高效溶磷菌及其制备方法和应用

1.本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种高效溶磷菌及其制备方法和应用。


背景技术：

2.磷元素是植物生长发育的必需元素之一，而土壤中的磷多数是以难溶性磷盐的形式存在，难以被植物吸收利用。为了保证植物生长所需的磷元素，只能通过频繁施用磷肥，然而土壤中的重金属离子如ca
2+
、al
3+
和fe
3+
等离子会将磷肥中的可溶性磷转化为难溶性磷，导致磷肥利用率低。此外，频繁施用磷肥导致导致土壤板结、酸化、养分元素和菌群失衡等一系列土壤问题，进而使土壤生态环境恶化。
3.为了解决这一问题，通过筛选高效的溶磷菌去溶解土壤中难溶性磷，将是减少磷肥的使用量和发展绿色农业的一条重要途径。利用溶磷菌将难溶性磷转化为植物可吸收利用的可溶性磷，增加土壤有效磷的含量，提高磷肥的利用效率，从而减少土壤难溶性磷素的累积，缓解土壤板结等问题，同时也能降低化学肥料对环境的污染，对农业的可持续发展具有重要意义。


技术实现要素：

4.针对上述问题，一方面，本发明提出了一种高效溶磷菌，所述溶磷菌命名为：pantoeacypripedip11，生物保藏编号为：cctcc no:m 2023159。
5.第二方面本发明还提出了一种由所述的溶磷菌pantoeacypripedip11发酵得到的发酵产物。
6.第三方面，本发明提出了一种菌剂，所述菌剂含有所述的溶磷菌pantoea cypripedii p11或含有所述的发酵产物。
7.第四方面，本发明提出了一种溶磷菌肥，所述溶磷菌肥含有所述的溶磷菌pantoea cypripedii p11或所述的发酵产物。
8.第五方面，本发明提出了一种土壤生态环境调节剂，所述调节剂含有所述的溶磷菌pantoea cypripedii p11或所述的发酵产物。
9.第六方面本发明提出了包括所述的溶磷菌pantoea cypripedii p11或所述的发酵产物或所述的菌剂的应用。
10.进一步地，包括在产吲哚乙酸和/或产铁载体中应用。
11.进一步地，包括在促进植物生长和提高植物产量中应用；更进一步地，所述溶磷菌pantoea cypripedii p11、发酵产物和/或菌剂中的菌悬液浓度为108cfu/ml。
12.进一步地，还包括在溶磷、提升磷肥利用率和/或增加土壤中可溶性磷含量时的应用。
13.进一步地，所述的菌剂在防止和/或改善由施用磷肥引起的土壤问题中的应用；所述土壤问题包括土壤板结、酸化、养分元素和菌群失衡。
14.第七方面，本发明提出了一种所述的高效溶磷菌pantoea cypripedi p1 1的制备
方法，包括以下步骤：
15.从铜陵市钟明镇金凤村地表层下5-10cm采集根际土壤样品；
16.称取10g土壤样品于250ml三角瓶中，加90ml无菌水，180r
·
min-1
振荡30min制备土壤悬液，再用10倍稀释法，依次制备10-2
、10-3
和10-4
的土壤稀释液；
17.分别吸取0.1ml土壤稀释液涂布于无机磷固体培养基上，每个梯度三次重复，28℃培养箱中倒置培养；
18.3-5d后挑取有明显溶磷圈且长势良好的菌落，用划线法再次转移到无机磷固体培养基上，传代培养3次再纯化后获得高效溶磷菌pantoea cyprip edii p11。
19.进一步地，所述无机磷固体培养基的配方为：琼脂18.0g，葡萄糖10.0g，nacl 0.3g，kcl 0.3g，(nh4)2so40.5g，mgso4·
7h2o 0.3g，feso4·
4h2o 0.036g，mnso4·
4h2o 0.03g，ca3(po4)25.0g，蒸馏水1l，ph值7.0～7.2。
20.本发明的有益效果：
21.本发明提出的的溶磷菌pantoea cypripedi p11将不可溶性磷转化为可溶性磷的含量最高可达663.59mg/l，能使土壤有效磷含量提高1.46倍，比现有发明溶磷菌burkholderia ubonensis(公开号为cn111662846b)的溶磷能力强，并且能够产吲哚乙酸、分泌铁载体，促进植物根系生长。
22.本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1示出了本发明实施例中溶磷菌pantoea cypripedii p11在lb培养基上的形态图；
25.图2示出了本发明实施例中基于溶磷菌pantoea cypripedii p11的l6s rdna基因序列的系统发育树；
26.图3示出了本发明实施例中溶磷菌pantoea cypripedii p11在无机磷固体培养基上的形态图；
27.图4示出了本发明实施例中溶磷菌pantoea cypripedii p11点涂于cas培养基上的形态图。
具体实施方式
28.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.以下结合具体实施例对本发明提出的高效溶磷菌pantoea cypripedii p11的获取过程以及应用效果进行详细说明。
