检测基孔肯雅病毒的多肽、试剂盒和方法与流程

1.本技术涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种检测基孔肯雅病毒的多肽、试剂盒和方法。


背景技术：

2.基孔肯雅病毒(chikungunya virus，chikv)是引起基孔肯雅热(chikungunya fever)的病原体，其基因组是一种单股正链rna，属于披膜病毒科(togaviridae)，甲病毒属(alphavirus)成员。
3.基孔肯雅热是一种蚊媒传播的病毒性疾病，该病一些临床体征与登革热和寨卡相同，在这些疾病常见地区容易被误诊，并且存在三者间合并感染并不罕见，鉴于临床鉴别这些感染的挑战，迫切需要快速、即时、准确的诊断方案。
4.在chikv感染后的最初几天，可从血液中检测到病毒。在患病第一周收集的样本，通常采用病毒学方法(特别是逆转录聚合酶链反应(rt-pcr))进行检测。酶联免疫分析(elisa)等血清学检测可在发病第6天或之后收集的样本中证实存在igm和igg基孔肯雅病毒抗体。
5.关于chikv的抗原检测，传统检测方法利用chikv的单克隆抗体进行检测，快速即时，但普遍存在特异性和亲和力上的缺陷。通过免疫动物抗体生成方式，生产针对不同结合位点的抗体，耗时久，效果不稳定。
6.如何快速即时准确地检测chikv是鉴别基孔肯雅热病的难点。


技术实现要素：

7.为了解决上述问题，快速、即时、准确地检测chikv，本技术的第一目的在于提供一种多肽，多肽可特异性结合chikv抗原蛋白；
8.多肽的序列包括(1)～(5)中至少一项的序列：
9.(1)seq id no:1所示的氨基酸序列；
10.(2)seq id no:2所示的氨基酸序列；
11.(3)seq id no:3所示的氨基酸序列；
12.(4)seq id no:4所示的氨基酸序列；
13.(5)seq id no:1～seq id no:4中的至少一条序列中的氨基酸被目标氨基酸替换得到的氨基酸序列，每条序列中氨基酸替换的个数不超过3个。
14.本技术的多肽，作为chikv抗原蛋白的肽适配体，灵敏度和特异性远远大于其他多肽适配体，可替代传统动物免疫抗体使用，从而能够快速、即时、准确地检测chikv及其浓度。
15.在其中一个实施例中，目标氨基酸选自thr、ser和asn中的至少一种。
16.本技术的第二目的在于提供上述多肽在制备检测基孔肯雅病毒的试剂盒中的用途。
17.在其中一个实施例中，试剂盒包括检测试剂，检测试剂用于和多肽联用以执行以下任一种方法：
18.酶联免疫吸附法、免疫荧光法、免疫组织化学法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法和液相芯片法。
19.在其中一个实施例中，多肽偶联有荧光微球。
20.在其中一个实施例中，检测试剂包括chikv抗原蛋白标准品、chikv抗原蛋白特异性抗体、包被缓冲液、封闭液和清洗液中的至少一种。
21.本技术的第三目的在于提供根据上述用途中定义的试剂盒。
22.本技术的第四目的在于提供一种检测基孔肯雅病毒的方法，采用上述试剂盒检测待测样本中的基孔肯雅病毒。
23.在其中一个实施例中，试剂盒用于执行以下任一种方法：
24.酶联免疫吸附法、免疫荧光法、免疫组织化学法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法和液相芯片法。
25.在其中一个实施例中，待测样本中的基孔肯雅病毒浓度不低于8.5ng/ml。
26.在其中一个实施例中，待测样本包括血液样本和尿液样本中的至少一种。
附图说明
27.为了更清楚地说明本技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
28.图1为本技术实施例1提供的体外合成肽适配体并发挥诊断功能的具体技术路线图；
29.图2为本技术实施例1提供的利用抗体cdr区序列信息筛选的肽适配体序列示意图；
30.图3为本技术实施例1提供的肽适配体与抗原蛋白间对接亲和力示意图；
31.图4为本技术实施例1提供的6条肽适配体与chikv包膜蛋白e分子对接结果的空间构象示意图；
32.图5为本技术实施例1提供的6条肽适配体及两种商品化抗体分别与三种抗原反应的检测过程示意图和检测结果；
33.图6为本技术实施例1提供的肽适配体与三种抗原蛋白间剂量反应曲线；
34.图7为本技术实施例1提供的肽适配体在不同临床标本中的检测结果；
35.图8为本技术实施例1提供的肽适配体在临床标本中的剂量反应曲线。
具体实施方式
