使用冷冻电子显微镜解析蛋白质结构的方法

使用冷冻电子显微镜解析蛋白质结构的方法


背景技术：
技术领域
1.本技术涉及结构生物学技术领域，尤其涉及一种利用低温电子显微镜解析蛋白质结构的方法。
2.相关技术的描述
3.此处的陈述仅提供与本技术相关的背景信息，并不一定构成现有技术。
4.蛋白质的高分辨率三维结构为了解蛋白质的功能提供了重要信息(garcia-nafria等人，2020)。经典的蛋白质结构是使用x射线晶体学和nmr光谱法确定的。根据蛋白质的种类，必须克服不同的障碍才能产生高分辨率的蛋白质结构。在x射线晶体学的情况下，必须生成适当衍射晶体，这需要大量纯化蛋白质。在nmr光谱法的情况中，可以在溶液中研究蛋白质结构，但必须用合适的同位素在主链和侧链中进行标记。这两种结构确定技术都非常耗时并且可能非常昂贵。在确定膜蛋白的三维结构时尤其如此(li等人，2021)。大约三分之一的人类蛋白质组是膜蛋白。许多膜蛋白对细胞的正常功能或功能障碍起着核心作用。它们的功能失常导致许多严重疾病，因此膜蛋白是大多数现代药物的靶标。它们对现代药物开发的重要性将进一步增加(sriram和insel，2018年)。
5.与水溶性蛋白质相比，膜蛋白的三维结构的确定确实存在额外的障碍。膜蛋白首先必须从它们的天然细胞膜中分离出来，这通常通过将整个膜溶解在去污剂中来完成，以便产生去污剂溶解的分子状态的膜蛋白。在这些条件下，膜蛋白可以以均质形式纯化。对于x射线晶体学，必须使洗涤剂溶解的膜蛋白形成结晶。在大多数情况下，膜蛋白仅在对其天然序列进行严重修饰后才会产生高度衍射的晶体。通过nmr光谱法解析膜蛋白的结构面临着蛋白质大小的额外限制：只有分子量低于80kda的蛋白质的结构才能通过目前可用的技术常规解决(purslow等人，2020)。
6.使用冷冻电子显微镜(cryoem)进行单粒子成像的最新进展彻底改变了膜蛋白结构生物学(k
ü
hlbrandt,2014；garcia-nafria等人,2020)。其中，许多单独的膜蛋白或膜蛋白复合物以洗涤剂溶解形式或重组到脂质双层纳米圆盘进行成像。从数百万个单个粒子的图像中，可以在相应的野生型膜蛋白的原子分辨率下估计3d结构，即不需要晶体。
7.对于一些大型或对称复合物，已经获得了超过分辨率的冷冻电镜结构(greber等人，2021)。然而，许多药物靶点既不是大的也不是对称的。目前，单粒子冷冻电镜在提高膜蛋白结构分辨率方面的广泛应用受到以下因素的限制：
8.(i)尽管技术取得了重大进展，但在或更高分辨率下对分子量低于100-kda的不对称复合物进行高分辨率结构解析通常仍然非常具有挑战性。
9.(ii)另一个严重的问题是用于电子显微镜的样品制剂的空气-水界面处的蛋白质吸附。这可能导致优先的蛋白质取向和蛋白质变性，从而显著降低单粒子分析的样品质量。


技术实现要素：

10.鉴于上述技术问题，本技术的目的之一在于提供一种利用冷冻电镜进行蛋白质结构解析的方法，该方法是通用的方法，并能解决分子量低至至少20kda的目标蛋白的结构解析的问题。
11.为实现上述目的，根据本技术的实施例，提供一种利用冷冻电镜进行蛋白质结构解析的方法。该方法包括：
12.使目标蛋白包含标签；
13.使包含有所述标签的所述目标蛋白与支架蛋白结合以形成所述目标蛋白与所述支架蛋白的复合物；以及
14.使用冷冻电子显微镜进行单粒子成像，以解析与所述支架蛋白复合的所述目标蛋白质结构。
15.所述支架蛋白为链霉亲和素、亲和素或者其衍生物中的任意一种。所述标签用于选择性地与支架蛋白结合。所述标签选自以下组成的组中的一者：生物素标签，其包含生物素；生物素化的蛋白质或多肽标签，其包含蛋白质序列和与所述蛋白质序列共价连接的生物素；链霉菌标签(strep-tag)；以及生物素化或链球菌标记的抗体、抗体fab片段或者单链抗体。
16.在本技术的实施例中，所述strep-tag是适于与链霉亲和素或链霉菌素或其其他衍生物选择性结合的多肽序列。
17.在本技术的实施例中，在所述标签为所述生物素标签的情况下，所述使目标蛋白包含标签的步骤包括：
18.使所述生物素标签包含在非规范氨基酸的侧链中，并将所述非规范氨基酸位点特异性地引入所述目标蛋白的氨基酸序列中；
19.或者，将所述生物素标签化学连接到氨基酸的特定侧链(例如赖氨酸的ε-氨基或半胱氨酸的-sh基)，并将所述氨基酸位点特异性地引入目标蛋白中；
20.或者，将所述生物素标签化学连接到目标蛋白n末端部分的特定糖基化位点。
21.在本技术的实施例中，所述生物素标签通过化学修饰或者基因工程选择性地附接到所述目标蛋白。
22.在本技术的实施例中，所述生物素化的蛋白质或多肽标签选自以下组成的组中的一者：
23.自标记蛋白质标签，其允许生物素残基与相应标签蛋白质进行位点特异性共价连接；
24.酰基载体蛋白标签(acp-tag)或者肽基载体蛋白标签(pcp-tag)；以及
25.avi-tag，其适于与所述目标蛋白的n端或者c端或者暴露的环区域融合，并且可通过escherichia coli生物素化酶bira而与生物素共价连接。
26.在本技术的实施例案中，acp-标签或pcp-标签和生物素使用coa的生物素衍生物作为底物分别通过sfp-和acps-ppt酶进行酶促共价连接。
27.在本技术的实施例中，所述自标记蛋白质标签为snap-tag、clip-tag或者halo-tag。
28.在本技术的实施例中，所述目标蛋白优选具有在20kda至50kda之间甚至更小的分
子量。在本技术的实施例中，所述目标蛋白具有低至至少33kda的分子量。在本技术的实施例中，所述目标蛋白具有低至至少20kda的分子量。
29.在本技术的实施例中，所述目标蛋白为水溶性蛋白或者膜蛋白。
30.在本技术的实施例中，当所述目标蛋白为g蛋白偶联受体，简称为gpcr，时，其在所述n端、c端或者细胞外环结构(即，e1、e2、e3)中的一者或者细胞内环结构(即，i1、i2、i3、i4)中的一者处插入有所述生物素标签或者所述生物素化蛋白或多肽标签。
31.在本技术的实施例中，当所述目标蛋白为gpcr时，其在所述n端、c端或者细胞外环结构(即，e1、e2、e3)中的一者或细胞内环结构(即，i1、i2、i3、i4)中的一者处选择性地连接有anticalin或者ig型或单链抗体。
