范围内，例如实施例11饮料ph值为5.87。
[0140]
5.可溶性固形物
[0141]
照gb/t12143检测，实施例11～13制得的各铁皮石斛叶组合物的可溶性固形物(20℃)均在1.7％～1.9％范围内，例如实施例11饮料可溶性固形物为1.84％。
[0142]
6.微生物限量检查
[0143]
使用如下检验方法对实施例11～13制得的各铁皮石斛叶组合物进行微生物限量检查：
[0144][0145]
结果：实施例11～13制得的各铁皮石斛叶组合物的菌落总数、大肠菌群、霉菌和酵母的检测结果均符合规定。
[0146]
试验例4：一年贮藏期的质量考察
[0147]
使实施例11～13制得的各铁皮石斛叶组合物置常温(25℃)避光处贮藏12个月后，按试验例3各检测项进行测定。12月的结果如下：
[0148]
1.色泽：实施例11～13各组合物均为浅黄色。
[0149]
2.滋味及气味：实施例11～13各组合物均具有清新的铁皮石斛叶香气，无异味。
[0150]
3.外观状态：实施例11～13各组合物均呈现澄清黎明液体，静置2天以上后底部有少量天然成分沉淀，振摇后能够立即均匀分散；无正常视力可见外来杂质。
[0151]
4.ph值：实施例11～13各组合物ph值均在5.4～6.1范围内，例如实施例11组合物ph值为5.94。
[0152]
5.可溶性固形物：实施例11～13各组合物可溶性固形物(20℃)均在1.7％～1.9％范围内，例如实施例11组合物可溶性固形物为1.81％。
[0153]
6.微生物限量检查：实施例11～13各组合物的菌落总数、大肠菌群、霉菌和酵母的检测结果均符合规定。
[0154]
以上结果表明本发明实施例11～13制得的组合物具有优良的性能，例如具有优良的稳定性能，保持期可以达到12个月甚至以上。
[0155]
本文中所举的实施例仅用以说明本发明的组成及功效，并非因此局限本发明的专利范围，故对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出类似修改，均隶属于本发明的专利范畴。这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