36.现将详细地提供本技术实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本技术。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本技术进行多种修改和变化而不背离本技术的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
37.因此，旨在本技术覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本技术的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本技术更广阔的方面。
38.为了至少解决上述技术问题的至少一个，本技术的第一方面提供了一种多肽，多肽可特异性结合chikv抗原蛋白；
39.多肽的序列包括(1)～(5)中至少一项的序列：
40.(1)seq id no:1所示的氨基酸序列；
41.(2)seq id no:2所示的氨基酸序列；
42.(3)seq id no:3所示的氨基酸序列；
43.(4)seq id no:4所示的氨基酸序列；
44.(5)seq id no:1～seq id no:4中的至少一条序列中的氨基酸被目标氨基酸替换得到的氨基酸序列，每条序列中氨基酸替换的个数不超过3个。
45.具体地，chikv的基因组编码两个开放阅读框(orf)。5’端的orf编码非结构蛋白(nsp1、nsp2、nsp3、nsp4)主要负责基因组rna的复制；3’端的orf编码结构蛋白(衣壳蛋白c、包膜蛋白e3、包膜蛋白e2、包膜蛋白e1)，负责病毒颗粒的形成。
46.术语“结合位点”，也可称“蛋白质结合位点”，是指能够结合例如配体(包括合成或内源性配体)、生物分子(例如核酸或蛋白)或材料的蛋白质表面的区域。蛋白质发挥生物学功能主要是通过其结合表面的特定部位与其他小分子或生物大分子的相互结合实现。
47.本技术中，结合位点是指chikv包膜蛋白e表面的b细胞表位，由亲水性氨基酸组成，易于接近b细胞受体(bcr)和抗体分子并被识别。
48.本技术创造性地通过生物信息学的方法，代替传统的抗体依赖免疫动物的制备方法，从氨基酸分子水平出发，聚焦于肽-蛋白相互作用界面(ppi)通过虚拟筛选得到高灵敏及高特异的肽适配体，并作为抗体的替代，将本技术的多肽序列以固相合成的方法进行人工合成，构建相应的多肽检测方法检测chikv，从而实现能够快速、即时、准确地检测chikv及其浓度。
49.具体地，本技术发现seq id no:1～seq id no:4所示序列的多肽适配体有着不弱于商品化抗体的chikv包膜蛋白e抗原结合力。
50.其中，seq id no:1能够与chikv包膜蛋白e表面结合，且相比于其他多肽适配体，具有更高的灵敏度和特异性，不仅能够对chikv进行定量检测，也能对chikv进行定量检测。
51.可以理解的是，在seq id no:1～seq id no:4所示序列的基础上，可以通过对seq id no:1～seq id no:4所示的氨基酸序列进行1～3个氨基酸的替换，获得和seq id no:1～seq id no:4抗原结合效果相似的氨基酸序列，该氨基酸序列也在本技术多肽的保护范围内。
52.特别地，本技术通过肽适配体-chikv包膜蛋白e结合相互作用界面分析，发现肽适配体参与氢键和盐桥的形成主要是苏氨酸(thr)、丝氨酸(ser)、天冬酰胺(asn)三种氨基酸残基，chikv e形成氢键的主要氨基酸残基为thr和ser两种氨基酸残基。肽适配体与chikv e非共价相互作用过程中对氨基酸具有一定的倾向性，即thr、ser、asn三种氨基酸残基的侧链对非共价结合有着正向的促进作用，相应地，对肽适配体的改造优化可以适当提升肽适
配体中thr、ser、asn三种氨基酸残基的占比，即采用thr、ser、asn作为目标氨基酸对肽适配体进行氨基酸的替换，以提升肽适配体与chikv e的亲和力。
53.本技术的第二方面提供了一种上述多肽在制备检测基孔肯雅病毒的试剂盒中的用途，以制备用于检测待测样本中的chikv抗原蛋白及其浓度的试剂盒。
54.一些实施方案中，试剂盒还包括检测试剂，检测试剂用于和多肽联用以执行以下任一种方法：
55.酶联免疫吸附法、免疫荧光法、免疫组织化学法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法和液相芯片法。
56.其中，酶联免疫检测是目前应用最广泛的免疫检测方法。该方法是将抗体标记上酶，抗原抗体反应的特异性与酶催化底物的作用结合起来，根据酶作用底物后的显色颜色变化来判断试验结果。常见用于标记的酶有辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶(ap)等。由于酶联免疫法无需特殊的仪器，检测简单，因此被广泛应用于疾病检测。