30.实施例1溶磷菌pantoea cypripedii p11的筛选
31.1.1土壤样品采集：土壤样品采集于铜陵市钟明镇金凤村地表层下5-10cm；
32.1.2培养基配制：
33.配制无机磷液体培养基：葡萄糖10.0g，nacl 0.3g，kcl 0.3g，(nh4)2so
4 0.5g，mgso4·
7h2o 0.3g，feso4·
4h2o 0.036g，mnso4·
4h2o 0.03g，ca3(po4)25.0g，蒸馏水1l，ph值7.0～7.2。无机磷固体培养基即加琼脂18.0g。
34.配制lb液体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母浸出粉5.0g，nacl 10.0g，蒸馏水1l，ph值7.0～7.2。lb固体培养基加琼脂18.0g。
35.1.3溶磷菌分离纯化：称取10g根际土壤样品于250ml三角瓶中，加90ml无菌水，180r
·
min-1
振荡30min制备土壤悬液，再用10倍稀释法，依次制备10-2
、10-3
和10-4
的土壤稀释液，分别吸取0.1ml土壤稀释液涂布于无机磷固体培养基上，每个梯度三次重复，28℃培养箱中倒置培养，3-5d后挑取有明显溶磷圈且长势良好的菌落，用划线法再次转移到无机磷固体培养基上，传代培养3次，最终纯化获得一株溶磷能力较强的溶磷菌pantoea cypripedii p11。使用甘油在-20℃和-80℃保种，并于2023年2月20日在中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，邮编为430072)进行保藏，其保藏名称为pantoea cypripedii p11，保藏编号为cctcc no:m2023159。
36.实施例2 pantoea cypripedii p11的鉴定
37.2.1形态特征鉴定：革兰氏阴性细菌，在lb液体培养基上呈乳黄色且不透明的菌落，表面光滑，如图1。
38.2.2 16s rdna鉴定：利用细菌通用引物27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’)和1492r(5
’‑
tacggctaccttgttacgactt-3’)进行pcr扩增，将得到的16s rdna序列上传到genbank进行序列比对，鉴定菌株为pantoea cypripedii，系统发育树如图2。
39.16s rdna序列:》op810910.1 pantoea cypripedii p11 16s ribosomal rna gene,部分序列如下：
40.tacctgcagtcgacggtagcacagaggagcttgctccttgggtgacgagtggcggacgggtgagtaatgtctggggatctgcccgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagtgggggaccttcgggcctcacaccatcggatgaacccagatgggattagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcggggaggaagggtgtgaagtgaatagcttcatgcattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggcttaacctgggaactgcattcgaaactggcaggctggagtctcgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatccacggaattnggcagagatgccttagtgccttcgggaaccgtgagaca
ggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcgattcggtcgggaactcaaaggagactgccggtgataaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggccagggctacacacgtgctacaatggcgcatacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcataaagtgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgctaccac
41.2.3生理生化实验鉴定
42.表1 pantoea cypripedii p11生理生化特征鉴定(+：阳性；-：阴性)
43.生理生化试验结果生理生化试验结果赖氨酸-脲酶-鸟氨酸-产气+木糖+mr+棉子糖+vp-山梨醇-靛基质+侧金盏花醇-动力+苯丙氨酸-硫化氢-44.结果表明溶磷菌pantoea cypripedii p11可以利用木糖、棉子糖，不能利用赖氨酸、鸟氨酸、山梨醇、侧金盏花醇、苯丙氨酸，无脲酶活性，可以产生有机酸，可以产气，可以产生色氨酸酶来分解色氨酸产生吲哚，具有运动性，不能分解含硫的氨基酸。