技术特征：
1.一种铁皮石斛叶发酵液，其是通过包括如下步骤和投料比例的方法制备得到的：(1)菌种活化：将植物乳杆菌加至10倍重量的37℃无菌蒸馏水中使溶解，再置于37℃恒温箱中活化30min，得到植物乳杆菌液，备用；(2)铁皮石斛叶酶解液的制备：将200g铁皮石斛干叶加至1.2l去离子水中，破壁处理至细胞破壁率达到75%以上，接着于90℃煮沸15min，然后迅速降温至50℃，调节料液的ph至4.5
±
0.2，加入果胶酶和纤维素酶，置于50℃水浴锅中，酶解2h后灭酶，加水至1.8l，得到铁皮石斛叶酶解液；(3)铁皮石斛叶发酵液的制备：向步骤(2)所得铁皮石斛叶酶解液中加入葡萄糖使溶解后，于95℃灭菌5min，迅速冷却至37℃；接着加入活化后的植物乳杆菌100ml，在37℃下无氧发酵48~72h至发酵液的ph达到3.5~4.0时，立即迅速降温至2~4℃使发酵停止，200目筛过滤，滤液补加水适量使发酵液体积至2l，95℃灭菌5min，得到铁皮石斛叶发酵液。2.根据权利要求1的铁皮石斛叶发酵液，其中的植物乳杆菌是浓度50~500亿cfu/g的菌粉，例如是100亿cfu/g的菌粉。3.根据权利要求1的铁皮石斛叶发酵液，其中果胶酶的加入量是0.5~5万u，例如是0.5~2万u，例如1万u；例如，其中的果胶酶是1~10万的粉末，例如是2万u/g的粉末。4.根据权利要求1的铁皮石斛叶发酵液，其中纤维素酶的加入量是0.5~5万u，例如是0.5~2万u，例如1万u；例如，其中的纤维素酶是0.5~5万u/g的粉末，例如是1万u/g的粉末。5.根据权利要求1的铁皮石斛叶发酵液，其中的葡萄糖加入量为20~200g，例如是30~150g，例如是55g；例如，与葡萄糖一起还添加烟酰胺，例如添加1~10g烟酰胺，例如添加2~5g烟酰胺，例如添加2~3g烟酰胺，例如添加2.5g烟酰胺；例如，与葡萄糖一起还添加肌醇，例如添加0.5~5g肌醇，例如添加0.2~2g肌醇，例如添加1~1.5g肌醇，例如添加1.2g肌醇。6.制备铁皮石斛叶发酵液的方法，其包括如下投料比例的步骤：(1)菌种活化：将植物乳杆菌加至10倍重量的37℃无菌蒸馏水中使溶解，再置于37℃恒温箱中活化30min，得到植物乳杆菌液，备用；(2)铁皮石斛叶酶解液的制备：将200g铁皮石斛干叶加至1.2l去离子水中，破壁处理至细胞破壁率达到75%以上，接着于90℃煮沸15min，然后迅速降温至50℃，调节料液的ph至4.5
±
0.2，加入果胶酶和纤维素酶，置于50℃水浴锅中，酶解2h后灭酶，加水至1.8l，得到铁皮石斛叶酶解液；(3)铁皮石斛叶发酵液的制备：向步骤(2)所得铁皮石斛叶酶解液中加入葡萄糖使溶解后，于95℃灭菌5min，迅速冷却至37℃；接着加入活化后的植物乳杆菌100ml，在37℃下无氧发酵48~72h至发酵液的ph达到3.5~4.0时，立即迅速降温至2~4℃使发酵停止，200目筛过滤，滤液补加水适量使发酵液体积至2l，95℃灭菌5min，得到铁皮石斛叶发酵液。7.根据权利要求6的方法，其中：植物乳杆菌是浓度50~500亿cfu/g的菌粉，例如是100亿cfu/g的菌粉；果胶酶的加入量是0.5~5万u，例如是0.5~2万u，例如1万u；果胶酶是1~10万的粉末，例如是2万u/g的粉末；纤维素酶的加入量是0.5~5万u，例如是0.5~2万u，例如1万u；纤维素酶是0.5~5万u/g的粉末，例如是1万u/g的粉末；葡萄糖加入量为20~200g，例如是30~150g，例如是55g；
与葡萄糖一起还添加烟酰胺，例如添加1~10g烟酰胺，例如添加2~5g烟酰胺，例如添加2~3g烟酰胺，例如添加2.5g烟酰胺；与葡萄糖一起还添加肌醇，例如添加0.5~5g肌醇，例如添加0.2~2g肌醇，例如添加1~1.5g肌醇，例如添加1.2g肌醇。8.一种铁皮石斛叶组合物，其包括铁皮石斛干叶600~700g例如650g制成的浸提液、权利要求1~5所述铁皮石斛叶发酵液0.8~1.2l例如1l、聚葡萄糖16~20kg例如18kg、水适量加至2000l。9.根据权利要求8的铁皮石斛叶组合物，其是通过包括如下步骤和投料比例的方法制备得到的：(1)制备铁皮石斛干叶浸提液：取经筛选、除杂后的铁皮石斛干叶，用水清洗，用60目滤袋装袋后置浸提罐中，加入干叶重量100~250倍例如150~200倍的90~95℃水，浸提30min后滤出，得到一次浸提液；滤渣加至浸提罐中，加入干叶重量100~250倍例如150~200倍的90~95℃水，浸提30min后滤出，得到二次浸提液；混合两次浸提液，用300目筛网过滤，再经过0.45μm膜过滤得到浸提液；(2)将聚葡萄糖加水溶解，加入铁皮石斛叶发酵液和步骤(1)所得浸提液，混合均匀，经200目过滤，加水至全量，将料液经0.45μm膜过滤；(3)将滤液经uht灭菌(137~139℃/15~30s)，冷却至液温低于25℃，无菌灌装至pet瓶中，即得铁皮石斛叶组合物。10.制备铁皮石斛叶组合物的方法，该铁皮石斛叶组合物包括铁皮石斛干叶600~700g例如650g制成的浸提液、本发明第一方面所魔窟铁皮石斛叶发酵液0.8~1.2l例如1l、聚葡萄糖16~20kg例如18kg、水适量加至2000l，该方法包括如下步骤：(1)制备铁皮石斛干叶浸提液：取经筛选、除杂后的铁皮石斛干叶，用水清洗，用60目滤袋装袋后置浸提罐中，加入干叶重量100~250倍例如150~200倍的90~95℃水，浸提30min后滤出，得到一次浸提液；滤渣加至浸提罐中，加入干叶重量100~250倍例如150~200倍的90~95℃水，浸提30min后滤出，得到二次浸提液；混合两次浸提液，用300目筛网过滤，再经过0.45μm膜过滤得到浸提液；(2)将聚葡萄糖加水溶解，加入铁皮石斛叶发酵液和步骤(1)所得浸提液，混合均匀，经200目过滤，加水至全量，将料液经0.45μm膜过滤；(3)将滤液经uht灭菌(137~139℃/15~30s)，冷却至液温低于25℃，无菌灌装至pet瓶中，即得铁皮石斛叶组合物。

技术总结
本发明涉及铁皮石斛叶的发酵方法及其组合物。一方面，涉及一种铁皮石斛叶发酵液，其制法是：将植物乳杆菌活化；将铁皮石斛干叶和水破壁处理，煮沸，加入果胶酶和纤维素酶酶解，灭酶，得酶解液；向酶解液中加入葡萄糖使溶解，灭菌，加入活化后的植物乳杆菌，无氧发酵至发酵液的pH达到3.5~4.0时，过滤，灭菌5min，即得。还涉及所述铁皮石斛叶发酵液的制备方法、包含铁皮石斛叶浸提液和所述铁皮石斛叶发酵液的组合物。本发明方法制备得到的发酵液和组合物呈现如说明书所述诸多优点。现如说明书所述诸多优点。


技术研发人员：梁斌 唐靖雯 吴浩 张丽艳 王传方 孙中华 熊珍俊 卢礼平 潘梅
受保护的技术使用者：贵州同威生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.05
技术公布日：2023/8/24