57.本技术用于病毒抗原检测的酶联免疫吸附法有直接法和夹心法。具体地，直接法是先将待测的蛋白包被在孔板内，然后直接和标记有酶的抗体反应，通过仪器(例如酶标仪)定量检测抗原。夹心法利用二种一抗对目标抗原进行捕获和固定，在确保灵敏度的同时大大提高了反应的特异性。
58.免疫荧光法以荧光素，如异硫氰酸荧光素、罗丹明等标记抗体，以检测标本中抗原的方法。免疫荧光技术也包括两种基本类型，即荧光抗体染色和荧光免疫测定。
59.荧光抗体染色是用荧光抗体浸染可能含有抗原的细胞或组织切片，若有相应抗原存在，则抗原与荧光抗体结合而使荧光素不被洗脱，在荧光显微镜下可见发光的物体，从而达到定位检测目的，在基础与临床医学的研究及疾病的诊断等方面有着广泛用途。根据荧光抗体的不同可分直接法和夹心法，前者即用荧光标记的第一抗体直接检测标本片上的抗原，如病毒及某些蛋白质成分等；后者则在未标记的相应抗体(第一抗体)处理标本片后，覆以荧光标记的抗球蛋白抗体(第二抗体)，借此可检测多种抗原与抗体。与直接法相比，间接法仅需标记一种第二抗体即可适应多种抗原抗体系统的检测，且敏感性较高。
60.荧光免疫测定与酶免疫测定一样，可分均相和非均相法。均相法常利用荧光的某些特性，如荧光的激发、吸收、淬灭等设计试验，无需作结合的与游离的标记物分离。双标记法即为均相荧光免疫测定的一种类型，检测试剂为fitc标记的抗原和罗丹明标记的抗体，当两种标记物标记的抗原和抗体特异性结合后使两种荧光素靠近，由于fitc的发射光谱能被罗丹明吸收，从而使fitc的荧光明显减弱。试验时将可能含有抗原的标本与两种标记物一起反应，则能与fitc标记的抗原竞争结合罗丹明标记的抗体，从而减少罗丹明对fitc发射光谱的吸收。通过fitc荧光测定可推算出标本中抗原的量，其与荧光强度成正比。
61.非均相法限于实验室条件、试剂和容器或载体的非特异性荧光干扰等，应用不及elisa广泛。时间分辨荧光免疫测定利用稀土金属(铕、铽等)的螯合物具有特长的荧光寿命，将其标记抗体并延长测定时间，以使短命的非特异性荧光衰退，从而测得均一的长寿命稀土螯合物荧光。稀土螯合物的激发光吸收峰(340nm)与荧光发射峰(613nm)之间的差别显著，也利于排除非特异荧光的干扰。可用于ige等微量血清成分及激素和某些药物水平的测定。
62.免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原
位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。免疫组织化学把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜的显像和放大作用，如荧光显微镜、电子显微镜，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质，如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等。
63.免疫化学发光法是用化学发光剂直接标记抗体，采用化学发光剂标记物与待测标本中相应抗原、磁颗粒性的抗抗体反应，通过磁场把结合状态(沉淀部分)和游离状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入发光促进剂进行发光反应，通过对发光强度的检测进行定量或定性检测。
64.免疫比浊法(immunonephelomytry)就是在一定的抗体浓度下，加入一定体积的样品，经过一段时间，用光散射浊度计(nephelometry)测量反应液体的浊度，来推算样品中的抗原含量。当抗体浓度高，加入少量可溶性抗原，即可形成一些肉眼看不见的小免疫复合物，可使通过液体的光束发生散射，随着加入抗原增多，形成的免疫复合物也增多，光散射现象也相应加强。免疫比浊法具有敏感、快速简便的特点，可测定蛋白的浓度。
65.免疫印迹法又称western印迹法，它将凝胶电泳与固相免疫结合，首先通过蛋白质电泳技术将需要区分的蛋白质转移至固相载体如nc膜等上，再借助酶免疫、放射免疫等技术进行测定。该法能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子质量。
66.液态芯片，又称悬浮阵列、流式荧光技术，是基于美国luminex公司研制的多功能流式点阵仪(luminex 100tm)开发的多功能生物芯片平台，通常用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体和配体识别分析等研究。
67.液态芯片起源于流式细胞仪，流式细胞仪有区分不同大小和颜色微球的能力，用于不同类别微球群的分析，因而液态芯片是一种以微球为基础的多指标数据采集和分析平台。