32.在本技术的实施例中，在所述gpcr的细胞内环结构i4处融合所述生物素标签、所述生物素化蛋白或多肽标签或者strep-tag，从而将所结合的链霉亲和素或streptactin稳定在刚性结构中。
33.在本技术的实施例中，在所述gpcr的细胞外环(即，e1、e2、e3)中的一者或者细胞内环(即，i1、i2、i3、i4)中的一者处融合所述生物素标签、所述生物素化蛋白或多肽标签或者所述strep-tag，从而将所结合的链霉亲和素或streptactin稳定在刚性结构中。
34.在本技术的实施例中，当所述目标蛋白为原型gpcr与细胞内信号蛋白的复合物时，可以通过以下方式引入所述标签，以使所述目标蛋白与作为支架蛋白的所述链霉亲和素或者其衍生物相结合：
35.1)在所述原型gpcr的n端、c端或者细胞外环结构中的一者或细胞内环结构中的一者处插入所述生物素标签、所述生物素化蛋白或多肽标签；
36.2)在所述原型gpcr的所述n端、c端或者细胞外环结构中的一者或细胞内环结构中的一者处选择性地连接anticalin或者ig型或者单链抗体；
37.3)将所述生物素标签或者所述生物素化蛋白或多肽标签融合到所述细胞内信号蛋白的序列中；
38.4)将生物素化抗体与所述细胞内信号蛋白选择性地结合；或者
39.5)选择性地将生物素化的anticalin结合到所述细胞内信号蛋白。
40.在本技术的实施例中，所述细胞内信号蛋白选自以下任意一种：
41.异源三聚体g蛋白或微型g蛋白，其适于与激动剂激活的gpcr结合；
42.g蛋白偶联受体激酶(grk)，其适于与活性gpcr结合并使其磷酸化；
43.抑制蛋白，其适于与磷酸化的gpcr结合；以及
44.模拟g蛋白或抑制蛋白中与受体结合区域的肽序列。
45.在本技术的实施例中，当所述目标蛋白是神经肽1受体(nk1r)时，所述标签为生物素化的halo-tag，所述支架蛋白为链霉亲和素，通过所述生物素化的halo-tag在所述链霉亲和素上组装四聚体nk1r，即，形成复合物sa(halotag-nk1r)n，其适于利用冷冻电镜解析所述nk1r的结构，其中，n为1至4之间的整数。
46.在本技术的实施例中，所述生物素化的halo-tag插入在所述nk1r的第三细胞内环结构il3中，并删除第227位至237位氨基酸序列。
47.在本技术的实施例中，在所述使目标蛋白包含标签的步骤之前，合成halotag-peg4-生物素配体，并且使所述halotag-peg4-生物素配体与halotag蛋白之间形成稳定的
酯键，以形成生物素化的halo-tag标签。
48.在本技术的实施例中，所述halotag-peg4-生物素配体的分子式为c
31h57
cln4o9s，分子量为697，其具有以下化学结构：
[0049][0050]
其中，所述halotag-peg4-生物素配体的末端-cl能够在亲和反应中被halotag蛋白的asp106置换形成稳定的酯键，从而形成生物素化的halo-tag标签。
[0051]
在本技术的实施例中，在所述使目标蛋白包含标签的步骤之前，所述方法包括：分子建模，其用于在所述目标蛋白序列中找到并调整生物素标签或者生物素化蛋白或多肽标签或所述strep-tag的适当插入位置，以获得所述目标蛋白与所述支架蛋白之间的最佳结构刚性。
[0052]
在本技术的实施例中，在所述分子建模过程中，在所述目标蛋白的氨基酸序列插入额外的间隔氨基酸，或者从所述目标蛋白的氨基酸序列中去除功能上不相关的灵活氨基酸序列。
[0053]
在本技术的实施例中，halotag-peg4-生物素配体中的peg4间隔进一步被缩短或扩大，以获得所述支架蛋白和所述目标蛋白之间的最佳结构刚性。
[0054]
根据本技术实施例的利用低温电子显微镜解析蛋白质结构的方法的优点总结如下：
[0055]
在本技术的方法中，使目标蛋白包含标签。使包含标签的目标蛋白与支架蛋白结合以形成复合物。然后使用冷冻电子显微镜进行单粒子成像以确定目标蛋白的结构。标签能够选择性地结合支架蛋白。这样，该方法对于多种可溶性蛋白或膜蛋白的结构解析具有通用性。因此，目标蛋白并不受限限于它们的对称结构和大分子量。相比之下，本技术的方法可以实现对分子量低至至少20kda的目标蛋白质的结构解析，并且解析结果不受目标蛋白质结构对称性的影响。
[0056]
本技术的另一目的是提供一种halotag-peg4-生物素配体在上述利用低温电子显微镜解析蛋白质结构的方法中的用途。所述halotag-peg4-生物素配体，其分子式为c31h57cln4o9s，分子量为697，其具有以下化学结构：
[0057][0058]
在本技术的实施例中，halotag蛋白的asp106适于与所述halotag-peg4-生物素配体的末端-cl能够在亲和反应中被halotag蛋白的asp106置换形成稳定的酯键，从而形成生物素化的halo-tag标签。
[0059]
根据本技术实施例的halotag-peg4-生物素配体的优点总结如下：
[0060]
halotag-peg4-生物素配体的末端-cl可以在亲核反应中被halotag蛋白的asp106
置换，形成稳定的酯键，从而形成生物素化的halo-tag。生物素化的halo-tag能够将目标蛋白与支架蛋白连接形成蛋白质复合物，该蛋白质复合物适用于进行单粒子cryo-em以确定目标蛋白的结构。可以改变halotag-peg4-生物素配体中peg4间隔的长度，以最大限度地减少halotag蛋白和链霉亲和素支架蛋白之间的灵活性。
[0061]
简要附图说明
[0062]
下面结合附图对本技术进行描述，其中：
[0063]
图1a-图1c显示了用于单粒子冷冻电子显微镜的支架蛋白上目标蛋白或蛋白复合物的四聚体形成。特别是，图1a显示了由细胞内c末端的七个跨膜螺旋(矩形1、2、
…
7)和螺旋8(矩形8)组成的原型g蛋白偶联受体(gpcr)的示意图。胞外n-末端包含生物素化标签；如图1b显示了与细胞内信号蛋白复合的原型gpcr的示意图；和图1c显示了支架蛋白的示意图，该支架蛋白上包含一种通过其标签特异性结合到四个支架结合位点中的每一个的目的蛋白(poi)。
[0064]
图2a显示sa-(nk1r-halotag)4的结构模型，包括四聚体链霉亲和素sa(中心)和四个结合的生物素化halotag蛋白分子。该结构模型是通过计算机建模获得的。
