一株地衣芽孢杆菌B63及其后生元产品和应用

一株地衣芽孢杆菌b63及其后生元产品和应用
技术领域
1.本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一株地衣芽孢杆菌b63及其后生元产品和应用。


背景技术：

2.益生菌发挥作用一般是在尚有活菌存在的条件下，此时属于菌株与其代谢物均存在的情形。例如王振华，李建臻等人研究发现益生芽孢杆菌因其能分泌各种消化酶、抑制病原微生物，调节免疫活性及改善水体环境。f zhang等人研究发现，枯草芽孢杆菌cfs抑制了金黄色葡萄球菌中与粘附分子(cna和clfa)，毒力因子hla，群体感应(arga，argb和rnaiii)和生物膜形成(ica和sara)有关的基因的表达。phoomjai sornsenee等人发现乳酸菌分离物的冻干无细胞上清液显示出抗生物膜，抗氧化剂，并降低脂多糖刺激的原始264.7细胞中的一氧化氮活性。prasertapiwatsiri发现由耐粘菌素的大肠杆菌形成的生物膜被实验室的无细胞上清液成功去除。ragul k等人研究发现来自大多数菌株的完整细胞(ic)和细胞内无细胞提取物(cfe)均表现出显著的抗氧化活性，同时，cfe和细胞内无细胞上清液(cfs)对α-淀粉酶，α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶表现出潜在的抑制活性，此外，pufstp35(地衣芽孢杆菌kt921419)的cfs和粗乙酸乙酯提取物显示出对ht-29结肠癌细胞系的强抗癌活性。
3.近年来菌株代谢产物所发挥的作用也引起了关注。例如rosanna inturri a等人表明长双歧杆菌bb536和鼠李糖乳杆菌hn001的上清液中释放的代谢物是热稳定的。f rafii等人发现，有两种梭菌菌株将呋喃妥因转化为允许呋喃妥因敏感细菌生长的化合物，当使用无细胞上清液时，呋喃妥因峰消失，无细胞上清液被热灭活，则该峰持续存在。
4.但是菌株代谢物的研究多是围绕其内容物提取单一物质开展，尚未有将关注点放在废弃液在菌株培养方面。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供了一株地衣芽孢杆菌b63及其后生元产品和应用。本发明从新疆农业大学动物医学学院生理组功能基因实验室获得1株地衣芽孢杆菌，命名为b63，并进行了保藏，保藏编号为cgmcc no.26746。将该菌株复苏活化，取单菌落接种到装有200ml培养基的三角瓶中进行摇床培养，然后离心得到无细胞上清液。该无细胞上清液可用于该菌株的常规液体培养基中，具有促进菌株自身生长发育的作用；而且多代培养该菌株获得的无细胞上清液对该菌株也具有促生长作用。本发明中对无细胞上清液绿色的回收利用即新兴领域后生元的使用，具有良好的应用前景。
6.为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
7.本发明提供了一株地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)b63，其保藏编号为cgmcc no.26746。
8.本发明还提供了一种后生元，所述后生元为保藏编号为cgmcc no.26746的地衣芽孢杆菌b63的无细胞上清液。
9.本发明还提供了一种所述后生元的制备方法，所述后生元通过将所述地衣芽孢杆菌b63菌株进行摇瓶培养，然后离心过滤获得。
10.优选的，所述摇瓶培养的条件为：摇床转数为160～200rpm，温度为35～39℃温度，培养时间为22～26h。
11.进一步优选的，所述摇瓶培养的条件为：摇床转数为180rpm，温度为37℃，培养时间为24h。
12.优选的，所述离心的条件为：5800～6200rpm离心4～6min。
13.进一步优选的，所述离心的条件为：6000rpm离心5min。
14.本发明还提供了一种由所述后生元经冻干制得的后生元产品。
15.本发明还提供了一种所述地衣芽孢杆菌b63、所述后生元、所述制备方法制成的后生元或所述后生元产品在促进菌株生长发育中的应用。
16.与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
17.(1)本发明中菌株b63自身产生的后生元，同常规液体培养基相比，加入该上清后，其对菌株生长具有一定的促进作用，菌落数增长率范围为71.11％～91.62％，而常规培养基的菌株增长率为21.21％，同比增长了49.9％～70.41％。
18.(2)本发明中菌株b63多代上清液对菌株生长发育均有促进作用，增长率范围为2.9％-94.35％％。
19.保藏证明说明：
20.保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
21.保藏编号：cgmcc no.26746；
22.保藏日期：2023年03月09日；
23.保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
24.分类学命名：地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)。
具体实施方式
25.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下实施例中使用的试剂、仪器均可由市售获得，实施例中使用的方法如无特别说明，与常规使用的方法一致。
26.下面结合实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细阐述。
27.本发明中使用的地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)b63由新疆农业大学动物医学学院生理组功能基因实验室保存并提供。
28.实施例1b63菌株自身产生的cfs
b63
对菌株的促生长作用
29.第一步：b63发酵培养
30.1)将所述地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)b63复苏，然后在平板上将b63菌株划线分离活化，得到单菌落；
31.2)挑单菌落接到1.5mlep管中液体摇管活化；
32.3)ep管种子液接0.1％到250ml三角瓶中液体摇瓶培养37℃摇瓶培养24h；