68.液态芯片的核心是把微小的聚苯乙烯小球(5.6μm)用荧光染色的方法进行编码，根据两种荧光染料的不同配比，将直径5.6μm的聚苯乙烯微球(beads)染成不同的荧光色，可获得多达100种经荧光编码的微球。将每种颜色的微球(或称为荧光编码微球)共价交联上针对特定检测物的抗体，通过不同荧光编码的微球可实现对多种特定检测物的检测。
69.在上述方法的实际应用中，本技术的多肽可代替上述方法中的抗体或者第二抗体使用，从而实现通过酶联免疫吸附法、免疫荧光法、免疫组织化学法、免疫化学发光法、免疫印迹法、液相芯片法检测chikv抗原蛋白浓度。
70.一些实施方案中，多肽偶联有荧光微球。
71.本技术中，术语“荧光微球”也可称为“荧光编码微球”，一般是指利用荧光的发射波长以及强度进行编码得到的荧光微球。荧光编码微球具有优良的比表面积，提供了更加灵敏的检测，同时荧光编码微球具有编码以及解码过程简单，编码容量大以及可大批量制备等优势。荧光编码微球的编码元件包括半导体的量子点、有机荧光染料以及上转换纳米颗粒等主要编码元件。
72.半导体的量子点的发射光谱窄，荧光稳定性好，较宽的的激发光谱可以实现多种量子点的单一波长激发。有机荧光染料价格低廉、种类较多，适用于多种编码方法以及多种材质的微球，不同批次间的荧光均一性较好。上转换纳米颗粒利用近红外发激光，可以避免生物分子背景荧光的干扰，另外可以避免不同发射波长间的共振能量转移现象。
73.荧光编码微球的生化检测主要利用两种方式，一种为悬浮芯片技术，另外一种方式基于微流控的技术或者微井阵列的方式。
74.具体地，为了实现基于液态芯片的病毒检测，在直接法检测时，样本中特异性抗原交联到荧光微球表面上的多肽，最终形成荧光微球-多肽(特异性结合抗原)复合物。在夹心法检测时，样本中特异性抗原被特异性抗体捕获后，再交联到编码微球表面的多肽，最终形成微球-多肽(特异性结合抗原)-抗体复合物。
75.进一步，采用适用仪器对复合物进行检测时，两束激光聚焦于编码微球上，一束判定微球的荧光编码，确定待测指标的种类；另一束测定微球上报告分子即藻红蛋白的荧光强度，即为荧光素的荧光值，该荧光值与样本中相应的分析物浓度成正比，通过仪器计算得到最终结果，从而实现待测指标浓度的测定。
76.一些实施方案中，检测试剂包括chikv抗原蛋白标准品、chikv抗原蛋白特异性抗体、包被缓冲液、封闭液和清洗液中的至少一种。
77.本技术中，chikv抗原蛋白抗原标准品通过商业途径购买获取。chikv抗原蛋白特异性抗体是本领域常规的特异性结合chikv抗原蛋白的抗体。
78.一些具体实施方案中，chikv抗原蛋白为chikv包膜蛋白e。
79.本技术的第三方面提供了上述用途中定义的试剂盒，包括上述多肽，用于检测待测样本中的chikv抗原蛋白及其浓度。
80.本技术的第四方面提供了一种检测基孔肯雅病毒的方法，采用上述试剂盒检测待测样本中的基孔肯雅病毒，以实现快速、即时、准确地检测chikv。可以理解的是，本技术的检测方法，可以用于诊断场景，可以对患者的体液进行检测从而确定患者是否感染chikv，也可以用于非诊断场景，利用chikv抗原蛋白标准品建立标准曲线，从而实现对样本中的chikv进行定量检测。
81.一些实施方案中，试剂盒用于执行以下任一种方法：
82.酶联免疫吸附法、免疫荧光法、免疫组织化学法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法和液相芯片法。
83.本技术的多肽，作为肽适配体，灵敏度和特异性远远大于其他多肽适配体，可替代传统动物免疫抗体使用，从而能够快速、即时、准确地检测chikv及其浓度。
84.为了保证准确的检测效果，一些实施方案中，待测样本中的基孔肯雅病毒浓度不低于8.5ng/ml。
85.一些实施方案中，待测样本包括血液样本和尿液样本中的至少一种，以实现基孔肯雅病毒的快速、即时、准确定性或定量检测，以及基孔肯雅热病的及时和有效诊断。
86.下面将结合实施例对本技术的实施方案进行详细描述，但本技术不局限于这些实施例。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料，试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
87.实施例1
88.本实施例以分子对接技术为基础，通过虚拟筛选获取发挥抗体重要生物功能及结合特性的线性氨基酸序列作为肽适配体，实现靶向特定抗原进行病原体的诊断。并利用固相合成的方法人工体外合成肽适配体，通过共价偶联纳米荧光微球作为检测抗体，以期实现体外合成肽适配体并发挥诊断功能，具体技术路线如图1所示，具体步骤如下所示：
89.1.抗原及对应抗体完整序列获取