[0065]
图2b显示了从各向异性网络模型(anm)分析计算的蛋白质复合物的内在迁移率。
[0066]
图3a显示sa(halotag)4的结构模型，包括四聚体链霉亲和素(sa中心，橙色)和四个结合的生物素化halotag蛋白分子(绿色)，每个sa亚基对应一个halotag蛋白。
[0067]
图3b显示了从anm分析计算的复合物的固有迁移率。
[0068]
图4a显示通过hplc分析的纯化的halotagpeg-生物素配体：光吸收波长为210nm并且保留时间为10分钟。
[0069]
图4b显示halotagpeg-生物素配体的lc-ms。ms：m/z计算值。对于c
31h58
cln4o9s
+
：697.36(100％)、698.36(36.6％)、699.36(41％)、719.3(12.13％)、720.3(4.41％)。
[0070]
图5a显示了链霉亲和素-halotag蛋白复合物的尺寸排阻色谱。图5b显示链霉亲和素四聚体(streptavidin)、halotag蛋白(halotag)、尺寸排阻色谱级分1和级分2的sds-page(图5a)。
[0071]
图6显示了通过尺寸排阻色谱法分离的链霉亲和素-halotag蛋白复合物的负染色制剂的电子显微照片(图5a，级分1)。
[0072]
图7a显示了链霉亲和素-halotag蛋白复合物的代表性冷冻电子显微照片(冷冻电子显微镜在300kv下操作；比例尺：50nm)。图7b显示了链霉亲和素-halotag蛋白复合物的代表性二维分类平均图像。
[0073]
图8a-图8b显示链霉亲和素-halotag蛋白复合物的冷冻电子显微照片的分辨率估计。具体地，图8a显示傅立叶壳相关(fsc)图，指示校正分辨率为3.6；图8b是非均匀细化后链霉亲和素-halotag蛋白复合物的三维图。
[0074]
图9a显示了链霉亲和素-nk1r-halotag复合物的尺寸排阻层析；以及
[0075]
图9b显示链霉亲和素-nk1r-halotag复合物、nk1r-halotag的sds-page，对应于尺寸排阻层析级分1至级分4(图9a)。
具体实施方式
[0076]
为了进一步说明本技术，下文描述了详述使用低温电子显微镜解析蛋白质结构的
方法的实验。需要说明的是，以下实施例是为了描述而不是限制本技术。
[0077]
定义
[0078]
当指代诸如“a”或“an”，以及“the”之类的单数名词时使用不定冠词或定冠词，除非另有说明，否则包括该名词的复数形式。当在本说明书和权利要求书中使用术语“包括”时，它不排除其他元件或步骤。此外，说明书和权利要求书中的第一、第二、第三等术语用于区分相似的元素，不一定用于描述顺序或时间顺序。应当理解，如此使用的术语在适当情况下是可互换的，并且本文描述的本发明的实施例可以以不同于本文描述或图示的顺序操作。提供以下术语或定义仅用于帮助理解本发明。除非本文特别定义，否则本文使用的所有术语与本发明领域的技术人员所理解的具有相同的含义。
[0079]
如本文所用，术语“目标蛋白(target protein)”或“目的蛋白(protein of interest，poi)”是指其结构将被确定的蛋白质。
[0080]
本文所用的“支架蛋白”是指具有多个蛋白结合结构域的蛋白，所述蛋白结合结构域特异性结合与待确定结构的蛋白连接的标签或修饰的标签。
[0081]
术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中进一步可互换使用，以指氨基酸残基及其变体和合成类似物的聚合物。
[0082]
生物素是六氢-2-氧代-1h-噻吩并(3,4-d)咪唑-4-戊酸。它也被称为维生素h和辅酶r，是一种水溶性维生素，也属于维生素b家族，b7。它是合成维生素c的必需物质，是脂肪和蛋白质正常代谢不可缺少的物质。
[0083]
链霉亲和素是由四个相同的蛋白质亚基组成的蛋白质复合物。该四聚体的蛋白质分子量为52kda，可以从streptomyces avidinii细菌中纯化或通过在大肠杆菌中表达异源蛋白质产生。链霉亲和素同型四聚体对生物素(也称为维生素b7或维生素h)具有极高的亲和力。解离常数(kd)约为10-14
mol/l，生物素与链霉亲和素的结合是自然界中已知的最强的非共价相互作用之一。由于链霉亲和素-生物素复合物对有机溶剂、变性剂(例如氯化胍)、去污剂(例如sds、tritonx-100)、蛋白水解酶以及极端温度和ph值具有抗性，因此链霉亲和素广泛用于分子生物学、生物分析和生物技术。
[0084]
在本文中，具有低于50kda的分子量的感兴趣的水溶性蛋白质包括酶、转录因子和转运蛋白，发现它们游离于细胞区室如细胞质、细胞核或内质网中。
[0085]
整合膜蛋白，在本文中简称为“膜蛋白”，是嵌入构成细胞膜双层结构的磷脂中的蛋白质。膜蛋白执行对细胞正常运作至关重要的特定功能。这些特定功能包括分子和离子易位进出细胞，检测细胞外信号并将它们传输到细胞中。膜蛋白的细胞外位点通常被糖基化，使细胞可被其他细胞识别。
[0086]
g蛋白偶联受体(gpcr)是整合膜蛋白，其将物理和化学信号从细胞外空间传递到细胞中。gpcr识别的化学信号范围从神经递质等小分子到激素和蛋白质。人类蛋白质组gpcr中有大约800个代表建立了最大的膜蛋白家族。人类中有五种不同类别的gpcr。类视紫红质a类包含数量最多的gpcr，约有700个代表。其中大约一半是嗅觉受体。典型的a类gpcr的分子量在30至40kda的范围内。每个受体包含一个由七个α-螺旋组成的跨膜结构域。细胞外n端通常是糖基化的。通过一步化学反应可以选择性地生物素化特定的保守糖基化位点。膜内c末端通常包含一个α-螺旋，其通过脂质锚连接到质膜的细胞内侧。gpcr是小分子药物最重要的靶标之一。
[0087]
神经激肽1受体(nk1r)是速激肽如p物质的主要受体。nk1r属于a类gpcr。它与gq和gs蛋白信号通路偶联。
[0088]
如本文所用，术语“融合”和本文可互换地用作“结合”、“缀合”、“连接”，尤其是指“遗传融合”，例如通过重组dna技术，并且指“化学和/或酶结合”导致稳定的共价键。
[0089]
如本文所用，术语“蛋白质复合物”或“复合物”或“组装的蛋白质”是指一组两种或更多种结合的大分子，其中至少一个是蛋白质。