45.实施例3溶磷能力的测定
46.3.1 pantoea cypripedii p11溶磷能力的定性测定
47.将纯化后的溶磷菌pantoea cypripedii p11点涂于无机磷固体培养基中央，于28℃培养7d，其在无机磷固体培养基上的生长如图3所示，测量菌落的溶磷圈直径(d)与菌落直径(d)，三次重复，d/d是表征溶磷菌的相对溶磷能力的一个指标，根据d/d值的大小，初步判断菌株溶磷能力的大小，d/d值越大，溶磷能力越强。溶磷菌pantoea cypripedii p11的d/d值大于3，证明其溶磷能力强，具体结果见表2。
48.表2溶磷菌pantoea cypripedii p11溶磷能力
49.菌株溶磷圈直径d(mm)菌落直径d(mm)d/d1256.93.6232278.03.3753236.13.770平均值257.03.589
50.3.2 pantoea cypripedii p11溶磷能力的定量测定
51.将溶磷菌pantoea cypripedii p11接种到无机磷液体培养基中，以不接菌的无机磷液体培养基为对照组，28℃摇床培养7d，利用钼锑抗比色法每24h检测上清液中的溶磷量，结果如表3。
52.表3溶磷菌pantoea cypripedii p11对磷酸三钙的溶解量
53.天数1234567
可溶性磷含量(mg/l)269.96470.88616.25630.35644.95663.59650.99
54.可以看出，溶磷菌pantoea cypripedii p11在接种到无机磷液体培养基后，溶液中的可溶性磷含量逐渐上升，培养到4d，可溶性磷含量达630.35mg/l，之后趋于平稳，第6天可溶性磷含量达到最高663.59mg/l，培养至第7天可溶性磷含量650.99mg/l。
55.实施例4 pantoea cypripedii p11产吲哚乙酸(iaa)能力测定
56.salkowski比色液：15ml 0.5mo1/l fec13，300ml浓硫酸(比重为1.84)，500ml蒸馏水，使用前混合之即成，避光保存。用时1ml样品中加入比色液4ml。将分离纯化后的溶磷菌pantoea cypripedii p11接种于含l-色氨酸的lb液体培养基中，30℃培养6d。将菌悬液5000r/min离心10min，取1ml上清液与4ml salkowski比色液混合，避光静置30min测定其在530nm下的吸光度。设置3个平行，24h测定一次。根据标准曲线计算出溶磷菌发酵液中iaa的含量即为该溶磷菌产iaa的能力，结果如表4所示。
57.表4溶磷菌pantoea cypripediip11产iaa含量
58.天数1234567iaa(μg/ml)22.8933.6040.5541.5640.8039.8237.44
59.可以看出，溶磷菌pantoea cypripedii p11在接种到lb液体培养基后，溶液中的iaa含量逐渐上升，培养到4d，iaa含量最高达41.56μg/ml。
60.实施例5 pantoea cypripedii p11产铁载体测定
61.将溶磷菌pantoea cypripedii p11接种于cas琼脂平板,菌株周围产生黄色晕圈。cas平板培养基：溶液a：60.5mg cas，50ml蒸馏水，10ml氯化铁溶液(含1mm fecl3·
6h2o，10mm hcl)；溶液b：72.9mg hdtma(十六烷基三甲基溴化铵)，40ml蒸馏水；溶液c：溶液a加入溶液b，混匀，121℃灭菌15min；2ml 1mm氯化钙溶液，2ml 1mm硫酸镁溶液，调ph6.8～7.0。蒸馏水定容至1000ml，加入18g琼脂，121℃灭菌15min，温度降至60℃以下时，加入50ml溶液c，混合均匀后制作平板。产铁载体测定方法具体为:将溶磷菌pantoea cypripedii p11点涂于cas平板培养基中央，置于28℃培养箱48h，观察并记录菌落周围颜色的变化。铁载体圈直径与溶磷菌菌落直径比值(d/d)为3.5，如图4所示。
62.实施例6 pantoea cypripedii p11土壤中的溶磷能力评价
63.取5.0g土壤加入25ml无菌水，121℃灭菌30min，放凉后接种溶磷菌pantoea cypripedii p11 5ml，同时以接种5ml lb液体培养基作为平行对照组，每组三个平行。25℃条件下静置，7d后取上清液，钼锑抗比色法测定其中可溶性有效磷含量。
64.不接菌对照组中可溶性有效磷含量为48.01mg/kg，实验组中可溶性有效磷含量为118.34mg/kg。证明溶磷菌pantoea cypripedii p11能够有效提高土壤中可溶性磷含量，增量达70.33mg/kg，使土壤可溶性磷提高1.46倍。
65.实施例7 pantoea cypripedii p11促生实验