90.抗原及抗体序列及晶体结构下载自pdb蛋白质结构数据库(protein data bank；https://www.rcsb.org/)；chikv包膜蛋白e(pdb id:3n40)；denv包膜蛋白e(pdb id:4utc)；zikv包膜蛋白e(pdb id:5jhm)；广泛中和抗体ede1 c8 fab片段(pdb id:4uta)；获取各蛋白的序列信息并下载晶体结构文件进一步处理。由于抗原及抗体拥有明确的晶体结构，通过pymol软件处理下载的晶体结构，去除小分子配体及水分子作为后续分子对接的蛋白文件。
91.2.抗原b细胞表位及抗体cdr区序列预测
92.b细胞表位(决定簇)是由抗原表面的亲水性氨基酸组成，易于接近b细胞受体(bcr)和抗体分子并被识别，采用三种不同的生信软件来预测chikv包膜蛋白e的b细胞表位作为肽适配体文库。
93.三种不同的生信软件分别为：
94.abcpred(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred)；
95.bcpred(http://crdd.osdd.net/raghava/bcepred)；
96.iedb-bepipred(https://www.iedb.org/)。
97.根据软件自带的打分算法筛选得到表1中的46条肽适配体，将同时满足以下两个条件作为肽适配体的入选标准：ⅰ.同一序列被两个以上软件同时预测；ⅱ.氨基酸个数满足肽适配体要求5-20个；从上述46条肽适配体筛选出16条肽适配体(b1-b16)，具体序列信息如表1所示。
98.表1
[0099][0100]
广泛中和抗体edei的氨基酸序列和结构信息在pbd数据库中获取(pbd代码：4utc；分辨率：)。ede1抗体fab段由489个氨基酸残基组成，其中重链可变区包含272个氨
基酸，轻链可变区包含217个氨基酸。使用abnum工具(http://www.bioinf.org.uk/abs/abnum/)对抗体的氨基酸序列进行标注，对于cdr区的编号方案采用基于序列可变性kabat方案和基于结构的chothia方案，获取准确的抗体重链和轻链cdr区序列信息。利用abymod(http://abymod.abysis.org/)对抗体进行建模。ede1抗体fab段符合抗体的基本结构，有着典型的高变区cdr1、cdr2、cdr3和骨架区fr1、fr2、fr3、fr4区。根据广泛中和抗体ede1 c8 fab片段序列特征共筛选出5条肽适配体(t7-t11)，具体结果如图2中的cdr-h2(t7)、cdr-h3(t8)、cdr-l1(t9)、cdr-l2(t10)和cdr-l3(t11)所示。
[0101]
3.autodock vina分子对接
[0102]
使用建模软件chem 3d对肽适配体进行建模，并对模型进行能量最小化分析，构建小分子结构文件作为小分子配体使用。通过autodock vina分子对接软件获得肽适配体分子上与抗原结合的关键氨基酸信息，并通过分子对接的结果评估肽适配体与抗原蛋白间亲和力大小。研究表明，抗原-抗体结合的过程中，结合能在-5～-11kcal/mol(结合能越小结合越紧密)。为进一步优化肽适配体的结合特异性，建立以下筛选标准：与目标抗原chikv包膜蛋白e结合能小于-6kcal/mol，denv/zika包膜蛋白e结合能大于-6kcal/mol，共有6条肽适配体符合标准(b2/b3/b4/b5/b13/t11)。肽适配体与抗原蛋白间对接亲和力如图3所示。
[0103]
4.autodock vina分子对接空间构象
[0104]
对6条优势肽适配体与chikv包膜蛋白e分子对接结果的空间构象展示，具体如图4所示。在图4中，ⅰ和ⅲ为肽适配体对接结果中亲和力前9的对接模型空间位置及构象，ⅱ和ⅳ为肽适配体与chikv包膜蛋白e的结合位点及二者间形成的非共价作用。
[0105]
5.肽适配体-chikv包膜蛋白e结合相互作用界面分析
[0106]
与传统抗体相比，肽适配体有着筛选周期短、适合于毒素和低免疫原性抗原、工作浓度低、批次差异性小、工艺简单、低成本、稳定易保存、常温运输等优点。肽适配体与抗体分子相同，都是由氨基酸组成，在结合抗原过程中能够更好的模拟蛋白间相互作用，较小的体积使得肽适配体能够接触到抗原的隐蔽位点，提升与抗原结合的稳定性。
[0107]
抗原蛋白-肽适配体相互作用过程中理想的结合位点是一个包含多个化学功能残基的“凹形”结合口袋区域，这些功能残基与配体分子在该区域内相互作用通过非共价结合(包括氢键，范德华力，疏水作用和静电引力等相互作用力)达到预期的结果。通过pymol软件对结果可视化基础上，使用pbdepisa分析最优对接复合物中的肽适配体-chikv包膜蛋白e相互作用界面，肽适配体与chikv e形成盐桥结构的氨基酸残基如表2所示，形成氢键结构的氨基酸残基如表3所示。
[0108]
表2
[0109][0110]
肽适配体b2与chikv e之间相互作用面积为2，b2与chikv包膜蛋白e的1