[0090]
术语“结合”是指任何相互作用，无论是直接的还是间接的。直接相互作用表明结合伙伴之间有接触。间接相互作用是指引起相互作用伙伴在两个以上分子的复合物中相互作用的任何相互作用。
[0091]
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白(igg)分子或含有特异性结合抗原的免疫球蛋白(ig)结构域的分子。抗体可以是来自天然来源或来自重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。igg抗体通常由四条多肽链组成。
[0092]
如本文所用，术语“抗运载蛋白(anticalin)”是指经工程改造的具有新的抗体样结合功能的脂质运载蛋白的蛋白质。
[0093]
如本文所用，术语“标记”或“标签”是指允许检测、可视化和/或分离、纯化和/或固定(多)肽或蛋白质的、本文所述的已经分离或纯化的可检测标记。旨在包括本领域已知的用于这些目的的任何标记/标签。
[0094]
术语“野生型”是指从天然存在的来源中分离的基因或基因产物。野生型基因是人群中最常观察到的基因，因此可以任意设计基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“修饰的”、“突变的”、“衍生物”或“变体”是指与野生型相比时显示的序列、翻译后修饰和/或功能特征(即改变的特征)。类型基因或基因产物或修饰基因或基因产物。
[0095]
如本文所用，术语“载体”、“载体构建体”、“表达载体”或“基因转移载体”旨在指能够转运与其连接的另一核酸分子的核酸分子，并且包括本领域技术人员已知的任何载体，包括任何合适的类型，包括但不限于质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体(例如λ噬菌体)、病毒载体(例如腺病毒、aav或杆状病毒载体)或人工染色体载体(如细菌人工染色体)(bac)、酵母人工染色体(yac)或p1人工染色体(pac)。
[0096]
在这里，我们提出了一种新技术来解决分子量低至至少20kda的目标蛋白的结构。它是通用的，即它可以以相同的方式用于许多不同的目标蛋白。用于结构确定的目标蛋白包含选择性结合链霉亲和素、亲和素或其修饰形式的标签(图1)。感兴趣的标签通常是可以共价连接生物素的蛋白质或短肽序列。或者，可以使用所谓的链球菌标签(strep-tag)，其是能够选择性结合链霉亲和素或者作为链霉亲和素的修饰形式的链霉亲和素-xt的短肽序列。表1总结了不同的感兴趣标签。
[0097]
表1
[0098]
[0099]
[0100][0101]
一般来说，标签可以分为表1中总结的两组。
[0102]
(1)直接附接至所述目标蛋白的生物素标签，或者与目标蛋白序列融合的生物素化蛋白或多肽标签。
[0103]
感兴趣的融合蛋白包含以下标签之一：
[0104]
(i)包含在非规范氨基酸的侧链中的生物素，其中，所述非规范氨基酸被位点特异性地引入所述目标蛋白的氨基酸序列中(kim等人，2013)。
[0105]
(ii)化学连接到所述目标蛋白的n端的特定糖基化位点的生物素(bieri等人，1999)。更具体地说，靠近细胞外n末端的糖基化共有位点在已测序的gpcr中是保守的，并且已经证实了几种受体的糖基化。可以使用碳水化合物特异性化学来利用该特征进行生物素化，从而将生物素标签限制在受体的细胞外结构域。
[0106]
(iii)自标记蛋白质标签，例如snap-tag、clip-tag或halo-tag，允许生物素残基与相应的蛋白质标签进行位点特异性共价连接(los等人，2008；reymond等人，2011)。
[0107]
(iv)酰基载体蛋白(acp)或肽基载体蛋白(pcp)标签，可分别使用sfp和acps磷酸泛酰巯基乙炔基转移酶(pptases)用生物素位点特异性标记(george等人，2004；vivero-pol等人，2005)。acp和pcp标签可以被12个残基肽标签a1和s6替换，它们可以分别通过sfp-和acps-pptase在融合蛋白上用生物素位点特异性地标记(zhou等人，2007)。
[0108]
(v)可以使用由8个氨基酸肽组成的链球菌标签(seq id no:1：wshpqfek)(https://en.wikipedia.org/wiki/strep-tag；schmidt&skerra,2007)，其序列与作为链霉亲和素的修饰版本的strep-tactin的四个相同结合位点之一强烈结合。总共有四个与相应目标蛋白融合的链球菌标签将与一个strep-tactin分子结合。或者，可以使用twinstrep-tag(seq id no:2：
[0109]
wshpqfekgggsgggsggshpqfek)，它以更高的亲和力与strep-tactin结合，并以亚
纳摩尔的亲和力与链霉亲和素的另一修饰版本strep-tactin-xt结合。strep-tag也可以与streptavidin结合，但与strep-tactin相比亲和力较低。此处，一个twin strep-tag序列与strep-tactin-xt、strep-tactin或者streptavidin的两个亚基结合(https://www.iba-lifesciences.com；palmer i等人，2007)，即在这种情况下只有两个twin-strep-tag序列可以与一种streptavidin、strep-tactin或strep-tactin-xt结合。
[0110]
(vi)另一种选择是15个氨基酸的avitag，它可以融合到目标蛋白的n或c末端或暴露的环区域，并且可以使用大肠杆菌生物素化酶bira共价连接生物素(fairhead&howarth,2015)。
[0111]
上述标签提供了额外的优势，可用于目标蛋白的亲和纯化(https://en.wikipedia.org/wiki/strep-tag；lin等人，2020)。
[0112]
(2)选择性地与所述目标蛋白相结合的生物素化的或者链球菌标记的抗体、抗体fab片段或者单链抗体(纳米抗体)或者anticalins(gebauer&skerra,2020)。
[0113]