66.取籽粒饱满的大麦种子，用无菌水冲洗5次，分别取50粒种子置于无菌水(对照组)和108cfu/ml pantoea cypripedii p11菌悬液(实验组)中浸泡1min，将种子种于装有灭菌土壤的花盆中，分为实验组和对照组，28℃培养10d，结果如表5所示。
67.表5溶磷菌pantoea cypripedii p11促生作用
[0068] 对照组实验组成活率(％)48.072.0
芽长均值(cm)16.517.2鲜重均值(mg)229.62311.74干重均值(mg)21.8824.84
[0069]
由表5数据可知，溶磷菌pantoea cypripedii p11对大麦种子具有很好地促生效果。
[0070]
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种高效溶磷菌，其特征在于，所述溶磷菌命名为：pantoeacypripedi p11，生物保藏编号为：cctccno：m2023159。2.一种发酵产物，其特征在于，由权利要求1所述的溶磷菌pantoea cypripedip11发酵得到。3.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的溶磷菌pantoea cypripedip11或含有权利要求2所述的发酵产物。4.一种溶磷菌肥，其特征在于，含有权利要求1所述的溶磷菌pantoea cypripedip11或含有权利要求2所述的发酵产物。5.一种土壤生态环境调节剂，其特征在于，含有权利要求1所述的溶磷菌pantoeacypripedip11或含有权利要求2所述的发酵产物。6.权利要求1所述的溶磷菌pantoeacypripedip11或权利要求2所述的发酵产物或权利要求3所述的菌剂在产吲哚乙酸和/或产铁载体中的应用。7.权利要求1所述的溶磷菌pantoeacypripedip11或权利要求2所述的发酵产物或权利要求3所述的菌剂在促进植物生长和提高植物产量中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述溶磷菌pantoea cypripedip11、发酵产物和/或菌剂中的菌悬液浓度为108cfu/ml。9.权利要求1所述的溶磷菌pantoeacypripedip11或权利要求2所述的发酵产物或权利要求3所述的菌剂在溶磷、提升磷肥利用率和/或增加土壤中可溶性磷含量时的应用。10.权利要求1所述的溶磷菌pantoeacypripedip11或权利要求2所述的发酵产物或权利要求3所述的菌剂在防止和/或改善由施用磷肥引起的土壤问题中的应用；所述土壤问题包括土壤板结、酸化、养分元素和菌群失衡。11.一种如权利要求1所述的高效溶磷菌pantoeacypripedip11的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：从铜陵市钟明镇金凤村地表层下5-10cm采集根际土壤样品；称取10g土壤样品于250ml三角瓶中，加90ml无菌水，180r
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min-1
振荡30min制备土壤悬液，再用10倍稀释法，依次制备10-2
、10-3
和10-4
的土壤稀释液；分别吸取0.1ml土壤稀释液涂布于无机磷固体培养基上，每个梯度三次重复，28℃培养箱中倒置培养；3-5d后挑取有明显溶磷圈且长势良好的菌落，用划线法再次转移到无机磷固体培养基上，传代培养3次再纯化后获得高效溶磷菌pantoeacyprip edip11。12.根据权利要求11所述的高效溶磷菌pantoeacypripedip11的制备方法，其特征在于，所述无机磷固体培养基的配方为：琼脂18.0g，葡萄糖10.0g，nacl0.3g，kcl0.3g，(nh4)2so40.5g，mgso4·
7h2o0.3g，feso4·
4h2o0.036g，mnso4·
4h2o0.03g，ca3(po4)25.0g，蒸馏水1l，ph值7.0～7.2。

技术总结
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种高效溶磷菌及其制备方法和应用，所述溶磷菌命名为：Pantoea cypripediP11，生物保藏编号为：CCTCC NO：M2023159，本发明提出的高效溶磷菌Pantoea cypripediP11将不可溶性磷转化为可溶性磷的含量最高可达663.59mg/L，能使土壤有效磷含量提高1.46倍，比现有发明溶磷菌Burkholderia ubonensis的溶磷能力强，并且能够产吲哚乙酸、分泌铁载体，促进植物根系生长。促进植物根系生长。促进植物根系生长。


技术研发人员：王仁中 吴德玲 赵宏苏 倪文杰 许凤清 张伟 黄琪
受保护的技术使用者：安徽中医药大学
技术研发日：2023.04.07
技术公布日：2023/8/24