位酪氨酸(tyr)、3位组氨酸(his)、5位苏氨酸(thr)、6位缬氨酸(val)、16位赖氨酸(lys)、17位苏氨酸(thr)、18位亮氨酸(leu)、20位天冬酰胺(asn)、335位天冬酰胺(asn)、338位苏氨酸(thr)、391位脯氨酸(pro)相互作用形成15个氢键，同时与chikv包膜蛋白e的3位组氨酸(his)形成1个盐桥结构。肽适配体b3与chikv包膜蛋白e之间相互作用面积为2，b3与chikv包膜蛋白e的5位苏氨酸(thr)、16位赖氨酸(lys)、17位苏氨酸(thr)、18位亮氨酸(leu)、310位丝氨酸(ser)、335位天冬酰胺(asn)、357位丝氨酸(ser)相互作用形成7个氢键。肽适配体b4与chikv包膜蛋白e之间相互作用面积为2，b4与chikv e的5位苏氨酸(thr)、16位赖氨酸(lys)、17位苏氨酸(thr)、310位丝氨酸(ser)、338位苏氨酸(thr)、357位丝氨酸(ser)相互作用形成9个氢键。肽适配体b5与chikv包膜蛋白e之间相互作用面积为位丝氨酸(ser)相互作用形成9个氢键。肽适配体b5与chikv包膜蛋白e之间相互作用面积为2，b5与chikv e的308位组氨酸(his)、310位丝氨酸(ser)、336位丙氨酸(ala)、338位苏氨酸(thr)、357位丝氨酸(ser)、387位异亮氨酸(ile)、388位缬氨酸(val)相互作用形成11个氢键。肽适配体b13与chikv e之间相互作用面积为2，b13与chikv e的3位蛋氨酸(met)、6位丝氨酸(ser)、8位精氨酸(arg)、9位苏氨酸(thr)、10位甘氨酸(gly)相互作用形成7个氢键。肽适配体t11与chikv e之间相互作用面积为2，t11与chikv e的3位苏氨酸(thr)、4位甘氨酸(gly)、5位谷氨酸(glu)、9位丙氨酸(ala)、10位苯丙氨酸(phe)、14位丝氨酸(ser)、18位精氨酸(arg)、19位苯丙氨酸(phe)相互作用形成15个氢键，同时与chikv e的5位谷氨酸(glu)、7位天冬氨酸(asp)形成2个盐桥结构。对界面上相互作用的氨基酸残基分析发现肽适配体参与氢键和盐桥的形成主要是thr(17.91％)、ser(10.45％)、asn(10.45％)三种氨基酸残基，chikv e形成氢键的主要氨基酸残基为thr(20.90％)和ser(19.50％)两种氨基酸残基。肽适配体与chikv e非共价相互作用过程中对氨基酸具有一定的倾向性，意味这该氨基酸残基的侧链对非共价结合有着正向的促进作用，后续对肽适配体的改造优化可以适当提升肽适配体中thr、ser、asn三种氨基酸残基的占比，以提升肽适配体与chikv e的亲和力。
[0111]
表3
[0112][0113]
6.肽适配体与ps-eu+荧光微球间的生物偶联
[0114]
使用碳乙二胺法(edc)将荧光微球与肽适配体间进行生物偶联，通过edc将聚苯乙
烯-cooh/eu+荧光微球(ps-cooh(eu+))的游离-cooh活化形成活性o-酰基异脲中间体，该中间体易于被反应混合物中伯氨基团的亲核攻击并取代，伯胺与原始羧基基团从而反应形成一个酰胺键，并在反应过程中加入n-羟基琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)，形成比o-酰基异脲中间体更稳定的nhs酯，提高羧基偶联的效率。
[0115]
6条肽适配体及两种商品化抗体分别与三种蚊媒病毒重组抗原蛋白反应，并用bsa作为阴性对照，检测过程和结果如图5所示。在图5中，ⅰ表示利用edc/nhs生物偶联荧光微球和肽适配体检测病毒抗原的原理示意图；ⅱ表示采用直接法检测病毒抗原；ⅲ采用夹心法检测病毒抗原；ⅳ表示6条肽适配体与不同抗原结合信号；
ⅴ
表示商品化抗体检测抗原信号；根据图5中ⅳ和
ⅴ
可知，b2/b3/b5/b13对chikv有着较强的不弱于商品化抗体的信号响应。
[0116]
本实施例中，两种商品化抗体及三种蚊媒病毒重组抗原蛋白均购自北京义翘神州科技有限公司(中国)，其中，三种蚊媒病毒重组抗原蛋白包括：重组登革热病毒2型包膜蛋白(recombinant dengue virus type 2envelope protein)货号:40471-v08b)；重组寨卡病毒包膜蛋白(recombinant zika virus envelope protein)货号:40543-v08b4；重组基孔肯雅病毒包膜蛋白e2(recombinant chikv virus envelope2 protein)货号:40440-v08b；抗登革热病毒包膜蛋白e抗体(anti-denv e antibody)为兔多克隆抗体，货号:40471-t62；抗登革热病毒包膜蛋白e抗体(anti-denv e antibody)为鼠单克隆抗体，货号:40471-m144。