在这种方法中，生物素或链球菌标签序列共价连接至igg型抗体、抗体片段或纳米抗体，该ig型抗体、抗体片段或纳米抗体以高亲和力和选择性结合poi中的天然或遗传引入的序列或结构基序。如果应将天然的、未修饰的poi组装到支架蛋白链霉亲和素或其衍生物上，这种方法尤其令人感兴趣。
[0114]
图1a-图1c描述了在水溶性蛋白质或gpcr等膜蛋白的情况下定位生物素化标签和链球菌标签的可能性。gpcr是最大的一类人类膜蛋白，也是最重要的药物靶点之一(zhou等人，2019；sriram和insel，2018)。由于大多数gpcr在c末端区域的某个半胱氨酸残基处包含s-棕榈酰化(qanbar和bouvier，2003；adachi等，2019；patwardhan等，2021)，因此跨膜螺旋7和s-棕榈酰化位点之间的细胞内环i4对于放置生物素/strep-tag(或者生物素化的a1和s6标签)特别感兴趣，因为它可以将结合的链霉亲和素/streptactin稳定在刚性结构中。类似地，放置在细胞外环e1、e2、e3之一或细胞内环i1、i2、i3、i4之一中的生物素/strep-tag可能会使结合的链霉亲和素/streptactin保持刚性结构，这将有助于目标gpcr的结构阐明。
[0115]
图1a显示了由细胞内c末端的七个跨膜螺旋(矩形1、2、
…
7)和螺旋8(矩形8)组成的原型g蛋白偶联受体(gpcr)的示意图。gpcr的c末端部分可能通过脂质锚连接到脂质双层纳米盘的细胞内侧。在该图示中，细胞外n端包含单个标签(例如，生物素化标签)，该标签能够直接或在翻译后修饰后选择性地结合到支架蛋白的四个不同结合位点之一(如图1c所示)。通常，目标gpcr包含一个单一的蛋白质或肽标签，它可以插入到n端、c端或细胞外(e1、e2、e3)或细胞内(i1、i2,i3,i4)环结构。或者，选择性靶向gpcr的细胞外或细胞内侧的ig型或单链抗体可能充当生物素化标签以结合链霉亲和素或链霉亲和素相关支架。表1列出了潜在的蛋白质和肽标签。
[0116]
图1b显示了与细胞内信号蛋白复合的原型gpcr的示意图，例如：(i)异源三聚体g蛋白或微型g蛋白，其适于与激动剂激活的gpcr结合；(ii)g蛋白偶联受体激酶(grk)，其适于与活性gpcr结合并使其磷酸化；(iii)抑制蛋白，其适于与磷酸化的gpcr结合；(iv)模拟g蛋白或抑制蛋白中与受体结合区域的肽序列。
[0117]
可采用不同的方法将标签引入此类gpcr/信号蛋白复合物，以使这些复合物能够与链霉亲和素或链霉亲和素样支架蛋白结合：(i)使用包含(图1a)中描述的标签的gpcr；
(ii)将特定标签附接到信号蛋白或信号肽序列中，在本文中，在一些实施方案中，特定标签是与目标蛋白序列融合的生物素化蛋白或多肽标签；(iii)使用靶向与gpcr结合的信号蛋白的生物素化的anticalin或抗体。图1c显示了支架蛋白的示意图，该支架蛋白包含一种通过其标签(例如，生物素化标签)特异性结合到四个支架结合位点中的每一个的目的蛋白(poi)。支架蛋白可以是与标签的生物素特异性结合的链霉亲和素或亲和素。或者，可以使用11-氨基酸链球菌标签，它选择性地结合(作为链霉亲和素的修饰形式的)支架蛋白streptactin。poi对应于(图1a)中描述的带有附加标签的gpcr，或者对应于(图1b)中描述的带有附加标签的gpcr/信号蛋白复合物。
[0118]
使用神经激肽1受体(nk1r)作为原型gpcr证明了新方法使用通过halotag在链霉亲和素模板上组装的gpcr以通过单粒子冷冻电镜阐明相应gpcr的结构的可行性。最近通过x射线晶体学和nmr光谱学解决了与小分子拮抗剂治疗剂结合的人nk1受体(nk1r)的高分辨率结构(等人，2019年；chen等人，2019年)。在这里，nk1r作为一个测试用例，用于比较不同链霉亲和素-(nk1r-halotag)4结构的低温-em结构与已发表的nmr和x射线结构的结构。
[0119]
分子建模是在gpcr的蛋白质序列中找到生物素化标签或链球菌标签的适当位置的一个非常重要的步骤。第一步，同源计算机建模将用于建立任何gpcr的3d结构模型，其结构必须通过新的冷冻电镜方法通过实验解决。在第二步中，将使用进一步的计算机建模将感兴趣的生物素化标签插入图1a-图1c中示意的gpcr的位置之一。蛋白质序列中的确切插入将通过计算机建模进行调整，以在链霉亲和素或链霉亲和素模板与gpcr之间获得最佳的结构刚性，如有必要，在原始gpcr氨基酸序列以及标签的氨基酸序列上插入额外的间隔氨基酸或从其中去除功能上不相关的灵活氨基酸序列。分子动力学模拟将用于探测靶蛋白相对于链霉亲和素模板的灵活性/刚性。这些模拟将有助于优化生物素在目标蛋白上的位置，以达到结合链霉亲和素的最佳可及性，同时具有最低的迁移率。图2a-2b中给出了(halotag-生物素)
4-链霉亲和素系统的示例。
[0120]
图2a显示sa-(nk1r-halotag)4的结构模型，包括四聚体链霉亲和素sa(中心)和四个结合的生物素化halotag蛋白分子，每个生物素化halotag蛋白分子插入至第三个细胞内环i3结构(参见图1a)，从nk1受体中去除氨基酸227和237之间的氨基酸序列。
[0121]
图2b显示了从各向异性网络模型(anm)分析计算的蛋白质复合物的内在迁移率。绿色矢量长度与不同蛋白质结构域的相对运动幅度相关。每个nk1受体亚基相对于单个halotag蛋白相对于sa模板有一个整体运动。仅描绘了一种nk1受体并入popc脂质双层，为清楚起见未显示。
[0122]
显然，前面描述的方法可以很容易地适用于解决作为目标的水溶性蛋白质的结构。
[0123]
示例1：计算机建模
[0124]
图3a显示sa(halotag)4的结构模型，包括四聚体链霉亲和素(sa中心)和四个结合的生物素化halotag蛋白分子，每个sa亚基对应一个halotag蛋白。
[0125]
图3b显示了从anm分析计算的复合物的固有迁移率。矢量长度与蛋白质结构域的运动幅度相关。halotag蛋白相对于sa模板有一个整体运动。anm是一种用于分析分子结构内部运动的计算工具。用于构建结构模型和计算内部运动的计算方法的细节描述如下。
[0126]