33.4)摇瓶后的发酵液6000rpm离心5min，无菌过滤后冻干得到cfs
b63
备用。
34.第二步：cfs
b6
对菌株的促生长作用测定
35.1)用1.5mlep管进行促生长实验，每管吸取试验用培养液1ml；
36.2)加入不同含量cfs
b63
；
37.3)实验设置两组，处理组在常规培养基的基础上分别加入10mg、30mg、50mg、70mg、90mg的cfs
b63
，对照组为常规培养基，不做任何处理，即加入0mg的cfs
b63
；
38.所述常规培养基的配方为：胰蛋白胨10g/l、酵母浸粉5g/l、氯化钠10g/l。
39.4)37℃温育24h涂布稀释；
40.5)根据目测观察计数，使用spss软件分析，结果如表1所示。
41.菌株增长率＝(实验组菌落均值-对照组菌落均值)/(实验组菌落均值+对照组菌落均值)x100％。
42.表1cfs
b6
对菌株的促生长实验效果
[0043][0044][0045]
结果表明：加入cfs
b63
后，同常规液体培养基相比，其对菌株生长具有一定的促进作用，菌落数增长率范围为71.11％～91.62％，而常规培养基的菌株增长率为21.21％，同比增长了49.9％～70.41％。
[0046]
实施例2b63菌株迭代培养产生的cfs
b63
对菌株的促生长作用
[0047]
第一步：b63发酵培养
[0048]
1)将所述地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)b63复苏，然后在平板上将b63菌株划线分离活化，得到单菌落；
[0049]
2)挑单菌落接到1.5mlep管中液体摇管活化；
[0050]
3)ep管种子液接1％到250ml三角瓶中液体摇瓶培养37℃摇瓶培养24h；
[0051]
4)摇瓶后的发酵液6000rpm离心5min，无菌过滤后冻干得到初培养的f1菌株产生的cfs
b63
；f1菌株再次培养获得f2的菌株与cfs
b63
，无菌过滤后冻干得到f2菌株产生的cfs
b63
；f2菌株再次培养获得f3的菌株与cfs
b63
，无菌过滤后冻干得到f3菌株产生的cfs
b63
；
[0052]
第二步：cfs
b6
对菌株的促生长测定
[0053]
1)用1.5mlep管进行促生长实验，每管吸取试验用培养液1ml；
[0054]
2)加入不同含量cfs
b63
；
[0055]
3)1ml常规培养液的ep管中分别加入不同含量上述制得的cfs
b63
；实验设置两组：处理组在常规培养基的基础上分别加入10mg、30mg、50mg、70mg、90mg、110mg的cfs
b63
；对照组为常规培养基，不做任何处理，即加入0mg的cfs
b63
；
[0056]
所述常规培养基的配方为：胰蛋白胨10g/l、酵母浸粉5g/l、氯化钠10g/l。
[0057]
4)37℃温育24h涂布稀释；
[0058]
5)根据目测观察计数，使用spss软件分析，结果分别如表2、3、4所示。
[0059]
菌株增长率＝(实验组菌落均值-对照组菌落均值)/(实验组菌落均值+对照组菌落均值)x100％。
[0060]
表2f1的cfs
b6
对菌株的促生长实验效果
[0061][0062]
表3f2的cfs
b6
对菌株的促生长实验效果
[0063][0064]
表4f3的cfs
b6
对菌株的促生长实验效果
[0065][0066]
结果表明：f1～f3代的cfs
b6
对菌株促生长范围为2.9％-94.35％，迭代培养的cfs
b63
对菌株也具有十分显著的促生长作用。
[0067]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一株地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)b63，其特征在于，其保藏编号为cgmccno.26746。2.一种后生元，其特征在于，所述后生元为权利要求1所述的地衣芽孢杆菌b63的无细胞上清液。3.权利要求2所述的后生元的制备方法，其特征在于，所述后生元通过将所述地衣芽孢杆菌b63菌株进行摇瓶培养，然后离心过滤获得。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述摇瓶培养的条件为：摇床转数为160～200rpm，温度为35～39℃温度，培养时间为22～26h。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述摇瓶培养的条件为：摇床转数为180rpm，温度为37℃，培养时间为24h。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述离心的条件为：5800～6200rpm离心4～6min。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述离心的条件为：6000rpm离心5min。8.一种后生元产品，其特征在于，由权利要求2所述的后生元经冻干制得。9.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌b63、权利要求2所述的后生元、权利要求3～7任一所述的制备方法制成的后生元或权利要求8所述的后生元产品在促进菌株生长发育中的应用。

技术总结
本发明提供了一株地衣芽孢杆菌B63及其后生元产品和应用，属于微生物应用技术领域。本发明从新疆农业大学动物医学学院生理组功能基因实验室获得1株地衣芽孢杆菌，命名为B63，并进行了保藏，保藏编号为CGMCCNo.26746。将该菌株复苏活化，取单菌落接种到装有200mL培养基的三角瓶中进行摇床培养，然后离心得到无细胞上清液。该无细胞上清液可用于该菌株的常规液体培养基中，具有促进菌株自身生长发育的作用；而且多代培养该菌株获得的无细胞上清液对该菌株也具有促生长作用。本发明中对无细胞上清液绿色的回收利用即新兴领域后生元的使用，具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。


技术研发人员：王金泉 彭啟敏 候萌 姚刚 赵红琼 刘丽娅 马学军 杨利伟 胡燕 李娜 银方方 王璐瑶 贾盛
受保护的技术使用者：新疆农业大学
技术研发日：2023.04.14
技术公布日：2023/8/24