[0117]
生物偶联：
[0118]
1)清洗：取10μl ps-eu+微球加入400μl mest溶液(50mm mes，0.05％tween 20)，27237
×
g离心10分钟；
[0119]
2)活化：清洗后弃去上清，加入180μl 50mm mest缓冲液，重悬，先加入10μl 100mm磺基-nhs(sulfo-nhs)，混匀，再加入10μl 40mm edc和旋转混合30min；
[0120]
3)27237
×
g离心10分钟除去过量的edc和磺基-nhs。
[0121]
4)加400μl偶联缓冲液pbst(pbst组成：0.1m磷酸钠和0.05％tween 20)，清洗一次，(27237
×
g离心10分钟)重悬至400μl偶联缓冲液中，涡旋混匀；
[0122]
5)偶联：加入3μl 2mg/ml多肽(3mm)或2μl 10mg/ml鼠抗兔单抗，或者10μl 2mg/ml兔抗鼠多抗并在25℃下反应1.5小时；
[0123]
6)27237
×
g离心5-7.5分钟；
[0124]
7)封闭：加入400μl 50mm tris ph8.0+2％bsa混合封闭1小时，pbst清洗两次(27237
×
g离心5分钟)；
[0125]
8)保存：清洗后加入200μl pbst+0.1％bsa(微球偶联物保存浓度：15μm；检测时稀释100倍使用，即工作浓度：150nm)；
[0126]
直接法检测抗原：
[0127]
1)包被：使用包被液(ph 9.6，碳酸盐缓冲液)稀释抗原蛋白，在黑色酶标板内每孔加入100μl，4℃过夜或37℃包被2h；
[0128]
2)清洗：倒去酶标板内液体，在吸水纸上扣干，加入200μl pbst，400rpm摇2min，扣干液体，重复三次；
[0129]
3)封闭：每孔加入200μl 5％脱脂奶粉，37℃封闭1-2h；
[0130]
4)清洗三次；
[0131]
5)将偶联有肽适配体的微球用pbst稀释至工作浓度，每孔加入100μl，室温反应1h；
[0132]
6)清洗五次；
[0133]
7)使用具有时间分辨功能的荧光酶标仪读取结果(lag time：200μs；integration time：400μs)。
[0134]
夹心法检测抗原：
[0135]
1)包被：使用包被液(ph 9.6，碳酸盐缓冲液)1/5000稀释抗体(t62)，在黑色酶标板内每孔加入100μl，4℃过夜或37℃包被2h；
[0136]
2)清洗：倒去酶标板内液体，在吸水纸上扣干，加入200μl pbst，400rpm摇2min，扣干液体，重复三次；
[0137]
3)封闭：每孔加入200μl 5％脱脂奶粉，37℃封闭1-2h；
[0138]
4)清洗三次；
[0139]
5)加入待测样品，室温反应1h；
[0140]
6)清洗三次；
[0141]
7)将偶联有肽适配体的微球用pbst稀释至工作浓度，每孔加入100μl，室温反应1h；
[0142]
8)清洗五次；
[0143]
9)使用具有时间分辨功能的荧光酶标仪读取结果(lag time：200μs；integration time：400μs)；
[0144]
lob和lod的计算：
[0145]
分别做20次空白孔和20次低浓度孔，并测量信号读数；
[0146]
根据公式lob＝空白平均值+1.645*(空白sd)以及lod＝lob+1.645*(低浓度sd)计算lob和lod。
[0147]
7.肽适配体与三种抗原蛋白间剂量反应曲线
[0148]
使用肽适配体通过直接法检测三种抗原，分析二者间的剂量反应曲线，具体如图6所示。在图6中，ⅰ显示b2/b3作为检测抗体直接检测chikv时有着很强的信号响应，在0-1000ng/ml的浓度范围保持良好的线性(r2大于0.99)，同时相比于b3，b2对chikv有着更强的特异性，在检测过程中对其他抗原蛋白信号强度均小于2000。ⅱ显示以b2/b3为检测抗体，包被非特异性商业化抗体t62(即抗登革热病毒包膜蛋白e抗体，货号:40471-t62)作为捕获抗体，构建夹心法检测三种抗原，在缓冲液中，b2对chikv检测限lod为8.5ng/ml，b3对chikv检测限lod为164ng/ml。图6的结果显示b2有着更强的特异性和检测灵敏度。b2的氨基酸序列为itpqsstteael(seq id no:1)。
[0149]
8.肽适配体在临床标本中检测效率
[0150]
制备临床标本：选取正常体检血清标本和尿液标本各12份，使用pbst将血清标本稀释10倍，向稀释后血清标本和尿液标本内加入一定量的chikv病毒抗原蛋白(重组基孔肯雅病毒包膜蛋白e2，货号:40440-v08b)，模拟chikv感染患者临床标本用于后续检测。