所有模型均使用 maestro软件中的3d构建器工具构建。根据薛定谔的结果正确分配了蛋白质的电离状态。使用desmond软件进行md模拟。在该系统中使用了液体模拟(opls)-3e力场的优化电位，用单点带电(tip3p)水模型和0.15m nacl将蛋白质溶剂化。正交水箱用于在蛋白质原子和箱侧之间创建一个的缓冲区。温度保持恒定在310k，在积分步长中获得2.0fs值。我们通过执行50ns无偏分子动力学(md)分析来研究结构，并利用anm计算来分析md轨迹中的蛋白质骨架运动。
[0127]
示例2：halotag peg-生物素配体合成
[0128]
halotag-peg4-生物素配体进行了合成。halotag-peg4-生物素配体的分子式为c
31h57
cln4o9s，分子量为697，化学结构如下：
[0129][0130]
式(i)。
[0131]
halotag-peg4-生物素配体的末端-cl用于在亲核反应中被halotag蛋白的asp106置换以形成稳定的酯键(los等人，2008)，从而形成生物素化的halo-tag。
[0132]
2-(2-((6-氯己基)氧基)乙氧基)乙胺盐酸盐和nhs-peo4-生物素用于合成peg-生物素配体。具体方法如下；在nhs-peo4-生物素(5mg，8.5
×
10-6
mol)溶于115μl干燥dmf中形成的搅拌溶液中，加入2-(2-((6-氯己基)氧基)乙氧基)乙胺盐酸盐(85μl，2.55
×
10-5
mol)溶解至ch2cl2所形成的溶液0.3m，最后加入一滴过量二异丙基乙胺。反应混合物室温搅拌4小时，然后稀释至1ml水并用制备型hplc纯化。h2o和乙腈作为半作制备型hplc的溶剂，在210nm处测量反应产物的吸光度。使用lc-ms上分析纯化后样品的纯度。1％的甲酸水溶液和乙腈作为溶剂流动相。
[0133]
总化学反应式如下：
[0134][0135]
图4a显示通过hplc分析的纯化的halotag peg-生物素配体：吸收波长为210nm并且保留时间为10分钟。
[0136]
图4b显示halotag peg-生物素配体的lc-ms。ms：m/z计算值。对于c31h58cln4o9s+：697.36(100％)、698.36(36.6％)、699.36(41％)、719.3(12.13％)、720.3(4.41％)。
[0137]
示例3：halotag蛋白的表达和纯化
[0138]
通过pcr扩增野生型halotag蛋白的dna片段并克隆到pet29a载体中。对于蛋白质生产，将质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)细胞中。细胞在37℃下生长，直到od600＝0.6，然后将样品转移到18℃，并通过添加0.2mm异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导蛋白质。诱导
18小时后，离心收取细胞，并重悬于含有25mm tris-hcl，ph7，400mm nacl和10mm咪唑的裂解缓冲液中。细胞悬浮液通过高压破碎(800p.s.i.)来裂解细胞。细胞裂解液以12,000
×
g离心20分钟。弃去沉淀，将上清液加到用由25mm tris-hcl、ph7.5、400mm nacl和10mm咪唑组成的结合缓冲液平衡的镍亲和柱上。结合在柱树脂上的蛋白质首先用50mm咪唑洗涤，然后用250mm咪唑洗脱。将获得的蛋白质制剂用25mm tris-hcl(ph8.0)、100mm nacl透析两次。最后，使用尺寸排阻色谱法分离单体形式的halotag蛋白。
[0139]
示例4：链霉亲和素-halotag蛋白复合物的尺寸排阻色谱
[0140]
链霉亲和素(购自德国哥根廷iba)与halotagpeg-生物素配体以1:4的摩尔比混合。孵育3小时后，将halotag单体蛋白加入混合物中。过夜孵育后，将halotag-peg4-生物素配体和halotag蛋白注入尺寸排阻色谱，将形成的链霉亲和素-halotag蛋白复合物与反应混合物分离。
[0141]
图5a显示了链霉亲和素-halotag蛋白复合物的尺寸排阻色谱。图5b显示链霉亲和素四聚体(示出为streptavidin)、halotag蛋白(示出为halotag)、尺寸排阻色谱级分1和级分2的sds-page(图5a)。尺寸排阻色谱和sds-page表明形成了链霉亲和素-halotag蛋白复合物。
[0142]
示例5：链霉亲和素_halotag蛋白复合物的负染色的电子显微
[0143]
负染色的样品的电子显微镜用于评估蛋白质质量。简而言之，将3l新鲜纯化的链霉亲和素-halotag复合物(0.025mg/ml)应用到由薄层辉光放电碳膜(中精科易科技有限公司)支撑的铜网格上。吸附1min后，用醋酸双氧铀(2％w/v)在室温下进行负染色。使用在120kv下运行的fei talos l120c检查负染色网格。
[0144]
图6显示了通过尺寸排阻色谱法分离的链霉亲和素-halotag蛋白复合物的负染色制剂的代表性电子显微照片(对应图5a中的级分1)。
[0145]
示例6：cryo-em的网格准备
[0146]
从sec收集的峰级分浓缩至1mg/ml，然后在4℃下以12,000
×
g离心30分钟。将总共4μl样品应用于辉光放电quantifoil多孔碳网格(金，2
–
2μm/孔，300目)，使用vitrobot(fei)进行印迹，在100％湿度下具有2秒的印迹时间和4℃，然后在液氮冷却的液态乙烷中冷冻。将冷冻的网格小心地转移并储存在液氮中，直到收集冷冻电镜图像。
[0147]
示例7：cryo-em的数据采集和图像处理
[0148]
在titan krios g3i(thermofisher scientific)上收集了总共19060部影片，该titan krios g3i在300kv下运行的，配备了gatan图像滤波器continuum 1069(以20ev的狭缝宽度运行)且安装有k3 summit检测器(gatan,inc.)的。epu用于在超分辨率计数模式下以的像素大小自动获取显微照片，标称散焦值范围为-1.5至-2.5μm。在2.1秒的曝光时间内，以每像素每秒50个电子的剂量收集每部32帧的电影，从而使样本上的总剂量为收集了10
°
、20
°
、30
°