[0151]
通过夹心法检测临床标本(尿液和1/10稀释血清)中的chikv病毒抗原蛋白，检测结果如图7所示，图7中相关统计结果如表4所示。
[0152]
表4
[0153][0154]
根据表4可知，与肽适配体b3相比，肽适配体b2表现出更低的cv值，均小于15％，更适合用于临床标本的检测。
[0155]
9.肽适配体在临床标本中检测灵敏度
[0156]
在临床标本中加入呈浓度梯度的抗原，利用肽适配体b2构建夹心法检测，检测结果如图8所示。根据图8可知，b2在血清中chikv病毒抗原蛋白检测限为57.8ng/ml，在尿液中抗原蛋白的检测限为147.3ng/ml。
[0157]
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0158]
以上实施例仅表达了本技术的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。因此，本技术专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.多肽，其特征在于，所述多肽可特异性结合chikv抗原蛋白；所述多肽的序列包括(1)～(5)中至少一项的序列：(1)seq id no:1所示的氨基酸序列；(2)seq id no:2所示的氨基酸序列；(3)seq id no:3所示的氨基酸序列；(4)seq id no:4所示的氨基酸序列；(5)seq id no:1～seq id no:4中的至少一条序列的氨基酸被目标氨基酸替换得到的氨基酸序列，每条序列中氨基酸替换的个数不超过3个。2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述目标氨基酸选自thr、ser和asn中的至少一种。3.根据权利要求1或2所述的多肽在制备检测基孔肯雅病毒的试剂盒中的用途。4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述试剂盒还包括检测试剂，所述检测试剂用于和所述多肽联合使用以执行以下任一种方法：酶联免疫吸附法、免疫荧光法、免疫组织化学法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法和液相芯片法。5.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于，所述多肽偶联有荧光微球。6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述检测试剂包括chikv抗原蛋白标准品、chikv抗原蛋白特异性抗体、包被缓冲液、封闭液和清洗液中的至少一种。7.权利要求3～6任一项所述的用途中定义的试剂盒。8.一种非疾病诊断目的检测基孔肯雅病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：采用权利要求8所述的试剂盒检测待测样本中的基孔肯雅病毒。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述试剂盒用于执行以下任一种方法：酶联免疫吸附法、免疫荧光法、免疫组织化学法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法和液相芯片法。10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括血液样本和尿液样本中的至少一种。

技术总结
本申请涉及一种检测基孔肯雅病毒的多肽、试剂盒和方法，所述多肽可特异性结合CHIKV抗原蛋白；所述多肽的序列包括(1)～(5)中至少一项的序列：(1)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；(3)SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；(4)SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；(5)SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4中的至少一条序列的氨基酸被目标氨基酸替换得到的氨基酸序列，每条序列中氨基酸替换的个数不超过3个。本申请的多肽，可替代传统动物免疫抗体使用，从而能够快速、即时、准确地检测CHIKV及其浓度。CHIKV及其浓度。CHIKV及其浓度。


技术研发人员：顾大勇 刘同功 陈曦 赵晓娜 陈红芳
受保护的技术使用者：深圳市第二人民医院（深圳市转化医学研究院）
技术研发日：2023.04.14
技术公布日：2023/8/24