和40
°
的倾斜数据，以克服链霉亲和素-halotag复合物的首选方向问题。每个堆栈中的所有电影帧都使用motioncor2进行对齐和剂量加权，生成像素大小为像素的2倍合并图像。cryosparc2软件的patchctf模块用于估计对比度传递函数(ctf)的散焦值和散光参数。总共选择了12655张显微照片进行进一步处理。为了了解研究亚基组成，进行了无参考二维(2d)分类。cryosparc2的2d分类模块用于进一步的数据处理。最初从选定的显微照片中挑选出大约5850507个颗粒并进行二维分类。在cryosparc中
执行2d分类后，通过目视检查判断选取最佳的2d类平均值，用于在cryosparc中构建异质细化的从头算重建。在异质细化后，选择显示完整特征(粒子)的一类，并使用c2对称性进行非均匀细化，然后进行局部细化，得到的整体分辨率。
[0149]
图7a-图7b显示了链霉亲和素-halotag复合物的代表性显微照片和二维分类。图7a是使用在300kv下操作的低温电子显微镜记录的显微照片，比例尺：50纳米。图7b是复合物的代表性二维分类平均图像。
[0150]
图8a-图8b示出了冷冻电子显微照片的分辨率估计。具体地，图8a显示傅立叶壳相关(fsc)图，指示校正分辨率为3.6；图8b描绘了非均匀细化后链霉亲和素-halotag复合物的三维图。
[0151]
示例8：nk1r-halotag融合蛋白的表达和纯化
[0152]
将halotag蛋白的dna编码序列插入到nk1r编码序列的细胞内环3中，然后通过pcr扩增构建体并克隆到peg bacmam载体中。hek293f细胞在smm 293t-ii培养基中在8％co2条件下在37℃的孵育摇床中培养。通过使用编码nk1r-halotag融合蛋白的质粒dna瞬时转染hek293f细胞来表达目标蛋白。简而言之，对于1升hek293f细胞培养物，将1mg质粒dna和4mg 25-kda线性聚乙烯亚胺在25ml新鲜培养基中预孵育10min，然后将两种培养基样品混合进一步孵育15min，然后将混合物加入到细胞。转染的细胞在离心收获前培养72小时。对于每批蛋白质纯化，通过以2000
×
g离心收集4升转染的hek293f细胞。将细胞沉淀重悬于含有20mm hepes(ph7.5)、500mm nacl、1mm mgcl2、1mm cacl2、0.1mm pmsf和1x蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中，并用法式压滤机破碎。将细胞膜溶解在含有1％(重量/体积)n-十二烷基-β-d-麦芽糖苷(ddm)、0.2％胆固醇半琥珀酸三盐(chs)和0.5μm奈妥吡坦的裂解缓冲液中，在4℃下搅拌12h。通过在40,000
×
g下离心1h，将溶解的nk1r-halotag蛋白与不溶性部分分离，并与2ml talon金属亲和树脂在4℃下一起孵育3h。然后用含有20mm tris ph 7.5、150mm nacl、0.5μm奈妥吡坦、0.1mm pmsf和0.1％ ddm、0.02％ chs和30mm咪唑的10倍柱体积的缓冲液洗涤树脂。树脂用5个柱体积的缓冲液洗脱，缓冲液含有20mm tris(ph 7.5)、150mm nacl、0.5μm奈妥吡坦、0.1mm pmsf和0.1％ ddm、0.02％ chs和250mm咪唑。收集洗脱的蛋白质并使用100kda浓缩器浓缩。将链霉亲和素(购自德国哥廷根iba)与halotag-peg4-生物素配体以1:4的摩尔比混合，将四个halotag-peg4-生物素配体结合到一个链霉亲和素四聚体上，命名为sa(halotag peg-biotin配体)n(n＝1-4)。孵育3小时后，将nk1r-halotag融合蛋白添加到混合物中以共价结合到sa(halotag peg-生物素配体)n的halotag配体。孵育过夜后，将反应混合物应用于尺寸排阻层析以从反应混合物中分离形成的链霉亲和素-nk1r-halotag复合物。
[0153]
图9a显示了链霉亲和素-nk1r-halotag复合物的尺寸排阻层析。图9b显示了链霉抗生物素nk1r-halotag复合物、nk1r-halotag的sds-page，尺寸排阻层析级分1至级分4(图9a)。体积排阻层析和sds-page表明形成了链霉亲和素nk1r-halotag复合物。
[0154]
除非另有说明，否则术语“包括”、“具有”、“包括”和“包含”将被解释为开放式术语(即，意思是“包括但不限于”)。尽管已经示出和描述了本发明的特定实施例，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以在不背离本发明的更广泛方面的情况下进行改变和修改，因此，所附权利要求的目的涵盖了所有落入本发明真正精神和范围内的变化和修改。
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技术特征：
1.一种利用冷冻电镜进行蛋白质结构解析的方法，包括：使目标蛋白包含标签；使包含有所述标签的所述目标蛋白与支架蛋白结合以形成所述目标蛋白与所述支架蛋白的复合物；以及使用冷冻电子显微镜进行单粒子成像，以解析与所述支架蛋白复合的所述目标蛋白质结构；其中：所述支架蛋白为链霉亲和素、亲和素或者其衍生物中的任意一种；所述标签用于选择性地与支架蛋白结合；并且所述标签选自以下组成的组中的一者：生物素标签，其包含生物素；生物素化的蛋白质或多肽标签，其包含蛋白质序列和与所述蛋白质序列共价连接的生物素；链霉菌标签(strep-tag)；以及生物素化或链球菌标记的抗体、抗体fab片段或者单链抗体。2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述标签为所述生物素标签的情况下，所述使目标蛋白包含标签的步骤包括：使所述生物素标签包含在非规范氨基酸的侧链中，并将所述非规范氨基酸位点特异性地引入所述目标蛋白的氨基酸序列中；或者，将所述生物素标签化学连接到氨基酸的特定侧链，并将所述氨基酸位点特异性地引入目标蛋白中；或者，将所述生物素标签化学连接到目标蛋白n末端部分的特定糖基化位点。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物素化的蛋白质或多肽标签选自以下组成的组中的一者：自标记蛋白质标签，其允许生物素残基与相应标签蛋白质进行位点特异性共价连接；酰基载体蛋白标签(acp-tag)或者肽基载体蛋白标签(pcp-tag)；以及avi-tag，其适于与所述目标蛋白的n端或者c端或者暴露的环区域融合，并且可通过escherichia coli生物素化酶bira而与生物素共价连接。4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述自标记蛋白质标签为snap-tag、clip-tag或者halo-tag。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标蛋白的分子量在20kda到50kda之间。6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标蛋白为水溶性蛋白或者膜蛋白。7.根据权利要求1所述的方法，其中，当所述目标蛋白为g蛋白偶联受体，简称为gpcr，时，其在n端、c端或者细胞外环结构中的一者或者细胞内环结构中的一者处插入有所述生物素标签或者所述生物素化蛋白或多肽标签。8.根据权利要求1所述的方法，其中，当所述目标蛋白为gpcr时，其在n端、c端或者细胞外环结构中的一者或细胞内环结构中的一者处选择性地连接有anticalin或者ig型或单链抗体。9.根据权利要求7所述的方法，其中，在所述gpcr的细胞内环结构i4处融合所述生物素
标签、所述生物素化蛋白或多肽标签或者strep-tag，从而将所结合的链霉亲和素或streptactin稳定在刚性结构中。10.根据权利要求7所述的方法，其中，在所述gpcr的细胞外环中的一者或者细胞内环中的一者处融合所述生物素标签、所述生物素化蛋白或多肽标签或者所述strep-tag，从而将所结合的链霉亲和素或streptactin稳定在刚性结构中。11.根据权利要求1所述的方法，其中，当所述目标蛋白为原型gpcr与细胞内信号蛋白的复合物时，可以通过以下方式引入所述标签，以使所述目标蛋白与作为支架蛋白的所述链霉亲和素或者其衍生物相结合：1)在所述原型gpcr的n端、c端或者细胞外环结构中的一者或细胞内环结构中的一者处插入所述生物素标签、所述生物素化蛋白或多肽标签；2)在所述原型gpcr的所述n端、c端或者细胞外环结构中的一者或细胞内环结构中的一者处选择性地连接anticalin或者ig型或者单链抗体；3)将所述生物素标签或者所述生物素化蛋白或多肽标签融合到所述细胞内信号蛋白的序列中；4)将生物素化抗体与所述细胞内信号蛋白选择性地结合；或者5)选择性地将生物素化的anticalin结合到所述细胞内信号蛋白。12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述细胞内信号蛋白选自以下任意一种：异源三聚体g蛋白或微型g蛋白，其适于与激动剂激活的gpcr结合；g蛋白偶联受体激酶(grk)，其适于与活性gpcr结合并使其磷酸化；抑制蛋白，其适于与磷酸化的gpcr结合；以及模拟g蛋白或抑制蛋白中与受体结合区域的肽序列。13.根据权利要求1所述的方法，其中，当所述目标蛋白是神经肽1受体(nk1r)时，所述标签为生物素化的halo-tag，所述支架蛋白为链霉亲和素，通过所述生物素化的halo-tag在所述链霉亲和素上组装四聚体nk1r，即，形成复合物sa(halotag-nk1r)
n
，其中，n为1至4之间的整数。14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述生物素化的halo-tag插入在所述nk1r的第三细胞内环结构il3中，并删除第227位至237位氨基酸序列。15.根据权利要求13所述的方法，其中，在所述使目标蛋白包含标签的步骤之前，合成halotag-peg4-生物素配体，并且使所述halotag-peg4-生物素配体与halotag蛋白之间形成稳定的酯键，以形成生物素化的halo-tag标签。16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述halotag-peg4-生物素配体的分子式为c
31
h
57
cln4o9s，分子量为697，其具有以下化学结构：其中，所述halotag-peg4-生物素配体的末端-cl能够在亲和反应中被halotag蛋白的asp106置换形成稳定的酯键，从而形成生物素化的halo-tag标签。
17.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述使目标蛋白包含标签的步骤之前，所述方法包括：分子建模，其用于在所述目标蛋白序列中找到并调整所述生物素标签或者所述生物素化蛋白或多肽标签或所述strep-tag的适当插入位置，以获得所述目标蛋白与所述支架蛋白之间的最佳结构刚性。18.根据权利要求17所述的方法，其中，在所述分子建模过程中，在所述目标蛋白的氨基酸序列插入额外的间隔氨基酸，或者从所述目标蛋白的氨基酸序列中去除功能上不相关的灵活氨基酸序列。19.根据权利要求16所述的方法，其中，halotag-peg4-生物素配体中的peg4间隔进一步被缩短或扩大，以获得所述支架蛋白和所述目标蛋白之间的最佳结构刚性。

技术总结
本申请提供一种利用冷冻电镜进行蛋白质结构解析的方法，包括：使目标蛋白包含标签；使包含有所述标签的所述目标蛋白与支架蛋白结合以形成所述目标蛋白与所述支架蛋白的复合物；以及使用冷冻电子显微镜进行单粒子成像，以解析与所述支架蛋白复合的所述目标蛋白质结构。所述支架蛋白为链霉亲和素、亲和素或者其衍生物中的任意一种。所述标签用于选择性地与支架蛋白结合。所述标签选自以下组成的组中的一者：生物素标签，其包含生物素；生物素化的蛋白质或多肽标签，其包含蛋白质序列和与所述蛋白质序列共价连接的生物素；链霉菌标签(Strep-tag)；以及生物素化或链球菌标记的抗体、抗体Fab片段或者单链抗体。抗体Fab片段或者单链抗体。抗体Fab片段或者单链抗体。


技术研发人员：霍斯特
受保护的技术使用者：中国科学院深圳先进技术研究院
技术研发日：2023.04.23
技术公布日：2023/8/24